BR112014031900B1 - Sequência de dna isolada, método de controlar insetos, de aumentar o rendimento de uma cultura de soja e uso do evento de soja 9582.816.151 - Google Patents
Sequência de dna isolada, método de controlar insetos, de aumentar o rendimento de uma cultura de soja e uso do evento de soja 9582.816.151 Download PDFInfo
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Abstract
SEQUÊNCIA DE DNA ISOLADA, POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO E MÉTODOS DE INTRODUZIR CARACTERÍSTICAS DE TOLERÂNCIA A HERBICIDA E RESISTÊNCIA A INSETOS EM UMA PLANTA DE SOJA, CONTROLAR INSETOS, CONTROLAR ERVAS DANINHAS, REPRODUZIR UMA PLANTA DE SOJA TRANSGÊNICA, BEM COMO O USO DA REFERIDA PLANTA DE SOJA TRANSGÊNICA. A presente invenção refere-se a um evento de soja 9582.816.15.1 que compreende genes que codificam Cry1F, Cry1Ac(synpro), e PAT, fornecendo resistência a insetos e tolerância a herbicidas às culturas de soja que contêm o evento, e permitindo métodos de proteção de cultura de produtos armazenados.
Description
[001] Reivindicação de Prioridade: Esta descrição reivindica a prioridade de pedido provisório US 61/663.700, depositado em 25 de junho de 2012. As informações nesse estão aqui incorporadas em sua totalidade.
[002] Os genes que codificam Cry1F e Cry1Ac synpro (Cry1Ac) são capazes de conferir resistência a insetos, por exemplo, resistência a insetos lepidópteros, a plantas transgênicas; e o gene que codifica PAT (fosfinotricina acetiltransferase) é capaz de conferir tolerância ao herbicida fosfinotricina (glufosinato) a plantas transgênicas. PAT foi expressa de forma bem-sucedida em soja para uso como um marcador selecionável na produção de culturas transgênicas resistentes a insetos, e para conferir níveis comerciais de tolerância ao herbicida glufosinato em plantas transgênicas.
[003] A expressão de transgenes em plantas é conhecida por ser influenciada por sua localização no genoma da planta, talvez devido à estrutura de cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou a proximidade de elementos reguladores transcricionais (por exemplo, intensifi- cadores) ao sítio de integração (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Ao mesmo tempo, a presença do transgene em locais diferentes no genoma irá influenciar o fenótipo total da planta de maneiras diferentes. Por esse motivo, geralmente é necessário avaliar um grande número de eventos transgênicos para identificar um evento transgênico específico caracterizado por expressão ótima de um gene introduzido de interesse. Por exemplo, foi observado em plantas em outros organismos que pode haver uma grande variação em níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Também pode haver diferenças em padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais, que podem não corresponder aos padrões esperados de elementos reguladores transcricionais presentes na construção de gene introduzida. Por esse motivo, é comum produzir centenas a milhares de eventos diferentes e avaliar esses eventos quanto a um único evento que possui níveis e padrões desejados de expressão de transgene para propósitos comerciais. Um evento que possui níveis ou padrões desejados de expressão de transgene é útil para introgres- são do transgene em outros backgrounds genéticos por cruzamento sexual aleatório utilizando métodos de reprodução convencionais. A progênie desses cruzamentos mantém as características de expressão de transgene do transformante original. Essa estratégia é usada para garantir a expressão de gene confiável em inúmeras variedades que são bem adaptadas a condições de crescimento local.
[004] Deseja-se ser capaz de detectar a presença de um evento particular para determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene ou grupo de transgenes de interesse. Ademais, um método para detectar um evento particular poderia ser útil para cumprir os regulamentos que exigem a aprovação pré-mercado e rotulagem de alimentos derivados de planas de cultura recombinante, por exemplo, ou para uso em monitoramento ambiental, monitoramento de características em culturas no campo, ou monitoramento de produtos derivados de uma colheita de cultura, bem como para uso para garantir o cumprimento das partes submetidas aos termos reguladores ou contratuais.
[005] É possível detectar a presença de um evento transgênico por qualquer método de detecção de ácido nucleico conhecido na técnica inclusive, mas sem se limitar a, a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou hibridização de DNA utilizando sondas de ácido nucleico. Esses métodos de detecção geralmente se concentram em elementos genéticos frequentemente usados, como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., pois para muitas construções de DNA, a região de codificação é intercambiável. Como resultado, esses métodos podem não ser úteis para discriminação entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos utilizando a mesma construção ou construções de DNA muito similares a menos que a sequência de DNA do DNA de flanqueamento adjacente ao DNA heterólogo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio PCR específico de evento é descrito no Pedido de Patente norte-americano 2006/0070139 para evento de milho DAS-59122-7. Poderia ser desejado ter um método simples e discriminativo para a identificação de evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[006] As modalidades da presente descrição referem-se a um novo evento de transformação de soja resistente a inseto e tolerante a herbicidas, designado evento de soja pDAB9582.816.15.1, que compreende cry1F v3 (cry1F), cry1Ac synpro (cry1 Ac) e pat v6 (pat), como descrito aqui, inseridos em um sítio específico dentro do genoma de uma célula de soja. A semente de soja representativa foi depositada com American Type Culture Collection (ATCC) com o No. de Acesso identificado no parágrafo [0033]. O DNA de plantas de soja contendo esse evento inclui as sequências de junção/flanqueamento descritas aqui que caracterizam a localização do DNA inserido dentro do geno- ma de soja. SEQ ID N°:1 e SEQ ID N°:2 são diagnósticas de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Mais particularmente, as sequências que circundam as junções em bp 1273/1274 de SEQ ID N°:1, e bp 175/176 e 316/317 de SEQ ID N°:2 são diagnosticas de evento de soja pDAB9582.816.15.1. O parágrafo [0012] abaixo descreve exemplos de sequências que compreendem essas junções que são características de DNA de sojas contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[007] Em uma modalidade, a descrição fornece uma planta de soja, ou parte dessa, que é resistente a Pseudoplusia includens (lagarta falsa-medideira) e que possui um genoma que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 11731373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses. Em outra modalidade, a descrição fornece a semente dessas plantas.
[008] Em outra modalidade, a descrição fornece um método para controlar insetos que compreende expor os insetos a plantas de soja resistentes a insetos, em que as plantas de soja possuem um genoma que contém uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses; essas são características da presença de evento de soja pDAB9582.816.15.1, para assim controlar os insetos. A presença dos genes cry1F v3 (cry1F) e cry1Ac synpro (cry1Ac) no evento de soja pDAB9582.816.15.1 confere resistência, por exemplo, a Pseudoplusia includens (lagarta falsa-medideira), Anti- carsia gemmatalis (velvetbean caterpillar), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoi- des, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spi- losoma virginica e Elasmopalpus lignosellus.
[009] Em outra modalidade, a descrição fornece um método para controlar ervas daninhas em uma cultura de soja que compreende aplicar o herbicida glufosinato à cultura de soja, a dita cultura de soja compreende plantas de soja que possuem um genoma contendo uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 11731373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos dessas, essas são diagnósticas da presença de evento de soja pDAB9582.816.15.1. A presença do gene pat no evento de soja pDAB9582.816.15.1 confere tolerância ao herbicida glufosi- nato.
[0010] Em outra modalidade, a descrição fornece um método para detectar o evento de soja pDAB9582.816.15.1 em uma amostra que compreende DNA de soja, sendo que o dito método compreende: (a) colocar a dita amostra em contato com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de flanqueamento dentro de bp 1-1273 de SEQ ID N°:1 ou o complemento dessa, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserção dentro de bp 1274-1577 de SEQ ID N°:1 ou o complemento dessa; e analisar um amplicon gerado entre os ditos iniciadores; ou (b) colocar a dita amostra em contato com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserção dentro de bp 1-175 de SEQ ID N°:2 ou o complemento dessa, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente à sequência de flanqueamento dentro de bp 176-1687 de SEQ ID N°:2 ou o complemento dessa; e (c) analisar um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
[0011] Em outra modalidade, a descrição fornece um método para detectar um evento de soja pDAB9582.816.15.1 que compreende: a) colocar a dita amostra em contato com um primeiro iniciador que se liga seletivamente a uma sequência de flanqueamento selecionada a partir do grupo que consiste em bp 1-1273 de SEQ ID N°:1 e bp 176-1687 de SEQ ID N°:2, e complementos desses; e um segundo iniciador que se liga seletivamente à SEQ ID N°:3, ou o complemento dessa b) submeter a dita amostra à reação em cadeia da polime- rase; c) analisar um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
[0012] Em outra modalidade a descrição fornece um método para reproduzir uma planta de soja que compreende: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de soja para produzir uma terceira planta de soja, sendo que a dita primeira planta compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses; e analisar a dita terceira planta de soja quanto a presença de DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses.
[0013] Em outra modalidade a descrição fornece uma molécula de DNA isolada que é diagnóstica de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Essas moléculas incluem, além de SEQ ID N°s: 1 e 2, moléculas de pelo menos 25 bp de comprimento que compreendem bp 1273-1274 de SEQ ID N°:1 e pelo menos 10 bp de SEQ ID N°:1 em cada direção de junção de bp 1273/1274; amplicons de pelo menos 25 bp de comprimento que compreendem 175 a 176 de SEQ ID N°:2 e pelo menos 10 bp de SEQ ID N°:2 em cada direção da junção de bp 175/176. Exemplos são bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses.
[0014] Em outra modalidade a descrição fornece um método para controlar pragas em grão, semente, ou farinha de semente de soja que compreende incluir o evento de soja pDAB9582.816.15.1 no dito grão, semente, ou farinha de semente como demonstrado pelo dito grão, semente, ou farinha de semente que compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses.
[0015] As modalidades da descrição também incluem células de planta de soja e partes de planta que incluem, mas sem se limitarem a, pólen, óvulo, flores, brotos, raízes e folhas, e núcleos de células vege- tativas, células de pólen, semente e farinha de semente, e células de óvulo, que contêm o evento de soja pDAB 9582.816.15.1.
[0016] Em algumas modalidades, o evento de soja pDAB 9582.816.15.1 pode ser combinado com outras características, inclusive, por exemplo, outro(s) gene(s) de tolerância a herbicida e/ou proteínas inibidoras de insetos e sequências reguladoras de transcrição (isto é, interferência de RNA, dsRNA, fatores de transcrição, etc.). As características adicionais podem ser empilhadas no genoma da planta através de reprodução de planta, re-transformação da planta transgênica contendo o evento de soja pDAB 9582.816.15.1, ou adição de novas características através de integração alvejada por recombinação homóloga.
[0017] Outras modalidades incluem a excisão de sequências de polinucleotídeo que compreendem o evento de soja pDAB9582.816.15.1, inclusive, por exemplo, o cassete de expressão de gene pat. Mediante a excisão de uma sequência de polinucleotídeo, o evento modificado pode ser re-alvejado em um sítio cromossômico específico em que sequências de polinucleotídeo adicionais são empilhadas com o evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[0018] Em uma modalidade, a presente descrição inclui um sítio alvo cromossômico de soja localizado no cromossomo 03 entre as sequências de flanqueamento apresentadas em SEQ ID N°s:1 e 2.
[0019] Em uma modalidade, a presente descrição inclui um método de produzir uma planta de soja transgênica que compreende inserir um ácido nucleico heterólogo em uma posição no cromossomo 03 entre as sequências genômicas apresentadas em SEQ ID N°s:1 e 2, isto é, entre bp 1-1273 de SEQ ID N°:1 e bp 176-1687 de SEQ ID N°:2.
[0020] Adicionalmente, as modalidades da descrição também fornecem análises para detectar a presença do evento em questão em uma amostra (de sojas, por exemplo). As análises podem ser baseadas na sequência de DNA da construção recombinante, inserida no genoma de soja, e nas sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção. Kits e condições úteis para conduzir as análises também são fornecidos.
[0021] As modalidades da descrição também se referem em parte à clonagem e análise das sequências de DNA das regiões de borda resultantes de inserção de T-DNA de pDAB9582 em linhagens de soja transgênica. Essas sequências são exclusivas. Com base nas sequências de inserção e junção, os iniciadores específicos de evento podem ser e foram gerados. A análise PCR demonstrou que esses eventos podem ser identificados por análise dos amplicons PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos de evento. Assim, esses e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar exclusivamente as linhagens de soja que compreendem o evento da descrição em questão.
[0022] Uma modalidade fornece um método para controlar insetos que compreende expor os insetos a plantas de soja resistentes a inseto, sendo que as ditas plantas de soja compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, sendo que a dita sequência é diagnóstica da presença de evento de soja pDAB9582.816.15.1, para então controlar os insetos.
[0023] Uma modalidade fornece um método para controlar Pseu- doplusia includens, Anticarsia gemmatalis, ou Spodoptera frugiperda que compreende expor Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmata- lis, Heliothis virescens, ou Spodoptera frugiperda a plantas de soja resistentes a insetos, sendo que as ditas plantas de soja compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2 e sendo que a sequência é diagnóstica da presença de evento de soja pDAB9582.816.15.1, para então controlar os insetos.
[0024] Uma modalidade fornece um método para controlar ervas daninhas em uma cultura de soja que compreende aplicar herbicida glufosinato à cultura de soja, sendo que a dita cultura de soja compreende plantas de soja que compreendem um DNA que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em sequência selecionada a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, sendo que a dita sequência é diagnóstica da presença de evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[0025] Uma modalidade fornece uma sequência de DNA isolada que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2.
[0026] Uma modalidade fornece um método para reproduzir uma planta de soja que compreende: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de soja para produzir uma terceira planta de soja, sendo que a dita primeira planta compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2 e complementos desses; e analisar a dita terceira planta de soja quanto à presença de DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses.
[0027] Uma modalidade fornece uma molécula de DNA isolada que compreende uma sequência de junção que compreende pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em bp 1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 11731373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses. Uma modalidade fornece uma planta de soja, ou parte dessa, que é resistente a Pseudoplusia includens (lagarta falsa-medideira) e compreende DNA que possui pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses.
[0028] Uma modalidade fornece uma composição derivada da planta de soja, ou partes dessa, em que a dita composição é um produto de base selecionado a partir do grupo que consiste em farelo de soja, farinha, concentrado de proteínas, e óleo.
[0029] Uma modalidade fornece um método para controlar pragas em grão, semente, farelo, ou farinha de soja que compreende incluir o evento de soja pDAB9582.816.15.1 no dito grão, semente, farelo, ou farinha como demonstrado pelo dito grão, semente, farelo, ou farinha que compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionada a partir do grupo que consiste em bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 1223-1323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses.
[0030] Uma modalidade fornece uma semente de soja que compreende em seu genoma uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em bp1258-1288 de SEQ ID N°:1; bp 12231323 de SEQ ID N°:1; bp 1173-1373 de SEQ ID N°:1; bp 1073-1473 de SEQ ID N°:1; bp 160-190 de SEQ ID N°:2; bp 125-225 de SEQ ID N°:2; e bp 75-275 de SEQ ID N°:2, e complementos desses. Uma modalidade adicional fornece uma semente de soja que compreende em seu genoma cry1F, cry1Ac, e pat de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e possui semente de soja representativa depositada com American Type Culture Collection sob N°. de Acesso PTA-12588. Uma modalidade adicional fornece uma planta de soja produzida ao desenvolver uma semente de soja dessas duas modalidades. Uma modalidade adicional fornece uma semente de soja produzida por essa planta de soja, em que a dita semente compreende em seu genoma os genes cry1F, cry 1Ac, e pat de evento de soja pDAB9582.816.15.1 que estão presentes em uma semente de soja depositada com American Type Culture Collection sob No. de Acesso PTA-12588. Uma modalidade adicional fornece uma parte dessa planta de soja, em que a dita parte é selecionada a partir do grupo que consiste em pólen, óvulo, flores, brotos, raízes, e folhas, e a dita parte compreende o dito evento. Uma modalidade adicional fornece uma composição derivada da planta de soja ou uma parte dessa, em que a dita composição é um produto de base selecionado a partir do grupo que consiste em farelo, farinha, e óleo de soja.
[0031] Em uma modalidade adicional, a planta de soja compreende uma sequência de DNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID N°:14. Uma modalidade fornece uma planta de soja progenitora da planta da modalidade acima, em que a dita planta exibe tolerância a um herbicida glufosinato, e a dita tolerância se deve à expressão de uma proteína codificada no dito evento ou dito genoma.
[0032] Uma modalidade adicional fornece uma semente de soja que compreende um genoma que compreende uma sequência de DNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID N°:14. Uma modalidade adicional fornece uma planta produzida ao desenvolver essa semente de soja.
[0033] Uma modalidade fornece uma planta de soja transgênica ou parte dessa que compreende o evento de soja pDAB9582.816.15.1, em que as sementes de soja representativas que compreendem o evento de soja pDAB9582.816.15.1 foram depositadas com American Type Culture Collection sob N°. de Acesso PTA-12588.
[0034] Como parte dessa descrição pelo menos 2500 sementes de uma linhagem de soja que compreende o evento de soja pDAB9582.816.15.1 foram depositadas e se tornaram disponíveis ao público sem restrição (porém, submetidas a direitos de patente), com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. O depósito, designado como Depósito ATCC No. PTA-12588, foi realizado em nome de Dow AgroSciences LLC em 23 de fevereiro de 2012. Esse depósito foi feito e será mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapeste em relação a depósitos de semente para os propósitos de procedimento de patente.
[0035] SEQ ID N°:1 é a sequência de borda de flanqueamento de DNA 5' de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Os nucleotídeos 11273 são sequências genômicas. Os nucleotídeos 1274-1577 são sequências de inserção.
[0036] SEQ ID N°:2 é a 3' sequência de borda de flanqueamento de DNA de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Os nucleotídeos 1-175 são sequências de inserção. Os nucleotídeos 176-316 consistem em uma sequência rearranjada de pDAB9582. Os nucleotídeos 317-1687 são sequências genômicas.
[0037] SEQ ID N°:3 é a sequência de DNA de cadeia T de pDAB9582, que é detalhada abaixo na Tabela 1.
[0038] SEQ ID N°:4 é um iniciador de oligonucleotídeo 81615_FW2 para a confirmação de DNA genômico de borda 5'.
[0039] SEQ ID N°:5 é um iniciador de oligonucleotídeo 81516_RV1 para a confirmação de DNA genômico de borda 3'.
[0040] SEQ ID N°:6 é um iniciador de oligonucleotídeo 81516_RV2 para a confirmação de DNA genômico de borda 3'.
[0041] SEQ ID N°:7 é um oligonucleotídeo 81516_RV3 para a confirmação de DNA genômico de borda 3'.
[0042] SEQ ID N°:8 é um iniciador de oligonucleotídeo 5'IREnd-01 para a confirmação de DNA genômico de borda 5'.
[0043] SEQ ID N°:9 é um iniciador de oligonucleotídeo 5'IREnd-02 para a confirmação de DNA genômico de borda 5'.
[0044] SEQ ID N°:10 é um iniciador de oligonucleotídeo AtU- bi10RV1 para a confirmação de DNA genômico de borda 5'.
[0045] SEQ ID N°:11 é um iniciador de oligonucleotídeo AtU-bi10RV2 para a confirmação de DNA genômico de borda 5'.
[0046] SEQ ID N°:12 é um iniciador de oligonucleotídeo 3'PATEnd05 para a confirmação de DNA genômico de borda 3'.
[0047] SEQ ID N°:13 é um iniciador de oligonucleotídeo 3'PATEnd06 para a confirmação de DNA genômico de borda 3' DNA.
[0048] SEQ ID N°:14 é a sequência esperada de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Inclusive a sequência de flanqueamento genômi- ca 5', inserção de cadeia T pDAB9582, e sequência de flanqueamento genômica 3'.
[0049] A Figura 1 é um mapa de plasmídeo de pDAB9582 contendo os cassetes de expressão de gene cry1F v3, cry1Ac synpro e pat v6.
[0050] A Figura 2 mostra as localizações de iniciador para confirmar a sequência de borda 5' e 3' do evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[0051] A Figura 3 mostra a disposição de sequência genômica no evento de soja pDAB9582.816.15.1 Descrição Detalhada da Invenção
[0052] Ambas as extremidades de inserção de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foram sequenciadas e caracterizadas. Análises específicas de evento foram desenvolvidas. O evento também foi mapeado no genoma de soja (cromossomo de soja 03). O evento pode ser introgredido em linhagens elite adicionais.
[0053] Conforme aludido à descrição acima na seção Antecedentes, a introdução e integração de um transgene em um genoma de planta envolve alguns eventos aleatórios (então, o nome "evento" para uma determinada inserção que é expressa). Isto é, com muitas técnicas de transformação como transformação de Agrobacterium, a transformação biolística (isto é, pistola de genes), e transformação medida por carboneto de silício (isto é, WHISKERS™), é imprevisível o local no genoma em que um será inserido. Assim, a identificação do DNA genômico vegetal de flanqueamento em ambos os lados da inserção pode ser importante para identificar uma planta que possui um determinado evento de inserção. Por exemplo, iniciadores de PCR podem ser projetados para gerar um amplicon PCR através da região de junção da inserção e do genoma hospedeiro. Esse amplicon PCR pode ser usado para identificar um único tipo ou tipo distinto de evento de inserção.
[0054] Definições e exemplos são fornecidos aqui para ajudar a descrever as modalidades da presente descrição e orientar os elementos versados na técnica para praticar essas modalidades. Exceto onde observado em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos elementos versados na técnica relativa. A nomenclatura de bases de DNA como apresentado em 37 CFR §1.822 é usada.
[0055] Como usado aqui, o termo "progênie" denota a descendên- cia de qualquer geração de uma planta de origem que compreende o evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[0056] Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido nucleico que inclui os transgenes de interesse, regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizado por inserção em um local de genoma particular. O termo "evento" se refere à transformante original e progênie da transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à progênie produzida por um cruzamento sexual aleatório entre o transformante e outra variedade, cuja progênie inclui o DNA genômico/transgene. Mesmo após o retrocruzamento repetido em um genitor recorrente, o DNA de transgene inserido e o DNA genômico de flanqueamento (DNA genômi- co/transgene) do genitor transformado está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" também se refere a DNA do transformante original e progênie, desse, que compreende o DNA inserido e a sequência genômica de flanque- amento imediatamente adjacente ao DNA inserido, que poderia ser esperado para ser transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido que inclui o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem de origem que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progênie resultante de autofecundação) e uma linhagem de origem que não contém o DNA inserido.
[0057] Uma "sequência de junção" ou "sequência de borda" transpõe o ponto no qual o DNA inserido no genoma é ligado ao DNA do genoma nativo de soja que flanqueia o ponto de inserção, a identificação ou detecção de uma ou as outras sequências de junção em um material genético de planta que é suficiente para ser diagnóstico do evento. As sequências de DNA que transpõem as inserções em eventos de soja descritos aqui e comprimentos similares de DNA de flan- queamento. Exemplos específicos dessas sequências diagnósticas são fornecidos aqui; entretanto, outras sequências que sobrepõem as junções das inserções, ou as junções das inserções e da sequência genômica, também são diagnósticas e poderiam ser usadas de acordo com as modalidades da descrição.
[0058] As modalidades da descrição se referem em parte à identificação de evento utilizando essas sequências de flanqueamento, junção, e inserção. Os iniciadores PCR e amplicons relacionados estão incluídos nas modalidades da descrição. De acordo com as modalidades da descrição em questão, métodos de análise PCR que utilizam amplicons que transpõem o DNA inserido e suas bordas podem ser usados para detectar ou identificar variedades ou linhagens de soja transgênica comercializadas das linhagens de soja específicas em questão.
[0059] As sequências de flanqueamento/junção são diagnósticas de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Com base nessas sequências, os iniciadores específicos de evento foram gerados. A análise PCR demonstrou que essas linhagens de soja podem ser identificadas em diferentes genótipos de soja por análise dos amplicons PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos de evento. Assim, es-ses e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar exclusivamente essas linhagens de soja. As sequências identificadas aqui são exclusivas.
[0060] Técnicas de detecção de modalidades da descrição em questão são especialmente úteis em conjunto com a reprodução de planta, para determinar que as plantas descendentes compreendem um determinado evento, após uma planta original que compreende um evento de interesse ser cruzada com outra linhagem de planta em uma tentativa de conferir uma ou mais características adicionais de interesse na progênie. Esses métodos de análise PCR beneficiam programas de reprodução de soja bem como controle de qualidade, especialmente para sementes de soja transgênica comercializada. Kits de detecção PCR dessas linhagens de soja transgênica também podem ser produzidos e usados. Isso também é benéfico para o registro de produto e administração de produto.
[0061] Ademais, as sequências de flanqueamento/genômicas de soja podem ser usadas para identificar especificamente a localização genômica de cada inserção. Essas informações podem ser usadas para produzir sistemas de marcador molecular específicos para cada evento. Essas podem ser usadas para estratégias de reprodução acelerada e para estabelecer dados de ligação.
[0062] Ademais, as informações de sequência de flanqueamento podem ser usadas para estudar e caracterizar processos de integração de transgene, características de sitio de integração genômica, classificação de evento, estabilidade de transgenes e suas sequências de flanqueamento, e expressão de gene (especialmente relacionada ao silenciamento de gene, padrões de metilação de transgene, efeitos de posição, e elementos relacionados à expressão potencial como MARS [regiões de ligação à matriz], e similares).
[0063] Devido à descrição em questão, deve ser evidente que as modalidades da descrição em questão incluem sementes disponíveis sob o No. de Depósito ATCC identificado no parágrafo [0033]. As modalidades da descrição também incluem uma planta de soja tolerante a herbicida desenvolvido a partir de uma semente depositada com o N°. de Depósito ATCC identificado no parágrafo [0033]. As modalidades da descrição também incluem partes da dita planta, como folhas, amostras de tecido, sementes produzidas pela dita planta, pólen, e similares (em que essas partes da planta compreendem cry1F, cry1Ac, pat, e SEQ ID NOS: 1 e 2).
[0064] Ademais, as modalidades da descrição também incluem plantas descendentes e/ou ancestrais de plantas desenvolvidas a partir da semente depositada, de preferência, uma planta de soja resistente a herbicida em que a dita planta possui um genoma que compreende uma sequência de junção/flanqueamento tipo selvagem detectável como descrito aqui. Como usado aqui, o termo "soja" significa Glycine max e inclui todas as variedades que podem ser reproduzidas com uma planta de soja.
[0065] Essa descrição inclui adicionalmente processos de produção de cruzamentos que utilizam uma planta da descrição em questão como pelo menos um genitor. Por exemplo, a descrição em questão inclui uma planta híbrida F1 que possui como um ou ambos os genitores qualquer uma das plantas exemplificadas aqui. Também dentro da descrição em questão, a semente é produzida por esses híbridos F1 da descrição em questão. Essa descrição inclui um método para produzir uma semente híbrida F1 ao cruzar uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, genitor endogâmico) e colher a semente híbrida resultante. A descrição em questão inclui uma planta exemplificada que é um genitor fêmea ou um genitor macho. As características das plantas resultantes podem ser aprimoradas por consideração cuidadosa das plantas originais.
[0066] Uma planta de soja resistente a insetos/tolerante a glufon- sinato da descrição em questão pode ser reproduzida primeiramente ao cruzar sexualmente uma primeira planta de soja original que consiste em uma planta de soja desenvolvida a partir de semente de qualquer uma das linhagens referidas aqui, e uma segunda planta de soja original, produzindo assim uma pluralidade de primeiras plantas; então selecionar uma primeira planta genitora que é resistente a glufosinato; autofecundar a primeira planta progenitora, produzindo assim uma plu- ralidade de segundas plantas progenitoras; e então selecionar a partir das segundas plantas progenitoras uma planta que é resistente a glu- fosinato. Essas etapas podem incluir adicionalmente o retrocruzamen- to da primeira planta progenitora ou da segunda planta progenitora com a segunda planta de soja original ou uma terceira planta de soja original. Uma cultura de soja que compreende sementes de soja da descrição em questão, ou progênie dessas, pode ser então plantada.
[0067] Também será entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser combinadas para produzir a descendência que contém dois genes exógenos independentemente segregantes adicionados. A autofecundação de progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas de ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta original e cruzamento aleatório com uma planta não transgênica também são contempladas, como a propagação vegetativa. Outros métodos de reprodução comumente usados para características e culturas diferentes são conhecidos na técnica. A reprodução por retrocruzamento foi usada para transferir genes para uma característica simplesmente herdável, altamente her- dável em um cultivar ou linhagem homozigota desejada, que é o progenitor recorrente. A origem da característica que será transferida é denominada genitor doador. Espera-se que planta resultante possua os atributos do genitor recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejada transferida a partir do genitor doador. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do genitor doador são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzados) com o genitor recorrente. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos do genitor recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejada transferida do genitor doador.
[0068] Também, uma planta de soja resistente a insetos/tolerante a glufosinato de uma modalidade da descrição pode ser transformada com transgenes adicionais utilizando métodos conhecidos na técnica. Técnicas de transformação como transformação de Agrobacterium, a transformação biolística (isto é, pistola de genes), e transformação mediada por carboneto de silício (isto é, WHISKERS™), podem ser usadas para trangene(s) adicional(is) introduzido(s) no genoma de evento de soja pDAB9582.816.15.1. A seleção e caracterização de plantas transgênicas contendo os transgenes recentemente inseridos podem ser concluídos para identificar plantas que contêm um integrante estável do novo transgene além de genes cry1F, cry1Ac, pat de modalidades da descrição.
[0069] As moléculas de DNA de modalidades da presente descrição podem ser usadas como marcadores moleculares em um método de reprodução assistida por marcadores (MAB). As moléculas de DNA de modalidades da presente descrição podem ser usadas em métodos (como, marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs, e SSRs) que identificam as características agronomicamente úteis geneticamente ligadas, como conhecido na técnica. As características de resistência a insetos e tolerância a herbicidas podem ser rastreadas na progênie de um cruzamento com uma planta de soja de modalidades da descrição em questão (ou progênie dessa e qualquer outro cultivar ou variedade de soja) utilizando os métodos MAB. As moléculas de DNA são marcadores dessa característica, e métodos MAB que são bem conhecidos na técnica podem ser usados para ras- trear a(s) característica(s) de tolerância a herbicidas em plantas de soja onde pelo menos uma linhagem de soja de modalidades da descrição em questão, ou progênie dessa, era um genitor ou ancestral. Os métodos de modalidades da presente descrição podem ser usados para identificar qualquer variedade de soja que possui o evento em questão.
[0070] As modalidades da descrição em questão incluem um mé- todo para produzir uma planta de soja resistente a insetos/tolerante as herbicidas em que o dito método compreende reprodução com uma planta que é incorporada dentro da descrição em questão. Mais especificamente, os ditos métodos podem compreender cruzar duas plantas incorporadas dentro da descrição em questão, ou uma planta in-corporada dentro da descrição em questão e qualquer outra planta. Os métodos preferidos compreendem adicionalmente selecionar a progê- nie do dito cruzamento ao analisar a dita progênie quanto a um evento detectável de acordo com uma modalidade da descrição em questão e um desempenho de variação favorável (por exemplo, rendimento). Por exemplo, as modalidades da descrição em questão podem ser usadas para rastrear o evento em questão através de ciclos de reprodução com plantas que compreendem outras características desejadas, como características agronômicas, tolerância ou resistência à doença, tolerância ou resistência a nematódeo e data de maturidade. As plantas que compreendem o evento em questão e a característica deseja-da pode ser detectada, identificada, selecionada, e rapidamente usada em séries adicionais de reprodução, por exemplo. O even- to/característica em questão também pode ser combinado através de reprodução, e rastreado de acordo com as modalidades da descrição em questão, com característica(s) resistente(s) a insetos adicional(is) e/ou com características de tolerância a herbicidas adicionais. As modalidades das últimas são plantas que compreendem o evento em questão combinado com os genes cry1F e cry1Ac, que conferem resistência a espécies de Lepidópteros, que incluem; Pseudoplusia inclu- dens (falsa medideira), Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar), Epinotia aporema, Omiodes indicata, Rachiplusia nu, Spodoptera fru- giperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis vires- cens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica e Elasmopalpus ligno- sellus.
[0071] Assim, as modalidades da descrição em questão podem ser combinadas, por exemplo, com características que codificam resistência a glifosato (por exemplo, planta resistente ou EPSPS, GOX, GAT bacteriano), resistência a glufosinato (por exemplo, dsm-2, bar), resistência a herbicida de inibição de acetolactato sintase (ALS)- (por exemplo, imidazolinonas [como imazetapir], sulfonilureias, triazolopiri- midina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, e outras químicas [Csr1, SurA, et al.]), resistência a bromoxinila (por exemplo, Bxn), resistência a inibidores de enzima HPPD (4-hidroxilfenil-piruvato-dioxigenase), resistência a inibidores de fitoeno desaturase (PDS), resistência a herbicidas inibidores de fotossistema II (por exemplo, psbA), resistência a herbicidas inibidores de fotossistema I, resistência a herbicidas inibidores de protoporfirinogênio oxidase IX (PPO) (por exemplo, PPO-1), resistência a herbicidas de fenilureia (por exemplo, CYP76B1), enzimas de degradação de dicamba (veja, por exemplo, US 20030135879), e outras poderiam ser empilhadas individualmente ou em múltiplas combinações para proporcionar a capacidade de controlar ou prevenir efetivamente mudanças na população de ervas daninhas e/ou resistência a qualquer herbicida das classes anteriormente mencionadas.
[0072] Adicionalmente, o evento de soja pDAB9582.816.15.1 pode ser combinado com uma ou mais características de entrada (por exemplo, resistência a insetos, resistência a patógenos, ou tolerância ao estresse, et al.) ou saída adicionais (por exemplo, rendimento aumentado, perfil de óleo aprimorado, qualidade de fibra melhorada, et al.). Assim, as modalidades da descrição em questão podem ser usa-das para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aprimorada com a capacidade de controlar de maneira flexível e econômica qualquer número de pragas agronômicas.
[0073] Os métodos para integrar uma sequência de polinucleotí- deo dentro de um sítio cromossômico específico de uma célula vegetal através de recombinação homóloga foram descritos dentro da técnica. Por exemplo, a integração sítio-específica como descrito na Publicação de Pedido de Patente No. US 2009/0111188 A1, aqui incorporada a título de referência, descreve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doadora em um alvo cromossômico. Ademais, o Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/021207, aqui incorporado a título de referência, descreve a recombinação homóloga mediada por dedos de zinco para integrar uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras dentro de locais específicos do genoma. O uso de recombinases como FLP/FRT conforme descrito na Patente No. US 6.720.475, aqui incorporada a título de referência, ou CRE/LOX como descrito na Patente No. US 5.658.772, aqui incorporada a título de referência, pode ser feito para integrar uma sequência de polinucleotídeo em um sítio cro- mossômico específico. Por fim, o uso de meganucleases para alvejar polinucleotídeos doadores em um local cromossômico específico foi descrito em Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060).
[0074] Outros métodos de integração sítio-específica dentro de células vegetais são geralmente conhecidos e aplicáveis (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159). Ademais, sistemas de recombinação sítio-específica que foram identificados em vários organismos procarióticos e eucarióticos inferiores podem ser aplicados para uso em plantas. Exemplos desses sistemas incluem, mas sem se limitarem a: o sistema de recombinase R/RS do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), e o sistema Gin/Gix de fago Mu (Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
[0075] Em algumas modalidades da presente descrição, deseja-se integrar ou empilhar um novo transgene em proximidade a um evento transgênico existente. O evento transgênico pode ser considerado um local genômico preferido que foi selecionado com base em características exclusivas como único sítio de inserção, segregação mendeliana normal e expressão estável, e uma combinação superior de eficácia, inclusive tolerância a herbicida e desempenho agronômico em e sobre múltiplos locais ambientais. As plantas progenitoras que compreendem os transgenes integrados devem manter as características de expressão de transgene dos transformantes existentes. Ademais, as plantas progenitoras que compreendem o evento integrado podem utilizar aná-lises anteriormente desenvolvidas para a detecção e confirmação, como as sequências de flanqueamento genômias e localização cromos- sômica de plantas progenitoras que compreendem o evento já são identificadas. Por fim, a integração de um novo transgene em um local cromossômico específico que está estreitamente ligado a um transgene existente poderia promover a introgressão dos transgenes em outros backgrounds genéticos por cruzamento sexual aleatório utilizando métodos de reprodução convencionais.
[0076] Em algumas da presente descrição, deseja-se excisar as sequências de polinucleotídeo de um evento transgênico. Por exemplo, a excisão de transgene como descrito na Publicação de Pedido de Patente No. US 2011/0191877, aqui incorporada a título de referência, descreve o uso de nucleases de dedos de zinco para remover uma sequência de polinucleotídeo, que consiste em um cassete de expressão de gene, de um evento transgênico cromossomicamente integrado. A sequência de polinucleotídeo que é removida pode ser um marcador selecionável. Mediante a excisão e remoção de uma sequência de polinucleotídeo, o evento transgênico modificado pode ser re- alvejado pela inserção de uma sequência de polinucleotídeo. A exci- são de uma sequência de polinucleotídeo e re-alvejamento subsequente do evento transgênico modificado fornecem vantagens como a reutilização de um marcador selecionável ou a capacidade de subme ter as mudanças não intencionais ao transcriptoma da planta que resulta da expressão de genes específicos.
[0077] Descreve-se aqui um sítio específico no cromossomo 03 no genoma de soja que pode ser usado para a inserção de ácidos nuclei- cos heterólogos. Desse modo, as modalidades da descrição em questão fornecem métodos para introduzir ácidos nucleicos heterólogos de interesse nesse sítio alvo pré-estabelecido ou nos arredores do sítio alvo. As modalidades da descrição em questão também incluem uma semente de soja e/ou uma planta de soja que compreende qualquer sequência nucleotídica heteróloga inserida no sítio alvo descrito ou nos arredores gerais desse sítio. Uma opção para realizar a integração alvejada é excisar e/ou substituir uma inserção diferente em vez do cassete de expressão pat exemplificado aqui. Nesse aspecto geral, a recombinação homóloga alvejada, por exemplo, e sem limitação, pode ser usada de acordo com as modalidades da descrição em questão.
[0078] Como usado aqui "empilhamento" de gene, evento ou característica se refere à combinação de características desejadas em uma linhagem transgênica. Os cultivadores de planas empilham as características transgênicas fazendo cruzamentos entre genitores que possuem uma característica desejada e então identificando a descendência que possui ambas as características desejadas. Outra maneira de empilhar os genes é transferir dois ou mais genes para dentro do núcleo da célula de uma planta ao mesmo tempo durante a transformação. Outra maneira de empilhar os genes é re-transformar uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, o empilhamento de gene pode ser usado para combinar duas ou mais características diferentes, inclusive, por exemplo, duas ou mais características de inseto diferentes, característica(s) de resistência a insetos e característica(s) de resistência a doenças, duas ou mais características de resistência a herbicida, e/ou característica(s) de resistência a insetos e característica(s) resistentes a herbicidas. O uso de um marcador selecionável além de um gene de interesse também pode ser considerado empilhamento gênico.
[0079] "Recombinação homóloga" se refere a uma reação entre qualquer par de sequências nucleotídicas que possui sítios correspondentes contendo uma sequência nucleotídica similar através da qual duas sequências nucleotídicas podem interagir (recombinar) para formar uma nova sequência de DNA recombinante. Os sítios de sequência nucleotídica similares são referidos aqui como uma "sequência homóloga." Geralmente, a frequência de recombinação homóloga aumenta à medida que o comprimento da sequência homóloga aumenta. Assim, embora a recombinação homóloga possa ocorrer entre duas sequências nucleotídicas que são menos que idênticas, a frequência de recombinação (ou eficiência) diminui à medida que a divergência entre as duas sequências aumenta. A recombinação pode ser realizada utilizando uma sequência homóloga em cada uma das moléculas doadoras e alvo, gerando assim um produto de recombinação de "crossover único". Alternativamente, duas sequências homólogas podem ser colocadas em cada uma das sequências nucleotídicas alvo e doadoras. A recombinação entre duas sequências homólogas no doador com duas sequências homólogas no alvo gera um produto de re- combinação de "crossover duplo". Se as sequências homólogas na molécula doadora flanquearem uma sequência que será manipulada (por exemplo, uma sequência de interesse), a recombinação de duplo crossover com a molécula alvo irá resultar em um produto de recombi- nação em que a sequência de interesse substitui uma sequência de DNA que estava originalmente entre as sequências homólogas na molécula alvo. A troca de sequência de DNA entre o alvo e doador através de um evento de recombinação de crossover duplo é denominada "substituição de sequência".
[0080] Uma planta, ou uma semente preferida de modalidades da descrição em questão compreende em seu genoma sequências nu- cleotídicas operativas cry1F, cry1Ac synpro e pat, como identificado aqui, juntamente com pelo menos 20 a 500 ou mais nucleotídeos de flanqueamento contíguos em ambos os lados da inserção, como definido aqui. Exceto onde indicado em contrário, uma referência a se-quências de flanqueamento se refere àquelas identificadas em relação a SEQ ID NOS: 1 e 2. Pode-se esperar que todas ou parte dessas sequências de flanqueamento sejam transferidas para a progênie que recebe o DNA inserido como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem genitora que inclui o evento.
[0081] As modalidades da descrição em questão incluem culturas de tecidos de células regeneráveis de uma planta de uma modalidade da descrição em questão. Também inclui-se uma planta regenerada de tal cultura de tecido, particularmente onde a dita planta é capaz de expressar todas as propriedades morfológicas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. As plantas preferidas de modalidades da descrição em questão possuem todas as características fisiológicas e morfológicas de uma planta desenvolvida a partir da semente depositada. As modalidades dessa descrição compreendem adicionalmente a progênie dessa semente e a semente com as características de qualidade de interesse.
[0082] Conforme usado aqui, uma "linhagem" é um grupo de plantas que exibem pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos para pelo menos uma característica. Essas linhagens podem ser criadas por várias gerações de autopolinização e seleção, ou propagação vegetativa de um único genitor utilizando técnicas de cultura de tecido ou célula.
[0083] Conforme usado aqui, os termos "cultivar" e "variedade" são sinônimos e se referem a uma linhagem que é usada para produ- ção comercial.
[0084] "Estabilidade" ou "estável" significa que em relação ao determinado componente, o componente é mantido de geração para geração e, de preferência, de pelo menos três gerações.
[0085] "Utilidade Comercial" é definida como ter vigor de planta satisfatório e alta fertilidade, de modo que a cultura possa ser produzida por cultivadores que utilizam um equipamento agrícola convencional, e o óleo com os componentes descritos pode ser extraído da semente utilizando um equipamento de esmagamento e extração convencional.
[0086] "Agronomicamente elite" significa que uma linhagem possui características agronômicas desejadas como rendimento, maturidade, resistência a doenças, e similares, além da resistência a insetos e tolerância a herbicida devido ao(s) evento(s) em questão. Quaisquer e todas essas características agronômicas e pontos de dados podem ser usadas para identificar essas plantas, como um ponto ou na extremidade ou ambas as extremidades de uma faixa de características usada para definir essas plantas.
[0087] Conforme um elemento versado na técnica irá reconhecer à luz dessa descrição, as modalidades preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores dirigidos e/ou compreendendo "sequências de junção" ou "sequências de transição" (onde a sequência de flanqueamento genômica de soja encontra a sequência de inserção). Por exemplo, isso inclui sondas polinucleotídi- cas, iniciadores, e/ou amplicons projetados para identificar uma ou ambas as sequências de junção (onde a inserção encontra a sequência de flanqueamento). Um desenho comum é ter um iniciador que se hibridiza à região de flanqueamento, e um iniciador que se hibridiza à inserção. Esses iniciadores possuem geralmente cerca de pelo menos ~15 resíduos de comprimento. Com essa disposição, os iniciadores podem ser usados para gerar/amplificar um amplicon detectável que indica a presença de um evento de uma modalidade da descrição em questão. Esses iniciadores podem ser usados para gerar um amplicon que transpõe (e inclui) uma sequência de junção como indicado acima.
[0088] O(s) iniciador(es) "touching down" na sequência de flan- queamento não é/são tipicamente desenhado(s) para se hibridizar além de cerca de 1200 bases ou muito além da junção. Assim, os ini-ciadores de flanqueamento típicos poderiam ser desenhados para compreender pelo menos 15 resíduos de cadeia dentro de 1200 bases nas sequências de flanqueamento a partir do início da inserção. Isto é, os iniciadores que compreendem uma sequência de um tamanho apropriado de (ou hibridização) pares de base 1 a 1273 de SEQ ID N°:1 e/ou pares de base 176 a 1687 de SEQ ID N°:2 estão dentro do escopo de modalidades da descrição em questão. Os iniciadores de inserção também podem ser desenhados em algum lugar na inserção, porém os pares de base 1273 a 1873 e 13058 a 13658 de SEQ ID N°:14, podem ser usados, por exemplo, de maneira não exclusiva para esse desenho de iniciador.
[0089] Um elemento versado na técnica também irá reconhecer que os iniciadores e sondas podem ser desenhados para se hibridizar, sob uma faixa de hibridização padrão e/ou condições PCR em que o iniciador ou a sonda não é perfeitamente complementar à sequência exemplificada. Isto é, algum grau de incompatibilidade ou degeneração pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotí- deos, por exemplo, tipicamente um ou dois ou mais nucleotídeos não precisam se ligar à cadeia oposta se a base não combinada estiver dentro ou no final do iniciador que é oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são fornecidas abaixo. Análogos de nucleotídeo sintéticos, como inosina, também podem ser usados em sondas. Sondas de ácido nucleico peptídico (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, também podem ser usadas. É importante que essas sondas e iniciadores sejam diagnósticas (capazes de identificar e distinguir unicamente) para a presença de um evento de uma modalidade da descrição em questão.
[0090] Deve ser observado que erros na amplificação PCR que podem ocorrer podem resultar em erros de sequenciamento menores, por exemplo. Isto é, exceto onde indicado em contrário, as sequências listadas aqui foram determinadas ao gerar amplicons longos de DNAs genômicos de soja, e então clonar e sequenciar os amplicons. Não é incomum encontrar ligeiras diferenças e menores discrepâncias em sequências geradas e determinadas dessa maneira, dadas as várias séries de amplificação que são necessárias para gerar amplicon suficiente para sequenciamento de DNAs genômicos. Um elemento versado na técnica deve reconhecer e notar que quaisquer ajustes necessários devido a esses tipos de erros ou discrepâncias de sequenci- amento comuns estão dentro do escopo de modalidades da descrição em questão.
[0091] Também deve ser observado que não é incomum que alguma sequência genômica seja deletada, por exemplo, quando uma sequência é inserida durante a criação de um evento. Assim, algumas diferenças também podem surgir entre as sequências de flanquea- mento e sequências genômicas em questão listadas em GENBANK, por exemplo.
[0092] Os componentes da "inserção" de sequência de DNA são ilustrados nas Figuras e são discutidos em mais detalhes abaixo nos Exemplos. As sequências de polinucleotídeo de DNA desses componentes, ou fragmentos desses, podem ser usadas como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos de modalidades da presente descrição.
[0093] Em algumas modalidades da descrição, as composições e métodos são fornecidos para detectar a presença da região de inser- ção de transgene/genômica, em plantas e sementes e similares, de uma planta de soja. As sequências de DNA fornecidas compreendem a sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica 5' em questão fornecida aqui (entre os pares de base 1 a 1273 de SEQ ID N°:1 e 1 a 1273 de SEQ ID N°:14), segmentos desses, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos des-sas. As sequências de DNA fornecidas compreendem a sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica 3' em questão fornecida aqui (entre os pares de base 176 a 1687 de SEQ ID N°:2 e 13659 a 15170 de SEQ ID N°:14), segmentos dessas, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos dessas. A sequência de junção de região de inserção transpõe a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de soja que flanqueia o sítio de inserção. Essas sequências podem ser diagnósticas do determinado evento.
[0094] Com base nessas sequências de inserção e borda, os iniciadores evento-específicos podem ser gerados. A análise PCR demonstrou que as linhagens de soja de modalidades da descrição em questão podem ser identificadas em genótipos de soja diferentes por análise dos amplicons PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores evento-específicos. Esses e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar exclusivamente as linhagens de soja que compreendem o evento de soja pDAB9582.816.15.1. Assim, amplicons PCR derivados desses pares de iniciadores são exclusivos e podem ser usados para identificar essas linhagens de soja.
[0095] Em algumas modalidades, as sequências de DNA que compreendem um fragmento contíguo da nova região de inserção de transgene/genômica são um aspecto dessa descrição. As sequências de DNA incluídas compreendem um comprimento suficiente de polinu- cleotídeos de sequência de inserção de transgene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência genômica de soja de uma ou mais das três plantas de soja e/ou sequências anteriormente mencionadas que são úteis como sequências iniciadoras para a produção de um produto amplicon diagnóstico de uma ou mais dessas plantas de soja.
[0096] As modalidades relacionadas pertencem a sequências de DNA que compreendem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais nucleotídeos contíguos de uma porção de transgene de uma sequência de DNA identificada aqui (como SEQ ID N°:1 e segmentos dessa), ou complementos dessa, e um comprimento similar de sequência de DNA de soja de flanqueamento dessas sequências, ou complementos dessas. Essas sequências são úteis como iniciadores de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos utilizando esses iniciadores são diagnósticos de qualquer um dos eventos de soja referidos aqui. Portanto, as modalidades da descrição também incluem os amplicons produzidos por esses iniciadores de DNA.
[0097] As modalidades dessa descrição também incluem métodos para detectar a presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de soja referido aqui. Esses métodos podem compreender: (a) colocar a amostra que compreende DNA em contato com um conjunto de iniciadores que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA de pelo menos um desses eventos de soja, produz um amplicon que é diagnóstico do(s) dito(s) evento(s); (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo assim o amplicon; e (c) detectando o amplicon.
[0098] Métodos de detecção adicionais de modalidades da descrição em questão incluem um método para detectar a presença de um DNA, em uma amostra, correspondente ao dito evento, em que o dito método compreende: (a) colocar a amostra que compreende DNA em contato com uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridiza- ção severas com DNA dos ditos eventos de soja e que não se hibridiza sob as condições de hibridização severas a uma planta de soja de controle (DNA não evento de interesse); (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização severas; e (c) detectar a hibridiza- ção da sonda no DNA.
[0099] Ainda em modalidades adicionais, a descrição em questão inclui métodos de produção de uma planta de soja que compreende o evento de soja pDAB9582.816.15.1 de uma modalidade da descrição em questão, em que o dito método compreende as etapas de: (a) cruzar sexualmente uma primeira linhagem de soja original (que compreende um cassete de expressão de uma modalidade da presente descrição, que confere tolerância a glufosinato às plantas da dita linha-gem) e uma segunda linhagem de soja original (que é desprovida dessa característica de tolerância a herbicida) produzindo assim uma pluralidade de características de progênie; e (b) selecionar uma planta progenitora pelo uso de marcadores moleculares. Esses métodos podem compreender opcionalmente a etapa adicional de retrocruzamen- to da planta progenitora com a segunda linhagem de soja original para produzir uma planta de soja de reprodução verdadeira que compreende a característica resistente a insetos e tolerante a glufosinato.
[00100] De acordo com outro aspecto da descrição, proporcionam- se métodos para determinar a zigosidade de progênie de um cruzamento com o dito evento. Os ditos métodos podem compreender colocar uma amostra, que compreende DNA de soja, em contato com um conjunto de iniciadores de uma modalidade da descrição em questão. Os ditos iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de ditos eventos de soja, produzem um primeiro amplicon que é diagnóstico dos ditos eventos de soja. Esses métodos compreendem ainda realizar uma reação de ampli- ficação de ácido nucleico, produzindo o primeiro amplicon; detectar o primeiro amplicon; e colocar a amostra que compreende DNA de soja em contato com um segundo conjunto de iniciadores (o dito segundo conjunto de iniciadores, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de plantas de soja, produz um segundo amplicon que compreende uma sequência endógena do DNA genômico de soja nativo que não contém a sequência de polinucleotí- deo do dito evento); e realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo assim o segundo amplicon. Os métodos compreendem adicionalmente detectar o segundo amplicon, e comparar os primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos os amplicons indica a zigosidade da inserção de transgene.
[00101] Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos utilizando as composições descritas aqui e métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação do evento de DNA em questão de soja em uma amostra e podem ser aplicados a métodos para reprodução de plantas de soja contendo esse DNA. Os kits contêm sequências de DNA complementares aos amplicons, por exemplo, descritas aqui, ou a sequências de DNA complementares ao DNA contido nos elementos genéticos de transgene dos eventos em questão. Essas sequências de DNA podem ser usadas em reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits também podem conter os reagentes e materiais necessários para o desempenho do método de detecção.
[00102] Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucleico isolada à qual um marcador detectável ou molécula repórter é ligado (como um isótopo radioativo, ligante, agente quimiluminescente, ou enzima). Essa sonda pode se hibridizar a uma cadeia de um ácido nucleico alvo, no caso de modalidades da presente descrição, em um filamento de DNA genômico de um dos ditos eventos de soja, seja de uma planta de soja ou de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas de acordo com as modalidades da presente descrição incluem não só ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, porém também poliami- das e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.
[00103] Os "iniciadores" são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são anelados em um filamento de DNA por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, então estendidos ao longo do filamento de DNA alvo por uma po- limerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Os pares de iniciadores de modalidades da presente descrição se referem a seu uso para amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos de amplifi-cação de ácido nucleico convencionais.
[00104] As sondas e iniciadores possuem geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, ou 1.000, ou 2.000, ou 5.000 polinucleo- tídeos ou mais de comprimento. Essas sondas e iniciadores se hibridi- zam especificamente a uma sequência alvo sob condições severas. De preferência, as sondas e iniciadores de acordo com as modalidades da presente descrição possuem similaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora sondas diferentes da sequência alvo e que mantêm a capacidade de hibridização em sequências alvo possam ser desenhadas por métodos convencionais.
[00105] Os métodos de preparação e uso de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Ma nual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Os pares de iniciadores de PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, utilizando programas de computador para esse propósito.
[00106] Os iniciadores e sondas baseados nas sequências de flan- queamento e sequências de inserção descritos aqui podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências descritas por métodos convencionais, por exemplo, por re-clonagem e sequencia- mento dessas sequências.
[00107] As sondas e iniciadores de ácido nucleico de modalidades da presente descrição se hibridizam sob condições severas a uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas ou fragmentos de ácido nucleico ou dessas são capazes de hibridização específica em outras moléculas de ácido nucleico sob determinadas circunstâncias. Conforme usado aqui, diz-se que duas moléculas de ácido nucleico são capazes de hibridização específica se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nu- cleico de cadeia dupla antiparalela. Diz-se que uma molécula de ácido nucleico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se essas exibirem complementaridade completa. Conforme usado aqui, diz-se que as moléculas exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. As moléculas que exibem complementaridade completa geralmente irão se hibridizar umas às outras com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas sob condições "de alta estringência" convencionais. As condições de alta estringência convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989.
[00108] Diz-se que duas moléculas exibem "complementaridade mínima" se essas puderem se hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma à outra pelo menos sob condições "de baixa estringência" convencionais. As condições de baixa estringência convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989. Para que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda essa precisa apenas exibir complementaridade mínima de sequência para ser capaz de formar uma estrutura de cadeia dupla estável sob as concentrações de solvente e sal particulares empregadas.
[00109] O termo "condição severa" ou "condições de estringência" é funcionalmente definido em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucleico a um ácido nucleico alvo (isto é, a uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) através do procedimento de hi- bridização específico discutido em Sambrook et al., 1989, em 9.529.55. Veja também, Sambrook et al., 1989 em 9,47-9,52 e 9,56-9,58.
[00110] Dependendo da aplicação prevista, alguém pode usar condições variadas de condições severas ou degeneração de sequência de polinucleotídeo de uma sonda ou iniciador para alcançar graus variados de seletividade de hibridização em relação à sequência alvo. Para aplicações que exigem alta seletividade, uma pessoa irá empregar tipicamente condições relativamente severas para a hibridização de uma sequência de polinucleotídeo com uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, alguém irá selecionar condições de teor de sal relativamente baixo e/ou alta temperatura, como fornecido por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCl a temperaturas de cerca de 50° C a cerca de 70° C. As condições severas, por exemplo, poderiam envolver lavar o filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta estringência (0,2X SSC, 0,1% SDS, 65° C). As condições de estringência apropriadas que promovem a hibridiza- ção de DNA, por exemplo, 6,0X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45° C, seguido por uma lavagem de 2,0X SSC a 50° C são conhecidas pelos elementos versados na técnica. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa estringência de cerca de 2,0X SSC a 50° C a uma alta estringência de cerca de 0,2X SSC a 50° C. Ademais, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22° C, a con-dições de alta estringência a cerca de 65° C. A temperatura e concentração de sal podem ser variadas, ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é alterada. Essas condições seletivas toleram pouca, se alguma, incompatibilidade entre a sonda e o modelo ou cadeia alvo. A detecção de sequências de DNA através de hibridização é bem conhecida pelos versados na técnica, e as instruções de Patente Nos. U.S. 4.965.188 e 5.176.995 são exemplificativas dos métodos de análises de hibridiza- ção.
[00111] Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucleico de uma modalidade da presente descrição irá se hibridizar especificamente a um ou mais iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados ou sugeridos aqui, inclusive complementos e fragmentos desses, sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente descrição, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente descrição possui a sequência de ácido nucleico como apresentado aqui em uma das sequências exemplificadas, ou complementos e/ou fragmentos dessas.
[00112] Em outro aspecto da presente descrição, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente descrição compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com essas sequências de ácido nucleico. Em um aspecto adicional da presente descrição, uma molécula de ácido nucleico marca- dora de uma modalidade da presente descrição compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com essa sequência. Essas sequências podem ser usadas como marcadores em métodos de reprodução de plantas para identificar a progênie de cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada por inúmeros métodos conhecidos pelos elementos versados na técnica; esses podem incluir, mas sem se limitarem a, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, marcadores à base de anticorpos, e marcadores quimiluminescentes.
[00113] Em relação à amplificação de uma sequência de ácido nu- cleico alvo (por exemplo, por PCR) que utiliza um par de iniciadores de amplificação particular, "condições severas" são condições que permitem que o par de iniciadores se hibridize apenas à sequência de ácido nucleico alvo à qual um iniciador que possui a sequência tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) poderia se ligar e, de preferência, para produzir um produto de amplificação exclusivo, o amplicon.
[00114] O termo "específico de (uma sequência alvo)" indica que uma sonda ou iniciador se hibridiza sob condições de hibridização severas apenas à sequência alvo em uma amostra que compreende a sequência alvo.
[00115] Conforme usado aqui, "DNA amplificado" ou "amplicon" se refere ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucleico alvo que é parte de um modelo de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de soja resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico de evento transgênico da planta de soja de uma modalidade da presente descrição, o DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de soja pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucleico que utiliza um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado de sequência de flanquea- mento no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção de DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA heteró- logo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico da presen- ça do DNA de evento. O amplicon possui um comprimento e uma se- quência que também são diagnósticos do evento. O amplicon pode variar em comprimento a partir do comprimento combinado dos pares de iniciadores e mais um par de bases nucleotídicas, e/ou o compri- mento combinado dos pares de iniciadores mais cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500, 750, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, ou mais pares de bases nucleotídicos (mais ou menos qualquer um dos incrementos mencionados acima). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado de sequência de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido para produzir um amplicon que inclui toda a sequência nucleotídica de inserção. Um membro de um par de iniciadores derivado da sequência genômica da planta pode ficar localizado a uma distância da sequência de DNA inserida. Essa distância pode variar de um par de bases nucleotídicas até cerca de vinte mil pares de bases nucleotídicas. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.
[00116] A amplificação de ácido nucleico pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, inclusive a reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e é descrita, inter alia, na Patente No. U.S. 4.683.195 e Patente No. U.S. 4.683.202. Os métodos de amplificação PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Esses métodos são bem conhecidos como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática de modalidades da presente descrição. A sequência da inserção de DNA de transgene heterólogo ou sequência genômica de flanqueamento de um evento em questão de soja pode ser verificada (e corrigida se necessário) ao amplificar essas sequências a partir do evento utilizando iniciadores derivados das sequências fornecidas aqui seguido por sequenciamen- to de DNA padrão do amplicon de PCR ou do DNA clonado.
[00117] O amplicon produzido por esses métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio consistem em um método bem conhecido comum de detectar amplicons de DNA. Outro método é Genetic Bit Analysis, onde um oligonucleotídeo de DNA é desenhado para sobrepor a sequência de DNA genômica de flanqueamento adjacente e a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de micropoços. Após a PCR da região de interesse (utilizando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento adjacente), um produto de PCR de cadeia simples pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado e serve como um modelo para uma reação de extensão de base única utilizando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados específicos para a próxima base esperada. A análise de um produto ligado pode ser concluída através de quantificação da quantidade de sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inser- ção/flanqueamento devido à amplificação, hibridização, e extensão de base única bem-sucedidas.
[00118] Outro método é a técnica de Pirosequenciamento como descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Nesse método, um oligonucleotídeo é desenhado para sobrepor o DNA genômi- co adjacente e a junção de DNA de inserção. O oligonucleotídeo é de- senhado para se hibridizar ao produto de PCR de cadeia simples da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência de inserção de transge- ne/flanqueamento devido à amplificação bem-sucedida, hibridização, e extensão de única base ou múltiplas bases.
[00119] A Polarização de Fluorescência é outro método que pode ser usado para detectar um amplicon de uma modalidade da presente descrição. Seguindo-se esse método, um oligonucleotídeo é desenhado para sobrepor o flanqueamento genômico e a junção de DNA inserida. O oligonucleotídeo é hibridizado ao produto de PCR de cadeia simples da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genômico de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado fluorescente. A extensão de base única resulta na incorporação de ddNTP. A incorporação de ddNTP fluorescentemente marcado pode ser medida como uma mudança na polarização utilizando um fluorímetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência de inserção de trans- gene/flanqueamento devido à amplificação bem-sucedida, hibridiza- ção, e extensão de base única.
[00120] TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é desenhada para sobrepor a junção de DNA genômica de flanqueamento e de inserção. A sonda FRET e iniciadores PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanque- amento) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Durante a amplificação específica, o mecanismo de revisão de DNA polimerase Taq libera a porção fluorescente da porção de têmpera na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento/inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas.
[00121] Sinais moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência de polinucleotídeo. Brevemente, uma sonda de oligonu- cleotídeo FRET é desenhada para sobrepor a junção de DNA genômi- ca de flanqueamento e inserção. A estrutura exclusiva da sonda FRET resulta em conter uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e temperadas em estreita proximidade. A sonda FRET e iniciadores PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação PCR bem-sucedida, a hibridização da sonda FRET à sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária de sonda e separação espacial das porções fluorescentes e temperadas. Um sinal fluorescente é produzido. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômi- ca de flanqueamento/inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas.
[00122] Mediante a descrição de um local no genoma de soja que é excelente para uma inserção, as modalidades da descrição em questão também compreendem uma semente de soja e/ou uma planta de soja que compreende pelo menos uma inserção de evento de não soja pDAB9582.816.15.1 nos arredores gerais desse local genômico. Uma opção é substituir uma inserção diferente em vez de uma do evento de soja pDAB9582.816.15.1 exemplificado aqui. Em geral, a recombina- ção homóloga alvejada, por exemplo, é empregada em modalidades particulares. Esse tipo de tecnologia é o assunto, por exemplo, de WO 03/080809 A2 e o pedido US publicado correspondente (US 20030232410). Assim, as modalidades da descrição em questão incluem plantas e células vegetais que compreendem uma inserção he- teróloga (em vez de ou com múltiplas cópias dos genes cry1F, cry1Ac, ou pat), flanqueada por todas ou uma parte reconhecível das sequências de flanqueamento identificadas aqui (bp 1-1273 de SEQ ID N°:1 e bp 176-1687 de SEQ ID N°:2). Uma cópia adicional (ou cópias adicionais) de um cry1F, cry1Ac, ou pat também poderia ser alvejada para a inserção dessa(s) maneira(s).
[00123] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidos ou citados aqui são incorporados a título de referência em sua totalidade na medida em que não são inconsistentes com as instruções explícitas desse relatório descritivo. Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar os procedimentos para praticar as modalidades da descrição e demonstrar determinadas modalidades preferidas da descrição. Esses exemplos não devem ser interpretados como limitativos. Deve ser avaliado pelos elementos versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos a seguir representam abordagens específicas usadas para ilustrar modos preferi-dos para sua prática. Entretanto, os elementos versados na técnica devem avaliar, à luz da presente descrição, que muitas mudanças podem ser feitas nessas modalidades específicas enquanto ainda obtêm resultados semelhantes ou similares sem abandonar o espirito e escopo da descrição. Exceto onde indicado em contrário, todas as porcentagens são expressas em peso e todas as proporções de mistura de solventes são expressas por volume exceto onde observado em contrário.
[00124] As seguintes abreviações são usadas exceto onde indicado em contrário. bp pares de bases °C graus Celsius DNA ácido desoxirribonucleico EDTA ácido etilenodiamina tetraacético kb quilobase μg microgramas μL microlitros mL mililitros M massa molar PCR reação em cadeia da polimerase PTU unidade de transcrição vegetal ou cassete de expressão SDS dodecil sulfato de sódio SSC uma solução tampão contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 7,0 TBE uma solução tampão contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA, pH 8,3.
[00125] A soja transgênica (Glycine max) contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi gerada através de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de nó cotiledonar de soja. A cepa desarmada Agrobacterium EHA101 (Hood et al., 1993), contendo o vetor binário pDAB9582 (Figura 1) contendo o marcador selecionável, pat v6, e os genes de interesse, cry1F v3 e cry1 Ac synpro, dentro da região de DNA de cadeia T, foi usada para iniciar a transformação. A sequência de DNA de cadeia T de pDAB9582 é fornecida em SEQ ID N°:3, que é explicada abaixo na Tabela 1. TABELA 1. Elementos genéticos localizados em pDAB9582.
[00126] A transformação mediada por Agrobacterium foi realizada utilizando um procedimento modificado de Zeng et al. (2004). Brevemente, as sementes de soja (cv Maverick) foram germinadas em meio basal e os nós cotiledonares foram isolados e infectados com Agrobacterium. A iniciação dos ramos, alongamento de ramos, e os meios de enraizamento foram suplementados com cefotaxime, timen- tina e vancomicina para a remoção de Agrobacterium. A seleção de glufosinato foi empregada para inibir o crescimento de ramos não transformados. Os ramos selecionados foram transferidos para o meio de enraizamento para desenvolvimento radicular e então transferidos para a mistura de solo para aclimatização de plântulas.
[00127] Os folíolos terminais de plântulas selecionadas tiveram a folha pintada com glufosinato para analisar os transformantes putativos. As plântulas analisadas foram transferidas para a estufa, deixadas aclimatar e então a folha foi pintada com glufosinato para reconfirmar a tolerância e consideradas transformantes putativas. As plantas analisadas foram amostradas e análises moleculares para a confirmação do gene marcador selecionável e/ou do gene de interesse foram realizadas. As plantas T0 foram deixadas autofertilizar na estufa para originar a semente T1.
[00128] Esse evento, evento de soja pDAB9582.816.15.1, foi gerado a partir de um isolado transformado independente. As plantas T1 foram retrocruzadas e introgredidas em variedades elite ao longo de gerações subsequentes. O evento foi selecionado com base em suas características exclusivas como sítio de inserção única, segregação mendeliana normal, expressão estável, e uma combinação superior de eficácia, inclusive resistência a insetos, tolerância a herbicidas e desempenho agronômico. Os seguintes exemplos contêm os dados que foram usados para caracterizar o evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00129] As propriedades bioquímicas das proteínas recombinan- tes Cry1F, Cry1Ac, e PAT expressas no evento de soja pDAB9582.816.15.1 foram caracterizadas. O ensaio de imunoad- sorção ligado à enzima quantitativa (ELISA) é um ensaio bioquímico conhecido dentro da técnica que pode ser usado para caracterizar as propriedades bioquímicas das proteínas e confirmar a expressão dessas proteínas no evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00130] As amostras de tecidos de soja foram isoladas das plantas de teste e preparadas para análise de expressão. A proteína PAT foi extraída de tecidos de planta de soja com uma solução salina tampo- nada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) contendo 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA). O tecido vegetal foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com o tampão apropriado conforme necessário, e analisado utilizando um kit PAT ELISA em um formato de sanduíche. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Envirologix, Portland, ME). O ensaio mediu as concentrações de proteína PAT expressa.
[00131] A proteína Cry1F foi extraída de tecidos de planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST). O tecido vegetal foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com o tampão apropriado como necessário, e analisado utilizando um kit Cry1F ELISA em um formato de sanduíche. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Esse mediu as concentrações de proteína Cry1F expressa.
[00132] A proteína Cry1Ac foi extraída de tecidos de planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) contendo 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA). O tecido vegetal foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com o tampão apropriado como necessário, e analisado utilizando um kit Cry1Ac ELISA em um formato de sanduíche. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Esse ensaio mediu as concentrações de proteína Cry1Ac expressa.
[00133] A análise de detecção foi realizada para investigar a estabi- lidade e herdabilidade de expressão tanto de maneira vertical (entre gerações) como horizontal (entre linhagens dentro de uma geração) no evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00134] Os níveis de proteínas Cry1F, Cry1Ac e PAT foram determinados em evento de soja pDAB9582.816.15.1 utilizando os protocolos descritos acima. As proteínas extraíveis solúveis foram medidas utilizando um método de ensaio de imunoadsorção ligado à enzima quantitativo (ELISA) de tecido de folha de soja. A partir de evento de soja pDAB9582.816.15.1 de gerações T2 a T6, a expressão é estável (não segregante) e consistente em todas as linhagens. A Tabela 2 menciona o nível de expressão médio das proteínas transgênicas no evento de soja pDAB9582.816.15.1.TABELA 2. Nível de expressão médio de proteínas transgênicas diferentes em evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00135] Para caracterizar e descrever o sítio de inserção genômico, a sequência das regiões de borda de T-DNA genômicas de flanquea- mento de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi determinada. A sequência genômica de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi confirmada, compreendendo 1273 bp de sequência de borda de flanqueamento 5' (SEQ ID N°:1) e 1371 bp de sequência de borda de flanqueamento 3' (SEQ ID N°:2). A amplificação PCR baseada nas sequências de borda de evento de soja pDAB9582.816.15.1 validou que as regiões de borda eram de origem de soja e que as regiões de junção são sequências exclusivas para o evento de soja pDAB9582.816.15.1. As regiões de junção poderiam ser usadas para a identificação evento- específica de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Ademais, o sítio de inserção de cadeia T foi caracterizado ao amplificar um fragmento ge- nômico correspondente à região das sequências de borda de flanque- amento identificadas do genoma de soja não transformada. A comparação de evento de soja pDAB9582.816.15.1 com a sequência genô- mica não transformada revelou que uma deleção de cerca de 21 bp do local original ocorreu durante a integração de cadeia T. De forma ge-ral, a caracterização da sequência de inserção e borda de evento de soja pDAB9582.816.15.1 indicou que uma cópia intacta da cadeia T de pDAB9582 estava presente no genoma de soja.
[00136] As bordas de flanqueamento 5' e 3' alinhadas com uma sequência de genoma shotgun completa Glycine max de cromossomo 03, indicando que o transgene de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi inserido no cromossomo de genoma de soja 03. Para confirmar o sítio de inserção de evento de soja pDAB9582.816.15.1 do genoma de soja, PCR foi realizada com pares iniciadores diferentes (Figura 2, Tabela 3, Tabela 4, e Tabela 5). O DNA genômico de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e outras linhagens de soja transgênicas ou não transgênicas foi usado como um modelo. Para confirmar que as sequências de borda 5' estão corretas, um iniciador desenhado para se ligar ao elemento de gene promotor At Ubi10, por exemplo, AtUbi10RV1, e um iniciador desenhado para se ligar à borda de extremidade 5' clonada no cromossomo de genoma de soja 03, designado 81615_FW2, foi usado para amplificar o segmento de DNA que transpõe o elemento de gene promotor At Ubi10 à sequência de borda de extremidade 5'. Similarmente, para a confirmação da sequência de borda clonada 3', um iniciador específico pat, por exemplo, 3'PATEnd05, e iniciadores desenhados de acordo com a sequência de borda de extremidade clo- nada 3', designada 81615_RV1 e 81615_RV2, foram usados para amplificar segmentos de DNA que transpõem o gene pat à sequência de borda 3'. Os fragmentos de DNA com tamanhos esperados foram amplificados apenas a partir do DNA genômico de evento de soja pDAB9582.816.15.1 com cada par de iniciadores, porém não de amostras de DNA de outras linhagens de soja transgênicas ou o controle não transgênico. Os resultados indicam que as sequências de borda clonadas 5' e 3' são as sequências de borda de flanquea- mento da inserção de cadeia T de evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00137] Para confirmar adicionalmente a inserção de DNA no ge- noma de soja, uma amplificação PCR que transpõe as sequências de borda de soja foi concluída no DNA genômico que não continha a inserção de cadeia T de evento de soja pDAB9582.816.15.1. O iniciador 81615_FW2, desenhado de acordo com a sequência de borda de extremidade 5', e um iniciador 81615_RV3, desenhado para a sequência de borda de extremidade 3', foram usados para amplificar os segmentos de DNA que continham o local onde a cadeia T pDAB9582 foi integrada. Conforme esperado, as reações PCR concluídas com o par de iniciadores de 81615_FW2 e 81615_RV3 produziram um fragmento de DNA de aproximadamente 1,8 kb a partir de todas as outras linhagens de controle de soja, porém não pDAB9582.816.15.1. O alinhamento das sequências de borda 5' e 3' identificadas de evento de soja pDAB9582.816.15.1 com uma sequência de genoma shotgun completa Glycine max de cromossomo 03 revelou cerca de 21 bp de deleção do local original. (Figura 3). Esses resultados demonstraram que o transgene de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi inserido no sítio de cromossomo de genoma de soja 03.
[00138] Análise Southern blot foi usada para estabelecer o padrão de integração de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Esses experimentos geraram dados que demonstraram a integração e integridade dos transgenes cry1Ac e cry1F dentro do genoma de soja. O evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi caracterizado como um evento de integração simples de comprimento total que contém uma única cópia de PTU de cry1Ac e cry1F de plasmídeo pDAB9582.
[00139] Dados de Southern blot sugeriram que um fragmento de cadeia T foi inserido no genoma de evento de soja pDAB9582.816.15.1. A análise Southern blot detalhada foi conduzida utilizando sondas específicas para o gene cry1Ac e cry1F, contidas na região de integração de cadeia T de pDAB9582.816.15.1, e enzimas de restrição descritivas que possuem sítios de clivagem localizados dentro do plasmídeo e produzem fragmentos de hibridização dentro do plasmídeo ou fragmentos que transpõem a junção do plasmídeo com DNA genômico de soja (fragmentos de borda). Os pesos moleculares indicados a partir da hibridização Southern para a combinação da enzima de restrição e a sonda eram exclusivos do evento, e estabeleceram seus padrões de identificação. Essas análises também mostraram que o fragmento de plasmídeo foi inserido no DNA genômico de soja sem rearranjos de cry1Ac e cry1F PTU.
[00140] O DNA genômico foi extraído do tecido foliar colhido de plantas de soja individuais contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1. Ademais, o gDNA foi isolado de uma planta de soja convencional, Maverick, que contém o background genético que é representativo da linhagem de substância, sem os genes cry1Ac e cry1F. O DNA genômico individual foi extraído de tecido foliar liofiliza- do seguindo o método CTAB padrão. Após a extração, o DNA foi quantificado de maneira espectrofluorométrica utilizando o reagente Pico Green (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[00141] Para a caracterização molecular Southern blot de evento de soja pDAB9582.816.15.1, dez microgramas (10 μg) de DNA genômico foram digeridos. O DNA genômico do evento de soja pDAB9582.816.15.1 e da linhagem de soja não transgênica Maverick foi digerido ao adicionar aproximadamente cinco unidades de enzima de restrição selecionadas por μg de DNA e o tampão de reação correspondente a cada amostra de DNA. Cada amostra foi incubada a aproximadamente 37°C de um dia para o outro. As enzimas de restrição AseI, HindIII, NsiI, e NdeI foram usadas individualmente para digestões únicas (New England Biolabs, Ipswich, MA). As enzimas de restrição NotI e ApaLI foram usadas em conjunto para uma digestão dupla (New England Biolabs, Ipswich, MA). Ademais, uma positive amostra de controle de hibridização foi preparada ao combinar o DNA de plasmídeo, pDAB9582 com DNA genômico da variedade de soja não transgênica, Maverick. O coquetel de DNA de plasmídeo/DNA ge- nômico foi digerido utilizando os mesmos procedimentos e enzima de restrição que as amostras de teste.
[00142] Após as digestões serem incubadas de um dia para o outro, 25μL de solução Quick-Precip Plus (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) foram adicionados e as amostras de DNA digeridas foram precipitadas com isopropanol. O pélete de DNA precipitado foi ressuspenso em 15 μL de 1X de tampão de carregamento (0,01% de azul de bro- mofenol, 10,0 mM de EDTA, 10,0% de glicerol, 1,0 mM de Tris pH 7,5). As amostras de DNA e marcadores de tamanho molecular foram então eletroforadas através de 0,85% de géis de agarose com 0,4X de tampão TAE (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) em 35 volts durante aproximadamente 18 a 22 horas para realizar a separação de fragmento. Os géis foram coloridos com brometo de etídio (Invitrogen, Car-lsbad, CA) e o DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV).
[00143] A análise Southern blot foi realizada essencialmente como descrito por Memelink, et al. (1994). Brevemente, após a separação eletroforética e visualização dos fragmentos de DNA, os géis foram depurinados com 0,25M de HCl durante aproximadamente 20 minutos, e então expostos a uma solução desnaturante (0,4 M de NaOH, 1,5 M de NaCl) durante aproximadamente 30 minutos seguido por solução neutralizante (1,5 M de NaCl, 0,5 M de Tris pH 7,5) durante pelo me- nos 30 minutos. A transferência Southern foi realizada de um dia para o outro em membranas de náilon utilizando um sistema de absorção com 10X SSC. Após a transferência, o DNA foi ligado à membrana por reticulação UV seguido por breve lavagem de membrana com uma solução 2X SSC. Esse processo produziu membranas Southern blot prontas para hibridização.
[00144] Os fragmentos de DNA ligados à membrana de náilon foram detectados utilizando uma sonda marcada (Tabela 6). As sondas foram geradas por uma incorporação baseada em PCR de um nucleo- tídeo marcado com digoxigenina (DIG), [DIG-11]-dUTP, no fragmento de DNA amplificado a partir de plasmídeo pDAB9582 utilizando iniciadores específicos para elementos de gene. A geração de sondas de DNA por síntese de PCR foi realizada utilizando um Kit de Síntese de Sonda PCR DIG (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante.
[00145] As sondas marcadas foram analisadas por eletroforese em gel de agarose para determinar sua qualidade e quantidade. Uma quantidade desejada de sonda marcada foi então usada para hibridi- zação ao DNA alvo nas membranas de náilon para a detecção dos fragmentos específicos utilizando os procedimentos essencialmente como descrito em DIG Easy Hyb Solution (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Brevemente, manchas de membrana de náilon contendo DNA fixo foram brevemente lavadas com 2X SSC e pré-hibridizadas com 20 a 25 ml de solução DIG Easy Hyb pré-aquecida em garrafas de hibridização a aproximadamente 45-55°C durante cerca de 2 horas em um forno de hibridização. A solução de pré-hibridização foi então decantada e substituída por ~15 ml de solução DIG Easy Hyb pré- aquecida contendo uma quantidade desejada de sondas específicas desnaturada por aquecimento em um termociclo durante aproximada- mente cinco minutos. A etapa de hibridização foi então conduzida a aproximadamente 45 a 55°C de um dia para outro no forno de hibridi- zação.
[00146] No final da hibridização de sonda, soluções DIG Easy Hyb contendo as sondas foram decantadas em tubos limpos e armazenadas a aproximadamente -20°C. Essas sondas poderiam ser reutilizadas duas vezes de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. As manchas de membrana foram lavadas brevemente e lavadas duas vezes em recipientes plásticos limpos com tampão de lavagem de baixa estringência (2X SSC, 0,1% de SDS) durante aproximadamente cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por lavagem duas vezes com tampão de lavagem de alta estringência (0,1X de SSC, 0,1% de SDS) durante 15 minutos cada a aproximadamente 65°C. As membranas de membrana brevemente lavadas com 1X de tampão de ácido maleico do conjunto DIG Wash and Block Buffer Set (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) durante aproximadamente 5 minutos. Esse foi seguido por bloqueio em 1X de tampão de bloqueio durante 2 horas e uma incubação com anticorpo anti-DIG-AP (fosfa- tase alcalina) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) em 1X de tampão de bloqueio também durante um mínimo de 30 minutos. Após 2-3 lavagens com 1X de tampão de lavagem, as sondas de DNA específicas permanecem ligadas às manchas de membrana e padrões de DNA marcados com DIG foram visualizados utilizando CDP-Star Chemiluminescent Nucleic Acid Detection System (Roche Diagnostics, India-napolis, IN) seguindo a recomendação do fabricante. As manchas foram expostas ao filme quimiluminescente durante um ou mais pontos de tempo para detectar os fragmentos hibridizantes e visualizar os padrões de tamanho molecular. Os filmes foram desenvolvidos com um desenvolvedor de filme All-Pro 100 Plus (Konica Minolta, Osaka, Japan) e as imagens foram escaneadas. O número e tamanhos de faixas detectadas foram documentados para cada sonda. O Marcador de Peso Molecular de DNA marcado com DIG II (DIG MWM II) e Marcador de Peso Molecular de DNA marcado com DIG VII (DIG MWM VII), visíveis após a detecção de DIG como descrito, foram usados para determinar o tamanho de fragmento hibridizante nos Southern blots.TABELA 6. Localização e comprimento de sonda usados em análise Southern.
[00147] Os tamanhos de fragmento esperados e observados com uma digestão e sonda particular, com base nos sítios de enzima de restrição conhecidos de PTU de cry1Ac e cry1F, são fornecidos na Tabela 7. Dois tipos de fragmentos foram identificados a partir dessas digestões e hibridizações: fragmentos internos onde os sítios de enzima conhecidos flanqueiam a região de sonda e estão completamente contidos dentro da região de inserção de PTU de cry1Ac e cry1F, e fragmentos de borda onde um sítio de enzima conhecido fica localizado em uma extremidade da região de sonda e um segundo sítio é es-perado no genoma de soja. Os tamanhos de fragmento de borda variam por evento, pois, na maioria dos casos, os sítios de integração de fragmento de DNA são exclusivos para cada evento. Os fragmentos de borda fornecem um meio para localizar um sítio de enzima de restrição relativo ao DNA integrado e avaliar o número de inserções de DNA. As análises Southern blot concluídas em múltiplas gerações de soja contendo evento de soja pDAB9582.816.15.1 produziram dados que sugeriram que uma PTU de cry1Ac e cry1F intacto de baixo número de cópias de plasmídeo pDAB9582 foi inserido no genoma de soja de evento de soja pDAB9582.816.15.1. TABELA 7. Fragmentos de hibridização previstos e observados em análise Southern blot. 1. Os tamanhos de fragmento esperados são baseados no mapa plasmidial de pDAB9582. 2. Os tamanhos de fragmento observados são considerados aproximadamente a partir dessas análises e são baseados nos tamanhos indicados dos fragmentos de Marcador de Peso Molecular II e Marcador VII de DNA marcados com DIG
[00148] As enzimas de restrição AseI e NsiI se ligam e clivam os sítios de restrição exclusivos em plasmídeo pDAB9582. Subsequentemente, prevê-se que essas enzimas foram selecionadas para caracterizar a inserção de gene cry1Ac nos fragmentos de borda de evento de soja pDAB9582.816.15.1 de >7286 bp ou >9479 bp se hibridizam com a sonda após as digestões de AseI e NsiI, respectivamente (Tabela 7). Faixas de hibridização de cry1Ac únicas de cerca de 8500 e >10.000 bp foram observadas quando as digestões AseI e NsiI forem usadas, respectivamente. A hibridização da sonda a faixas desse ta-manho sugere a presença de um único sítio de inserção do gene cry1Ac no genoma de soja de evento de soja pDAB9582.816.15.1. As enzimas de restrição NotI e ApaLI foram selecionadas para realizar uma digestão dupla e liberar um fragmento que contém a unidade de transcrição de planta cry1Ac (PTU; promotor/gene/terminador) (Tabela 7). Os fragmentos previstos 4550bp foram observados com a sonda após a digestão dupla de NotI e ApaLI. Os resultados obtidos com a digestão de enzima das amostras pDAB9582.816.15.1 seguido por hibridização de sonda indicaram que uma PTU de cry1Ac intacto de plasmídeo pDAB9582 foi inserido no genoma de soja de evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00149] As enzimas de restrição NdeI e NsiI se ligam e clivam os sítios de restrição no plasmídeo pDAB9582. Subsequentemente, essas enzimas foram selecionadas para caracterizar a inserção de gene cry1F no evento de soja pDAB9582.816.15.1. Prevê-se que os fragmentos de borda de > 5569 bp e > 9479 se hibridizam à sonda após as digestões de NdeI e NsiI, respectivamente (Tabela 7). Faixas de hibridização únicas cry1F de ~7.500 bp e >10.000 bp foram observadas quando NdeI e NsiI foram usados, respectivamente. A hibridização da sonda a faixas desse tamanho sugere a presença de um único sítio de inserção do gene cry1F no genoma de soja de evento de soja pDAB9582.816.15.1. A enzima de restrição, HindIII, foi selecionada para liberar um fragmento que contém a unidade de transcrição vegetal cry1F (PTU; promotor/gene/terminador) (Tabela 7). O fragmento de 7732 bp previsto foi observado com a sonda após as digestões de HindIII. Os resultados obtidos com a digestão de enzima das amostras de pDAB9582.816.15.1 seguido por hibridi- zação de sonda indicaram que uma PTU de cry1F intacta de plas- mídeo pDAB9582 foi inserida no genoma de soja de evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00150] Análises Southern blot também foram conduzidas para verificar a ausência do gene de resistência à espectinomicina (specR), Elemento Ori Rep e a Proteína de iniciação de replicação trfA (elemento A de trf) no evento de soja pDAB9582.816.15.1. Nenhuma hibridização específica para a resistência à espectino- micina, elemento Ori Rep ou elemento trf A é esperada quando os controles positivos (pDAB9582 adicionado ao DNA genômico Maverick) e negativos apropriados e (DNA genômico Maverick) forem incluídos para análise Southern. Após a digestão de NsiI e hibridi- zação com a sonda específica specR, uma faixa de tamanho esperada de 15320 bp foi observada na amostra de controle positivo (pDAB9582 adicionado ao DNA genômico Maverick). A sonda specR não se hibridizou a amostras do controle negativo e evento de soja pDAB9582.816.15.1. Similarmente, uma faixa de tamanho esperada de 15320 bp foi detectada na amostra de controle positiva (pDAB9582 mais maverick) porém sem as amostras do controle negativo e evento de soja pDAB9582.816.15.1 após a digestão de NsiI e hibridização com a sonda trfA. Outra faixa de tamanho esperada de 5329 bp foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB9582 adicionado ao DNA genômico Maverick), porém sem as amostras do controle negativo e evento de soja pDAB9582.816.15.1 após a digestão NdeI e hibridização com a sonda específica OriRep. Esses dados indicam a ausência de gene de resistência à espectinomicina, elemento Ori Rep e proteína de iniciação de replicação trfA no evento de soja pDAB9582.816.15.1.
[00151] Os testes agronômicos replicados foram realizados para comparar a eficácia agronômica de evento de soja pDAB9582.816.15.1 com uma curva de nível nula - Maverick. A maioria dos testes de campo foi plantada em locais geográficos distintos nos Estados Unidos onde a variedade de soja que contém o evento de soja pDAB9582.816.15.1 é cultivada. Os testes de campo adicionais foram concluídos fora desses locais, e foram selecionados para expor a variedade de soja que contém o evento de soja pDAB9582.816.15.1 a estresses potenciais que ocorrem a partir do crescimento em locais não preferidos. Devido à variabilidade ambiental dentro de um pequeno número dos testes de campo, alguns dos sítios foram descontinuados do estudo.
[00152] O experimento foi ajustado como um desenho de bloco completo randomizado com duas replicações por local. Havia oito entradas que incluem o evento de soja pDAB9582.816.15.1. Cada terreno consiste em duas fileiras, 12,5 pés de comprimento, plantadas a 30 polegadas de distância. Ao longo da estação, os terrenos de campo foram mantidos sob práticas agronômicas normais e mantidos isentos de ervas daninhas.
[00153] A semente do estudo foi produzida em berçário de plantas em Porto Rico. A semente de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e Maverick foram desenvolvidos no mesmo berçário e tratados de maneira similar para minimizar qualquer variabilidade de origem de semente. Então, a semente foi enviada novamente para a América do Norte onde essa foi embalada e distribuída para os vários locais de plantio. Ao longo da estação, inúmeras características agronômicas foram medidas. Essas características e o estágio de crescimento quando os dados foram coletados são listados na Tabela 8. Tabela 8. Lista de características agronômicas medidas em testes de campo para comparar o evento de soja pDAB9582.816.15.1 com Maverick.
[00154] No final do período de cultivo, os dados de todas as locali- zações foram combinados e uma análise de localização foi realizada. A análise de dados foi realizada utilizando JMP® Pro 9.0.3 (SAS, Cary, NC). Um modelo misto foi usado para a análise onde a entrada foi considerada um efeito fixo e localização, localização por entrada, e os efeitos de replicação foram considerados aleatórios. Os quadrados mínimos da análise foram relatados na Tabela 9. Para variáveis onde um efeito de entrada significativo foi medido, uma separação subsequente foi realizada utilizando o teste T Student para fazer a comparação entre Maverick e o evento de soja pDAB9582.816.15.1. O nível de probabilidade para determinar a significância foi ajustado em p=0,05.TABELA 9. Quadrados mínimos a partir da análise de localização que compara o evento de soja pDAB9582.816.15.1 com Maverick. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes em p=0,05 de acordo com o Teste T Student.
[00155] Todas as características medidas com a exceção de dias até o florescimento, maturação e 100 peso de semente exibiram paridade entre o evento de soja pDAB9582.816.15.1 e Maverick. O evento de soja pDAB.816.15.1 floresceu cerca de 2 dias depois de Maverick. O atraso de dois dias não é um atraso grave para produtores, e não compromete o desempenho da cultura. O florescimento dos terrenos é considerado quando aproximadamente 50% das plantas em um terreno exibem flores abertas. O evento de soja pDAB9582.816.15 também amadureceu um dia depois de Maverick no final da estação, porém esse atraso não resultou em uma diferença agronômica significante que poderia comprometer o desempenho da cultura. Também, o peso de semente 100 de evento de soja pDAB9582.816.15 era estatisticamente diferente de Maverick, porém isso não resultou em uma redução significativa no rendimento. Os resultados indicam que o evento de soja pDAB9582.816.15 pode se desenvolver de forma diferente de Maverick, porém a diferença é mínima e não está fora da faixa normal de sojas comercialmente desenvolvidas.
[00156] Para testar a tolerância ao herbicida de evento de soja pDAB9582.816.15.1 o evento foi plantado em um teste de eficácia Santa Isabel, Puerto Rico. O cultivar Maverick, que foi originalmente transformado para produzir o evento de soja pDAB9582.816.15.1, foi plantado em cada berçário e incluído como um controle nos experimentos. A semente do berçário T3 foi derivada de seleções de planta simples no estágio T2 e a semente do berçário T4 foi derivada de seleções de planta simples no estágio T3. Quatro linhagens do evento foram testadas em cada geração. Cada linhagem foi plantada em um terreno que possui 4 fileiras largas e 7,5 pés de comprimento. O espaçamento entre as fileiras é 30 polegadas. Os terrenos foram cultivados sob luzes durante aproximadamente 2,5 semanas para compensar a curta duração do dia em Porto Rico. Cada berçário foi pulverizado com glufosinato em uma taxa de 411 g ae/ha. Um terreno das plantas de controle, Maverick, foi pulverizado com a mesma taxa de glufosinato e um segundo terreno foi não pulverizado e usado como comparação de controle para o evento. O evento de soja pDAB9582.816.15.1 mostrou tolerância à aplicação de herbicida glufosinato. Em contrapartida, nenhuma das plantas Maverick era tolerante aos tratamentos com herbicida.
[00157] As avaliações de campo e estufa foram conduzidas para caracterizar o nível de proteção de planta fornecido pelas proteínas Cry1Ac e Cry1F no evento de soja pDAB9582.816.15.1 contra pragas de soja que incluem os seguintes insetos Lepidópteros, inclusive Anti- carsia gemmatalis (lagarta da soja), Pseudoplusia includens (lagarta falsa-medideira), Spodoptera frugiperda (lagarta-cartucho) e Heliothis virescens (lagarta-da-maçã).
[00158] Um teste de estufa foi conduzido em plantas de aproximadamente quatro semanas de idade. Quinze plantas foram usadas para avaliar o evento de soja pDAB9582.816.15.1 e o controle Maverick. Para cada espécie de inseto testada (larvas neonatas A. gemmatalis, P. includes, e S. frugiperda), três discos foliares foram cortados de cada planta em um total de 45 discos foliares por planta por espécie de inseto. As perfurações foliares de 1,4 cm foram colocadas em uma arena de teste sobre 2% de água-ágar, infestados com uma larva neo- nata e vedados com uma tampa de plástico perfurada.
[00159] A mortalidade e consumo foliar foram classificados após a infestação. As larvas que não eram responsáveis por sondagem suave foram consideradas mortas. As taxas de mortalidade dos insetos que foram colocados em materiais vegetais contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 eram significativamente maiores (86% de mortalidade para Spodoptera frugiperda, 100% de mortalidade para Anticar- sia gemmatalis, e 100% de mortalidade para Pseudoplusia includens) do que os insetos que foram colocados nos controles Maverick. Tabela 10. O dano foliar foi avaliado ao pontuar visualmente a porcentagem de disco foliar consumido pelo inseto. Os resultados obtidos a partir dos experimentos em estufa indicaram que o evento de soja pDAB9582.816.15.1 manteve dano foliar significativamente mais baixo e maior mortalidade de insetos como comparado com as plantas de controle Maverick quanto à infestação de Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens, e Spodoptera frugiperda.
[00160] Uma avaliação de eficácia de plantas de evento de soja pDAB9582.816.15.1 cultivadas em campo foi conduzida ao coletar amostras de folhas de terrenos de berçário de sementes em Santa Isabel, Porto Rico e enviar essas folhas para Indianapolis, IN para bio- ensaio. O terreno de berçário de plantas T3 de evento de soja pDAB9582.816.15.1 consiste em aproximadamente 180 plantas dispostas em quatro fileiras. Cada fileira possui 2,3 m de comprimento e espaçada a uma distância de 76,2 cm; as plantas individuais foram espaçadas a uma distância de 5,1 cm dentro de cada fileira. Os bioen- saios foram realizados em uma folha trifoliada completamente expandida localizada aproximadamente quatro nós abaixo do meristema. O tecido de folha trifoliada foi excisado de 10 plantas de soja individuais contendo o evento pDAB9582.816.15.1 e 10 plantas individuais Maverick. As folhas foram embaladas e transferidas para o laboratório. No laboratório, um ou dois discos foliares de 3,33 cm de diâmetro foram perfurados de cada folha trifoliada para fornecer um total de 16 discos foliares. Cada disco foliar foi colocado em uma arena de teste sobre 2% de ágar, infestado com uma larva neonata de S. frugiperda, e vedado com uma tampa de plástico perfurada. Os discos foliares foram mantidos em uma câmara de ambiente controlado durante 7 dias, nesse período de tempo a mortalidade e consumo de folhas foram classi- ficados. As larvas não responsáveis por sondagem suave foram consideradas mortas. O dano foliar foi avaliado ao classificar visualmente a porcentagem de perfuração foliar consumida pelo inseto.
[00161] A mortalidade e consumo de folha foram classificados após a infestação. As larvas que não eram responsáveis por sondagem suave foram consideradas mortas. As taxas de mortalidade dos insetos que foram colocados em materiais vegetais contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 eram significativamente maiores (68% de mortalidade para Spodoptera frugiperda) do que aqueles que foram colocados nos controles Maverick (0% de mortalidade para Spodoptera frugi- perda). Tabela 10. O dano foliar foi avaliado ao pontuar visualmente a porcentagem de disco foliar consumida pelo inseto. Os resultados obtidos a partir desse bioensaio foliar indicaram que as larvas de Spodoptera frugiperda expostas ao evento de soja pDAB9582.816.15.1 mantiveram dano foliar significativamente mais baixo e sobrevivência de insetos (também descrito como maior mortalidade de insetos) do que as larvas de Spodoptera frugiperda expostas às plantas de controle Maverick.
[00162] A eficácia de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi avaliada em um primeiro teste de campo (Primeiro Teste de Campo na Tabela 10). As sementes de soja da geração T4, contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 e sementes da variedade de soja não transformada Maverick foram plantadas em um desenho de bloco completo randomizado com duas réplicas. Cada terreno em réplica consiste em duas fileiras, 2,3 m de comprimento e espaçado a uma distância de 0,76 m. Havia 40 sementes plantadas por fileira, espaçadas a uma distância de 5,7 cm dentro da fileira. O teste foi plantado e uma réplica foi pulverizada com herbicida glufosinato em 411 g ae/ha e a outra réplica não, resultando somente na réplica não pulverizada de plantas Maverick que sobreviveram ao bioensaio.
[00163] As folhas do bioensaio foram coletadas quando as plantas de soja estavam no estágio de crescimento R2. Vários dias antes de as folhas serem coletadas para bioensaio, perfurações foliares foram removidas da folha um nó inferior (e uma folha mais velha) nas mesmas plantas e analisados quanto à expressão de proteínas Cry 1Ac e Cry 1F utilizando um método ELISA similar àquele descrito no Exemplo 2 (Tabela 12). As folhas trifoliadas de haste principal totalmente expandidas, que não mostram sinais de danos ou descoloração e quatro nós localizadas abaixo do meristema, foram excisadas para bioen- saio. Uma única folha trifoliada foi excisada de cada uma das 15 plantas por réplica. As folhas foram armazenadas a 15° C e biologicamente analisadas. Os folíolos de cada folha trifoliada foram excisados e um único disco de 3,33 cm de diâmetro cortado do centro de cada folíolo de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e dois discos de 3,33 cm de diâmetro foram cortados de cada folíolo Maverick. Esses discos foliares foram colocados individualmente em poços marcados separados de bandejas de bioensaio de plástico de 32 poços; sendo que cada poço contém uma fina camada de ágar. Uma única larva de P. inclu- dens, larva neonata de A. gemmatalis, ou larva neonata de S. frugi- perda foi colocada em cada disco foliar. As bandejas de bioensaio foram seladas com folhas de plástico adesivas perfuradas para proporcionar ventilação. Para cada espécie, 30 larvas foram expostas ao tecido foliar de evento de soja pDAB9582.816.15.1, e 30 larvas foram expostas ao tecido foliar de Maverick. As bandejas de plástico que apoiam os discos foliares infestados foram mantidas a 25°C e 40% de umidade relativa (RH). Após 7 dias, as larvas foram determinadas como mortas (nenhum movimento quando estimuladas com uma sonda afiada), atrofiadas (menores em tamanho do que as larvas mantidas em folhas Maverick), ou vivas (normais em tamanho e resposta a estímulos).
[00164] A mortalidade foi classificada após a infestação. As taxas de mortalidade dos insetos que foram colocados em materiais vegetais contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 eram significativamente maiores (97% de mortalidade para Spodoptera frugiperda, 100% de mortalidade para Anticarsia gemmatalis, E 100% de mortalidade para Pseudoplusia includens) do que os insetos que foram colocados nos controles Maverick. Tabela 10. Os resultados obtidos a partir desse bioensaio de folha indicaram que as larvas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis, e Pseudoplusia includens expostas ao evento de soja pDAB9582.816.15.1 mantiveram sobrevivência de insetos significativamente mais baixa (também descrita como maior mortalidade de insertos) do que as larvas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis, e Pseudoplusia includens expostas às plantas de controle Maverick.
[00165] A eficácia de evento de soja pDAB9582.816.15.1 foi avaliada em um segundo teste de campo seperado (Segundo Teste de Campo na Tabela 10). As sementes de soja da geração T4, contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 e as sementes da variedade de soja não transformada Maverick foram plantadas em um desenho de bloco completo randomizado com 4 réplicas. Cada terreno em réplica consiste em 4 fileiras, 6,1 m de comprimento e espaçado a uma distância de 1,02 m. Havia 160 sementes plantadas por fileira, espaçadas a uma distância de 3,8 cm dentro da fileira. As fileiras adicionais de Maverick foram plantadas entre e em torno dos terrenos de teste para atrais populações de pragas de insetos nativos.
[00166] As folhas para o bioensaio foram coletadas quando as plantas de soja estavam no estágio de crescimento R2. As folhas para um bioensaio adicional foram coletadas das mesmas plantas quando as plantas de soja estavam no estágio de crescimento R5. Vários dias antes de as folhas serem coletadas para cada bioensaio, perfurações foliares foram retiradas da folha um nó inferior nas mesmas plantas e analisados quanto às proteínas Cry 1Ac e Cry 1F utilizando um método ELISA similar àquele descrito no Exemplo 2 (Tabela 12). As folhas trifoliadas totalmente expandidas, que não mostram sinais de danos ou descoloração e localizadas quatro nós abaixo do meristema, foram ex- cisadas para bioensaio. Uma única folha trifoliada foi excisada de cada uma das 15 plantas por réplica; 4 folhas trifoliadas por réplica foram usadas para o bioensaio de P. includens, 4 folhas trifoliadas por réplica foram usadas para o bioensaio de S. frugiperda, 4 folhas trifoliadas por réplica foram usadas para o bioensaio de H. virescens, e 3 folhas trifo- liadas por réplica foram usadas para o bioensaio de A. gemmatalis. Os dois folíolos laterais de cada folha trifoliada foram excisados e colocados em placas de petri separadas, marcadas contendo uma fina camada de ágar. Duas larvas de segundo ínstar de P. includens, A. gemmatalis, S. frugiperda, ou H. virescens foram colocadas em cada folíolo. Para P. includens, S. frugiperda, e H. virescens, 64 larvas foram expostas a tecido foliar de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e plantas Maverick. Para A. gemmatalis, 48 larvas foram expostas a tecido foliar de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e plantas de controle Maverick. As placas de petri que contêm os folíolos infestados foram cobertas com tapas e mantidas a 25°C e 40% de RH. Após 4 dias, as larvas foram determinadas como mortas (nenhum movimento quando estimuladas com uma sonda afiada), moribundas (a larva responde a estímulos, porém é incapaz do próprio direito se colocadas no lado), atrofiadas (menores em tamanho do que as larvas mantidas em folhas Maverick), ou vivas (normais em tamanho e resposta a estímulos).
[00167] O procedimento de bioensaio no estágio R5 é o mesmo que o procedimento usado no estágio R2 com a exceção que para S. frugi- perda e H. virescens, todos os três folíolos foram excisados de cada folha trifoliada e uma única larva de segundo ínstar foi colocada em cada folíolo. Isso resultou em 48 larvas de S. frugiperda e H. virescens que são expostas a folíolos de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e Maverick.
[00168] A mortalidade foi classificada após a infestação para os bi- oensaios de folha R2 e R5. As taxas de mortalidade dos insetos que foram colocados sobre os materiais vegetais contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 eram significativamente maiores (69% de mortalidade para o bioensaio de folha R2 e 54% de mortalidade para o bi- oensaio de folha R5 de Spodoptera frugiperda, 100% de mortalidade para os bioensaios de folha R2 e R5 de Anticarsia gemmatalis, 95% de mortalidade para o bioensaio de folha R2 e 70% de mortalidade para o bioensaio de folha R5 de Heliothis virescens, e 100% de mortalidade para o bioensaio de folha R2 e 98% de mortalidade para o bioensaio de folha R5 de Pseudoplusia includens) do que os insetos que foram colocados nos controles Maverick. Tabela 10. Os resultados obtidos a partir desse bioensaio de folha indicaram que as larvas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens e Heliothis virescens expostas ao evento de soja pDAB9582.816.15.1 mantiveram a sobrevivência de insetos significativamente mais baixa (também descrita como maior mortalidade de inseto) do que as larvas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens e Heliothis virescens expostas às plantas de controle Maverick.
[00169] As vagens de soja foram coletadas de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e plantas de soja Maverick desenvolvidas no segundo teste de campo, e biologicamente analisadas com larvas de H. virescens. As duas vagens mais superiores na haste principal foram excisadas de seis plantas selecionadas aleatoriamente dentro de cada terreno em réplica. Cada conjunto de vagens foi colocado em uma placa de petri de plástico e infestada por uma única larva de H. virescens de segundo ínstar. O experimento foi desenhado de modo que 24 lar- vas possam ser expostas a um conjunto de vagens que foi colhido de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e plantas de controle Maverick. As placas de petri foram mantidas sob as mesmas condições que o bio- ensaio de folha excisada anteriormente descrito. Após 2 dias, a sobrevivência das larvas de H. virescens foi observada utilizando o procedimento descrito para os bioensaios de folha.
[00170] A mortalidade foi classificada após a infestação das vagens de soja. As taxas de mortalidade dos insetos que foram colocados em vagens de soja contendo o evento de soja pDAB9582.816.15.1 eram significativamente mais altas (50% de mortalidade para o bioensaio de vagem de soja de Heliothis virescens) do que os insetos que foram colocados nas vagens de controle Maverick. Tabela 10. Os resultados obtidos a partir desse ensaio em vagens de soja desenvolvidas em campo indicaram que as larvas de Heliothis virescens expostas ao evento de soja pDAB9582.816.15.1 mantiveram a sobrevivência de insetos significativamente mais baixa (também descrita como maior mortalidade de insetos) do que as larvas de Heliothis virescens expostas às plantas de controle Maverick.
[00171] Os terminais (a seção mais superior de haste principal que possui duas a três folhas trifoliadas expandidas e um grupo de vagens imaturas) de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e as plantas de soja de controle Maverick foram infestadas no campo com ovos de H. vi- rescens. As seções de gaze de algodão contendo aproximadamente vinte ovos de H. virescens foram colocadas nos terminais de cinco plantas selecionadas aleatoriamente dentro de cada terreno em réplica (20 plantas testadas no total), e mantidas no lugar com um clipe de papel revestido de plástico. Sacos de pano foram colocados sobre os terminais e a extremidade aberta do saco de malha foi fixada na haste principal com um fio enrolado. A eclosão de ovos foi monitorada diariamente em um conjunto representativo de sacos de malha. Após todos os ovos serem eclodidos, o número de larvas de H. virescens vivas em cada saco de malha fixado nas cinco plantas foi contado.
[00172] O número médio de larvas de insetos vivas que foi colocado sobre os terminais de soja de evento de soja pDAB9582.816.15.1 era significativamente menor (0,00 número de insetos para o bioensaio de terminal de soja de Heliothis virescens) do que os insetos que foram colocados nos terminais dos controles Maverick. Tabela 11. Os resultados obtidos a partir desse ensaio indicaram que as larvas de Heliothis virescens expostas ao evento de soja pDAB9582.816.15.1 mantiveram números significativamente menores de sobrevivência de insetos do que as larvas de Heliothis virescens expostas às plantas de controle Maverick.
[00173] As contagens de larvas nativas de P. includens nos terrenos de teste foram feitas uma vez por semana durante um período de quatro semanas. As duas fileiras centrais de cada terreno foram amostradas. Um pano branco de 91 cm x 91 cm foi colocado em um local aleatoriamente selecionado entre as duas fileiras centrais. As plantas na seção de fileira adjacente a uma borda da folha foram inclinadas sobre o pano e agitadas 15 vezes para expulsar quaisquer insetos presentes. Esse processo foi repetido para a fileira na borda oposta do pano. As larvas foram contadas por espécies e tamanho: larvas < 6 mm de comprimento foram contadas como larvas pequenas e larvas > 6 mm de comprimento foram contadas como larvas grandes. Todos os insetos foram removidos do pano antes de tirar a próxima medida. O pano foi movido para um segundo local aleatoriamente selecionado entre as duas fileiras centrais e o processo de amostragem foi repetido, resultando em duas sub-amostras por terreno em cada data de amostragem.
[00174] O número médio de insetos que foram contados em uma fileira de 1,82 m de evento de soja pDAB9582.816.15.1 era significati- vamente mais baixo (0,00 número de insetos para Pseudoplusia inclu- dens) do que o número de insetos que foram contados em uma fileira de 1,82 m dos controles Maverick. Tabela 11. Os resultados obtidos a partir desse ensaio indicaram que a infestação por Pseudoplusia inclu- dens de evento de soja pDAB9582.816.15.1 era significativamente menor do que a infestação por Pseudoplusia includens exposta às plantas de controle Maverick.
[00175] Os resultados obtidos a partir desses experimentos replicados indicaram que as larvas de Lepidópteros expostas ao evento de soja pDAB9582.816.15.1 mantiveram a sobrevivência significativamente mais baixa do que as larvas expostas às plantas de controle Maverick para todas as espécies de insetos testadas. Assim, o evento de soja pDAB9582.816.15.1 possui atividade inseticida sobre essa ampla gama de insetos-praga.TABELA 10. As contagens de mortalidade de insetos para insetos Le- pidópteros que foram biologicamente analisadas em folha de soja e material de vagem de evento de soja pDAB9582.816.15.1 como comparado com as plantas de controle Maverick.
TABELA 11. Número médio de insetos Lepidópteros vivos que estavam presentes no evento de soja pDAB9582.816.15.1 como comparado com plantas de controle Maverick.
TABELA 12. O nível de expressão médio de proteínas transgênicas diferentes isoladas de materiais vegetais de evento de soja pDAB9582.816.15.1 que foram usados para bioensaios de insetos.
[00176] A SEQ ID N°:14 fornece a sequência esperada de evento de soja pDAB9582.816.15.1. Essa sequência contém a sequência de flanqueamento genômica 5', a inserção de cadeia T esperada de sequências de flanqueamento genômicas pDAB9582 e 3'. Em relação à SEQ ID N°:14, os resíduos 1 a 1273 são sequências de flanqueamento genômicas 5', os resíduos 1274 a 13658 são resíduos da inserção de cadeia T pDAB9582, 13659 a 13821 são resíduos de um rearranjo do plasmídeo pDAB9582 e os resíduos 13822 a 15170 são sequências de flanqueamento 3'. A sequência de junção ou transição em relação à extremidade 5' da inserção ocorre, desse modo, nos resíduos 1273 a 1274 de SEQ ID N°:14. A sequência de junção ou transição em relação à extremidade 3' da inserção ocorre, desse modo, nos resíduos 13658 a 13659 de SEQ ID N°:14.
[00177] Deve ser observado que a SEQ ID N°:14 é a representação esperada de evento de soja pDAB9582.816.15.1 e foi montada a partir de um alinhamento de SEQ ID N°:1, SEQ ID N°:2, e da cadeia t de pDAB9582. A sequência real da inserção de cadeia T de evento de soja pDAB9582.816.15.1 pode se desviar ligeiramente de SEQ ID N°:14. Durante o processo de transformação de introduzir uma inser- ção de cadeia T no genoma de células vegetais, não é incomum ocorrer algumas deleções ou outras alterações da inserção. Ademais, erros em amplificação de PCR que podem ocorrer podem resultar em erros de sequenciamento menores. Por exemplo, as sequências de flanqueamento listadas aqui foram determinadas ao gerar amplicons de DNAs genômicos de soja, e então clonar e sequenciar os amplicons. Não é incomum encontrar ligeiras diferenças e pequenas discrepâncias em sequências geradas e determinadas dessa maneira, dadas as muitas séries de amplificação que são necessárias para gerar amplicon suficiente para sequenciamento de DNAs genômicos. Um elemento versado na técnica poderia reconhecer e notar que quaisquer ajustes necessários devido a esses tipos de erros ou discrepâncias de sequenciamento comuns estarem dentro do escopo da descrição em questão. Assim, o segmento relativo da sequência de plasmí- deo fornecida aqui pode compreender algumas variações menores. Assim, uma planta que compreende um polinucleotídeo que possui alguma faixa de identidade com a sequência de inserção em questão está dentro do escopo da descrição em questão. A identidade com a sequência de SEQ ID N°:14 pode ser uma sequência de polinucleotí- deo que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com uma sequência exemplificada ou descrita aqui. A sequência das sequências de flan- queamento mais a sequência de inserção podem ser confirmadas com referência à semente depositada. Assim, algumas diferenças entre a SEQ ID N°:14 e a inserção de cadeia T real de evento de soja pDAB9582.816.15.1 podem ser identificadas.
[00178] Mediante a ilustração e descrição dos princípios da presente descrição, deve ser evidente para os elementos versados na técnica que a descrição pode ser modificada em disposição sem que se abandone esses princípios. Todas as modificações que estão dentro do es- pírito e escopo das reivindicações em anexo serão reivindicadas.
[00179] Todas as publicações e documentos de patente publicados citados nesse relatório descritivo estão aqui incorporados a título de referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse específica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referência.
Claims (5)
1. Sequência de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que é diagnóstica para o evento de soja 9582.816.151, como representado em sementes depositadas na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-12588, a referida sequência consistindo em uma ou mais sequencias selecionadas a partir do grupo que consiste em pares de base 1258-1288 de SEQ ID NO:1; pares de base 1223-1323 de SEQ ID NO:1; pares de base 1173-1373 de SEQ ID NO:1; pares de base 1073-1473 de SEQ ID NO:1; pares de base 160190 de SEQ ID NO:2; pares de base 125-225 de SEQ ID NO:2; e pares de base 75-275 de SEQ ID NO:2.
2. Método de controlar insetos, caracterizado pelo fato de que compreende expor os insetos ao evento de soja 9582.816.151 como representado em sementes depositadas na American Type Culture Collection sob o N° de Acesso PTA-12588 e compreendendo SEQ ID NO: 14, para deste modo, controlar os insetos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os ditos insetos são selecionados do grupo que consiste em Pseudoplusia includens (lagarta falsa-medideira), Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja), Spodoptera frugiperda (lagarta- cartucho), e Heliothis virescens (lagarta-da-maçã).
4. Método de aumentar o rendimento de uma cultura de soja, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar herbicida de glu- fosinato a cultura de soja, sendo que a dita cultura de soja compreende plantas de soja do evento 9582.814.19.1, como representado nas sementes depositadas na ATCC com o N° de Acesso PTA-12006, em que as referidas plantas de soja compreendem uma sequência de DNA consistindo em SEQ ID NO: 14.
5. Uso do evento de soja 9582.816.151 conforme representado em sementes depositadas na American Type Culture Collection sob o N° de Acesso PTA-12588 e compreendendo SEQ ID NO: 14, caracterizado pelo fato de que é para produzir uma cultura de soja transgênica para controle de resistência de inseto e apresentando tolerância a um herbicida.
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