JP6778235B2 - 昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントpDAB9582.816.15.1 - Google Patents
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Description
,700号の優先権を主張するものである。その中の情報は完全に組み込まれる。
、昆虫抵抗性、例えば、鱗翅目の昆虫に対する抵抗性をトランスジェニック植物に付与す
ることができ、PAT(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)をコードする
遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシン(グルホシネート)に対する耐性をトランスジェニ
ック植物に付与することができる。PATは、昆虫抵抗性トランスジェニック作物の作出
における選択マーカーとして、および除草剤グルホシネートに対する商業的なレベルの耐
性をトランスジェニック植物に付与するための両方に使用するために、ダイズにおいて首
尾よく発現されている。
ン)のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント(例えば、エンハンサー)の
近傍にあることに起因して、植物ゲノムにおけるそれらの位置の影響を受けることが公知
である(Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻:421〜477頁、1988年)。同時に、ゲノム内
の異なる位置に導入遺伝子が存在することが、植物の全体的な表現型に違ったふうに影響
を及ぼす。この理由のために、多くの場合、対象の導入された遺伝子の最適な発現を特徴
とする特定の導入遺伝子イベントを同定するためには、多数の導入遺伝子イベントをスク
リーニングすることが必要である。例えば、植物および他の生物体において、イベント間
で導入された遺伝子の発現のレベルが広範に変動する可能性があることが観察された。発
現の空間パターンまたは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織
における導入遺伝子の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写
調節エレメントから予測されるパターンに対応しない可能性がある。このために、何百か
ら何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベントを、導入遺伝子の所望の発現レベ
ルおよび発現パターンを有する単一のイベントについて商業目的のためにスクリーニング
することが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベ
ントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入遺伝子を他の遺伝的背景
に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、元の形質転換体の導入遺
伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生長条件によく適合する多
数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。
るために、特定のイベントの存在を検出することができることが望ましい。さらに、特定
のイベントを検出するための方法は、例えば、組換え作物に由来する食物の市販前承認お
よび表示を必要とする規制に合致するため、または、環境のモニタリング、圃場内の作物
の形質のモニタリング、または作物収穫で得られる生産物のモニタリングにおいて使用す
るため、ならびに、規制条項および契約条項に従う関係者のコンプライアンスを確実にす
ることにおいて使用するために役立つ。
したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはDNAのハイブリダイゼーションを含めた当
技術分野で公知の任意の核酸検出方法によって検出することが可能である。これらの検出
方法では、一般に、多くのDNA構築物に関して、コード領域を交換することができるの
で、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などの遺伝エレメントを使用するこ
とに焦点を合わせることも多い。結果として、そのような方法は、挿入された異種DNA
に近接する隣接DNAのDNA配列が既知でなければ、異なるイベント、特に、同じDN
A構築物または非常に類似した構築物を使用して作出されたイベント間を識別するために
は有用でない可能性がある。例えば、イベント特異的なPCRアッセイは、トウモロコシ
イベントDAS−59122−7について米国特許出願第2006/0070139号に
記載されている。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を同定するための
単純かつ識別力のある方法を有することが望ましい。
イズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されている、本明細書に記載のcry1Fv3
(cry1F)、cry1Ac synpro(cry1Ac)およびpat v6(p
at)を含む、新しい昆虫抵抗性かつ除草剤耐性のトランスジェニックダイズ形質転換イ
ベントに関する。代表的なダイズ種子は、American Type Culture
Collection(ATCC)に、パラグラフ[0033]において識別される受
託番号で寄託されている。このイベントを含有するダイズ植物のDNAは、ダイズゲノム
内の挿入DNAの位置を特徴付ける本明細書に記載の接合部/隣接配列を含む。配列番号
1および配列番号2は、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1に特徴的で
ある。より詳細には、配列番号1のbp1273/1274、配列番号2のbp175/
176および316/317、にある接合部を取り囲む配列が、ダイズイベントpDAB
9582.816.15.1に特徴的である。下のパラグラフ[0012]には、ダイズ
イベントpDAB9582.816.15.1を含有するダイズのDNAの特性であるこ
れらの接合部を含む配列の例が記載されている。
dens)(ダイズシャクトリムシ)に対して抵抗性であり、配列番号1のbp1258〜1
288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;
配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2の
bp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1
つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むゲノムを有するダイズ植物またはその部
位を提供する。別の実施形態では、本開示は、そのような植物の種子を提供する。
昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、ダイズ植物がダイズイベ
ントpDAB9582.816.15.1が存在することの特徴である配列番号1のbp
1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173
〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;
配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から
選択される1つまたは複数の配列;ならびにその相補物を含有するゲノムを有する方法を
提供する。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1にcry1F v3(c
ry1F)遺伝子およびcry1Ac synpro(cry1Ac)遺伝子が存在する
ことにより、例えば、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(
ダイズシャクトリムシ)、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)(
ハッショウマメイモムシ(velvetbean caterpillar))、エピノチア・アポレマ(Epinot
ia aporema)、オモイデス・インジカタス(Omoides indicatus)、ラチプルシア・ヌ(R
achiplusia nu)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、スポドプテ
ラ・コスモイデス(Spodoptera cosmoides)、スポドプテラ・エリダニア(Spodoptera e
ridania)、ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)、ヘリコベルパ・ゼア(He
liocoverpa zea)、スピロソーマ・ビルギニカ(Spilosoma virginica)およびエラスモ
パルパス・リグノセルス(Elasmopalpus lignosellus)に対する抵抗性が付与される。
ホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が、配列番号
1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp
1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜
190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からな
る群から選択される1つまたは複数の配列;ならびにその相補物を含有するゲノムを有す
るダイズ植物を含み、これらの配列が、ダイズイベントpDAB9582.816.15
.1の存在に特徴的である、方法を提供する。ダイズイベントpDAB9582.816
.15.1にpat遺伝子が存在することにより、グルホシネート除草剤に対する耐性が
付与される。
B9582.816.15.1を検出する方法であって、
(a)前記試料を、配列番号1のbp1〜1273内の隣接配列またはその相補物に選択
的に結合する、長さが少なくとも10bpである第1のプライマー、および配列番号1の
bp1274〜1577内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが
少なくとも10bpである第2のプライマーと接触させ、前記プライマー間に生成したア
ンプリコンについてアッセイするステップ、または
(b)前記試料を、配列番号2のbp1〜175内の挿入断片配列またはその相補物に選
択的に結合する、長さが少なくとも10bpである第1のプライマー、および配列番号2
のbp176〜1687内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少な
くとも10bpである第2のプライマーと接触させるステップ、および
(c)前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ
を含む方法を提供する。
検出する方法であって、
(a)前記試料を、配列番号1のbp1〜1273および配列番号2のbp176〜16
87からなる群から選択される隣接配列およびその相補物に選択的に結合する第1のプラ
イマー;ならびに配列番号3、またはその相補物に選択的に結合する第2のプライマー;
と接触させるステップと、
(b)前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、
(c)前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップと
を含む方法を提供する。
のダイズ植物を交雑させて第3のダイズ植物を作出するステップであり、前記第1の植物
が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番
号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のb
p160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜2
75からなる群から選択される1つまたは複数の配列;ならびにその相補物を含むDNA
を含む、ステップと、前記第3のダイズ植物を、配列番号1のbp1258〜1288;
配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号
1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp12
5〜225;および配列番号2のbp75〜275およびその相補物を含むDNAの存在
についてアッセイするステップとを含む方法を提供する。
特徴的である、単離されたDNA分子を提供する。そのような分子は、配列番号1および
2に加えて、配列番号1のbp1273〜1274および配列番号1のbp1273/1
274接合部から各方向に少なくとも10bpを含む、長さが少なくとも25bpの分子
;配列番号2の175〜176および配列番号2のbp175/176接合部から各方向
に少なくとも10bpを含む、長さが少なくとも25bpのアンプリコン;を含む。例は
、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番
号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のb
p160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜2
75、ならびにその相補物である。
除する方法であって、前記粒、種子、または種子ミールが、配列番号1のbp1258〜
1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373
;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2
のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される
1つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むDNAを含むことによって実証される
、前記粒、種子、または種子ミールにダイズイベントpDAB9582.816.15.
1を含めるステップを含む方法を提供する。
、ならびに栄養細胞の核、花粉細胞、種子および種子ミール、および卵細胞を含めた、ダ
イズイベントpDAB9582.816.15.1を含有するダイズ植物の細胞および植
物の部位も包含する。
、他の除草剤耐性遺伝子(複数可)および/または昆虫抑制タンパク質ならびに転写調節
配列(すなわち、RNA干渉、dsRNA、転写因子など)を含めた他の形質と組み合わ
せることができる。追加的な形質は、植物の育種、ダイズイベントpDAB9582.8
16.15.1を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによ
る標的化組み込みによる新しい形質の付加によって植物ゲノムに掛け合わせることができ
る。
B9582.816.15.1を含むポリヌクレオチド配列を削除することを含む。ポリ
ヌクレオチド配列を削除したら、改変されたイベントを特定の染色体上の部位で再標的化
し、そこで追加的なポリヌクレオチド配列にダイズイベントpDAB9582.816.
15.1を掛け合わせることができる。
染色体に位置するダイズ染色体上の標的部位を包含する。
列番号1のbp1〜1273と配列番号2のbp176〜1687の間の第03染色体上
の位置に異種核酸を挿入するステップを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方
法を包含する。
を検出するためのアッセイも提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構
築物のDNA配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。ア
ッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。
ェニックダイズ系統に挿入することによって生じる境界領域のDNA配列のクローニング
および分析にも関する。これらの配列は独特である。挿入断片配列および接合部配列に基
づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができ、これを生成した。PCR分
析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したPCRアンプリ
コンを分析することによってこれらのイベントを同定することができることが実証された
。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、本開示のイベントを含むダイズ
系統を一意的に同定することができる。
るステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が、配列番号1のbp
1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173
〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;
配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から
選択される配列を含むDNAを含み、前記配列がダイズイベントpDAB9582.81
6.15.1の存在に特徴的である、方法を提供する。
ンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)、ヘリオチス・ビレセンス(Hel
iothis virescens)、またはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)を
昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させ、それにより昆虫を防除するステップを含む、シュード
プルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)、アンチカルシア・ゲムマタリス
(Anticarsia gemmatalis)、またはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiper
da)を防除する方法であって、前記ダイズ植物が、配列番号1のbp1258〜1288
;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番
号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp1
25〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される配列を含
むDNAを含み、前記配列がダイズイベントpDAB9582.816.15.1の存在
に特徴的である、方法を提供する。
草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が、配列番号1のbp12
58〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1
373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列
番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択
される配列からなる群から選択される配列を含むDNAを含むダイズ植物を含み、前記配
列がダイズイベントpDAB9582.816.15.1の存在に特徴的である、方法を
提供する。
1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473
;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号
2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列を含む単離された
DNA配列を提供する。
を交雑させて第3のダイズ植物を作出するステップであり、前記第1の植物が配列番号1
の1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp117
3〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190
;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群か
ら選択される1つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むDNAを含む、ステップ
と、前記第3のダイズ植物を、配列番号1の1258〜1288;配列番号1のbp12
23〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1
473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配
列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列、ならびに
その相補物を含むDNAの存在についてアッセイするステップとを含む方法を提供する。
1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473
;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号
2のbp75〜275からなる群から選択される少なくとも1つの配列、ならびにその相
補物を含む接合部配列を含む単離されたDNA分子を提供する。ある実施形態は、シュー
ドプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)に対
して抵抗性であり、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜
1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473
;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号
2のbp75〜275からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、な
らびにその相補物を有するDNAを含む、ダイズ植物またはその部位を提供する。
およびダイズ油(soy oil)からなる群から選択される生産品である、ダイズ植物または
その部位に由来する組成物を提供する。
あって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号1のbp1258〜1288;配列
番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1の
bp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜
225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数
の配列、ならびにその相補物を含むDNAを含むことによって実証される、前記粒、種子
、ミール、または粉にダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含めるステ
ップを含む方法を提供する。
のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1
073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225
;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択されるDNA配列、ならびに
その相補物を含むダイズ種子を提供する。別の実施形態は、そのゲノム内にダイズイベン
トpDAB9582.816.15.1のcry1F、cry1Acおよびpatを含み
、American Type Culture Collectionに受託番号PT
A−12588の下で寄託されている代表的なダイズ種子を有するダイズ種子を提供する
。別の実施形態は、これらの2つの実施形態のいずれかのダイズ種子を生長させることに
よって作出されるダイズ植物を提供する。別の実施形態は、このダイズ植物によって産生
されるダイズ種子であって、そのゲノム内に、American Type Cultu
re Collectionに受託番号PTA−12588の下で寄託されているダイズ
種子に存在するものであるダイズイベントpDAB9582.816.15.1のcry
1F遺伝子、cry1Ac遺伝子およびpat遺伝子を含む種子を提供する。別の実施形
態は、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記イベントを含
む、このダイズ植物の部位を提供する。別の実施形態は、ダイズミール、ダイズ粉(soy
flour)、およびダイズ油(soy oil)からなる群から選択される生産品である、ダイズ植
物またはその部位に由来する組成物を提供する。
同一性を有するDNA配列を含む。ある実施形態は、グルホシネート除草剤に対する耐性
を示し、前記耐性が前記イベントまたは前記ゲノムにおいてコードされるタンパク質の発
現に起因するものである、上記の実施形態の植物の後代ダイズ植物を提供する。
配列を含むゲノムを含むダイズ種子を提供する。別の実施形態は、このダイズ種子を生長
させることによって作出される植物を提供する。
ジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がAmerican
Type Culture Collectionに受託番号PTA−12588の下
で寄託されているダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含む、トランス
ジェニックダイズ植物またはその部位を提供する。
本開示の一部として、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含むダイ
ズ系統の少なくとも2500種子がAmerican Type Culture Co
llection(ATCC)、10801 University Boulevar
d、Manassas、VA、20110に寄託され、制限なく一般に公開されている(
しかし、特許権に支配される)。ATCC寄託番号PTA−12588と称される寄託物
は、Dow AgroSciences LLC on 23/February/20
12を代表して作製された。この寄託物は、特許手続のための種子寄託物に関するブタペ
スト条約の条項に従い、その下で作製されたものであり、また、それに従い、その下で維
持される。
配列番号1はダイズイベントpDAB9582.816.15.1についての5’DN
A隣接境界配列である。ヌクレオチド1〜1273はゲノム配列である。ヌクレオチド1
274〜1577は挿入断片配列である。
NA隣接境界配列である。ヌクレオチド1〜175は挿入断片配列である。ヌクレオチド
176〜316は、pDAB9582から再配置された配列である。ヌクレオチド317
〜1687はゲノム配列である。
付けている。
81615_FW2である。
81516_RV1である。
81516_RV2である。
81516_RV3である。
5’IREnd−01である。
5’IREnd−02である。
ーAtUbi1ORV1である。
ーAtUbi1ORV2である。
ー3TATEnd05である。
ー3’PATEnd06である。
列である。5’ゲノム隣接配列、pDAB9582T鎖挿入断片、および3’ゲノム隣接
配列を含む。
し特徴付けた。イベント特異的なアッセイを開発した。イベントは、ダイズゲノム(ダイ
ズの第03染色体)上にマッピングされた。イベントを別の優良な系統に、遺伝子移入し
得る。
導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを伴う(したがって発現される所
与の挿入物について「イベント」と称する)。すなわち、多くの形質転換技法、例えば、
アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換、微粒子銃形質転換(すなわち遺伝子銃
)、および炭化ケイ素媒介性形質転換(すなわちWHISKERS(商標))などを用い
ると、導入遺伝子がゲノム内のどこに挿入されるかは予測不可能である。したがって、挿
入断片の両側の隣接植物ゲノムDNAを同定することは、所与の挿入イベントを有する植
物を同定するために重要であり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合領域にわた
ってPCRアンプリコンを生成するPCRプライマーを設計することができる。このPC
Rアンプリコンを使用して、独特のまたは別個の種類の挿入イベントを同定することがで
きる。
針となるために、本明細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用
語は、当業者による従来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第1.822
条に明記されているDNA塩基の命名法を使用する。
6.15.1を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。
伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することに
よって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴
とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転
換体および異種DNAを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、その後
代がゲノムDNA/導入遺伝子DNAを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交
雑によって作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質
転換された親由来の挿入された導入遺伝子DNAおよび隣接ゲノムDNA(ゲノムDNA
/導入遺伝子DNA)は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イ
ベント」は、元の形質転換体由来のDNA、および挿入DNAを含む一方の親系統(例え
ば、元の形質転換体および自殖によって生じる後代)と挿入DNAを含有しない親系統と
の有性交雑の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入DNAを受け取る後代に伝達され
ることが予測され得る挿入DNAおよび挿入DNAのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むそ
の後代も指す。
するダイズのネイティブなゲノム由来のDNAに連結している点にわたり、植物の遺伝物
質中の一方または他方の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である
。本明細書に記載のダイズイベントにおける挿入物にわたるDNA配列および同様の長さ
の隣接DNAが包含される。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供
されるが、挿入物の接合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする
他の配列も特徴的であり、本開示の実施形態に従って使用することができる。
てイベントを特定することに一部関する。関連するPCRプライマーおよびアンプリコン
は、本開示の実施形態に包含される。本開示の実施形態に従って、挿入DNAおよびその
端までわたるアンプリコンを使用するPCR分析方法を使用して、対象の登録商標を持つ
トランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたトランスジェニックダイズの品種
または系統を検出または特定することができる。
ある。これらの配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。PCR分析に
より、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したPCRアンプリコン
を分析することによって、異なるダイズ遺伝子型においてこれらのダイズ系統を同定する
ことができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、
これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。本明細書において同定される配列
は独特である。
形質を後代に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交
雑した後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。
これらのPCR分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトラ
ンスジェニックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のPC
R検出キットも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管
理にも有益である。
的に同定することができる。この情報を使用して、それぞれのイベントに特異的な分子マ
ーカー系を作製することができる。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖
データを確立するために使用することができる。
み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに
遺伝子発現(特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、
およびMARS[マトリックス付着領域]などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連
する)を試験し、特徴付けることができる。
れるATCC寄託番号の下で入手可能な種子を包含することが明白でなければならない。
本開示の実施形態は、パラグラフ[0033]において識別されるATCC寄託番号で寄
託された種子から生長させた除草剤耐性ダイズ植物も包含する。本開示の実施形態は、前
記植物の部位、例えば、葉、組織試料、前記植物体によって生産される種子、花粉なども
包含する(植物のこれらの部分は、cry1F、cry1Ac、pat、ならびに配列番
号1および配列番号2を含む)。
び/または後代植物、好ましくは除草剤耐性ダイズ植物であって、本明細書に記載の検出
可能な野生型接合部/隣接配列を含むゲノムを有する植物も包含する。本明細書で使用さ
れる場合、用語「ダイズ」は、Glycine maxを意味し、ダイズ植物を用いて育
種することができるその全品種を包含する。
らに包含する。例えば、本開示は、本明細書において例示されている植物のいずれかを一
方の親または両親として有するFiハイブリッド植物を包含する。また、本開示のそのよ
うなFiハイブリッドによって生産される種子も本開示の範囲内である。本開示は、例示
した植物と、異なる(例えば、純系の親)植物を交雑し、得られたハイブリッド種子を収
穫することによってFiハイブリッド種子を作出するための方法を包含する。本開示は、
雌親または雄親のいずれかである、例示した植物を包含する。得られる植物の特性は、親
植物を慎重に考察することによって改良することができる。
統の任意の1つの種子から生長させたダイズ植物からなる第1の親ダイズ植物と、第2の
親ダイズ植物との有性交雑を最初に行い、それによって複数の第1の後代植物を作出する
こと;次いで、グルホシネートに対して抵抗性である第1の後代植物を選択すること;第
1の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第2の後代植物を作出すること;次いで
、第2の後代植物から、グルホシネートに対して抵抗性である植物を選択することによっ
て育種することができる。これらのステップは、第1の後代植物または第2の後代植物を
第2の親ダイズ植物または第3の親ダイズ植物と戻し交雑することをさらに含んでよい。
次いで本開示のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を植え付けることができる
。
2つの外因性遺伝子を含有する子孫を作出することもできることがまた理解される。適切
な後代を自殖させることにより、付加された外因性遺伝子のどちらについてもホモ接合性
である植物を作出することができる。栄養繁殖のように、親植物との戻し交雑および非ト
ランスジェニック植物との異系交雑も意図されている。種々の形質および作物のために一
般に使用される他の育種方法は当技術分野で公知である。反復親である望ましいホモ接合
性の栽培品種または純系統に、単純に遺伝した、高度に遺伝性の形質の遺伝子を伝達する
ために戻し交雑育種が使用されてきた。伝達される形質の供給源は、供与親と称されてい
る。生じた植物は、反復親(例えば、栽培品種)の属性および供与親から伝達された望ま
しい形質を有することが予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型を保有する個体を
選択し、反復親と繰り返し交雑(戻し交雑)する。生じた親は、反復親(例えば、栽培品
種)の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。
野で公知の方法を用いて追加的な導入遺伝子で形質転換することができる。形質転換技法
、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換、微粒子銃形質転換(すなわ
ち遺伝子銃)、および炭化ケイ素媒介性形質転換(すなわちWHISKERS(商標))
などを用いて、追加的な導入遺伝子(複数可)をダイズイベントpDAB9582.81
6.15.1のゲノムに導入することができる。新しく挿入された導入遺伝子を含有する
トランスジェニック植物の選択および特徴付けを完了して、本開示の実施形態のcry1
F遺伝子、cry1Ac遺伝子、pat遺伝子に加えて、新規の導入遺伝子の安定な組み
込み体を含有する植物を同定することができる。
ーとして使用することができる。本開示の実施形態のDNA分子は、当技術分野で公知の
通り、遺伝的に連鎖している作物学的に有用な形質を特定する方法(例えば、AFLPマ
ーカー、RFLPマーカー、RAPDマーカー、SNPおよびSSRなど)において使用
することができる。MAB法を使用して、本開示の実施形態のダイズ植物(またはその後
代および任意の他のダイズの栽培品種または品種)との交雑の後代において昆虫抵抗性お
よび除草剤耐性形質を追跡することができる。DNA分子はこの形質についてのマーカー
であり、当技術分野で周知のMAB法を使用して、本開示の実施形態の少なくとも1つの
ダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ植物における除草剤抵抗性形
質(複数可)を追跡することができる。本開示の実施形態の方法を使用して、対象イベン
トを有する任意のダイズ品種を特定することができる。
抵抗性/除草剤耐性ダイズ植物を作出する方法を包含する。より詳細には、前記方法は、
本開示に例示された2つの植物、または本開示に例示された1つの植物と任意の他の植物
とを交雑するステップを含んでよい。好ましい方法は、前記交雑の後代を、本開示の実施
形態に従って検出可能なイベントおよび好都合な品種性能(例えば、収量)について前記
後代を分析することによって選択するステップをさらに含む。例えば、本開示の実施形態
を用いて、他の望ましい形質、例えば、農業形質、病害に対する耐性もしくは抵抗性、線
形動物に対する耐性もしくは抵抗性および成熟日を含む植物を用いた育種サイクルを通し
て本主題のイベントを追跡することができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物
を検出し、特定し、選択し、例えば育種のさらなるラウンドに直ちに使用することができ
る。対象イベント/形質は、さらなる昆虫抵抗性形質(複数可)および/または別の除草
剤耐性形質と育種を通じて組み合わせ、本開示の実施形態に従って追跡することもできる
。後者の実施形態は、本主題のイベントを、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudo
plusia includens)(ダイズシャクトリムシ)、アンチカルシア・ゲムマタリス(Antica
rsia gemmatalis)(ハッショウマメイモムシ(velvetbean caterpillar))、エピノチ
ア・アポレマ(Epinotia aporema)、オミオデス・インディカタ(Omiodes indicata)、
ラチプルシア・ヌ(Rachiplusia nu)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugi
perda)、スポドプテラ・コスモイデス(Spodoptera cosmoides)、スポドプテラ・エリ
ダニア(Spodoptera eridania)、ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)、ヘ
リコベルパ・ゼア(Heliocoverpa zea)、スピロソーマ・ビルギニカ(Spilosoma virgin
ica)およびエラスモパルパス・リグノセルス(Elasmopalpus lignosellus)を含めた鱗
翅目の種に対する抵抗性を付与するcry1F遺伝子およびcry1Ac遺伝子と組み合
わせて含む植物である。
または細菌のEPSPS、GOX、GAT)、グルホシネート抵抗性(例えば、dsm−
2、bar)、アセト乳酸合成酵素(ALS)阻害性除草剤への抵抗性(例えば、イミダ
ゾリノン[イマゼタピルなど]、スルホニル尿素系、トリアゾロピリミジンスルホンアニ
リド、ピリミジニルチオベンゾエート系、および他の化学物質[Csr1、SurAなど
])、ブロモキシニル抵抗性(例えば、Bxn)、HPPD(4−ヒドロキシルフェニル
−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ)酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエンデサチュラ
ーゼ(PDS)の阻害剤に対する抵抗性、光化学系II阻害性除草剤に対する抵抗性(例
えば、psbA)、光化学系I阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼIX(PPO)阻害性除草剤に対する抵抗性(例えば、PPO−1)、フェ
ニル尿素除草剤に対する抵抗性(例えば、CYP76B1)、ジカンバ分解酵素(例えば
、US20030135879を参照されたい)をコードする形質と組み合わせることが
でき、その他のものを、単独で、または多数の組合せで積み重ねて、雑草のシフト(weed
shift)および/または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を有効に制御する、
または妨げる能力をもたらすことができる。
加的なインプット形質(例えば、昆虫抵抗性、病原体抵抗性、もしくはストレス耐性など
)またはアウトプット形質(例えば、生産量の増加、油プロファイルの改良、繊維品質の
改良など)を組み合わせることができる。したがって、本開示の実施形態を使用して、任
意の数の作物害虫を柔軟かつ費用効果的に制御する能力を伴う改良された作物の品質の完
全な作物パッケージをもたらすことができる。
み込むための方法は、当技術分野の範囲内で記載されている。例えば、参照により本明細
書に組み込まれる米国特許出願公開第2009/0111188A1号に記載の部位特異
的な組み込みでは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体上の標的への導入を媒介するた
めのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用が記載されている。さらに、参照により
本明細書に組み込まれる国際特許出願第WO2008/021207号には、1つまたは
複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に組み込むためのジンクフィ
ンガー媒介相同組換えが記載されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第
6720475号に記載のFLP/FRT、または参照により本明細書に組み込まれる米
国特許第5658772号に記載のCRE/LOXなどのリコンビナーゼの使用を利用し
て、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体上の部位に組み込むことができる。最終的に、
ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体上の位置に標的化するためのメガヌクレアーゼの
使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻(1996年)5055〜5060頁)に記載されている。
である(Kumarら、Trends in Plant Sci. 6巻(4号)(2001年)155〜159頁)。さらに、
いくつかの原核生物および下等真核生物において同定された部位特異的な組換え系を植物
における使用に適用することができる。そのような系の例としては、これらに限定されな
いが、酵母であるジゴサッカロマイセス・ロキシー(Zygosaccharomyces rouxii)のpS
R1プラスミ由来のR/RSリコンビナーゼ系(Arakiら(1985年)J. Mol. Biol. 182巻
:191〜203頁)、およびファージMuのGin/Gix系(MaeserおよびKahlmann(1991
年)Mol. Gen. Genet. 230巻:170〜176頁)が挙げられる。
入遺伝子(複数可)を組み込む、または掛け合わせることが望ましい。トランスジェニッ
クイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現、ならびに、多数の
環境区域における、およびそれ全てにわたる除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の
優れた組合せなどの独特の特性に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座と考えるこ
とができる。組み込まれた導入遺伝子を含む後代植物は、既存の形質転換体の導入遺伝子
の発現特性を維持すべきである。さらに、組み込まれたイベントを含む後代植物のゲノム
隣接配列および染色体上の位置はすでに同定されているので、以前に開発された、イベン
トを検出し、確認するためのアッセイを、イベントを含む後代植物に利用することができ
る。最終的に、既存の導入遺伝子の近くに連結された特定の染色体上の位置に新しい導入
遺伝子を組み込むことにより、従来の育種方法を使用した有性異系交雑による導入遺伝子
の他の遺伝的背景への遺伝子移入が促進される。
を削除することが望ましい場合がある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国
特許出願公開第2011/0191877号に記載の導入遺伝子の削除では、染色体に組
み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオ
チド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が記載されている。除去
されるポリヌクレオチド配列は、選択マーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列を削
除および除去したら、改変されたトランスジェニックイベントを、ポリヌクレオチド配列
を挿入することによって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列を削除し、そ
の後、改変されたトランスジェニックイベントを再標的化することにより、選択マーカー
の再使用、または特定の遺伝子が発現することによって生じる、植物のトランスクリプト
ームに対する意図されたものではない変化を克服する能力などの利点がもたらされる。
ゲノム内の第03染色体上の特定の部位を開示している。したがって、本開示の実施形態
は、対象とする異種核酸をこの予め確立した標的部位に、またはこの標的部位の付近に導
入するための方法を提供する。本開示の実施形態は、開示されている標的部位またはその
ような部位の概ね近くに挿入された任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および
/またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組み込みを実現するための1つの選択
肢は、本明細書において例示されているpat発現カセットの代わりに異なる挿入断片を
削除することおよび/または置換することである。この一般的な点について、例えば、ま
たこれらに限定することなく、本開示の実施形態に従って標的化相同組換えを使用するこ
とができる。
所望の形質を1つのトランスジェニック系統に組み合わせることを指す。植物育種家は、
それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑を行い、次にこれらの所望の形質を両方とも
有する子孫を同定することによってトランスジェニック形質を掛け合わせる。遺伝子を掛
け合わせるための別の方法は、形質転換の間に、2種以上の遺伝子を同時に植物の細胞核
に移入することによる。遺伝子を掛け合わせるための別の方法は、トランスジェニック植
物を、対象とする別の遺伝子を用いて再形質転換することによる。例えば、遺伝子を掛け
合わせることを用いて、例えば、2種以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質(複数可)
および病害抵抗性形質(複数可)、2種以上の除草剤への抵抗性形質、および/または昆
虫抵抗性形質(複数可)および除草剤抵抗性形質(複数可)を含めた2種以上の異なる形
質を組み合わせることができる。対象の遺伝子に加えて選択マーカーを使用することも、
遺伝子を掛け合わせることと考えることができる。
い組換えDNA配列を形成し得る類似したヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有
するヌクレオチド配列の任意の対の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は
、本明細書ではそれぞれが「相同配列」と称される。一般に、相同組換えの頻度は、相同
配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一には満たない
2つのヌクレオチド配列間で起こり得るが、組換え頻度(または効率)は、2つの配列間
の相違が増加するにつれて減退する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれの
1つの相同配列を使用して実現することができ、それによって「単一乗換え」組換え産物
を生成することができる。あるいは、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配
列のそれぞれに2つの相同配列を置くことができる。ドナー上の2つの相同配列と標的上
の2つの相同配列との間の組換えにより、「2重乗換え」組換え産物が生成する。ドナー
分子上の相同配列が、操作される配列(例えば、対象の配列)に隣接する場合、標的分子
との2重乗換え組換えにより、対象の配列が元々標的分子上の相同配列の間にあったDN
A配列と交換された組換え産物がもたらされる。2重乗換え組換えイベントによって標的
とドナーとの間でDNA配列を交換することは、「配列交換」と称される。
同定される、作動的なcry1Fヌクレオチド配列、cry1Ac synproヌクレ
オチド配列およびpatヌクレオチド配列と、本明細書において同定される、挿入断片の
両側の少なくとも20〜500以上の連続した隣接ヌクレオチドを一緒に含む。別段の指
定のない限り、隣接配列に言及する場合、それは配列番号1および2について特定された
ものを指す。これらの隣接配列の全部または一部は、イベントを含む親系統の有性交雑の
結果として挿入DNAを受け取る後代に伝達されることが予測され得る。
る。また、そのような組織培養物から再生された植物も、特に前記植物が例示されている
品種の形態学的性質および生理的性質の全てを発現することができる場合、包含される。
本開示の実施形態の好ましい植物は、寄託されている種子から生長させた植物の生理的特
性および形態学的特性の全てを有する。本開示の実施形態は、そのような種子および対象
の品質形質を保有する種子の後代をさらに含む。
伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世
代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の
親から栄養繁殖させることによって創出することができる。
のために使用される系統を指す。
くは、少なくとも3世代維持されることを意味する。
ように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子
から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義さ
れる。
草剤耐性に加えて、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有
することを意味する。これらの作物学的特性およびデータポイントの全てを使用して、そ
のような植物を、そのような植物を定義するために使用する特性の範囲内の一点として、
または一端もしくは両端で特定することができる。
ば、「接合部配列」または「移行部配列」(ダイズゲノムの隣接配列と挿入断片配列が接
する場所)を対象とし、かつ/またはそれを含むプローブおよび/またはプライマーを含
んでよい。これは、例えば、一方のまたは両方の接合部配列(挿入断片と隣接配列が接す
る場所)を同定するために設計されたポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および/
またはアンプリコンを含む。1つの一般的な設計は、隣接領域内でハイブリダイズする1
つのプライマー、および挿入断片内でハイブリダイズする1つのプライマーを有する。そ
のようなプライマーは、多くの場合、およそ、それぞれの長さが少なくとも約15残基で
ある。この配置を用いて、プライマーを使用して、本開示の実施形態のイベントの存在を
示す検出可能なアンプリコンを生成/増幅することができる。これらのプライマーを使用
して、上に示されている接合部配列にわたる(およびそれを含む)アンプリコンを生成す
ることができる。
て、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型
的な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って1200塩基の範囲内のど
ちらかの鎖の少なくとも15残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号1の塩
基対1〜1273および/または配列番号2の塩基対176〜1687由来の(またはそ
れとハイブリダイズする)適切なサイズの配列を含むプライマーは、本開示の実施形態の
範囲内である。挿入プライマーは、配列番号14の挿入断片のどこにでも、塩基対127
3から1873および13058から13658のどこにでも同様に設計することができ
、また、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排他的に使用することができる
。
で、ハイブリダイズするようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここで
プライマーまたはプローブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう
。すなわち、ある程度のミスマッチまたは縮重が容認され得る。およそ20ヌクレオチド
のプライマーについて、例えば、一般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライ
マーの内部または末端にある場合、1または2ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくて
よい。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合
成ヌクレオチド類似体は、プローブにも使用することができる。ペプチド核酸(PNA)
プローブ、ならびにDNAプローブおよびRNAプローブも使用することができる。重要
なのは、そのようなプローブおよびプライマーが、本開示の実施形態のイベントの存在に
対して特徴的である(独自に特定し、区別することができる)ことである。
起こり得ることに留意するべきである。すなわち、別段の指定のない限り、本明細書にお
いて列挙されている配列は、ダイズのゲノムDNAから長いアンプリコンを生成し、次い
でそのアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムDN
Aから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考
慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が
見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエ
ラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本開示の実施形態の範囲内である
ことを認識し、留意するべきである。
ることは珍しくないことにも留意すべきである。したがって、本主題の隣接配列と、例え
ばGENBANKに列挙されているゲノム配列との間にもいくらかの差異が出現する可能
性がある。
り詳細に考察されている。これらの構成要素のDNAポリヌクレオチド配列、またはその
断片を、本開示の実施形態の方法においてDNAプライマーまたはプローブとして使用す
ることができる。
子/ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書
において提供される本主題の5’導入遺伝子/ゲノムの挿入領域接合部配列(配列番号1
の塩基対1〜1273と配列番号14の塩基対1〜1273の間)、そのセグメント、な
らびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むDNA配列が提供され
る。本明細書において提供される本主題の3’導入遺伝子/ゲノムの挿入領域接合部配列
(配列番号2の塩基対176〜1687と配列番号14の塩基対13659〜15170
の間)、そのセグメント、ならびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメント
を含むDNA配列が提供される。挿入領域の接合部配列は、ゲノムに挿入された異種DN
Aと、挿入部位に隣接しているダイズの細胞由来のDNAの接合部にわたる。そのような
配列は、所与のイベントに対して特徴的であり得る。
ることができる。PCR分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用い
て生成したPCRアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型において
本開示の実施形態のダイズ系統を同定することができることが実証された。これらおよび
他の関連する手順を用いて、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含む
ダイズ系統を一意的に同定することができる。したがって、そのようなプライマー対に由
来するPCRアンプリコンは独特であり、これらのダイズ系統を同定するために使用する
ことができる。
A配列は本開示の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチド
および3つの上述のダイズ植物の1つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さ
のポリヌクレオチドを含むDNA配列および/またはこれらのダイズ植物の1つまたは複
数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である
配列が包含される。
よびそのセグメントなど)の導入遺伝子部分の少なくとも10、11、12、13、14
、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、またはそれ以
上の連続したヌクレオチドを含むDNA配列、またはその相補物、およびこれらの配列由
来の同様の長さのダイズの隣接DNA配列、またはその相補物に関する。そのような配列
は、DNA増幅方法において、DNAプライマーとして有用である。これらのプライマー
を使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれか
に対して特徴的である。したがって、本開示の実施形態は、そのようなDNAプライマー
によって生成されるアンプリコンも包含する。
Aの存在を検出する方法も包含する。そのような方法は、(a)DNAを含む試料を、こ
れらのダイズイベントの少なくとも1つ由来のDNAを用いた核酸の増幅反応において使
用したとき、前記イベント(複数可)に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプラ
イマーセットと接触させるステップと;(b)核酸の増幅反応を実施し、それによって、
アンプリコンを生成するステップと;(c)アンプリコンを検出するステップとを含んで
よい。
を検出する方法であって、(a)DNAを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で前記ダイズイベントの由来のDNAとハイブリダイズさせ、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物(対象のイベントがないD
NA)とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと;(b)試料およびプロ
ーブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと;(c)プロ
ーブのDNAとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を包含する。
82.816.15.1を含むダイズ植物を作出する方法であって、(a)第1の親ダイ
ズ系統(前記系統の植物にグルホシネート耐性を付与する本開示の実施形態の発現カセッ
トを含む)と第2の親ダイズ系統(この除草剤耐性形質を欠く)を有性交雑し、それによ
って、複数の後代植物を作出するステップと;(b)分子マーカーを使用することによっ
て後代植物を選択するステップとを含む方法を包含する。そのような方法は、場合によっ
て、後代植物を第2の親ダイズ系統と戻し交雑して、前記昆虫抵抗性およびグルホシネー
ト耐性形質を含む真の育種(true-breeding)ダイズ植物を作出するさらなるステップを
含んでよい。
が提供される。前記方法は、ダイズDNAを含む試料を本開示の実施形態のプライマーセ
ットと接触させるステップを含んでよい。前記プライマーは、前記ダイズイベント由来の
ゲノムDNAを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記ダイズイベントに対し
て特徴的である第1のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸の増幅反応を実
施し、それによって、第1のアンプリコンを生成するステップと;第1のアンプリコンを
検出するステップと;ダイズDNAを含む試料を、第2のプライマーセットと接触させる
ステップと(前記第2のプライマーセットは、ダイズ植物由来のゲノムDNAを用いた核
酸の増幅反応において使用したとき、前記イベントのポリヌクレオチド配列を含まないネ
イティブなダイズのゲノムDNAの内在性配列を含む第2のアンプリコンを生成する);
核酸の増幅反応を実施し、それによって、第2のアンプリコンを生成するステップとをさ
らに含む。この方法は、第2のアンプリコンを検出するステップと、試料中の第1のアン
プリコンと第2のアンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンが存
在することにより、試料が、導入遺伝子挿入物の接合性を示すステップとをさらに含む。
で周知の方法を使用して開発することができる。このキットは、試料中の対象のダイズイ
ベントDNAを特定するために有用であり、このDNAを含有するダイズ植物を育種する
ための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアン
プリコンと相補的であるDNA配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝エレメント
に含有されるDNAと相補的であるDNA配列を含有する。これらのDNA配列は、DN
A増幅反応において、またはDNAのハイブリダイゼーション方法においてプローブとし
て、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために必要な試薬および材料
も含有することができる。
素、リガンド、化学発光剤、または酵素など)を付着させた単離された核酸分子である。
そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本開示の実施形態の場合では、ダイズ植物由来で
あるかイベント由来のDNAを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベント
の1つ由来のゲノムDNAの鎖にハイブリダイズできる。本開示の実施形態によるプロー
ブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的DNA配列に特異的に結合し、
その標的DNA配列の存在を検出するために使用することができるポリアミドおよび他の
プローブ材料も含む。
してプライマーと標的DNA鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例
えば、DNAポリメラーゼによって標的DNA鎖に沿って伸長される、単離された/合成
された核酸である。本開示の実施形態のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれ
らの使用を指す。
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、4
0、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53
、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、
67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、8
0、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93
、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、1
05、106、107、108、109、110、111、112、113、114、1
15、116、117、118、119、120、121、122、123、124、1
25、126、127、128、129、130、131、132、133、134、1
35、136、137、138、139、140、141、142、143、144、1
45、146、147、148、149、150、151、152、153、154、1
55、156、157、158、159、160、161、162、163、164、1
65、166、167、168、169、170、171、172、173、174、1
75、176、177、178、179、180、181、182、183、184、1
85、186、187、188、189、190、191、192、193、194、1
95、196、197、198、199、200、201、202、203、204、2
05、206、207、208、209、210、211、212、213、214、2
15、216、217、218、219、220、221、222、223、224、2
25、226、227、228、229、230、231、232、233、234、2
35、236、237、238、239、240、241、242、243、244、2
45、246、247、248、249、250、251、252、253、254、2
55、256、257、258、259、260、261、262、263、264、2
65、266、267、268、269、270、271、272、273、274、2
75、276、277、278、279、280、281、282、283、284、2
85、286、287、288、289、290、291、292、293、294、2
95、296、297、298、299、300、301、302、303、304、3
05、306、307、308、309、310、311、312、313、314、3
15、316、317、318、319、320、321、322、323、324、3
25、326、327、328、329、330、331、332、333、334、3
35、336、337、338、339、340、341、342、343、344、3
45、346、347、348、349、350、351、352、353、354、3
55、356、357、358、359、360、361、362、363、364、3
65、366、367、368、369、370、371、372、373、374、3
75、376、377、378、379、380、381、382、383、384、3
85、386、387、388、389、390、391、392、393、394、3
95、396、397、398、399、400、401、402、403、404、4
05、406、407、408、409、410、411、412、413、414、4
15、416、417、418、419、420、421、422、423、424、4
25、426、427、428、429、430、431、432、433、434、4
35、436、437、438、439、440、441、442、443、444、4
45、446、447、448、449、450、451、452、453、454、4
55、456、457、458、459、460、461、462、463、464、4
65、466、467、468、469、470、471、472、473、474、4
75、476、477、478、479、480、481、482、483、484、4
85、486、487、488、489、490、491、492、493、494、4
95、496、497、498、499、500、または1000または2000または
5000ポリヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプラ
イマーは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブ
リダイズする。好ましくは、本開示の実施形態によるプローブおよびプライマーは、標的
配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列とハイブリダイズす
る能力を保持するプローブを従来の方法によって設計することができる。
ing: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laborato
ry Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。PCRのプライマー対
は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用すること
によって得ることができる。
プローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし
、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること(および、必要であれ
ば、補正すること)ができる。
的DNA配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増
幅の方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のDNAの存在を特定す
ることができる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的
にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される場合、2つの核酸分子は、2
つの分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハ
イブリダイズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示
す場合、その「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一
方のあらゆるヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性
」を示すと言える。完全な相補性を示す分子は、一般に、従来の「高ストリンジェンシー
」条件下で互いにアニーリングしたままであることが可能になるのに十分な安定性で互い
とハイブリダイズする。従来の高ストリンジェンシー条件はSambrookら、1989年に記載さ
れている。
ングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズするこ
とができる場合、「最小相補性」を示す。従来の低ストリンジェンシー条件は、Sambrook
ら、1989年に記載されている。核酸分子がプライマーまたはプローブとしての機能を果た
すためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成できるために
配列と最小相補性があると示すことのみが必要である。
1989年、9.52〜9.55において考察されている特定のハイブリダイゼーション手順による、
核酸プローブの標的核酸(すなわち、対象とする特定の核酸配列)とのハイブリダイゼー
ションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58
も参照されたい。
まな程度を実現するために、ストリンジェントな条件のさまざまな条件またはプローブも
しくはプライマーのポリヌクレオチド配列の縮重を使用することができる。高い選択性を
必要とする適用のために、一般には、あるポリヌクレオチド配列と第2のポリヌクレオチ
ド配列をハイブリダイズさせるために比較的ストリンジェントな条件を用いることがある
。例えば、約50℃〜約70℃の温度で約0.02M〜約0.15MのNaClによって
もたらされるような比較的低塩かつ/または高温の条件を選択することがある。ストリン
ジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション濾過器を高ストリンジェンシー洗浄
緩衝液(0.2×SSC、0.1%のSDS、65℃)で少なくとも2回洗浄することを
伴ってよい。DNAのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件
、例えば、約45℃で6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、その後
50℃で2.0×SSCで洗浄することは、当業者に公知である。例えば、洗浄ステップ
における塩濃度は、低ストリンジェンシーである50℃で約2.0×SSCから高ストリ
ンジェンシーである50℃で約0.2×SSCまでから選択することができる。さらに、
洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件である室温、約22℃から高ス
トリンジェンシー条件である約65℃まで増加させることができる。温度と塩との両方が
変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれかは、他方の変数が変化する一方で
一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、もしあれば、プローブと鋳型または標
的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダイゼーションによってDNA配列を
検出することは当業者に周知であり、米国特許第4,965,188号および同第5,1
76,995号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
で、本明細書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー
(またはアンプリコンもしくは他の配列)の1つまたは複数と特異的にハイブリダイズす
る。本開示の一態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、本明細書において例
示された配列の1つに記載されている核酸配列、またはその相補物および/もしくは断片
を有する。
と、80%から100%の間または90%未満から100%の間の配列同一性を共有する
。本開示の別の態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、そのような配列と9
5%から100%の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を
特定するための植物育種方法において、マーカーとして使用することができる。プローブ
の標的DNA分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によっ
て検出することができ;それらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タ
グ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを挙げることができる。
して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列(またはそ
の相補物)を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること
、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件であ
る。
なハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダ
イズすることを示す。
型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交雑によって生じたダ
イズ植物が、本開示の実施形態のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムD
NAを含有するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したDNAを
、挿入された異種DNAの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプラ
イマー、および挿入された異種DNAに由来する第2のプライマーを含むプライマー対を
使用して、イベントDNAの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増
幅方法に供することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対し
て特徴的である配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ
足す1ヌクレオチド塩基対、および/またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18
、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、4
5、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58
、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、
72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、8
5、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98
、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、
109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、
119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、
129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、
139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、
149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、
159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、
169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、
179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、
189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、
199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、
209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、
219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、
229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、
239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、
249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、
259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、
269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、
279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、
289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、
299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、
309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、
319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、
329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、
339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、
349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、
359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、
369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、
379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、
389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、
399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、
409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、
419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、
429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、
439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、
449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、
459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、
469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、
479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、
489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、
499、または500、750、1000、1250、1500、1750、2000、
またはそれ以上のヌクレオチド塩基対(上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは
引く)にわたってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を
含むアンプリコンが生成されるように、挿入DNAの両側の隣接配列に由来してもよい。
植物のゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入DNA配列からある距離に
位置してよい。この距離は、1ヌクレオチド塩基対から最大約2万ヌクレオチド塩基対ま
でにわたることができる。用語「アンプリコン」の使用は、DNAの熱増幅反応において
形成される可能性があるプライマー二量体を特に除外する。
酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で
公知であり、とりわけ、米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,
202号に記載されている。22kbに至るまでのゲノムDNAを増幅するためにPCR
増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにDNA増幅の技術分野で公知の他の方
法を、本開示の実施形態の実施において使用することができる。本明細書において提供さ
れる配列に由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後
PCRアンプリコンまたはクローニングされたDNAの標準のDNA配列決定を行うこと
により、本主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子DNA挿入断片の配列または隣接
ゲノム配列を検証すること(および必要であれば、補正すること)ができる。
できる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、DNAアンプリ
コンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノム
DNA配列および挿入DNA配列の両方とオーバーラップするDNAオリゴヌクレオチド
を設計する遺伝子ビット分析(Genetic Bit Analysis)である。オリゴヌクレオチドは、
マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のPCR後(挿入配
列内の1つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の1つのプライマーを使用する
)、一本鎖のPCR産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、DN
Aポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したddNTPを使用する一塩
基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。結合した産物の分析は、蛍光シグナルの量
の定量化によって完了することができる。蛍光信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイ
ゼーション、および一塩基伸長に起因して、挿入断片/隣接配列が存在することが示され
る。
るようなパイロシークエンス技法である。この方法では近接するゲノムDNAと挿入DN
Aの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチ
ドを、対象の領域(挿入配列内の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の1つのプラ
イマー)由来の一本鎖のPCR産物とハイブリダイズさせるために設計された、DNAポ
リメラーゼ、ATP、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン5’−
ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。dNTPを個々に加え、
それが取り込まれた結果、測定される光信号がもたらされる。光信号により、増幅、ハイ
ブリダイゼーション、および単一塩基または多塩基の伸長が上首尾であり、したがって導
入遺伝子挿入断片/隣接配列が存在することが示される。
別の方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接DNAと挿入
DNAの接合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象
の領域(挿入DNA内の1つのプライマーおよび隣接ゲノムDNA配列内の1つのプライ
マー)由来の一本鎖のPCR産物とハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼおよび蛍光
標識したddNTPの存在下でインキュベートする。一塩基伸長により、ddNTPが取
り込まれる。蛍光標識したddNTPの取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化と
して測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩
基伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片/隣接配列が存在することを示す。
r City、Calif.)は、DNA配列の存在を検出し、定量する方法である。簡
単に述べると、ゲノムの隣接と挿入DNAの接合部とオーバーラップするFRETオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計する。FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入DN
A配列内の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の1つのプライマー)を、耐熱性ポ
リメラーゼおよびdNTPの存在下でサイクルにかける。特異的な増幅の間に、Taq
DNAポリメラーゼ校正機構により、FRETプローブ上のクエンチング部分から蛍光部
分が放出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、
隣接配列/導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
簡単に述べると、隣接ゲノムDNAと挿入DNAの接合部とオーバーラップするFRET
オリゴヌクレオチドプローブを設計する。FRETプローブの独特の構造により、蛍光部
分およびクエンチング部分が極めて近傍に保たれる二次構造が含有される。FRETプロ
ーブおよびPCRプライマー(挿入DNA配列内の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配
列内の1つのプライマー)を、耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下でサイクルに
かける。PCR増幅が上手くいった後、FRETプローブが標的配列にハイブリダイズす
ることにより、プローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間
的に分離される。蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブ
リダイゼーションの成功によって、隣接ゲノム配列/導入遺伝子挿入断片配列が存在する
ことを示す。
子位置の概ね近くに少なくとも1つの非ダイズイベントpDAB9582.816.15
.1挿入断片を含むダイズ種子および/またはダイズ植物も含む。1つの選択肢は、本明
細書において例示されているダイズイベントpDAB9582.816.15.1挿入断
片を異なる挿入断片で置換することである。一般的には、例えば、特定の実施形態におい
て、標的化相同組換えが使用される。この種類の技術は、例えば、WO03/08080
9A2および対応する公開された米国特許出願(U.S.20030232410)の主
題である。したがって、本開示の実施形態は、本明細書において同定される隣接配列の全
てまたは認識できる部分が隣接する異種挿入断片(多コピーのcry1F、cry1Ac
またはpat遺伝子の代わりにまたはそれと一緒に)を含む植物および植物細胞を包含す
る(配列番号1のbp1−1273および配列番号2のbp176−1687)。cry
1F、cry1Acまたはpatの1つの追加的なコピー(または複数の追加的なコピー
)も、この/これらのように挿入の標的とすることができる。
は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明
細書に組み込まれる。以下の実施例は、本開示の実施形態を実施するための手順を例示す
るため、および本開示のある特定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これら
の実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示
されている技法は、それを実施するための好ましい方式を例示するために使用される特定
の手法を表していることが理解されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本開
示の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これ
らの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の
指定のない限り、全ての百分率は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の
割合は体積による。
bp 塩基対
℃ 摂氏温度
DNA デオキシリボ核酸
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位または発現カセット
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SSC 塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、pH7.
0
TBE トリス塩基、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有する緩衝溶液、pH8.3.
(実施例)
5Jの形質転換および選抜
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含むトランスジェニックダイズ
(Glycine max)を、ダイズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって
生成した。T鎖DNA領域内に選抜マーカー、patv6および対象の遺伝子cry1F
v3およびcry1 Ac synproを含むバイナリーベクターpDAB9582(
図1)を保有する武装解除したアグロバクテリウム株EHA101(Hoodら、1993年)を
使用して形質転換を開始した。pDAB9582のT鎖DNA配列は配列番号3に示され
、下の表1において注釈を付けている。
簡単に述べると、ダイズ種子(Maverick栽培品種)を基本培地上で発芽させ、子
葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。アグロバクテリウムを除去するために
、苗条誘導(shoot initiation)培地、苗条伸長培地、および発根培地にセフォタキシム
、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネートによる選択を使用して、
形質転換されていない苗条の生長を阻害した。選択された苗条を、根を発生させるために
発根培地に移し、次に、小植物を順化させるために土壌混合物に移した。
ーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して、気候順化させ、次に葉にグ
ルホシネートを塗布して耐性を再確認し、推定形質転換体であるとみなした。スクリーニ
ングされた植物の試料を採取し、選択マーカー遺伝子および/または対象の遺伝子を確認
するための分子解析を行った。T0植物を温室内で自家受精させてTi種子を生じさせた
。
転換分離株から生成した。Ti植物を戻し交雑し、その後の世代にわたって優良品種に遺
伝子移入した。イベントをその独特の特性、例えば、単一の挿入部位、正常なメンデル分
離、安定発現、ならびに昆虫抵抗性、除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた
組合せに基づいて選抜した。以下の実施例は、ダイズイベントpDAB9582.816
.15.1を特徴付けるために使用したデータを含有する。
け
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1において発現させた組換え型のC
ry1Fタンパク質、Cry1Acタンパク質、およびPATタンパク質の生化学的性質
を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)は、タンパク質の生化学的
性質を特徴付け、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1におけるこれらの
タンパク質の発現を確認するために用いることができる、当技術分野の範囲内で公知の生
化学的アッセイである。
ry1Acタンパク質の発現
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。0.5%ウ
シ血清アルブミン(BSA)を含有する界面活性剤Tween−20(PBST)を含有
するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からPATタンパク質を抽出し
た。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、P
AT ELISAキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者(En
virologix、Portland、ME)の推奨プロトコールに従って使用した。
このアッセイにより、発現されたPATタンパク質の濃度を測定した。
てダイズ植物の組織からCry1Fタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性
上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Cry1F ELISAキットをサ
ンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者(Strategic Diagn
ostics Inc.、Newark、DE)の推奨プロトコールに従って使用した。
このアッセイにより、発現されたCry1Fタンパク質の濃度を測定した。
ST)を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からCry1Ac
タンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な
緩衝液で希釈し、Cry1Ac ELISAキットをサンドイッチ形式で使用して解析し
た。キットは製造者(Strategic Diagnostics Inc.、New
ark、DE)の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現したC
ry1Acタンパク質の濃度を測定した。
現の安定性および遺伝性を垂直方向(世代間)および水平方向(世代内の系列間)の両方
で調査した。
びPATタンパク質の発現
上記のプロトコルを使用してダイズイベントpDAB9582.816.15.1にお
けるCry1Fタンパク質、Cry1Acタンパク質およびPATタンパク質のレベルを
決定した。ダイズの葉組織から、可溶性の抽出可能なタンパク質を、定量的酵素結合免疫
吸着検定法(ELISA)方法を使用して測定した。T2〜T6世代のダイズイベントp
DAB9582.816.15.1で発現は安定であり(分離性でない)、系列全てにわ
たって一貫していた。表2に、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1にお
けるトランスジェニックタンパク質の平均発現レベルが列挙されている。
おけるDNA配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントpDAB9582.8
16.15.1の隣接ゲノムT−DNA境界領域の配列を決定した。1273bpの5’
隣接境界配列(配列番号1)および1371bpの3’隣接境界配列(配列番号2)を含
むダイズイベントpDAB9582.816.15.1のゲノム配列を確認した。ダイズ
イベントpDAB9582.816.15.1の境界配列に基づくPCR増幅により、境
界領域がダイズ起源であること、および接合領域がダイズイベントpDAB9582.8
16.15.1に独特の配列であることが検証された。接合領域をダイズイベントpDA
B9582.816.15.1のイベント特異的な同定のために使用することができる。
さらに、T鎖の挿入部位を、形質転換されていないダイズのゲノム由来の同定された隣接
境界配列の領域に対応するゲノムの断片を増幅することによって特徴付けた。ダイズイベ
ントpDAB9582.816.15.1を形質転換されていないゲノム配列と比較する
ことにより、T鎖の組み込みの間に元の遺伝子座から約21bpが欠失したことが明らか
になった。全体的に、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の挿入断片お
よび境界配列を特徴付けることにより、pDAB9582由来のT鎖のインタクトなコピ
ーがダイズゲノム内に存在することが示された。
5’隣接境界および3’隣接境界を第03染色体由来のダイズ(Glycine max)全ゲノ
ムショットガン配列に対しアラインメントし、ダイズイベントpDAB9582.816
.15.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第03染色体に挿入されたことが示されている
。ダイズゲノムからダイズイベントpDAB9582.816.15.1の挿入部位を確
認するために、異なるプライマー対を用いてPCRを行った(図2、表3、表4、および
表5)。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1由来のゲノムDNAおよび
他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノム
DNAを鋳型として使用した。5’境界配列が正確であることを確認するために、At
Ubi10プロモーター遺伝子エレメント、例えば、AtUbi1ORV1に結合するよ
うに設計したプライマー、および、ダイズゲノムの第03染色体上のクローニングされた
5’末端境界に結合するように設計したプライマー、81615_FW2と称されるプラ
イマーを、At Ubi1Oプロモーター遺伝子エレメントから5’末端境界配列にわた
るDNAセグメントを増幅するために使用した。同様に、クローニングされた3’境界配
列を確認するために、pat特異的なプライマー、例えば、3’PATEnd05、なら
びに、81615_RV1および81615_RV2と称される、クローニングされた3
’末端境界配列に従って設計したプライマーを、pat遺伝子から3’境界配列にわたる
DNAセグメントを増幅するために使用した。予測されたサイズを有するDNA断片は、
各プライマー対を用いたダイズイベントpDAB9582.816.15.1のゲノムD
NAからのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニ
ック対照由来のDNA試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた5’境
界配列および3’境界配列が、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1のT
鎖挿入断片の隣接境界配列であることを示している。
82.816.15.1のT鎖挿入断片を含有しないゲノムDNAにおいてダイズ境界配
列にわたるPCR増幅を完了した。5’末端境界配列に従って設計したプライマー816
15_FW2、および3’末端境界配列に対して設計した1つのプライマー81615−
RV3を使用して、pDAB9582T鎖が組み込まれた遺伝子座を含有したDNAセグ
メントを増幅した。予測通り、81615_FW2および81615_RV3のプライマ
ー対を用いて完了したPCR反応により、全ての他のダイズ対照系統からおよそ1.8k
bのDNA断片が生じたが、pDAB9582.816.15.1からは生じなかった。
同定されたダイズイベントpDAB9582.816.15.1の5’境界配列および3
’境界配列を第03染色体由来のダイズ(Glycine max)全ゲノムショットガン配列とア
ラインメントすることにより、元の遺伝子座からの約21bpの欠失が明らかになった(
図3)。これらの結果により、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の導
入遺伝子がダイズゲノムの第03染色体の部位に挿入されたことが実証された。
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1
の組み込みパターンを確立した。これらの実験により、cry1Acおよびcry1F導
入遺伝子のダイズゲノム内への組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1は、プラスミドpDAB9582由
来のcry1Acおよびcry1F PTUの単一コピーを含有する全長の、単純な組み
込みイベントであると特徴付けられた。
.15.1のゲノムに挿入されたことが示唆された。詳細なサザンブロット分析を、pD
AB9582.816.15.1のT鎖組み込み領域に含有されるcry1Acおよびc
ry1F遺伝子に特異的なプローブ、およびプラスミド内に位置する切断部位を有し、プ
ラスミドまたはプラスミドとダイズのゲノムDNAの接合部にわたる断片(境界断片)内
にハイブリダイズ断片を生じる説明的な制限酵素を使用して行った。サザンハイブリダイ
ゼーションによって示された制限酵素とプローブの組合せについての分子量は、このイベ
ントに独特であり、その同定パターンを確立した。これらの分析により、cry1Acお
よびcry1FPTUの再配置を伴わずにプラスミド断片がダイズのゲノムDNAに挿入
されたことも示された。
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムDNA(gDNA)の単離
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有する個々のダイズ植物から
回収した葉組織からゲノムDNAを抽出した。さらに、cry1Acおよびcry1F遺
伝子が存在しない物質系統の代表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるM
averickからgDNAを単離した。標準のCTAB法の後、凍結乾燥した葉組織か
ら個々のゲノムDNAを抽出した。抽出した後、DNAを、Pico Green試薬(
Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して分光蛍光分析によって定量
した。
DNAの消化および分離
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1をサザンブロットによって分子キ
ャラクタリゼーションするために、10マイクログラム(10μg)のゲノムDNAを消
化した。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1および非トランスジェニッ
クダイズ系統であるMaverick由来のゲノムDNAを、各DNA試料にDNA1μ
g当たりおよそ5ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えること
によって消化した。各試料を、およそ37℃で一晩インキュベートした。単独消化のため
に、制限酵素AseI、HindIII、NsiI、およびNdeIを個々に使用した(
New England BioLabs、Ipswich、MA)。二重消化のために
制限酵素NotIおよびApaLIを一緒に使用した(New England Bio
Labs、Ipswich、MA)。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、
プラスミドDNAであるpDAB9582を非トランスジェニックダイズ品種であるMa
verick由来のゲノムDNAと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドDN
A/ゲノムDNA反応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化し
た。
tion(Edge Biosystems、Gaithersburg、MD)25μ
Lを加え、消化されたDNA試料を、イソプロパノールを用いて沈澱させた。沈澱したD
NAペレットを、1×ローディング緩衝液(0.01%ブロモフェノールブルー、10.
0mMのEDTA、10.0%グリセロール、1.0mMのトリス、pH7.5)15μ
Lに再懸濁させた。次いで、DNA試料および分子サイズマーカーを、0.4×TAE緩
衝液(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)を用いた0
.85%未満のアガロースゲルにより、35ボルトでおよそ18〜22時間、電気泳動し
て断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジウム(Invitrogen、Carlsb
ad、CA)で染色し、DNAを紫外線(UV)の下で可視化した
サザン転写およびメンブレン処理
サザンブロット分析を基本的にMemelinkら(1994年)に記載されている通
り実施した。簡単に述べると、DNA断片を電気泳動によって分離し、可視化した後、ゲ
ルを、0.25MのHClを用い、およそ20分にわたって脱プリン化し、次いで、変性
溶液(0.4MのNaOH、1.5MのNaCl)におよそ30分間、その後、中和溶液
(1.5MのNaCl、0.5Mのトリス、pH7.5)に少なくとも30分間曝露させ
た。ナイロンメンブレンへのサザン転写を、10×SSCを伴うウィッキング系を用いて
一晩実施した。転写後、UV架橋によってDNAをメンブレンに結合させ、その後、メン
ブレンを2×SSC溶液で簡単に洗浄した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーショ
ンのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。
DNAプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したDNA断片を検出した(表
6)。ジゴキシゲニン(DIG)標識されたヌクレオチド[DIG−11]−dUTPを
、遺伝子エレメントに特異的なプライマーを使用してプラスミドpDAB9582から増
幅されたDNA断片にPCRに基づいて組み込むことによってプローブを生成した。PC
R合成によるDNAプローブの生成を、PCR DIG Probe Synthesi
s Kit(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)
を製造者の推奨手順に従って使用して行った。
を決定した。次いで、基本的にDIG Easy Hyb Solution(Roch
e Diagnostics、Indianapolis、IN)に関して記載されてい
る手順を用いて、特異的な断片を検出するために、所望の量の標識したプローブをナイロ
ンメンブレン上の標的DNAとハイブリダイズさせるために使用した。簡単に述べると、
固定されたDNAを含有するナイロンメンブレンブロットを2×SSCで簡単に洗浄し、
ハイブリダイゼーションビン中の予め温めたDIG Easy Hyb Solutio
n20〜25mLと、ハイブリダイゼーションオーブン内、およそ45〜55℃で約2時
間にわたってプレハイブリダイズさせた。次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をデ
カントし、サーマルサイクラー中でおよそ5分間加熱することによって変性させた所望の
量の特異的なプローブを含有する予め温めたDIG Easy Hyb Solutio
n約15mLと交換した。次いで、ハイブリダイゼーションステップをハイブリダイゼー
ションオーブン内、およそ45〜55℃で一晩行った。
yb Solutionを清潔なチューブ内にデカントし、およそ−20℃で保管した。
これらのプローブは、製造者の推奨手順に従って2回再使用することができた。メンブレ
ンブロットを簡単にすすぎ、清潔なプラスチック容器中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝
液(2×SSC、0.1%SDS)を用いて室温でおよそ5分にわたって2回洗浄し、そ
の後、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.1×SSC、0.1%SDS)を用いて2
回、それぞれおよそ65℃で15分間洗浄した。メンブレンブロットを、DIG Was
h and Block Buffer Set(Roche Diagnostics
、Indianapolis、IN)の1×マレイン酸緩衝液を用いておよそ5分にわた
って簡単に洗浄した。その後、1×ブロッキング緩衝液で2時間にわたってブロッキング
し、同じく1×ブロッキング緩衝液中の抗DIG−AP(アルカリホスファターゼ)抗体
(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)と一緒に最
低でも30分間インキュベートした。1×洗浄緩衝液を用いて2〜3回洗浄した後、特異
的なDNAプローブはメンブレンブロットに結合したままであり、DIG標識されたDN
A標準物質を、CDP−Star Chemiluminescent Nucleic
Acid Detection System(Roche Diagnostics
、Indianapolis、IN)を製造者の推奨に従って使用して可視化した。1つ
または複数の時点でブロットを化学発光フィルムに曝露させて、ハイブリダイズした断片
を検出し、分子サイズ標準物質を可視化した。フィルムをALL−Pro 100 Pl
usフィルム現像剤(Konica Minolta、Osaka、Japan)を用い
て現像し、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを各プローブについ
て実証した。記載の通りDIG検出後に可視化されるDIG−Labeled DNA
Molecular Weight Marker II(DIG MWM II)およ
びDIG−Labeled DNA Molecular Weight Marker
VII(DIG MWM VII)を使用して、サザンブロット上にハイブリダイズし
た断片サイズを決定した。
サザンブロットの結果
cry1Acおよびcry1FPTUの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物お
よびプローブに関して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表7に示され
ている。これらの消化およびハイブリダイゼーションから2種類の断片を同定した:公知
の酵素部位がプローブ領域に隣接し、cry1Acおよびcry1FPTUの挿入領域内
に完全に含有されている内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置
し、第2の部位がダイズゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、DNA
断片の組み込み部位はそれぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベン
トごとに変動する。境界断片により、組み込まれたDNAに対して制限酵素部位を位置づ
ける手段およびDNA挿入物の数を評価する手段がもたらされる。ダイズイベントpDA
B9582.816.15.1を含有するダイズの多世代に対して完了したサザンブロッ
ト分析により、プラスミドpDAB9582由来の低コピー、インタクトなcry1Ac
およびcry1FPTUが、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1のダイ
ズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。
結合および分割する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントpDAB9582.81
6.15.1におけるcry1Ac遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。728
6bpより大きいまたは9479bpより大きい境界断片は、それぞれAseIおよびN
siIで消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された(表7)。それぞ
れAseIおよびNsiI消化を使用したとき、約8500bpおよび10000より大
きいbpの単一のcry1Acハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブが
このサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントpDAB9582
.816.15.1のダイズゲノム内にcry1Ac遺伝子に対する単一の挿入部位が存
在することが示唆される。制限酵素NotIおよびApaLIを、cry1Ac植物転写
単位(PTU、プロモーター/遺伝子/ターミネーター)を含有する断片を放出し、二重
消化をさせるために選択した(表7)。予測された4550bpの断片は、NotIおよ
びApaLI二重消化した後、プローブを用いて観察された。酵素を用いてpDAB95
82.816.15.1試料を消化し、その後プローブとハイブリダイズさせることで得
られた結果により、プラスミドpDAB9582由来のインタクトなcry1AcPTU
の単一コピーがダイズイベントpDAB9582.816.15.1のダイズゲノムに挿
入されたことが示された。
、切断する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントpDAB9582.816.15
.1におけるcry1F遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。5569bpより
大きい境界断片および9479より大きい境界断片は、それぞれNdeIおよびNsiI
で消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された(表7)。NdeIおよ
びNsiIを使用したとき、それぞれ約7500bpおよび10000bpより大きい単
一のcry1Fハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバ
ンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントpDAB9582.816.15
.1のダイズゲノム内にcry1F遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆
される。制限酵素HindIIIを、cry1F植物転写単位(PTU;プロモーター/
遺伝子/ターミネーター)を含有する断片を放出させるために選択した(表7)。予測さ
れた7732bpの断片が、HindIII消化後にプローブを用いて観察された。pD
AB9582.816.15.1試料を酵素で消化し、その後プローブとハイブリダイズ
させることで得られた結果により、プラスミドpDAB9582由来のインタクトなcr
y1F PTUがダイズイベントpDAB9582.816.15.1のダイズゲノムに
挿入されたことが示された。
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1にスペクチノマイシン抵抗性遺伝
子(specK)、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfA
(TRf Aエレメント)が存在しないことを検証するために、サザンブロット分析も行
った。適切な陽性対照(MaverickゲノムDNAにpDAB9582を付加したも
の)および陰性対照(MaverickゲノムDNA)をサザン分析に含めた場合、スペ
クチノマイシン抵抗性、Ori Repエレメントまたはtrf Aエレメントに対する
特異的なハイブリダイゼーションは予測されなかった。NsiI消化し、specR特異
的なプローブとハイブリダイズさせた後、陽性対照試料(MaverickゲノムDNA
にpDAB9582を付加したもの)において、15320bpの、1つの予測されたサ
イズのバンドが観察された。specRプローブは陰性対照の試料およびダイズイベント
pDAB9582.816.15.1の試料とはハイブリダイズしなかった。同様に、N
siI消化し、trfAプローブとハイブリダイズさせた後、15320bpの、1つの
予測されたサイズのバンドが陽性対照試料(pDAB9582プラスmaverick)
において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントpDAB9582.816
.15.1の試料では検出されなかった。NdeI消化し、OriRep特異的なプロー
ブとハイブリダイズさせた後、5329bpの、別の予測されたサイズのバンドが陽性対
照試料(MaverickゲノムDNAにpDAB9582を付加したもの)において検
出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントpDAB9582.816.15.1
の試料では検出されなかった。これらのデータは、ダイズイベントpDAB9582.8
16.15.1にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ori Repエレメントおよび複
製開始タンパク質trfAが存在しないことを示している。
反復農業試験を実行して、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の農業
での有効性をヌル同質遺伝子系統であるMaverickと比較した。圃場試験の大多数
について、米国全土にわたって地理的に別個の場所に設置し、そこでダイズイベントpD
AB9582.816.15.1を含有するダイズ品種を栽培した。追加的な圃場試験を
これらの場所の外で完了し、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有
するダイズ品種を、好ましくない場所で生長させることにより生じる潜在的なストレスに
曝露させるために選択した。少数の圃場試験の中での環境の変動性に起因して、いくつか
の現場では試験を中止した。
として設定した。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含めて8種をエ
ントリーした。各小区画は作条2つ、長さ12.5フィートからなり、30インチ離して
植えた。季節を通して、圃場の小区画を通常の農業習慣の下で維持し、雑草がない状態に
保った。
DAB9582.816.15.1およびMaverickの種子を、種子が原因のいか
なる変動性も最小限にするために同じ苗床で生長させ、同様に処理した。次に、種子を北
アメリカに戻し、そこで包装し、種々の植え付け場所に分配した。季節を通していくつも
の農業特性を測定した。これらの特性およびデータを収集した生長段階は表8に列挙され
ている。
JMP(登録商標)Pro 9.0.3(SAS、Cary、NC)を使用してデータ解
析を行った。解析のために混合モデルを使用し、エントリーを固定効果とみなし、場所、
エントリーごとの場所、および反復効果を変量とみなした。この解析からの最小二乗平均
が表9において報告されている。有意なエントリー効果が測定された変数についてはその
後にスチューデントのT検定を使用して平均分離(mean separation)を実施して、Ma
verickとダイズイベントpDAB9582.816.15.1の比較を行った。有
意性を決定するための確率水準はp=0.05に設定した。
いてダイズイベントpDAB9582.816.15.1とMaverickの間で同等
性が示された。ダイズイベントpDAB.816.15.1はMaverickの約2日
後に開花した。2日の遅延は生産者にとって大きな遅延ではなく、作物の生産力を損なう
ものではない。小区画内の植物のおよそ50%が開花を示した時に小区画の開花とみなし
た。同様に、ダイズイベントpDAB9582.816.15は季節の最後にMaver
ickの1日後に成熟したが、この遅延によって作物の生産力が損なわれるような著しい
農業上の差異は生じなかった。同様に、ダイズイベントpDAB9582.816.15
の種子100個の重量はMaverickと統計学的に異なったが、これによって収量の
有意な減少は生じなかった。結果は、ダイズイベントpDAB9582.816.15が
Maverickとは発育の仕方が異なり得るが、差異は最小限であり、商業的に生長さ
せたダイズの正常範囲の外には出ないことを示している。
プエルトリコ、サンタイサベルにおける有効性試験において該イベントを植えた。ダイズ
イベントpDAB9582.816.15.1を作出するために最初に形質転換した栽培
品種Maverickを各苗床に植え、実験に対照として含めた。T3苗床の種子はT2
段階における単一植物選択から得、T4苗床の種子はT3段階における単一植物選択から
得た。各世代において4系列のイベントを試験した。作条4つの広さ、7.5フィートの
長さの小区画に各系列を植えた。作条間の間隔は30インチであった。プエルトリコの日
の短さを補償するために、小区画を光の下でおよそ2.5週間にわたって生長させた。各
苗床にグルホシネートを411g ae/haの比率で噴霧した。対照植物であるMav
erickの1つの小区画に、グルホシネートを同じ比率で噴霧し、第2の小区画には噴
霧せず、イベントに対する対照比較として使用した。ダイズイベントpDAB9582.
816.15.1はグルホシネート除草剤施用に対する耐性を示した。対照的に、除草剤
処理に対して耐性のMaverick植物は存在しなかった。
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1のCry1Acタンパク質および
Cry1Fタンパク質によってもたらされる、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticars
ia gemmatalis)(ハッショウマメイモムシ)、シュードプルシア・インクルデンス(Pse
udoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodo
ptera frugiperda)(ツマジロクサヨトウ(fall armyworm))およびヘリオチス・ビレ
センス(Heliothis virescens)(タバコバッドワーム(tobacco budworm))を含めた鱗
翅目の昆虫を含めたダイズ害虫からの植物の保護のレベルを特徴付けるために、圃場およ
び温室での評価を行った。
pDAB9582.816.15.1およびMaverick対照を評価した。試験した
各昆虫種(A.ゲムマタリス(A. gemmatalis)、P.インクルデス(P. includes)、お
よびS.フルギペルダ(S. frugiperda)新生幼虫)について、合計45のリーフディス
ク/植物/昆虫種のために各植物から3つのリーフディスクを切り取った。1.4cmの
リーフパンチを2%の素寒天の上部の試験アリーナに置き、新生幼虫1匹を外寄生させ、
穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。
虫は死亡したとみなした。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有す
る植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Maverick対照上に置いた昆虫よりも有
意に高かった(スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)について死亡率
86%、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)について死亡率10
0%、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)について死亡率1
00%)。表10。昆虫に消費されたリーフディスクの百分率を視覚的にスコアリングす
ることによって葉の損傷を評価した。温室での実験から得られた結果により、ダイズイベ
ントpDAB9582.816.15.1では、アンチカルシア・ゲムマタリス(Antica
rsia gemmatalis)、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)、
およびスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)の外寄生に対して、Ma
verick対照植物と比較して有意に低い葉の損傷および高い昆虫の死亡率が持続した
ことが示された。
価を、プエルトリコ、サンタイサベルの種子増加苗床小区画から葉の試料を収集し、これ
らの葉をバイオアッセイするためにIN、インディアナポリスに送ることによって行った
。T3ダイズイベントpDAB9582.816.15.1植物のための苗床小区画は、
4つの作条に配置されたおよそ180の植物からなった。各作条は長さ2.3mであり、
76.2cmの間隔があけられ、個々の植物は各作条内に5.1cmの間隔で植えられた
。分裂組織のおよそ4節下に位置する完全に増大した主茎の三出葉1枚のバイオアッセイ
を行った。三出葉組織をイベントpDAB9582.816.15.1を有する10の個
々のダイズ植物および10の個々の「Maverick」植物から、切除した。葉を包装
して実験室に移した。実験室において、各三出葉から直径3.33cmのリーフディスク
1つまたは2つを押し抜き、合計16のリーフディスクを準備した。各リーフディスクを
2%の寒天の上部の試験アリーナに置き、新生ヨトウガ(S. frugiperda)幼虫1匹を外
寄生させ、穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。リーフディスクを、制御された環境
のチャンバー内で7日間保持し、7日の時点で死亡率および葉の消費を評価した。穏やか
な触針に反応しない幼虫は死亡したとみなした。
虫を死亡したとみなした。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有す
る植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Maverick対照上に置いた昆虫(スポド
プテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)について死亡率0%)よりも有意に高
かった(スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)について死亡率68%
)。表10。昆虫に消費されたリーフディスクの百分率を視覚的にスコアリングすること
によって葉の損傷を評価した。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズ
イベントpDAB9582.816.15.1に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ
(Spodoptera frugiperda)の幼虫では、Maverick対照植物に曝露させたスポド
プテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)の幼虫よりも有意に低い葉の損傷およ
び昆虫の生存(高い昆虫の死亡率としても説明される)が持続したことが示された。
0の第1の圃場試験)において評価した。ダイズイベントpDAB9582.816.1
5.1を含有する、T4世代からのダイズ種子、および形質転換されていないダイズ品種
Maverickの種子を、完全乱塊法計画、反復数2で植えた。各反復小区画は作条2
つ、長さ2.3mおよび0.76mの間隔からなった。作条内に、作条当たり種子40個
を5.7cmの間隔で植えた。試験種子を植え、一方の反復にグルホシネート除草剤を4
11g ae/haで噴霧し、他方の反復にはこれを噴霧せず、その結果、Maveri
ck植物に関して噴霧していない反復のみがバイオアッセイのために生存した。
アッセイのために葉を収集する数日前に、同じ植物の1節下の葉(および古い葉)からリ
ーフパンチを取得し、Cry1Acタンパク質およびCry1Fタンパク質の発現につい
て、実施例2に記載のものと同様のELISA法を使用して分析した(表12)。分裂組
織の4節下に位置し、損傷または変色の徴候が示されてない完全に増大した主茎の三出葉
をバイオアッセイのために切除した。反復当たり15の植物のそれぞれから三出葉を1枚
切除した。葉を15℃で保管し、バイオアッセイした。各三葉の小葉を切除し、ダイズイ
ベントpDAB9582.816.15.1の小葉のそれぞれの中心から直径3.33c
mのディスクを1枚切り取り、Maverickの小葉それぞれから直径3.33cmの
ディスクを2枚切り取った。これらのリーフディスクをそれぞれ、32ウェルのプラスチ
ックバイオアッセイトレーの別々の標識したウェルに入れた。各ウェルは寒天の薄い層を
含有した。新生P.インクルデンス(P. includens)の幼虫、新生A.ゲムマタリス(A.
gemmatalis)の幼虫、または新生ヨトウガ(S. frugiperda)の幼虫1匹を各リーフディ
スク上に置いた。換気をもたらすためにバイオアッセイトレーを穴のあいた接着性のプラ
スチックシートで密閉した。各種について、幼虫30匹をダイズイベントpDAB958
2.816.15.1からの葉組織に曝露させ、幼虫30匹をMaverickからの葉
組織に曝露させた。外寄生させたリーフディスクを保持するプラスチックトレーを25℃
、相対湿度(RH)40%で保持した。7日後に、幼虫について、死亡した(鋭い針を用
いて刺激しても動かない)か、発育が阻止された(Maverickの葉の上に保持され
た幼虫よりもサイズが小さい)か、または生きている(サイズおよび刺激に対する応答が
正常である)かを決定した。
.1を含有する植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Maverick対照上に置いた
昆虫よりも有意に高かった(スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)に
ついて死亡率97%、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)につい
て死亡率100%、およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens
)について死亡率100%)。表10。この葉のバイオアッセイから得られた結果により
、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1に曝露させたスポドプテラ・フル
ギペルダ(Spodoptera frugiperda)、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemm
atalis)、およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)の幼虫
では、Maverick対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
frugiperda)、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)、およびシュ
ードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)の幼虫よりも有意に低い昆虫
の生存(高い昆虫の死亡率としても説明される)が持続したことが示された。
表10の第2の圃場試験)で評価した。ダイズイベントpDAB9582.816.15
.1を含有する、T4世代からのダイズ種子および形質転換されていないダイズ品種Ma
verickの種子を完全乱塊法計画、反復数4で植えた。各反復小区画は作条4つ、長
さ6.1mおよび1.02mの間隔からなった。作条内に、作条当たり種子160個を3
.8cmの間隔で植えた。ネイティブな害虫集団を誘引するために試験小区画の間および
その周りの追加的な作条にMaverickを植えた。
なバイオアッセイのための葉を、ダイズ植物がR5生長段階になった時に同じ植物から収
集した。各バイオアッセイのために葉を収集する数日前に、同じ植物の1節下の葉からリ
ーフパンチを取得し、Cry1Acタンパク質およびCry1Fタンパク質について実施
例2に記載のものと同様のELISA法を使用して分析した(表12)。分裂組織の4節
下に位置し、損傷または変色の徴候が示されてない完全に増大した主茎の三出葉をバイオ
アッセイのために切除した。反復当たり15の植物のそれぞれから三出葉を1枚切除し、
反復当たり三葉4枚をP.インクルデンス(P. includens)のバイオアッセイのために使
用し、反復当たり三葉4枚をヨトウガ(S. frugiperda)のバイオアッセイのために使用
し、反復当たり三葉4枚をH.ビレセンス(H. virescens)のバイオアッセイのために使
用し、反復当たり三葉3枚をA.ゲムマタリス(A. gemmatalis)のバイオアッセイのた
めに使用した。各三葉の両側の小葉を切除し、寒天の薄い層を含有する別々の標識したペ
トリ皿に入れた。P.インクルデンス(P. includens)、A.ゲムマタリス(A. gemmata
lis)、ヨトウガ(S. frugiperda)、またはH.ビレセンス(H. virescens)の二齢の幼
虫2匹を各小葉上に置いた。P.インクルデンス(P. includens)、ヨトウガ(S. frugi
perda)、およびH.ビレセンス(H. virescens)については、幼虫64匹をダイズイベ
ントpDAB9582.816.15.1およびMaverick植物からの葉組織に曝
露させた。A.ゲムマタリス(A. gemmatalis)については、幼虫48匹をダイズイベン
トpDAB9582.816.15.1およびMaverick対照植物からの葉組織に
曝露させた。外寄生させた小葉を保持するペトリ皿を蓋で覆い、25℃、RH40%で保
持した。4日後に、幼虫について、死亡した(鋭い針を用いて刺激しても動かない)か、
瀕死である(幼虫は刺激には応答するが、端に置いても元に戻ることができない)か、発
育が阻止された(Maverickの葉の上に保持された幼虫よりもサイズが小さい)か
、または生きている(サイズおよび刺激に対する応答が正常である)かを決定した。
ス(H. virescens)について、小葉3枚全てを各三葉から切除し、二齢の幼虫1匹を各小
葉上においたことを除いてR2段階で使用した手順と同じであった。これにより、ヨトウ
ガ(S. frugiperda)およびH.ビレセンス(H. virescens)の幼虫48匹がダイズイベ
ントpDAB9582.816.15.1およびMaverickからの小葉に曝露され
た。
後の死亡率を評価した。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有する
植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Maverick対照上に置いた昆虫よりも有意
に高かった(スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)に関してR2の葉
のバイオアッセイについて死亡率69%およびR5の葉のバイオアッセイについて死亡率
54%、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)に関してR2の葉の
バイオアッセイとR5の葉のバイオアッセイの両方について死亡率100%、ヘリオチス
・ビレセンス(Heliothis virescens)に関してR2の葉のバイオアッセイについて死亡
率95%およびR5の葉のバイオアッセイについて死亡率70%、ならびにシュードプル
シア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)に関してR2の葉のバイオアッセイに
ついて死亡率100%およびR5の葉のバイオアッセイについて死亡率98%)。表10
。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズイベントpDAB9582.
816.15.1に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)
、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)、シュードプルシア・イン
クルデンス(Pseudoplusia includens)およびヘリオチス・ビレセンス(Heliothis vire
scens)の幼虫では、Maverick対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペル
ダ(Spodoptera frugiperda)、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis
)、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)およびヘリオチス・
ビレセンス(Heliothis virescens)の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存(高い昆虫の死
亡率としても説明される)が持続したことが示された。
びMaverickダイズ植物からダイズのさやを収集し、H.ビレセンス(H. viresce
ns)の幼虫を用いてバイオアッセイした。各反復小区画内でランダムに選択した6つの植
物から主茎の一番上のさや2つを切除した。さやのセットそれぞれをプラスチックペトリ
皿に入れ、二齢のH.ビレセンス(H. virescens)の幼虫1匹を外寄生させた。ダイズイ
ベントpDAB9582.816.15.1およびMaverick対照植物から収穫さ
れたさやのセットに幼虫24匹が曝露されるように実験を設計した。ペトリ皿を上記の切
除した葉のバイオアッセイと同じ条件下で保持した。2日後に、葉のバイオアッセイにつ
いて記載されている手順を使用してH.ビレセンス(H. virescens)の幼虫の生存を観察
した。
.816.15.1を含有するダイズのさやの上に置いた昆虫の死亡率はMaveric
k対照のさやの上に置いた昆虫よりも有意に高かった(ヘリオチス・ビレセンス(Heliot
his virescens)に関するダイズのさやのバイオアッセイについて死亡率50%)。表1
0。圃場で生長させたダイズのさやでのこのアッセイから得られた結果により、ダイズイ
ベントpDAB9582.816.15.1に曝露させたヘリオチス・ビレセンス(Heli
othis virescens)の幼虫では、Maverick対照植物に曝露させたヘリオチス・ビ
レセンス(Heliothis virescens)の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存(高い昆虫の死亡
率としても説明される)が持続したことが示された。
ick対照のダイズ植物の頂端部(2つ〜3つの増大している三出葉および未成熟のさや
の集団を有する主茎の一番上の部分)にH.ビレセンス(H. virescens)の卵を外寄生さ
せた。H.ビレセンス(H. virescens)の卵をおよそ20個有するチーズクロスの切片を
各反復小区画内でランダムに選択した5つの植物(全部で20の植物を試験した)の頂端
部に置き、プラスチックで覆った紙クリップを用いて定位置に保持した。布製のメッシュ
の袋を頂端部にかぶせ、メッシュの袋の開放端を主茎の周りでビニールタイを用いて固定
した。メッシュの袋の代表的なセットにおいて卵の孵化を毎日モニターした。全ての卵が
孵化した後に、5つの植物に取り付けた各メッシュの袋内で生きているH.ビレセンス(
H. virescens)の幼虫の数を計数した。
虫の幼虫の平均数は、Maverick対照の頂端部の昆虫よりも有意に低かった(ヘリ
オチス・ビレセンス(Heliothis virescens)に関するダイズの頂端部のバイオアッセイ
について0.00数の昆虫)。表11。このアッセイから得られた結果により、ダイズイ
ベントpDAB9582.816.15.1に曝露させたヘリオチス・ビレセンス(Heli
othis virescens)の幼虫では、Maverick対照植物に曝露させたヘリオチス・ビ
レセンス(Heliothis virescens)の幼虫よりも有意に少ない数の昆虫の生存が持続した
ことが示された。
1回、4週間にわたって行った。各小区画の中央の2つの作条から試料採取した。中央の
2つの作条の間のランダムに選択した位置に91cm×91cmの白い布を置いた。シー
トの一端に近接する作条の区分内の植物を布の上に曲げ、15回振って、存在するあらゆ
る昆虫を取り出した。布の逆端にある作条についてこのプロセスを繰り返した。幼虫を種
およびサイズごとに計数した。長さが6mm未満の幼虫を小さな幼虫として計数し、長さ
が6mm以上の幼虫を大きな幼虫として計数した。次の測定を行う前に布から全ての昆虫
を除去した。布を中央の2つの作条の間の第2のランダムに選択した位置に移動させ、試
料採取プロセスを繰り返し、これにより、各試料採取日に小区画当たり2つの副試料をも
たらした。
数された昆虫の平均数は、Maverick対照の1.82mの作条にわたって計数され
た昆虫の数よりも有意に低かった(シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia i
ncludens)について0.00数の昆虫)。表11。このアッセイから得られた結果により
、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1へのシュードプルシア・インクル
デンス(Pseudoplusia includens)の外寄生は、Maverick対照植物に曝露させた
シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)の外寄生よりも有意に少
ないことが示された。
ベントpDAB9582.816.15.1に曝露させた鱗翅目の幼虫では、Maver
ick対照植物に曝露させた幼虫よりも有意に低い生存が持続したことが示された。した
がって、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1はこの広い範囲の害虫に殺
虫活性を有する。
配列番号14にダイズイベントpDAB9582.816.15.1の予測される配列
が提供されている。この配列は、5’ゲノム隣接配列、pDAB9582の予測されるT
鎖挿入断片および3’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号14に関して、残基1〜12
73は5’ゲノム隣接配列であり、残基1274〜13658はpDAB9582T鎖挿
入の残基であり、13659〜13821はpDAB9582プラスミドからの再配置の
残基であり、残基13822〜15170は3’隣接配列である。したがって挿入断片の
5’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号14の残基1273〜1274に生
じる。したがって挿入断片の3’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号14の
残基13658〜13659に生じる。
、配列番号1、配列番号2、およびpDAB9582のt鎖のアラインメントから組み立
てられたものであることに留意すべきである。ダイズイベントpDAB9582.816
.15.1のT鎖挿入断片の実際の配列は配列番号14からわずかに逸脱する可能性があ
る。T鎖挿入を植物細胞のゲノムに導入する形質転換プロセスの間に、挿入断片のいくつ
かの欠失または他の変更が起こることは珍しくない。さらに、PCR増幅において、軽微
な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得る。例えば、本明細書におい
て列挙されている隣接配列は、ダイズのゲノムDNAからアンプリコンを生成し、次いで
アンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムDNAから
配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮する
と、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだ
されることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーま
たは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本開示の範囲内であることを認識し、留
意するべきである。したがって、本明細書において提供されるプラスミド配列の関連する
セグメントは、いくつかの軽微な変動を含んでよい。したがって、本開示の挿入断片配列
に対していくらかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は本開示の範囲内
である。配列番号14の配列に対する同一性とは、本明細書で例示または記載されている
配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
7%、98%、99%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。隣接配
列プラス挿入断片配列の配列は、寄託された種子を照会することで確認することができる
。したがって、配列番号14とダイズイベントpDAB9582.816.15.1の実
際のT鎖挿入との間のいくつかの差異を同定することができる。
取り合わせおよび詳細を改変することができることが当業者には明らかであるはずである
。我々は添付の特許請求の範囲の主旨および範囲内に入る全ての改変について特許請求す
る。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]
昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される配列を含むDNAを含み、前記配列が、ダイズイベント9582.816.15.1の存在に特徴的である、方法。
[2]
前記昆虫がシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)である、[1]に記載の方法。
[3]
前記昆虫がアンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ハッショウマメイモムシ)である、[1]に記載の方法。
[4]
前記昆虫がスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(ツマジロクサヨトウ)である、[1]に記載の方法。
[5]
前記昆虫がヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)(タバコバッドワーム)である、[1]に記載の方法。
[6]
ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される配列を含むDNAを含むダイズ植物を含み、前記配列がダイズイベント9582.816.15.1の存在に特徴的である、方法。
[7]
配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列を含む単離されたDNA配列。
[8]
ダイズ植物を育種する方法であって、
第1のダイズ植物と第2のダイズ植物を交雑させて第3のダイズ植物を作出するステップであり、前記第1のダイズ植物が配列番号1の1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むDNAを含む、ステップと、前記第3のダイズ植物を、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列およびその相補物を含むDNAの存在についてアッセイするステップとを含む方法。
[9]
配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される少なくとも1つの配列およびその相補物を含む接合部配列を含む単離されたDNA分子。
[10]
シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)に対して抵抗性であり、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列およびその相補物を有するDNAを含む、ダイズ植物またはその部位。
[11]
[10]に記載の植物の種子。
[12]
ダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油からなる群から選択される生産品である、[6]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[13]
ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列およびその相補物を含むDNAを含むことによって実証される、前記粒、種子、ミール、または粉にダイズイベント9582.816.15.1を含めるステップを含む方法。
[14]
ゲノム内に、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;配列番号2のbp75〜275からなる群から選択されるDNA配列;ならびにその相補物を含むダイズ種子。
[15]
[14]に記載のダイズ種子から生長させたダイズ植物。
[16]
花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記ダイズイベント9582.816.15.1を含む、[15]に記載のダイズ植物の部位。
[17]
ダイズミール、ダイズ粉(soybean flour)、およびダイズ油(soybean oil)からなる群から選択される生産品である、[15]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[18]
配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するDNA配列を含むトランスジェニックダイズ植物。
[19]
ダイズイベント9582.816.15.1を含むトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がAmerican Type Culture Collectionに受託番号PTA−12588の下で寄託されているダイズイベント9582.816.15.1を含む、トランスジェニックダイズ植物またはその部位。
Claims (19)
- 除草剤耐性および昆虫抵抗性を有するトランスジェニックダイズ植物であって、配列番号14のヌクレオチド配列を含むダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含み、Cry1F、Cry1AcおよびPAT遺伝子を発現することができる、トランスジェニックダイズ植物。
- 配列番号14のヌクレオチド配列を含むダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含み、Cry1F、Cry1AcおよびPAT遺伝子を発現することができるトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、前記トランスジェニックダイズ植物の種子がAmerican Type Culture Collectionに受託番号PTA−12588の下で寄託されている、トランスジェニックダイズ植物またはその部位。
- 前記ダイズ植物またはその部位が、配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、ならびにその相補物を有するDNAを含む、請求項2に記載のトランスジェニックダイズ植物。
- 請求項1に記載の植物からのダイズ種子であって、前記ヌクレオチド配列を含むダイズ種子。
- 前記トランスジェニックダイズ植物が、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)に対して抵抗性であり、かつ、グルホシネート耐性である、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物またはその部位。
- 配列番号14のヌクレオチド配列を含み、除草剤耐性と昆虫抵抗性を有する、請求項4に記載の種子を生長させることによって作出されるトランスジェニックダイズ植物。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含む、請求項1に記載のトランスジェニックダイズ植物。
- 配列番号14のヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
- ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の接合部配列を含み、前記接合部配列が配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含む、請求項8に記載の単離されたDNA分子。
- 請求項2、3および5のいずれかに記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物であって、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油からなる群から選択される生産品であり、配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含むDNAを含む、組成物。
- 花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、配列番号14のヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載のダイズ植物の部位。
- ダイズ植物に除草剤耐性および2つの昆虫抵抗性形質を遺伝子移入する方法であって、請求項1に記載のダイズ植物を第2のダイズ植物と交雑させて第3のダイズ植物を作出するステップ、および前記第3のダイズ植物を、配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位から選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列ならびにその相補物を含むDNAの存在についてアッセイするステップとを含む、方法。
- 昆虫を請求項1のトランスジェニックダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記トランスジェニックダイズ植物が配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むDNAを含む、方法。
- 前記昆虫がシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ハッショウマメイモムシ)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(ツマジロクサヨトウ)およびヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)(タバコバッドワーム)から選択される、請求項13に記載の方法。
- ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むDNAを含む請求項1のトランスジェニックダイズ植物を含む、方法。
- Cry1F、Cry1AcおよびPAT遺伝子を発現するDNA挿入物を含み、前記DNA挿入物が前記挿入物の5’末端で配列番号1に隣接し、かつ、前記DNA挿入物が前記挿入物の3’末端で配列番号2に隣接する、請求項1〜3および5〜7のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物。
- ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉を配列番号14を含むDNAを含むダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含むダイズ植物から得ることを含む方法。
- 請求項1〜3、5〜7および16のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物を作出する方法であって、配列番号14内のCry1F、Cry1AcおよびPAT遺伝子をコードする配列を含むヌクレオチド配列を用いてダイズ植物を形質転換するステップを含む、方法。
- 除草剤耐性と昆虫抵抗性を有するトランスジェニックダイズ作物を作出するための、請求項1〜3、5〜7および16のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物または請求項4に記載の種子の使用。
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