JP6385343B2 - 昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントpDAB9582.816.15.1 - Google Patents
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Description
(a)前記試料を、配列番号1のbp1〜1273内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも10bpである第1のプライマー、および配列番号1のbp1274〜1577内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも10bpである第2のプライマーと接触させ、前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ、または
(b)前記試料を、配列番号2のbp1〜175内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも10bpである第1のプライマー、および配列番号2のbp176〜1687内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも10bpである第2のプライマーと接触させるステップ、および
(c)前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ
を含む方法を提供する。
(a)前記試料を、配列番号1のbp1〜1273および配列番号2のbp176〜1687からなる群から選択される隣接配列およびその相補物に選択的に結合する第1のプライマー;ならびに配列番号3、またはその相補物に選択的に結合する第2のプライマー;と接触させるステップと、
(b)前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、
(c)前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップと
を含む方法を提供する。
本開示の一部として、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含むダイズ系統の少なくとも2500種子がAmerican Type Culture Collection(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VA、20110に寄託され、制限なく一般に公開されている(しかし、特許権に支配される)。ATCC寄託番号PTA−12588と称される寄託物は、Dow AgroSciences LLC on 23/February/2012を代表して作製された。この寄託物は、特許手続のための種子寄託物に関するブタペスト条約の条項に従い、その下で作製されたものであり、また、それに従い、その下で維持される。
配列番号1はダイズイベントpDAB9582.816.15.1についての5’DNA隣接境界配列である。ヌクレオチド1〜1273はゲノム配列である。ヌクレオチド1274〜1577は挿入断片配列である。
bp 塩基対
℃ 摂氏温度
DNA デオキシリボ核酸
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位または発現カセット
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SSC 塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、pH7.0
TBE トリス塩基、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有する緩衝溶液、pH8.3.
(実施例)
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含むトランスジェニックダイズ(Glycine max)を、ダイズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。T鎖DNA領域内に選抜マーカー、patv6および対象の遺伝子cry1Fv3およびcry1 Ac synproを含むバイナリーベクターpDAB9582(図1)を保有する武装解除したアグロバクテリウム株EHA101(Hoodら、1993年)を使用して形質転換を開始した。pDAB9582のT鎖DNA配列は配列番号3に示され、下の表1において注釈を付けている。
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1において発現させた組換え型のCry1Fタンパク質、Cry1Acタンパク質、およびPATタンパク質の生化学的性質を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)は、タンパク質の生化学的性質を特徴付け、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1におけるこれらのタンパク質の発現を確認するために用いることができる、当技術分野の範囲内で公知の生化学的アッセイである。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する界面活性剤Tween−20(PBST)を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からPATタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、PAT ELISAキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者(Envirologix、Portland、ME)の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現されたPATタンパク質の濃度を測定した。
上記のプロトコルを使用してダイズイベントpDAB9582.816.15.1におけるCry1Fタンパク質、Cry1Acタンパク質およびPATタンパク質のレベルを決定した。ダイズの葉組織から、可溶性の抽出可能なタンパク質を、定量的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)方法を使用して測定した。T2〜T6世代のダイズイベントpDAB9582.816.15.1で発現は安定であり(分離性でない)、系列全てにわたって一貫していた。表2に、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1におけるトランスジェニックタンパク質の平均発現レベルが列挙されている。
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の隣接ゲノムT−DNA境界領域の配列を決定した。1273bpの5’隣接境界配列(配列番号1)および1371bpの3’隣接境界配列(配列番号2)を含むダイズイベントpDAB9582.816.15.1のゲノム配列を確認した。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の境界配列に基づくPCR増幅により、境界領域がダイズ起源であること、および接合領域がダイズイベントpDAB9582.816.15.1に独特の配列であることが検証された。接合領域をダイズイベントpDAB9582.816.15.1のイベント特異的な同定のために使用することができる。さらに、T鎖の挿入部位を、形質転換されていないダイズのゲノム由来の同定された隣接境界配列の領域に対応するゲノムの断片を増幅することによって特徴付けた。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を形質転換されていないゲノム配列と比較することにより、T鎖の組み込みの間に元の遺伝子座から約21bpが欠失したことが明らかになった。全体的に、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の挿入断片および境界配列を特徴付けることにより、pDAB9582由来のT鎖のインタクトなコピーがダイズゲノム内に存在することが示された。
5’隣接境界および3’隣接境界を第03染色体由来のダイズ(Glycine max)全ゲノムショットガン配列に対しアラインメントし、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第03染色体に挿入されたことが示されている。ダイズゲノムからダイズイベントpDAB9582.816.15.1の挿入部位を確認するために、異なるプライマー対を用いてPCRを行った(図2、表3、表4、および表5)。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1由来のゲノムDNAおよび他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノムDNAを鋳型として使用した。5’境界配列が正確であることを確認するために、At Ubi10プロモーター遺伝子エレメント、例えば、AtUbi1ORV1に結合するように設計したプライマー、および、ダイズゲノムの第03染色体上のクローニングされた5’末端境界に結合するように設計したプライマー、81615_FW2と称されるプライマーを、At Ubi1Oプロモーター遺伝子エレメントから5’末端境界配列にわたるDNAセグメントを増幅するために使用した。同様に、クローニングされた3’境界配列を確認するために、pat特異的なプライマー、例えば、3’PATEnd05、ならびに、81615_RV1および81615_RV2と称される、クローニングされた3’末端境界配列に従って設計したプライマーを、pat遺伝子から3’境界配列にわたるDNAセグメントを増幅するために使用した。予測されたサイズを有するDNA断片は、各プライマー対を用いたダイズイベントpDAB9582.816.15.1のゲノムDNAからのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニック対照由来のDNA試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた5’境界配列および3’境界配列が、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1のT鎖挿入断片の隣接境界配列であることを示している。
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の組み込みパターンを確立した。これらの実験により、cry1Acおよびcry1F導入遺伝子のダイズゲノム内への組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1は、プラスミドpDAB9582由来のcry1Acおよびcry1F PTUの単一コピーを含有する全長の、単純な組み込みイベントであると特徴付けられた。
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムDNA(gDNA)の単離
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有する個々のダイズ植物から回収した葉組織からゲノムDNAを抽出した。さらに、cry1Acおよびcry1F遺伝子が存在しない物質系統の代表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるMaverickからgDNAを単離した。標準のCTAB法の後、凍結乾燥した葉組織から個々のゲノムDNAを抽出した。抽出した後、DNAを、Pico Green試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して分光蛍光分析によって定量した。
DNAの消化および分離
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1をサザンブロットによって分子キャラクタリゼーションするために、10マイクログラム(10μg)のゲノムDNAを消化した。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1および非トランスジェニックダイズ系統であるMaverick由来のゲノムDNAを、各DNA試料にDNA1μg当たりおよそ5ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えることによって消化した。各試料を、およそ37℃で一晩インキュベートした。単独消化のために、制限酵素AseI、HindIII、NsiI、およびNdeIを個々に使用した(New England BioLabs、Ipswich、MA)。二重消化のために制限酵素NotIおよびApaLIを一緒に使用した(New England BioLabs、Ipswich、MA)。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドDNAであるpDAB9582を非トランスジェニックダイズ品種であるMaverick由来のゲノムDNAと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドDNA/ゲノムDNA反応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。
サザン転写およびメンブレン処理
サザンブロット分析を基本的にMemelinkら(1994年)に記載されている通り実施した。簡単に述べると、DNA断片を電気泳動によって分離し、可視化した後、ゲルを、0.25MのHClを用い、およそ20分にわたって脱プリン化し、次いで、変性溶液(0.4MのNaOH、1.5MのNaCl)におよそ30分間、その後、中和溶液(1.5MのNaCl、0.5Mのトリス、pH7.5)に少なくとも30分間曝露させた。ナイロンメンブレンへのサザン転写を、10×SSCを伴うウィッキング系を用いて一晩実施した。転写後、UV架橋によってDNAをメンブレンに結合させ、その後、メンブレンを2×SSC溶液で簡単に洗浄した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。
DNAプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したDNA断片を検出した(表6)。ジゴキシゲニン(DIG)標識されたヌクレオチド[DIG−11]−dUTPを、遺伝子エレメントに特異的なプライマーを使用してプラスミドpDAB9582から増幅されたDNA断片にPCRに基づいて組み込むことによってプローブを生成した。PCR合成によるDNAプローブの生成を、PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を製造者の推奨手順に従って使用して行った。
サザンブロットの結果
cry1Acおよびcry1FPTUの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブに関して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表7に示されている。これらの消化およびハイブリダイゼーションから2種類の断片を同定した:公知の酵素部位がプローブ領域に隣接し、cry1Acおよびcry1FPTUの挿入領域内に完全に含有されている内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置し、第2の部位がダイズゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、DNA断片の組み込み部位はそれぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベントごとに変動する。境界断片により、組み込まれたDNAに対して制限酵素部位を位置づける手段およびDNA挿入物の数を評価する手段がもたらされる。ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有するダイズの多世代に対して完了したサザンブロット分析により、プラスミドpDAB9582由来の低コピー、インタクトなcry1Acおよびcry1FPTUが、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1のダイズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子(specK)、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfA
(TRf Aエレメント)が存在しないことを検証するために、サザンブロット分析も行った。適切な陽性対照(MaverickゲノムDNAにpDAB9582を付加したもの)および陰性対照(MaverickゲノムDNA)をサザン分析に含めた場合、スペクチノマイシン抵抗性、Ori Repエレメントまたはtrf Aエレメントに対する特異的なハイブリダイゼーションは予測されなかった。NsiI消化し、specR特異的なプローブとハイブリダイズさせた後、陽性対照試料(MaverickゲノムDNAにpDAB9582を付加したもの)において、15320bpの、1つの予測されたサイズのバンドが観察された。specRプローブは陰性対照の試料およびダイズイベントpDAB9582.816.15.1の試料とはハイブリダイズしなかった。同様に、NsiI消化し、trfAプローブとハイブリダイズさせた後、15320bpの、1つの予測されたサイズのバンドが陽性対照試料(pDAB9582プラスmaverick)において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントpDAB9582.816.15.1の試料では検出されなかった。NdeI消化し、OriRep特異的なプローブとハイブリダイズさせた後、5329bpの、別の予測されたサイズのバンドが陽性対照試料(MaverickゲノムDNAにpDAB9582を付加したもの)において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントpDAB9582.816.15.1の試料では検出されなかった。これらのデータは、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfAが存在しないことを示している。
反復農業試験を実行して、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1の農業での有効性をヌル同質遺伝子系統であるMaverickと比較した。圃場試験の大多数について、米国全土にわたって地理的に別個の場所に設置し、そこでダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有するダイズ品種を栽培した。追加的な圃場試験をこれらの場所の外で完了し、ダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含有するダイズ品種を、好ましくない場所で生長させることにより生じる潜在的なストレスに曝露させるために選択した。少数の圃場試験の中での環境の変動性に起因して、いくつかの現場では試験を中止した。
ダイズイベントpDAB9582.816.15.1のCry1Acタンパク質およびCry1Fタンパク質によってもたらされる、アンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ハッショウマメイモムシ)、シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(ツマジロクサヨトウ(fall armyworm))およびヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)(タバコバッドワーム(tobacco budworm))を含めた鱗翅目の昆虫を含めたダイズ害虫からの植物の保護のレベルを特徴付けるために、圃場および温室での評価を行った。
配列番号14にダイズイベントpDAB9582.816.15.1の予測される配列が提供されている。この配列は、5’ゲノム隣接配列、pDAB9582の予測されるT鎖挿入断片および3’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号14に関して、残基1〜1273は5’ゲノム隣接配列であり、残基1274〜13658はpDAB9582T鎖挿入の残基であり、13659〜13821はpDAB9582プラスミドからの再配置の残基であり、残基13822〜15170は3’隣接配列である。したがって挿入断片の5’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号14の残基1273〜1274に生じる。したがって挿入断片の3’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号14の残基13658〜13659に生じる。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]
昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される配列を含むDNAを含み、前記配列が、ダイズイベント9582.816.15.1の存在に特徴的である、方法。
[2]
前記昆虫がシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)である、[1]に記載の方法。
[3]
前記昆虫がアンチカルシア・ゲムマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ハッショウマメイモムシ)である、[1]に記載の方法。
[4]
前記昆虫がスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(ツマジロクサヨトウ)である、[1]に記載の方法。
[5]
前記昆虫がヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)(タバコバッドワーム)である、[1]に記載の方法。
[6]
ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される配列を含むDNAを含むダイズ植物を含み、前記配列がダイズイベント9582.816.15.1の存在に特徴的である、方法。
[7]
配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列を含む単離されたDNA配列。
[8]
ダイズ植物を育種する方法であって、
第1のダイズ植物と第2のダイズ植物を交雑させて第3のダイズ植物を作出するステップであり、前記第1のダイズ植物が配列番号1の1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むDNAを含む、ステップと、前記第3のダイズ植物を、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列およびその相補物を含むDNAの存在についてアッセイするステップとを含む方法。
[9]
配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される少なくとも1つの配列およびその相補物を含む接合部配列を含む単離されたDNA分子。
[10]
シュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズシャクトリムシ)に対して抵抗性であり、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列およびその相補物を有するDNAを含む、ダイズ植物またはその部位。
[11]
[10]に記載の植物の種子。
[12]
ダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油からなる群から選択される生産品である、[6]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[13]
ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;および配列番号2のbp75〜275からなる群から選択される1つまたは複数の配列およびその相補物を含むDNAを含むことによって実証される、前記粒、種子、ミール、または粉にダイズイベント9582.816.15.1を含めるステップを含む方法。
[14]
ゲノム内に、配列番号1のbp1258〜1288;配列番号1のbp1223〜1323;配列番号1のbp1173〜1373;配列番号1のbp1073〜1473;配列番号2のbp160〜190;配列番号2のbp125〜225;配列番号2のbp75〜275からなる群から選択されるDNA配列;ならびにその相補物を含むダイズ種子。
[15]
[14]に記載のダイズ種子から生長させたダイズ植物。
[16]
花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記ダイズイベント9582.816.15.1を含む、[15]に記載のダイズ植物の部位。
[17]
ダイズミール、ダイズ粉(soybean flour)、およびダイズ油(soybean oil)からなる群から選択される生産品である、[15]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[18]
配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するDNA配列を含むトランスジェニックダイズ植物。
[19]
ダイズイベント9582.816.15.1を含むトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がAmerican Type Culture Collectionに受託番号PTA−12588の下で寄託されているダイズイベント9582.816.15.1を含む、トランスジェニックダイズ植物またはその部位。
Claims (2)
- 配列番号14のヌクレオチド配列を含むダイズイベントpDAB9582.816.15.1を含むゲノムを含むダイズ種子であって、前記ゲノムがCry1F、Cry1AcおよびPAT遺伝子を発現するヌクレオチド配列を含み、American Type Culture Collectionに受託番号PTA−12588の下で寄託されている、ダイズ種子。
- 前記ゲノムが配列番号1の1258位〜1288位;配列番号1の1223位〜1323位;配列番号1の1173位〜1373位;配列番号1の1073位〜1473位;配列番号2の160位〜190位;配列番号2の125位〜225位;および配列番号2の75位〜275位からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含む、請求項1に記載のダイズ種子。
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