CN101410524A

CN101410524A - 表达目标多核苷酸的方法和组合物

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Publication number: CN101410524A
Application number: CNA2006800391954A
Authority: CN
Inventors: B·F·麦卡钦; C·B·哈策尔; D·刘; A·L·卢; W·J·梅尔; P·D·奥尔森; J·F·H·王
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2009-04-15
Also published as: ZA200801554B; UA96578C2; ZA200802239B; CN101297040A

Abstract

提供表达目标多核苷酸的方法和组合物。组合物包含示于SEQ IDNO：1、10、15或16的增强子结构域及其活性变体和片段。还提供包含至少一个转录增强子序列的DNA构建体，所述转录增强子序列包含示于SEQ ID NO：1、10、15或16的核苷酸序列或其活性变体或片段并且与异源启动子有效连接。这样的嵌合转录调节区可以有效连接任何目标多核苷酸。还提供包含所述DNA构建体的细胞、植物、植物部分和种质。还提供嵌合转录调节区的使用方法。在具体的实施方案中，提供表达目标多核苷酸(包括例如赋予对除草剂耐受性的序列)的方法，以及选择出具有所述DNA构建体的细胞的方法。

Description

表达目标多核苷酸的方法和组合物

发明领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域。更具体地说，涉及表达目标多核苷酸的组合物和方法。

发明背景

植物宿主中异源DNA序列的表达取决于在植物宿主中有功能的有效连接的启动子的存在情况。选定的启动子序列将决定异源DNA序列在生物体中表达的时间和位置。在期望于特定组织或器官中表达的情况下，可使用组织优选的启动子。在期望基因表达响应于刺激的情况下，诱导型启动子是选择的调节元件。相比之下，在期望于整个植物细胞中连续表达的情况下，使用组成型启动子。可将核心启动子序列上游和/或下游的其余调节序列纳入转化载体的表达构建体中，以在转基因植物中产生可变水平的异源核苷酸序列表达。

经常期望在植物的特定组织或器官中表达DNA序列。例如，可如下实现植物对土壤和空气传播的病原体感染的抗性增加：遗传操作植物基因组，以包含与异源病原体抗性基因有效连接的组织优选启动子，使得在期望的植物组织中产生病原体抗性蛋白。

或者，可能期望抑制植物组织中天然DNA序列的表达，以获得预期表型。在此情况下，此抑制可如下实现：转化植物，以包含与反义核苷酸序列有效连接的组织优选启动子，使得反义序列的表达产生干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。

因此，需要分离和表征可位于核心启动子序列的上游和/或下游并允许改变转基因植物中异源核苷酸序列的表达水平的调节序列，用于遗传操作植物。

发明概述

提供表达目标多核苷酸的方法和组合物。组合物包含示于SEQ IDNO：1、10、15、16、17或18的增强子结构域及其活性变体和片段。还提供包含至少一个转录增强子序列的DNA构建体，所述转录增强子序列包含示于SEQ ID NO：1、10、15、16、17或18的核苷酸序列或其活性变体或片段，与异源启动子有效连接。这样的嵌合转录调节区可有效连接任何目标多核苷酸。还提供包含该DNA构建体的细胞、植物、植物部分和种质。

还提供使用嵌合转录调节区的方法。在具体的实施方案中，提供表达目标多核苷酸的方法和选择具有该DNA构建体的细胞的方法，所述目标多核苷酸包括例如赋予对除草剂耐受性的序列。

附图简述

图1提供了具有35S增强子元件的构建体的实例。

图2提供了示意图，表明35S增强子对TX效率的作用。

图3提供了示意图，表明35S增强子对T0效率的作用。

图4提供了示意图，表明35S增强子对事件拷贝数的作用。

图5提供了示意图，表明35S增强子对表达的作用。

图6提供了杀虫基因评价测定。

图7提供了示意图，表明GAT选择流程的开发。

图8表明GAT可用作选择标记。

图9提供了示意图，表明GAT转化效率。

发明详述

现在将参考附图在后文更全面地描述本发明，其中显示了本发明的一些但不是全部的实施方案。实际上，这些发明可以多种不同形式实施，不应被解释为限于本文陈述的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本文的公开内容满足适用法律规定。相同编号自始自终指相同部分。

这些发明所属领域的技术人员将想起本文陈述的本发明的许多改变和其它实施方案，它们有益于先前描述和相关附图中提出的讲授内容。因此，要理解的是，本发明不限于所公开的具体实施方案，意将改变和其它实施方案包含在随附权利要求的范围内。尽管本文使用了专用术语，但它们仅在一般性和描述性意义上使用，无限制用途。

I.多核苷酸

本发明组合物包含转录控制区的增强子结构域以及该增强子结构域的变体和片段。当增强子结构域与启动子有效连接时，就形成了功能性转录调节区，并且可以指导有效连接的目标多核苷酸的表达。具体地说，本发明提供包含示于SEQ ID NO：1、10、15、16、17或18的增强子结构域的分离多核苷酸；其活性变体和片段；和由SEQ IDNO：1、10、15、16、17或18的序列组成的多核苷酸。在又一个实施方案中，使用的增强子结构域不含由约-90位至约-46位的35S启动子区。-90至-46启动子区示于SEQ ID NO：5。

术语“启动子”意指含转录起始区的DNA调节区，该调节区在某些实施方案中含TATA盒，其能够指导RNA聚合酶II，以在对特定编码序列适合的转录起始位点启动RNA合成。启动子还可有效连接至影响转录的其余调节元件，包括但不限于内含子、5′非翻译区和增强子元件。本文使用的“增强子序列”、“增强子结构域”、“增强子元件”或“增强子”在与合适的启动子有效连接时，将调节有效连接的目标多核苷酸的转录水平。在具体的实施方案中，本发明的增强子可改变正常的启动子表达模式。例如，组织优选的/特异性启动子在与本发明的增强子有效连接时，将表现出一般以单独的启动子观察不到的异位表达。例如，油质蛋白启动子为种子优选启动子，但在本发明增强子或其活性变体或片段存在下表现出叶表达。在另一个实例中，为叶优选启动子的Zrp2启动子在与本发明的增强子序列或其生物活性变体或片段有效连接时变成组成型的，而根启动子RM2启动子在与本发明的增强子或其生物活性变体或片段有效连接时将表现出叶表达。因此，本发明的组合物还包含一种含嵌合转录控制区的多核苷酸，该嵌合转录控制区含有与至少1、2、3、4个或更多个拷贝的增强子结构域或该结构域的活性变体或片段有效连接的启动子。这些组合物允许表达有效连接的目标多核苷酸。

本发明包括分离的或大致纯化的多核苷酸或蛋白组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或其生物活性部分大致上或基本上没有一般与存在于其天然环境中的多核苷酸相伴或互作的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸基本没有其它细胞物质，或者在通过重组技术生产时基本没有培养基，或者在化学合成时基本没有化学前体或其它化学物质。“分离的”多核苷酸最好没有在获得该多核苷酸的生物的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸(即位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)的序列(最好为蛋白编码序列)。例如，在多个实施方案中，分离的多核苷酸可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该序列天然地位于获得该多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸侧翼。基本没有细胞物质的多核苷酸包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)杂质蛋白或多核苷酸的制备物。当本发明的多核苷酸或其生物活性部分重组生产时，培养基最好为少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学前体。

本发明还包括所公开的增强子序列的片段和变体。具体地说，提供SEQ ID NO：1、10、15、16、17或18的增强子结构域的片段和变体。本文使用的术语“片段”指一部分多核苷酸。增强子结构域的片段可保留在与适宜启动子有效连接时调节(增加或降低)转录水平的生物活性。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段可不必保留生物活性。用于增强子结构域的多核苷酸片段可在本发明增强子结构域的至少约50个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约350个核苷酸、约400个核苷酸、约450个核苷酸、约500个核苷酸和直到本发明的全长核苷酸序列的范围内。在其它实施方案中，增强子结构域的片段含约50个至约100个、100个至约150个、150个至约200个、200个至约250个、约250个至约300个、约300个至约350个、约350个至约400个、约400个至约450个、约450个至约500个、约500个至约535个核苷酸的长度。

在具体的实施方案中，增强子的活性变体和片段包含保守区。这些区域包含示于以下的一个或多个下划线序列：

cccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctctta

cgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacag

tctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatc

tgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttga

agatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacc

acgtcttcaaagcaagtggattgatgtgat (SEQ ID NO：1)。

另参见Fang等，(1989)The Plant Cell 1：141-150，该文献在此引入作为参考。

增强子结构域的生物活性部分可通过分离一部分本发明的增强子结构域并评价该片段的转录调节活性而制备。检测转录调节的方法包括例如测定有效连接的目标多核苷酸的水平，或测定由有效连接的目标序列编码的多肽的表达。这些测定可直接检测多核苷酸或多肽的水平，或者它们可测定序列表达改变时的活性或预期表型。这些测定是本领域已知的。

本文使用的术语“变体”指大致相似的序列。对于多核苷酸，天然变体可使用众所周知的分子生物学技术鉴别，例如用本文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴别。对于多核苷酸，变体含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。本文使用的“天然”多核苷酸包含天然核苷酸序列。对于多核苷酸，天然变体可用众所周知的分子生物学技术鉴别，例如用下文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴别。变体多核苷酸还包括合成来源的核苷酸序列，例如使用定点诱变产生的那些核苷酸序列。一般来说，据利用本文别处描述的序列比对程序和参数测定，本发明特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性。本发明多核苷酸的生物活性变体可与该序列不同，不同之处少至1-15个核酸残基、少至1-10个、例如6-10个、少至10、9、8、7、6、5、4、3、2乃至1个核酸残基。

因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然序列以及突变形式这二者。这些变体将继续具有期望的转录调节活性。预期本文包含的序列的缺失、插入和置换不产生根本的序列特征改变。但是，当在这样做之前难以预测置换、缺失或插入的确切作用时，本领域技术人员会认识到，将通过常规筛选测定评价该作用。也就是说，可使用本文别处公开的测定评价活性。

变体多核苷酸还包括来源于突变和重组方法如DNA改组的序列。采用这样的方法，可操作启动子的一个或多个不同增强子结构域序列，以产生新的增强子结构域。以此方式，由相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库，所述群包含具有显著序列同一性并可在体外或体内同源重组的序列区。此DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等，(1997)J Mol Biol.272：336-347；Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等，(1998)Nature391：288-291；和美国专利第5,605,793和5,837,458号。

本发明的多核苷酸可用于由其它生物、特别是其它植物、更特别是其它单子叶植物分离对应的序列。以此方式可使用诸如PCR、杂交等的方法，基于这些序列与本文陈述序列的序列同源性鉴别它们。基于它们与本文陈述的完整增强子结构域或其片段或变体的序列同一性分离的序列包含在本发明中。

在PCR方法中，可设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，以由提取自任何目标植物的基因组DNA扩增对应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，公开于Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)，后文称为Sambrook。另参见Innis等编辑，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand编辑，(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，全部或部分的已知多核苷酸用作探针，该探针与选定生物的克隆基因组DNA片段群中存在的其它对应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可用可检测基团如³²P或任何其它可检测标记来标记。因此，例如，杂交探针可通过标记基于本发明增强子结构域的合成寡核苷酸而制备。制备杂交探针和构建基因组文库的方法是本领域公知的，公开于Sambrook。

例如，本文公开的完整增强子结构域序列或其一个或多个部分，可用作能够与对应增强子序列特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这些探针包括在增强子结构域序列中独特的序列，并为至少约10个核苷酸长，或至少约20个核苷酸长。这些探针可用于通过PCR扩增选定生物的对应35S增强子序列。该技术可用于由目标生物分离另外的编码序列，或用作诊断测定，以测定生物中编码序列的存在情况。杂交技术包括杂交筛选平板DNA文库(plated DNAlibraries)(或为噬菌斑或为菌落；参见例如Sambrook等(1989)Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

这些序列的杂交可在严格条件下进行。术语“严格条件”和“严格杂交条件”意指探针与其靶序列杂交的可检测程度远大于与其它序列的条件(例如高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调整严格条件，以允许序列中有某些错配，以便检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般来说，探针少于约1000个核苷酸长，或少于约500个核苷酸长。

典型地，严格条件将为这样的条件：其中盐浓度低于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0-8.3，对短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件还可以添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37℃杂交，并以1X～2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)于50-55℃清洗。示例性的中等严格条件包括用40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS于37℃杂交，并以0.5X～1X SSC于55-60℃清洗。示例性的高严格条件包括用50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS于37℃杂交，并以0.1X SSC于60-65℃进行至少30分钟时程的最终清洗。杂交持续时间一般少于约24小时，通常约4至约12小时。清洗持续时间将至少为足以达到平衡的时间长度。

特异性典型地随杂交后清洗而变，关键因素是最终清洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂种，T_m(热解链点)可由Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的公式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L近似；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分率，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分率，而L是杂种的碱基对长度。T_m是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。每错配1％，T_m就降低约1℃；因此，可调整T_m、杂交和/或清洗条件，以与期望同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90％同一性的序列，则T_m可降低10℃。一般来说，选择在限定的离子强度和pH下比特定序列及其互补序列的T_m低约5℃的严格条件。但是，严格杂交条件可使用比T_m低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或清洗；中等杂交条件可使用比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或清洗；低严格条件可使用比T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或清洗。使用该公式、杂交和清洗组成以及期望的T_m，一般技术人员将理解，杂交和/或清洗溶液的严格性的变化已固有地被描述。如果期望的错配程度产生低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选增加SSC浓度，使得可使用较高的温度。关于核酸杂交的全面指引可见于Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，第I部，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等编辑，(1995)Current Protocols in Molecular Biologt，第2章(GreenePublishing and Wiley-InterScience，New York)。另参见Sambrook。

因此，本发明包括具有胚优选的启动子活性并在严格条件下与本文公开的增强子结构域序列或其片段杂交的分离序列。一般来说，选择在限定离子强度和pH下比特定序列的T_m低约5℃的严格条件。然而，严格条件包括在比T_m低约1℃至约20℃的范围内的温度，这取决于如本文别处限定的期望严格程度。

使用以下术语描述两个以上多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“对比窗”，(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分率”。

(a)本文使用的“参比序列(reference sequence)”是用作序列比较基础的限定序列。参比序列可为特定序列的一部分或全部；例如，为全长cDNA或基因序列的区段，或为完整cDNA或基因序列。

(b)本文使用的“对比窗(comparison window)”涉及多核苷酸序列的连续和特定区段，其中对比窗中的多核苷酸序列相比于参比序列(其不含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便最优比对两个多核苷酸。一般来说，对比窗为至少20个连续核苷酸长，任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员知晓，为避免由于在多核苷酸序列中包含空位而与参比序列具有高相似性，通常引入空位罚分，其由匹配数中被扣除。

用于比较的序列比对方法在本领域众所周知。因此，任何两个序列之间的序列同一性百分率的测定都可使用数学算法完成。这些数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部检索比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877改进。

这些数学算法的计算机实现可用于比较序列，以确定序列同一性。这些实现包括但不限于：PC/Gene程序(得自Intelligenetics，Mountain View，California)中的CLUSTAL；ALIGN程序(2.0版)以及GCG Wisconsin遗传软件包第10版(得自Accelrys Inc.，9685S crantonRoad，San Diego，California，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可使用默认参数进行。CLUSTAL程序充分描述于Higgins等(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。在对比氨基酸序列时，对ALIGN程序可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸检索可用BLASTN程序进行，记分＝100，字长＝12，以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可用BLASTX程序进行，记分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为获得用于对比用途的加空位比对，可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389所述使用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)实施检测分子之间的远缘关系的迭代检索。参见Altschul等(1997)(出处同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用对应程序的默认参数(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可通过检查人工进行比对。

除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP第10版使用以下参数获得的值：核苷酸序列的同一性％和相似性％使用空位权重(GAP Weight)50和长度权重(Length Weight)3以及nwsgapdna.cmp打分矩阵；氨基酸序列的同一性％和相似性％使用空位权重8和长度权重2以及BLOSUM62打分矩阵；或其任何等同程序。所述“等同程序”意指任何序列对比程序，当与通过GAP第10版产生的对应比对相比较时，其对所述任何两个序列都产生具有等同核苷酸或氨基酸残基匹配的比对和等同的序列同一性百分率。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以寻找最大化匹配数和最小化空位数的两个完整序列的比对。GAP考虑所有可能的比对和空位，产生具有最大匹配碱基数和最少空位的比对。其允许在匹配碱基单元中提供空位引入罚分和空位延伸罚分。对于插入的每个空位，GAP一定得益于匹配的空位引入罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，则对于插入的每个空位GAP一定另外得益于空位长度乘以空位延伸罚分。在第10版GCG Wisconsin遗传软件包中用于蛋白序列的默认空位引入罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位引入罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位引入和空位延伸罚分可表示为选自0-200的整数。因此，例如，空位引入和空位延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或以上。

GAP提供了最佳比对的一个家族成员。该家族可能有许多成员，但没有其它成员具有更好的品质。GAP展示了用于比对的4个优值：品质(Quality)、比率(Ratio)、同一性(Identity)和相似性(Similarity)。品质被距离最大化，以便比对序列。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分率是实际匹配的符号的百分率。相似性百分率是相似的符号的百分率。空位对面的符号被忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50相似性阈值时，记录相似性。在第10版GCG Wisconsin遗传软件包中使用的打分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)本文使用的“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的背景下涉及在指定比较窗内比对最大对应性时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分率用于指蛋白时，一般认为不相同的残基位置的差异经常在于保守氨基酸置换，在保守氨基酸置换中，氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基置换，并因此不改变分子的功能特性。当序列差异在于保守置换时，可上调序列同一性百分率，以校正置换的保守特性。差异在于这些保守置换的序列被描述为具有“序列相似性”或“相似性”。实施这种调整的方法是本领域技术人员众所周知的。通常，这涉及将保守置换记录为部分而不是全部错配，由此增加序列同一性百分率。因此，例如，在相同氨基酸被给予记分1而非保守置换被给予记分0的情况下，保守置换被给予0-1之间的记分。计算保守置换的记分，例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中实现。

(d)本文使用的“序列同一性百分率”指通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列而测定的值，其中比较窗中的一部分多核苷酸序列与参比序列相比(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，用于两个序列的最佳比对。如下计算百分率：测定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以获得匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分率。

II.DNA构建体

使用的术语“多核苷酸”无意将本发明限于包括DNA的多核苷酸。本领域一般技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然分子，也包括合成类似物。本发明的多核苷酸还包含所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

本发明中公开的多核苷酸以及其变体和片段可用于任意植物的遗传操作。增强子结构域或其活性片段或变体在与异源启动子有效连接时在这方面是有用的。这样的转录调控区在本文被称为“嵌合”转录调控区。嵌合转录控制区可与其表达受控以实现期望的表型响应的多核苷酸有效连接。以此方式可在表达盒中提供本发明的增强子结构域或嵌合转录调控区的多核苷酸连同用于在目标生物中表达的目标多核苷酸。

嵌合转录调节区可包含多个拷贝的增强子结构域或其活性变体和片段。在具体的实施方案中，嵌合转录调控区包含至少1、2、3、4、5、6、7或更多个拷贝的增强子结构域。在其它实施方案中，使用的增强子结构域不包含示于SEQ ID NO：5的序列。

启动子和增强子结构域之间的距离可变，只要嵌合转录调节区继续以预期方式指导有效连接的目标多核苷酸的转录。例如，增强子结构域可定位于紧邻启动子至少约10000至约15000、约10000至约9000、约9000至约8000、约8000至约7000、约7000至约6000、约6000至约5000、约5000至约4000、约4000至约3000、约3000至约2000、约2000至约1000、约1000至约500、约500至约250、约250。还认识到一个或多个拷贝的增强子可位于启动子的上游(5′)，或者一个或多个拷贝的增强子可位于启动子的3′。在具体的实施方案中，当位于启动子的3′时，增强子位于终止子区的下游。在又一个实施方案中，一个或多个增强子可以5′或3′方向(如在SEQ ID NO：1中所示)或以3′→5′方向排列。

如果使用多个增强子，则增强子可相对于启动子位于构建体中，使得实现对表达的预期影响。例如，增强子可彼此紧邻或至少间隔1-100、100-300、300-500、500-1000个核苷酸。

这样的构建体可以用于在目标生物中表达的表达盒提供。该表达盒可包含与目标多核苷酸有效连接的3′调节序列和5′调节序列。“有效连接的”用于指两个或多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的有效连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。增强子和转录起始区之间的有效连接是允许转录控制区转录有效连接的目标多核苷酸的连接。有效连接的元件可为连续的或非连续的。当所述有效连接的用于指两个蛋白编码区的连接时，意思是编码区处于同一读框中。表达盒可另外含有至少一个共转化入生物中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因。提供的此类表达盒具有多个限制位点和/或重组位点，用于在调节区的转录调节下插入目标多核苷酸。表达盒还可另外包含选择标记基因。

表达盒可按5′→3′转录方向包含嵌合转录调节区，该区含增强子结构域或其活性变体或片段、启动子或其活性变体或片段、翻译起始区、目标多核苷酸、翻译终止区和任选地在宿主生物中有功能的转录终止区。调节区(即启动子、增强子结构域和翻译终止区等)和/或目标多核苷酸对宿主细胞或彼此可为天然的/类似的。或者，调节区和/或目标多核苷酸对宿主细胞或彼此可为异源的。

本文使用的关于序列的“异源的”为起源于外来物种的序列，或者如果来自相同物种的话，则为通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面由其天然形式显著修饰的序列。例如，与异源多核苷酸有效连接的启动子所来自的物种与得到该多核苷酸的物种不同，或者如果来自相同/类似物种的话，则一个或两个由其起源形式和/或基因组基因座显著修饰，或者启动子对有效连接的多核苷酸不是天然启动子。“异源多核苷酸”在其涉及增强子结构域时意指不是与本发明的增强子结构域序列一起天然存在的序列。尽管该启动子对增强子结构域序列是异源的，但其对植物宿主可为同源的，或天然的，或异源的，或外源的。

终止区与增强子结构域或转录起始区可为天然的，与有效连接的目标多核苷酸可为天然的，与植物宿主可为天然的，或者对于增强子结构域、转录起始区、目标多核苷酸、植物宿主或其任意组合可来源于另一个来源(即外源的或异源的)。方便的终止区可得自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineau等(199I)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。

含本发明序列的表达盒还可包含至少一个额外的核苷酸序列，用于将基因共转化入生物中。或者，可在另一个表达盒上提供额外的序列。

已知额外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括去除编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其它这样的已充分表征的可能对基因表达有害的序列。序列的G-C含量可调整至给定细胞宿主的平均水平，该平均水平通过参比在宿主细胞中表达的已知基因计算。在有可能的时候，对序列进行修饰，以避免预计的发夹二级mRNA结构。

表达盒可另外包含5′前导序列。此前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，包括：细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀斑病毒)(Gallie等(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virology 154：9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等(1989)载于Molecular Biology of RNA，修订版，Cech(Liss，New York)，237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等(1991)Virology 81：382-385)。另参见Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968。

在制备表达盒时，可操作多种DNA片段，以便以正确的方向以及在适宜时以正确的读框提供DNA序列。为此，可使用连接物或接头连接DNA片段，或者可包含其它操作，以提供便利的限制位点、去除多余DNA、去除限制位点等。为此，可包含体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换，例如转换和颠换。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D)抗性的基因。其余的选择标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等(2004)Plant Cell16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等(2004)J.Cell Science117：943-54和Kato等(2002)Plant Physiol 129：913-42)和黄色荧光蛋白(Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte等(2004)J.Cell Science117：943-54)。关于其它选择标记，一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318；Yao等(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)MolMicrobiol.6：2419-2422；Barkley等(1980)载于The Operon，177-220页；Hu等(1987)Cell 48：555-566；Brown等(1987)Cell 49：603-612；Figge等(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA86：5400-5404；Fuerst等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.USA90：1917-1921；LaboW等(1990)Mol Cell Biol 10：3343-3356；Zambretti等(1992)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：3952-3956；Baim等(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等(1991)NucleicAcids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等(1992)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36：913-919；Hlavka等(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等(1988)Nature334：721-724。这些公开内容在此引入作为参考。以上列出的选择标记基因无限制意图。在本发明中可使用任何选择标记基因。

如上所论述，提供包含与异源启动子有效连接的至少一个拷贝的增强子结构域或其活性变体或片段的嵌合转录调节区。可将任何目标启动子与本发明的增强子结构域有效连接。这样的启动子可基于期望的结果选择，并可包括用于在目标宿主细胞(即植物)中表达的组成型、诱导型、组织优选的或其它启动子。组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和公开于WO 99/43838和美国专利第6,072,050号中的其它组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等(1985)Nature313：810-812)；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。其它组成型启动子包括例如美国专利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611号。

在一个实施方案中，启动子包含诱导型启动子，尤其是得自病原体诱导型启动子的启动子。这些启动子包括来自致病相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，这些启动子在病原体感染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如Redolfi等，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等，(1992)Plant Cell4：645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。另参见WO99/43819，这些文献在此引入作为参考。

可使用在病原体感染部位或其附近局部表达的启动子。参见例如Marineau等(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14972-14977。另参见Chen等(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner等(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利第5,750,386号(线虫诱导的)；和其中提及的参考文献。特别令人感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰孢(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如Cordero等(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。

另外，由于病原体通过伤口或昆虫损害找到进入植物的入口，所以可在本发明的构建中使用伤口诱导型启动子。这样的伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等(1996)Nature Biotechnology14：494-498)；wun1和wun2，美国专利第5,428,148号；win1和win2(Stanford等(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(McGur1等(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok等(1994)Plant J.6(2)：141-150)等，这些文献在此引入作为参考。

化学物质调节的启动子可通过应用外源化学调节物用于调节植物中的基因表达。根据对象，启动子可为化学诱导型启动子，在此情况下应用化学物质诱导基因表达，或者可为化学阻抑型启动子，在此情况应用化学物质阻抑基因表达。化学物质诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子、由用作苗前除草剂的疏水亲电化合物激活的玉米GST启动子和被水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其它化学物质调节的目标启动子包括类固醇应答启动子(参见例如糖皮质激素诱导型启动子，载于Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)：247-257)以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见例如Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237，和美国专利第5,814,618和5,789,156号)，这些文献在此引入作为参考。

可使用组织优选启动子，以达到增强特定植物组织中的目标多核苷酸表达的目标。组织优选启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J. 4(3)：495-505。必要时这些启动子可被修饰，用于弱表达。

叶优选启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。

根优选启动子是已知的，可选自许多可得自文献的启动子，或由多种相适物种从头分离的启动子。参见例如Hire等(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(在菜豆GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌土壤杆菌甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。另参见Bogusz等(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了两种自固氮非豆科固氮菌Parasponia andersonii和相关非固氮非豆科植物山黄麻(Trematomentosa)分离的血红蛋白基因的根特异性启动子。将这些基因的启动子与β-葡糖醛酸酶报告基因连接，并导入到非豆科烟草(Nicotianatabacum)和豆科百脉根(Lotus corniculatus)这二者中，在两种情况下根特异性启动子活性都被保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们推断，增强子和组织优选的DNA决定子在那些启动子中是分开的。Teeri等(1989)使用与lacZ的基因融合体，表明编码章鱼碱合酶的土壤杆菌T-DNA基因在根尖表皮中尤其有活性，TR2′基因在完整植株中是根特异性的，由叶组织中的伤害刺激，是供杀虫或杀幼虫基因使用的特别理想的特征组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TRl′基因显示出类似特征。其它根优选启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。另参见美国专利第5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179号。

种子优选启动子包括种子特异性启动子(在种子发育过程中有活性的那些启动子，例如种子贮藏蛋白启动子)以及种子萌发启动子(在种子萌发过程中有活性的启动子)。参见Thompson等(1989)BioEssays10：108，该文献在此引入作为参考。这样的种子优选启动子包括但不限于Cim1(细胞激动素诱导信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps (肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利第6,225,529号；这些文献在此引入作为参考)。γ-玉米醇溶蛋白是内胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆类β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆卵磷脂、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯质蛋白(waxy)、超甜基因(shrunken)1、超甜基因2、球蛋白1等。另参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子，该文献在此引入作为参考。

可使用由本发明的嵌合转录调控区表达的多核苷酸序列改变植物表型。多种表型变化令人感兴趣，包括改变植物胚中的基因表达、改变植物的病原体或昆虫防御机制、增加植物中对除草剂的植物耐受性、改变响应于环境胁迫的胚发育等。这些结果可通过表达含目标异源核苷酸序列的适宜基因产物实现。在具体的实施方案中，目标异源核苷酸序列是其表达水平在植物或植物部分中增加的内源植物序列。或者，可通过提供降低的一种或多种目标多核苷酸的表达得到所述结果。

本发明的嵌合转录调控区还可包含其它转录调节区的其余部分。因此，本文公开的含增强子结构域和异源启动子的转录调控元件可包含上游调节元件，例如负责编码序列的组织和时序表达的那些调节元件。在本文公开内容的范围内，术语“调节元件”还指DNA序列，其通常但不总是在结构基因编码序列的上游(5′)，其包含调节编码区表达的序列。要理解的是，位于内含子中或编码区序列的3′的核苷酸序列也可有助于调节目标编码区的表达。适宜的内含子的实例包括但不限于玉米IVS6内含子或玉米肌动蛋白内含子。调节元件还可包括位于转录起始位点下游(3′)或转录区中或这二者中的那些元件。在本发明范围内，转录后调节元件可包括在转录起始后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻抑子以及mRNA稳定性决定子。

进一步认识到本发明的增强子可在DNA构建体中位于第一和第二启动子之间并与第一和第二启动子有效连接。在这些实施方案中，增强子允许由相异方向调节第一和第二启动子这二者的表达。这些DNA构建体的示例性但非限制性的实例按5′→3′方向或3′→5′方向包含：第一目标多核苷酸、第一启动子、至少一个拷贝的本发明增强子、第二启动子和第二目标多核苷酸，其中第一目标多核苷酸与第一启动子有效连接，第一启动子与至少一个拷贝的本发明增强子有效连接，至少一个拷贝的本发明增强子与第二启动子有效连接，第二启动子与第二目标多核苷酸有效连接。在具体的实施方案中，增强子序列对第一和第二增强子序列是异源的。

III.植物及其部分

本文使用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、由其可再生植株的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和在植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如为胚、花粉、子房、种子、叶、花、枝、果实、核仁、穗、穗轴(cob)、外壳、茎、根、根尖、花药等。谷物用于指由商业种植者生产的成熟种子，用于非生长或再生物种的用途。再生植株的子代、变异株和突变株也包括在本发明范围内，只要这些部分包含导入的多核苷酸。

本发明可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物物种的实例包括但不限于玉米(Zea mays)；芸薹(Brassica sp.)(例如甘兰型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))，尤其是那些可用作种子油来源的芸薹；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、黍(例如珍珠稷(Pennisetumglaucum)、稷(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracandj)、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense，Gossypium hirsutum)、甘薯Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、糖甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativd)、扁豆(Phaseolus vulgaris)、菜豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜(Cucumis)属成员，例如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、荷兰石竹(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrimd)和菊花。

可用于实施本发明的针叶树包括例如松树，例如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加州铁杉(Tsuga canadensis)；美国西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉，例如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；和雪松，例如美国西部侧柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)。在具体的实施方案中，本发明的植物为栽培植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸薹、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、黍、烟草等)。在其它实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在再其它实施方案中，玉米植物是最佳的。

其它目标植物包括提供目标种子的谷类植物、油类种子植物和豆科植物。目标种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油类种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸薹、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

“目标植物或植物细胞”是已对目标基因实施遗传改变如转化的植物或植物细胞，或是由如此改变的植物或细胞传下来并包含此改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于检测目标植物或植物细胞的表型变化的参比点。

对照植物或植物细胞可包含例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于遗传改变产生目标植物或细胞的起始物质具有相同基因型的野生型植物或细胞；(b)与起始物质具有相同基因型但已用失效构建体(即用对目标性状无已知作用的构建体，例如含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)在目标植物或植物细胞的子代中为非转化分离种的植物或植物细胞；(d)在遗传学上与目标植物或植物细胞相同但不接触会诱导目标基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)在不表达目标基因的条件下的目标植物或植物细胞自身。

提供具有嵌合转录控制区的任何生物，所述嵌合转录控制区包含本发明的增强子结构域或其活性变体或片段。在具体的实施方案中，提供具有嵌合转录控制区的植物、植物部分、细胞和种质，它们含本发明的增强子结构域或其活性变体或片段。在具体的实施方案中，嵌合转录控制区与目标多核苷酸有效连接。这样的多核苷酸包括例如赋予对除草剂耐受性的任何多核苷酸。还提供含这些序列的植物细胞、植物部分和种质。

IV.目标多核苷酸

具有增强子结构域或其活性变体或片段的嵌合转录调控区可用于表达任何目标多核苷酸。本发明的目标多核苷酸的一般类别包括例如那些涉及信息的基因如锌指、那些涉及通信的基因如激酶以及那些涉及看家的基因如热激蛋白。转基因的更具体类别例如包括编码重要农艺性状、抗虫、抗病、抗除草剂和环境胁迫抗性(改变对冷、盐、干旱等的耐受性)的基因。

抗虫基因可编码对造成极大产量损失的害虫的抗性，例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。这样的基因包括例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利第5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881号；以及Geiser等(1986)Gene 48：109)；等等。

编码抗病性状的基因包括脱毒基因，例如使伏马毒素脱毒的那些基因(美国专利第5,792,931号)；减毒(avr)和抗病(R)基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)；等等。

外源产物包括植物酶和产物以及来自其它来源包括原核生物和其它真核生物的那些产物。这样的产物包括酶、辅因子、激素等。

其它适用基因及其相关表型的实例包括编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因，或赋予病毒抗性的其它病毒或植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量提升的基因；和提供对胁迫的抗性的基因，所述胁迫例如为冷、由干旱产生的脱水、热和盐、有毒金属或痕量元素等。

如所指出的，与含有本文的增强子结构域的转录控制区有效连接的多核苷酸可为目标基因的反义序列。因此，本文公开的启动子序列可与反义DNA序列有效连接，以降低或抑制植物胚中天然蛋白的表达。

“RNAi”指降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利第6,506,559号)。以其它名称提到的较老技术现在被认为依靠相同机制，但在文献中被给予不同的名称。这些名称包括“反义抑制”，能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的生产，和“共抑制”或“有义抑制”，其指能够抑制相同或基本相似的外源或内源基因的表达的有义RNA转录物的生产(美国专利第5,231,020号，该文献在此引入作为参考)。这些技术依靠构建体的使用，导致其一条链与要沉默的靶基因互补的双链RNA的累积。在实施方案的转录控制区的背景下，35S增强子可用于驱动将产生RNA干扰(包括小型RNA和siRNA)的构建体的表达。

在适宜的情况下，可优化多核苷酸，用于增加转化植物中的表达。也就是说，可使用植物优选密码子合成多核苷酸，用于改善表达。参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11关于宿主优选密码子选择的论述。在本领域可得到合成植物优选基因的方法。参见例如美国专利第5,380,831和5,436,391号，以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，这些文献在此引入作为参考。

在一个实施方案中，目标多核苷酸编码赋予对目标除草剂的耐受性的多核苷酸。在一个实施方案中，赋予对目标除草剂的耐受性的多核苷酸包括赋予对一定剂量的磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫代)苯甲酸和/或磺酰氨基-羰基-三唑啉除草剂的耐受性的ALS抑制剂耐受性多肽。磺酰脲和咪唑啉酮除草剂通过阻断乙酰乳酸合酶(ALS)(也称为乙酰羟酸合酶(AHAS))抑制高等植物的生长。例如，在ALS中含特定突变的植物(例如S4和/或HRA突变)耐受磺酰脲除草剂。磺酰脲耐受性植物和咪唑啉酮耐受性植物的生产更全面地描述于美国专利第5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824号；和国际公布号WO 96/33270，这些文献就其所有用途整体在此引入作为参考。在具体的实施方案中，ALS抑制剂耐受性多肽包含磺酰胺耐受性乙酰乳酸合酶、磺酰胺耐受性乙酰羟酸合酶、咪唑啉酮耐受性乙酰乳酸合酶或咪唑啉酮耐受性乙酰羟酸合酶。

还可使用编码除草剂抗性的多核苷酸，所述除草剂用于抑制谷氨酰胺合酶的作用，例如草胺膦或草铵膦(basta)(例如bar基因)、草甘膦(例如EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国公布号20040082770和WO 03/092360)或本领域已知的其它此类基因。bar基因编码对除草剂草铵膦(basta)的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，而ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。

草甘膦抗性由突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因给予。参见例如Shah等的美国专利第4,940,835号，该专利公开了可赋予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。Barry等的美国专利第5,627,061号也描述了编码EPSPS酶的基因。另参见美国专利第6,248,876B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE 37,287E和5,491,288号；和国际公布号WO 97/04103、WO 97/04114、WO 00/66746、WO 01/66704、WO 00/66747和WO00/66748，这些文献就其所有用途在此引入作为参考。如在美国专利第5,776,760和5,463,175号中更全面的描述，还将草甘膦抗性赋予表达草甘膦氧化还原酶编码基因的植物，这两个专利就其所有用途在此引入作为参考。另外，可通过过量表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因赋予植物草甘膦抗性。参见例如美国专利申请序号10/004,357和10/427,692，它们每个均在此引入作为参考。

还可使用赋予对除草剂耐受性的多肽，所述除草剂抑制酶-谷氨酰胺合酶，例如草胺膦或草铵膦(例如bar基因)。谷氨酰胺合酶(GS)似乎是大部分植物细胞发育和生命必需的必需酶，GS抑制剂对植物细胞有毒性。已基于归因于植物中的GS抑制的毒性作用开发了草铵膦除草剂。这些除草剂是非选择性的；即它们抑制植被的所有不同物种的生长。含外源草胺膦乙酰转移酶的植物的发育描述于美国专利第5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616和5,879,903号，这些文献就其所有用途整体在此引入作为参考。还公开了具有此活性的突变草胺膦乙酰转移酶。

在其它实施方案中，可使用赋予对除草剂抗性的多肽，所述除草剂抑制protox(原卟啉原氧化酶)。protox是叶绿素产生必需的，叶绿素是所有植物存活必需的。protox酶用作多种除草化合物的标靶。这些除草剂还抑制植被的所有不同物种的生长。含改变的protox活性、抗这些除草剂的植物的发育描述于美国专利第6,288,306、6,282,837和5,767,373号；以及国际公布号WO 01/12825，这些文献就其所有用途整体在此引入作为参考。

在其它实施方案中，使用包含其它除草剂抗性模式的多肽。例如，羟基苯基丙酮酸双加氧酶是催化其中对羟基苯基丙酮酸(HPP)被转化为尿黑酸的反应的酶。抑制该酶的分子和结合该酶以便抑制HPP转化为尿黑酸的分子可用作除草剂。更加抗某些除草剂的植物描述于美国专利第6,245,968、6,268,549和6,069,115号；以及国际公布号WO99/23886，这些文献就其所有用途整体在此引入作为参考。还公开了具有该活性的突变型羟基苯基丙酮酸双加氧酶。

其余的除草剂包括但不限于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂如精喹禾灵、合成的植物生长素如二氯喹啉酸、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂除草剂(例如甲磺草胺)、色素合成抑制剂除草剂如羟基苯基丙酮酸双加氧酶(例如硝草酮或磺草酮)、草胺膦乙酰转移酶或八氢番茄红素去饱和酶抑制剂如吡氟草胺或色素合成抑制剂。

V.导入方法

含有本发明增强子结构域及其有效连接的异源启动子的DNA构建体可用于转化任何目标生物。在具体的实施方案中，生物包括植物或其部分。以此方式可获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、胚等。

本发明的方法包括将多肽或多核苷酸导入到植物中。“导入”意指提供给植物多核苷酸的方式，以此方式序列可进入植物细胞的内部。本发明的方法不依赖将序列导入到植物中的特定方法，只是多核苷酸或多肽要进入植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽导入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“稳定转化”意指导入到植物中的核苷酸构建体整合到植物基因组中，并能够由其子代遗传。“瞬时转化”意指将多核苷酸导入到植物中但不整合入植物基因组中，或者将多肽导入到植物中。

转化方法以及将多肽或多核苷酸序列导入到植物中的方法可随为转化标靶的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变。将多肽和多核苷酸导入到植物细胞中的适宜方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 83：5602-5606)、土壤杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055号和美国专利第5,981,840号)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722)和轰击粒子加速(参见例如美国专利第4,945,050号、美国专利第5,879,918号、美国专利第5,886,244和5,932,782号；Tomes等(1995)载于Plant cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，修订版，Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lecl转化(WO 00/28058)。另参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl. Genet.96：319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利第5,240,855、5,322,783和5,324,646号；Klein等(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利第5,736，369号(谷物)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等(1985)载于The Experimental Manipulation of OvuleTissues，修订版，Chapman等(Longman，New York)，197-209页(花粉)；Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D′Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米对根癌土壤杆菌)；所有这些文献都在此引入作为参考。

在具体的实施方案中，可使用多种瞬时转化方法将本发明的DNA构建体提供给植物。这样的转化方法包括使用本领域已知的技术将含增强子结构域的DNA构建体瞬时转化入植物中。这样的技术包括病毒载体系统和以排除随后的DNA释放的方式沉淀多核苷酸。因此，可由颗粒结合的DNA发生转录，但其释放以整合入基因组中的频率被极大降低。这样的方法包括使用包被聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)的颗粒。

在其它实施方案中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本发明的多核苷酸导入到植物中。一般来说，这些方法包括将本发明的核苷酸构建体掺入到病毒DNA或RNA分子中。此外，一般认为本发明的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。将多核苷酸导入到植物中并表达有效连接的序列(包括病毒DNA或RNA分子)的方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931号和Porta等(1996)MolecularBiotechnology 5：209-221；这些文献在此引入作为参考。

将多核苷酸靶向插入到植物基因组中的特定位置的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，使用位点特异性重组系统实现多核苷酸在预期基因组位置的插入。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些文献都在此引入作为参考。简而言之，本发明的多核苷酸可包含在转移表达盒中，侧接两个非重组发生的重组位点。将转移表达盒导入到植物中，该植物具有稳定整合入其基因组中的靶点，所述靶点位于两个对应于转移表达盒位点的非重组发生的重组位点侧翼。提供适宜的重组酶，转移表达盒被整合在靶点处。由此目标多核苷酸中被整合在植物基因组中的特定染色体位置。

已转化的细胞可按照常规方法培养成植株。参见例如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可用相同转化株或不同株授粉培育这些植株，鉴别组成型表达预期表型特征的所获子代。可培育两代以上，以确保预期表型特征的表达被稳定保持和遗传，然后收获种子，以确保已实现预期表型特征的表达。以此方式，本发明提供具有稳定整合入其基因组中的本发明多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸可用任何目标多核苷酸序列的组合堆叠，以便产生具有期望性状的植物。本文使用的性状指来源于特定序列或序列组的表型。例如，本发明的多核苷酸可用任何其它多核苷酸堆叠，所述多核苷酸编码具有杀虫和/或杀昆虫活性和/或除草活性的多肽，例如其它苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(描述于美国专利第5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881和Geiser等(1986)Gene 48：109)、凝集素(Van Damme等(1994)Plant Mol.Biol.24：825)、果胶(pentin)(描述于美国专利第5,981,722号)等。产生的组合还可包括多个拷贝的任一种目标多核苷酸。本发明的多核苷酸还可用任何其它基因或基因组合堆叠，以产生具有多种期望的性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于期望用于动物饲料的性状，例如高油基因(例如美国专利第6,232,529号)；平衡的氨基酸(例如hordothionin(美国专利第5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409号)；大麦高赖氨酸(Williamson等(1987)Eur.J. Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等(1988)Gene 71：359；和Musumura等(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的可消化性(例如已修饰的贮藏蛋白(2001年11月7日申请的美国申请序号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日申请的美国申请序号10/005,429))；这些文献的公开内容在此引入作为参考。

本发明的多核苷酸还可堆叠以下性状：期望用于抗病或抗除草剂等性状(例如伏马毒素脱毒基因(美国专利第5,792,931号)；减毒和抗病基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science262：1432；Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)；产生除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，例如草胺膦或草铵膦(basta)(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及期望用于加工或处理产物的性状，例如高油(例如美国专利第6,232,529号)；改性油(例如脂肪酸去饱和基因(美国专利第5,952,544号；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；以及有利于聚羟基烷酸酯(PHA)表达的聚合物或生物塑料(例如美国专利第5,602,321号、β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰基辅酶A还原酶(Schubert等(1988)J. Bacteriol.170：5837-5847))；这些文献的公开内容在此引入作为参考。人们还可将本发明的多核苷酸与提供农艺性状的多核苷酸组合，所述农艺性状例如为雄性不育(例如参见美国专利第5.583,210号)、茎强度、开花时间，或转化技术性状，例如细胞周期调节或基因靶向(例如WO 99/61619、WO 00/17364和WO99/25821)；这些文献的公开内容在此引入作为参考。

可通过任何方法产生这些堆叠的组合，包括但不限于通过任何常规方法或TopCross方法交叉育种植物或遗传转化。如果通过遗传转化植物堆叠序列，则目标多核苷酸序列可以任何时间或任何顺序组合。例如，含一种或多种期望性状的转基因植物可用作标靶，以通过随后的转化导入其它性状。可在共转化方法中将所述性状与由任何转化表达盒组合提供的目标多核苷酸一起同时导入。例如，如果要导入两个序列，则两个序列可包含在独立的转化表达盒中(反式)，或包含在同一的转化表达盒中(顺式)。序列的表达可由相同启动子或不同启动子驱动。在某些情况下，可能期望导入将抑制目标多核苷酸表达的转化表达盒。这可与任何组合的其它阻抑表达盒或过量表达表达盒进行组合，以在植物中产生期望的性状组合。还认识到，多核苷酸序列可在期望的基因组位置使用位点特异性重组系统堆叠。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些文献都在此引入作为参考。

VI.使用方法

提供调节任何多核苷酸或由此编码的多肽的浓度和/或活性的方法。一般来说，相对于不具有导入的本发明序列的天然对照植物、植物部分或细胞，浓度和/活性增加或降低达至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明中的调节可发生在植物向预期发育阶段生长的过程中和/或之后。可直接(例如通过测定生物中的多肽或多核苷酸水平)或间接(例如通过检测生物中的多肽活性或多肽)检测目标多核苷酸或多肽的表达水平。

在具体的实施方案中，将含增强子结构域的DNA构建体导入到植物细胞中。随后，使用本领域技术人员众所周知的方法选择具有导入的本发明序列的植物细胞，所述方法包括但不限于DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。在一种方法中，提供细胞群，并将含本发明嵌合转录调节区的DNA构建体导入至少一个细胞群中，所述嵌合转录调节区与含有选择标记的多核苷酸有效连接。然后使细胞群与有效浓度的适宜选择剂接触；并选择表达所述多核苷酸的植物细胞。由此鉴别出具有该DNA构建体的植物细胞。在植物形成条件下培养由前述实施方案改变或修饰的植物或植物部分，培养时间足以调节与含有增强子结构域的转录控制区有效连接的多核苷酸的浓度和/或活性。植物形成条件在本领域众所周知，并在本文别处简要论述。

在一个实施方案中，本发明的增强子用于调节两种目标多核苷酸的表达。在这些方法中，将具有定位于第一和第二启动子之间并与第一和第二启动子有效连接的本发明增强子的DNA构建体导入植物中。在这些方法中，增强子允许调节相异方向的第一和第二启动子的表达。这些DNA构建体的示例性但非限制性的实例按5′→3′或3′→5′方向包含：第一目标多核苷酸、第一启动子、至少一个拷贝的本发明增强子、第二启动子和第二目标多核苷酸，其中第一目标多核苷酸与第一启动子有效连接，第一启动子与至少一个拷贝的本发明增强子有效连接，至少一个拷贝的本发明增强子与第二启动子有效连接，第二启动子与第二目标多核苷酸有效连接。在具体的实施方案中，增强子序列对第一和第二增强子序列是异源的。

在某些实施方案中，含增强子结构域的嵌合转录调节区可用于与选择标记有效连接的DNA构建体，所述选择标记例如为可赋予对除草剂耐受性的多核苷酸。例如，将包含含本发明增强子结构域的嵌合转录调节区的DNA构建体与可赋予对除草剂耐受性的多核苷酸有效连接，该多核苷酸可在例如植物、细菌、放线菌、酵母、藻类或其它真菌中用作选择标记。例如，已用这样的DNA构建体转化的生物可基于其在除草剂存在下生长的能力选择，该除草剂应不允许对照生物生长。本文使用的选择剂的“有效浓度”是允许表达目标多核苷酸的细胞存活的选择剂浓度，但不表达目标多核苷酸序列的细胞在该浓度的选择剂存在下无法存活。

如在实施例4和图6中所示，这样的选择方法允许人们评价目标多核苷酸的表达。例如，在具体的实施方案中，这样的方法允许人们在转化过程的早期解决在目标多核苷酸表达方面的潜在问题。在这些实施方案中，包含嵌合转录调节区的构建体与编码选择标记的多核苷酸有效连接。相同的构建体还包含也与嵌合转录调节区或单独的目标启动子有效连接的目标多核苷酸。尽管可使用任何目标多核苷酸，但在具体的实施例中，使用杀虫多核苷酸。

在其它实施方案中，包含含增强子结构域并与目标多核苷酸有效连接的嵌合转录调节区的构建体可表现出非常高的转化效率，例如至少20％、30％、40％、50％或60％或更高的效率。在具体的实施方案中，目标多核苷酸赋予对选择标记的耐受性，在更具体的实施方案中，该序列赋予对目标除草剂的耐受性。以此方式提供改善的转化方法。而且，当含本发明的增强子结构域的构建体与可赋予对选择标记的耐受性的多核苷酸(例如赋予除草剂耐受性的序列)有效连接时，获得的转化体可表现出非常高频率的对该标记的耐受性，使得例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的转化体耐受该标记。本文使用的“转化效率”被定义为表现出预期的目标多核苷酸表型(即表现出对除草剂的耐受性)的T0事件的百分率。

另外，当包含含至少一个拷贝的增强子结构域的嵌合转录调节结构域的构建体与目标多核苷酸有效连接时，其中仅一个拷贝的构建体被插入到基因组中的转化事件的频率可高达至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上。以此方式本发明还提供改进的转化方法。要认识到的是，可使用多个拷贝的增强子结构域，包括1、2、3、4、5、6个或以上。在这些方法中，可使用适宜的方法基于导入到生物中的多核苷酸选择转化体。

本发明还提供含至少一种核酸构建体的试剂盒，所述核酸构建体包含含至少一个拷贝的本发明增强子结构域或其活性变体或片段的嵌合转录调节区。在某些方面，本发明的构建体将包含T-DNA序列。

提供以下实施例是为了阐述，而非为了限制。

实施例

实施例1.在玉米中使用GAT序列的转化方法

I.土壤杆菌母板的制备

1.获得具有GAT组分(SEQ ID NO：7或8)的工程根癌土壤杆菌菌株，并以50％甘油母液储存于-80℃冰箱。使用的转录控制区是与ZmUbi PRO-5UTR-ZmUbi内含子1启动子(SEQ ID NO：9)有效连接的3X35S ENH(-)。该转录控制区(SEQ ID NO：9)示于下文，表明了调节区的多个区域的位置：a)反向的35S增强子(3X)具有单下划线；b)UBI启动子具有双下划线，c)UBI内含子为斜体。

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2.划线分离细菌，由甘油母液制备母板，以在#800培养基上产生单个菌落，该细菌于28℃避光培养3-4天。

3.将母板的1个菌落在#810培养基上划线制备工作板。该细菌于28℃避光培养1-2天。

II.用于胚感染的细菌的制备

1.胚分离前1天制备土壤杆菌的液体培养物。准备烧瓶装入30ml 557A培养基、30μl 2％乙酰丁香酮和30μl 5％壮观霉素。

2.用来自810培养基的1接种环土壤杆菌接种，并置于摇床(200rpm)上于28℃暗室过夜。

3.在感染的早晨，取土壤杆菌液体培养物的样品，并用557A进行1/4稀释。使用稀释的液体培养物使用550nm的可见光进行OD读数。

4.适宜时按照OD读数对土壤杆菌培养物进行稀释，以在胚分离期间将OD读数保持在0.2-0.8之间。

5.在制备用于感染的土壤杆菌时，重复液体培养物的OD读数。使用由标准曲线获得的式E(1.755*(lnOD)+21.77)，使用OD读数计算获得5E10cfu/ml(cfu＝菌落形成单位)需要的ml数。将计算量的土壤杆菌液体培养物吸取入14ml管中，并以4500rpm于4-20℃离心10分钟。取出上清液，并将土壤杆菌重悬浮在适宜量的100μM乙酰丁香酮的561Q溶液中。

III.不成熟胚的分离

1.在授粉后9-11天收获GS3穗，胚大小长1-2mm。

2.将穗在50％漂白液和1滴吐温(Tween)中消毒20-30分钟。在无菌水中清洗3-5次。

3.从核仁分离出胚，置于装有2ml 561Q的小管中。

VI.胚的土壤杆菌感染

1.用移液管取出含分离的胚的小管中的561Q，加入1ml处于上述OD的土壤杆菌悬液。

2.涡旋约30秒混合。

3.室温感染5分钟。

V.共培养

1.取出液体培养基后，转移胚，在562P共培养培养基的表面上定向胚，胚轴向下。

2.将胚置于20℃培养箱中长达3天。再转换至28℃培养3天。

VI.选择转基因推定愈伤组织事件

1.共培养后，将胚转移至含1mM草甘膦的563I选择培养基。胚于28℃避光培养。

2.每14-21天将胚转移至新鲜563I培养基。选择过程可持续约2个月，直至可鉴别出活跃生长的推定愈伤组织事件。将推定的愈伤组织事件保持在563I培养基上，并对愈伤组织取样，用于PCR。

VII.再生T0植株

1.将愈伤组织事件转移至含0.1mM草甘膦的287I培养基，直至体细胞胚成熟。愈伤组织于28℃避光培养。

2.将成熟胚转移至平板中含0.1mM草甘膦的273I胚萌发培养基。将平板在光照下于28℃培养。

3.在出现枝条和根时，将单个植株转移至装有含0.1mM草甘膦的273I的管中。将管在光照下于28℃培养。

4.具有已长成枝条和根的小植株应被转移至温室，用于T1种子的进一步生长和生产。

实施例2.35S增强子对玉米中GAT和ALS的转化效率和效力的作用

材料与方法

使用4个35S增强子构建体(PHP20118、PHP20120、PHP20122、PHP20124)和一个非35S构建体(PHP19288)用于生产事件，以评价35S增强子对GAT的转化效率和效力的作用(SEQ ID NO：7)(图1)。4个35S增强子构建体之间的差异在于构建体中35S增强子的拷贝数和35S增强子的方向。下面提供了每个35S增强子构建体的概述。

PHP20118包含35S ENH(+)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1(+表示正向35S增强子)。该转录控制区(SEQ ID NO：11)示于下文，表明了调节区的多个区域的位置：a)正向的35S增强子具有单下划线；b)UBI启动子具有双下划线，和c)UBI内含子为斜体。

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PHP20122包含3X35S ENH(+)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1(+表示正向35S增强子)。该转录控制区(SEQ ID NO：12)示于下文，表明了调节区的多个区域的位置：a)正向的35S增强子具有单下划线；b)UBI启动子具有双下划线，和c)UBI内含子为斜体。

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PHP20120包含35S ENH(-)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1(-表示反向35S增强子)。该转录控制区(SEQ ID NO：13)示于下文，表明了调节区的多个区域的位置：a)反向的35S增强子具有单下划线；b)UBI启动子具有双下划线，和c)UBI内含子为斜体。

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ctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgca (SEQ ID NO：13)

PHP20124包含3X35S ENH(-)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1(-表示反向35S增强子)。该转录控制区(SEQ ID NO：14)示于下文，表明了调节区的多个区域的位置：a)反向的35S增强子具有单下划线；b)UBI启动子具有双下划线，和c)UBI内含子为斜体。

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使用来自相同穗的相同胚平行进行转化实验。将GS3系的不成熟胚由各个穗无菌取出，并分为5个部分。然后用分别含5个构建体中每一个的表达盒的根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株LBA4404感染每部分胚。6天共培养后，将胚转移至新鲜的含草甘膦选择培养基。草甘膦选择存活下来的转化细胞增殖并产生体细胞胚发生愈伤组织。在约2个月传代培养后，然后操作愈伤组织，以在草甘膦存在下再生转基因全株，并将其转移至温室。然后在温室中于V3或V4期以6X(156oz/ac)Roundup Ready UltraMax^TM对T0植株进行草甘膦喷雾。取样阳性植株，进行定量PCR确定拷贝数，并进行蛋白质印迹确定表达。然后使T0植株与近交系杂交，以获得种子，用于进一步评价。

结果

检测转化效率，其为选择后产生抗性愈伤组织的感染胚的百分率。PHP19288、PHP20118、PHP20120、PHP20122和PHP20124的平均转化效率分别为58％、63％、59％、57％和51％。数据表明，所有构建体都具有相当高的和类似的转化效率，但PHP20118显现出略微增加(图2)。

确定T0植株效力被定义为完全抗6x草甘膦喷雾的T0事件的百分率。非35S构建体(PHP 19288)的效力为48.1％。相比之下，35S增强子构建体(PHP20118、PHP20120、PHP20122和PHP20124)的效力分别为96.6％、93.5％、89.1％和91.1％(图3)。数据表明，所有35S增强子构建体都显著增加抗草甘膦的植物效力。

使用35S增强子的另一个显著改善是转基因的整合模式。对于非35S增强子构建体，为单拷贝的测试事件的百分率仅为38％，但对于4种35S增强子构建体(PHP20118、PHP20120、PHP20122和PHP20124)，单拷贝事件分别占事件的65％、63％、71％和88％(图4)。

通过蛋白质分析取样全部5种构建体中的一部分事件，以观察非35S和35S事件之间在GAT表达方面的任何比较性差异。该分析表明，非35S增强子构建体的事件具有非常低水平的GAT表达，而35S增强子构建体的大部分事件显示出非常高水平的GAT表达(图5)。

实施例3.在开发新的基于愈伤组织的基因/构建体评价系统时使用 35S增强子GAT

材料与方法

正在开发该测定，以改善在转化过程中的非常早的阶段对杀虫基因表达的评价，以便鉴别与表达相关的潜在问题。该测定的基础是使用草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因(SEQ ID NO：8)作为选择标记。GAT和杀虫测试基因均由强组成型启动子驱动，并连接在同一构建体中。使用的启动子包括ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1和以上实施例1中描述的3X35S增强子。因此，预期以高水平草甘膦选择将鉴别出高杀虫测试基因表达子。然后在昆虫生物测定中使用来自这些推定高表达子的愈伤组织，以确定基因产物是否有功能。对那些显示出效力的构建体进行转化。如果构建体未显示出效力，则可进行随后的生物化学和分子分析，以识别出问题，并再设计基因和在系统中重新测试(图6)。

结果

初步数据已表明，可在愈伤组织阶段检测有效的昆虫控制基因的活性。目前正评价愈伤组织活性和植物效力之间的关系。

实施例4.作为选择标记的GAT

材料与方法

使用土壤杆菌介导的转化将GAT(SEQ ID NO：8)表达盒导入到玉米基因组中。GAT表达盒包含含ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1的启动子和与gat基因有效连接的3X35S增强子(如以上在实施例1中所述)以及pinII终止子。根癌土壤杆菌菌株LBA4404通过去除其天然T-DNA而被致病解除。替代地，Ti质粒上的T-DNA位点包含GAT表达盒。

由发育中的颖果在无菌条件下取出不成熟玉米胚，并用含GAT表达盒的根癌土壤杆菌菌株LBA4404处理。胚和土壤杆菌一起在无草甘膦存在的固体培养基上共培养一段时间后，将胚转移至含抗生素和草甘膦的新鲜选择培养基。抗生素杀死任何剩余的土壤杆菌。选择培养基对玉米体细胞胚发生是刺激性的，对含整合的gat基因的那些细胞是选择性的。因此，推测存活于草甘膦以增殖和产生胚发生组织的愈伤组织被遗传转化。取愈伤组织样品进行分子分析，以通过PCR确认转基因的存在情况。然后操作胚组织，以在草甘膦存在下再生转基因植物，然后将该植物转移至温室。T0植物用不同浓度的草甘膦喷雾。取样阳性植株进行转基因拷贝数的分子分析，并与近交系杂交，以由初始转化的植株获得种子。

通过在具有不同水平草甘膦的培养基上测试未转化的胚响应建立草甘膦杀伤曲线。由不成熟穗分离GS3胚，并将其置于含0.0mM、0.5mM、1.0mM和2.0mM草甘膦的培养基上。在约40天培养后，观察并记录胚的响应。类似地，将具有GAT构建体的感染的GS3胚放置在含0.0mM、0.5mM、1.0mM和2.0mM草甘膦的培养基上。在约40天培养后，观察并记录感染的胚的响应(图7)。

进行平行实验，以比较GAT、bar和mopat的转化效率。由各个穗无菌取出GS3系的不成熟胚，并分为3部分。然后用分别含GAT、bar或mopat表达盒的根癌土壤杆菌菌株LBA4404感染各部分胚。在共培养后，用GAT构建体感染的胚在常规草甘膦培养基上选择，用bar或mopat构建体感染的胚在常规草铵膦培养基上选择。每2周进行一次传代培养。在约50天选择时，观察并记录胚的响应。

结果

由草甘膦杀伤曲线实验可见，在具有0.0mM草甘膦的培养基上所有胚都发端出健康愈伤组织，而在具有0.5mM草甘膦的培养基上约一半胚显示出愈伤组织发端。在含1.0mM和2.0mM草甘膦的培养基上胚具有非常少的愈伤组织生长。这表明0.5mM不足以抑制所有胚生长，但1mM或2mM强得足以杀死未转化胚。在感染的胚实验中，大部分愈伤组织在具有0.0mM和0.5mM草甘膦的培养基上生长，但某些胚在具有1.0mM或2.0mM草甘膦的培养基上发端出抗性愈伤组织。蛋白质印迹或PCR分析已证实，这些抗性愈伤组织被转化。目前，GAT一直表现为有效的选择标记，在GS3和introEF09B基因型中均具有极佳的转化效率(图9和表1)。

表1在introEF09B中的GAT转化效率

基因型构建体选择标记感染胚数 GH事件数基于GH事件

数的txn％

EFWWBTX GATHRA GAT 1332 354 27％

EFWWCTX GATHRA GAT 136 47 35％

EFWWETX GATHRA GAT 1109 158 14％

EFWWZTX GATHRA GAT 1790 502 28％

4367 1061 24％

在比较GAT、bar和mopat的平行实验中，GAT得到约64％的最佳转化效率，bar为34％，而mopat为30％。采用GAT选择的愈伤组织看起来比以草甘膦选择的那些愈伤组织生长得更快(图9)。

实施例5：转基因植物的转化和再生

用包含含增强子结构域SEQ ID NO：1及与其有效连接的ZmUBIPRO-5UTR-ZmUBI内含子1(SEQ ID NO：6)的嵌合转录调节区的质粒轰击温室供体植物的不成熟玉米胚。嵌合转录调节区与目标多核苷酸有效连接并赋予对除草剂双丙氨酰膦(Bialaphos)抗性的选择标记基因PAT(Wohlleben等(1988)Gene 70：25-37)。或者，在单独的质粒上提供选择标记基因。转化如下进行。培养基配方如下。

靶组织的制备

脱壳穗，在30％Clorox漂白水加0.5％Micro去污剂中表面消毒20分钟，用无菌水清洗2次。切下不成熟胚，以每板25个胚将胚轴侧向下放置(胚子叶侧向上)在560Y培养基上达4小时，然后排列在2.5cm目标区内，准备轰击。

制备含上述构建体的质粒载体。使用CaCl₂沉淀法如下将该质粒DNA加含PAT选择标记的质粒DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨粒上：100μl制备钨颗粒的水溶液；10μl(1μg)DNA的Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaCl₂；和10μl 0.1M亚精胺。

序贯地将每种试剂加入钨颗粒悬浮液，同时保持在多管涡旋器上。对最终的混合物短暂超声，并使其在恒定涡旋下温育10分钟。在沉淀期后，各管短暂离心，取出液体，用500ml100％乙醇清洗，离心30秒。再次去除液体，将105μl100％乙醇加入至最终的钨颗粒沉淀。对于粒子枪轰击，短暂超声钨/DNA颗粒，10μl点样到每个大载体的中心，使其干燥约2分钟，之后轰击。

用粒子枪以水平#4轰击样品板。所有样品都接受650PSI的单次射击，由每管制备的颗粒/DNA取总共10份等份试样。

在轰击后，将胚在560Y培养基上保持2天，然后转移至含3mg/升双丙氨酰膦(Bialaphos)的560R选择培养基，每2周传代培养1次。在约10周的选择后，将选择抗性愈伤组织克隆转移至288J培养基，以启动植株再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，将充分发育的体细胞胚转移至萌发培养基，并转移至光照培养室。在约7-10天后，将发育中的小植株转移至管内的272V无激素培养基中达7-10天，直至小植株完全长成。然后将植株转移至铺有盆栽土的浅苗床(等于2.5″盆)中的插入位，并在生长室中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，然后转移至标准600盆(1.6加仑)中，并生长至成熟。监测植株，并记录基于目标多核苷酸的预期表型。

轰击培养基(560Y)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调节至pH 5.8后用D-I H₂O定容)；2.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)(在用D-I H₂O定容后加入)；和8.5mg/l硝酸银(在灭菌培养基并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l 2，4-D(在用KOH调节至pH 5.8后用D-IH₂O定容)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-I H₂O定容后加入)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨酰膦(均在灭菌培养基并冷却至室温后加入)。

植物再生培养基(288J)含有4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40/l甘氨酸，用精制的D-I H₂O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l 0.1mM脱落酸(在调节至pH 5.6后用精制的D-I H₂O定容)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-I H₂O定容后加入)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨酰膦(在灭菌培养基并冷却至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-I H₂O定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调节至pH 5.6后用精制的D-I H₂O定容)；和6g/l细菌琼脂糖(在用精制的D-I H₂O定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。

实施例6.大豆胚转化

培养条件

将大豆胚发生悬浮培养物(Jack栽培种)保持在35ml液体培养基SB 196(参见以下配方)中，该培养基处于150rpm、26℃的旋转摇床上，采用16∶8小时昼/夜光周期的冷白色荧光，光强度为60-85μE/m2/s。通过将约35mg组织培养物接种入35ml新鲜液体SB 196中每7天至两周传代培养一次(优选的传代培养间隔为每7天1次)。

用以下实施例描述的质粒和DNA片段通过粒子枪轰击的方法转化大豆胚发生悬浮培养物(Klein等(1987)Nature，327：70)。

大豆胚发生悬浮培养物发端

大豆培养物每月发端两次，每次发端之间有5-7天。

在种植后45-55天采摘可用大豆植株的具有不成熟种子的荚，剥掉它们的外壳，并置于灭菌的品红盒中。大豆种子通过在5％漂白水溶液和1滴象牙皂(95ml高压蒸汽灭菌的蒸馏水加5ml漂白水和1滴肥皂)中振摇15分钟消毒。充分混合。使用2个1升瓶的无菌蒸馏水清洗种子，将小于4mm的那些种子放置在单个显微镜载玻片上。切下种子的小端，子叶压出种皮外。将子叶转移至含SB1培养基的平板(每板25-30个子叶)。平板用纤维带包裹，储存8周。在此时间后切下次生胚，并放置于SB 196液体培养基中达7天。

用于轰击的DNA的制备

使用含目标基因和选择标记基因的完整质粒或DNA质粒片段进行轰击。常规地制备用于轰击的质粒DNA，并使用在Promega^TM方法和应用指南，第2版(106页)中描述的方法纯化。通过凝胶分离双酶切的质粒获得携带嵌合转录调节区的质粒片段，该嵌合转录调节区含有增强子结构域SEQ ID NO：1及与其有效连接的ZmUBIPRO-5UTR-ZmUBI内含子1(SEQ ID NO：6)，并且含有与内含子1有效连接的目标多核苷酸。在每种情况下，用适于目标质粒的0.5ml特定酶混合物消化100μg质粒DNA。获得的DNA片段通过在1％SeaPlaque GTG琼脂糖(Bio Whitaker Molecular Applications)上进行凝胶电泳来分离，并从琼脂糖凝胶上切下上述含该构建体的DNA片段。使用琼脂酶(GELase)消化酶按照生产商的方案由琼脂糖纯化DNA。

将50μl含3mg金粒(3mg金)的无菌蒸馏水等份试样加入到5μl的1μg/μl DNA溶液(如上所述制备的完整质粒或DNA片段)、50μl 2.5M CaCl₂和20μl 0.1M亚精胺中。以涡旋振荡器的水平3振摇混合物3分钟，并在台式离心机中离心10秒。在用400μl 100％乙醇清洗后，通过在40μl100％乙醇中超声悬浮沉淀。将5μl DNA悬浮液分配至Biolistic PDS1000/HE设备碟的每个飞碟中。每次轰击每5μl等份试样含约0.375mg金(即每碟)。

组织制备和用DNA轰击

将约150-200mg的7日龄胚悬浮培养物置于空的无菌60×15mm培养皿中，该培养皿用塑料网覆盖。每板1-2次射击轰击组织，膜破裂压力设定在1100PSI，腔体抽至27-28英寸汞柱的真空度。将组织置于距离阻滞/停止筛约3.5英寸处。

转化胚的选择

使用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶HPT基因用作选择标记时)或氯磺隆(当乙酰乳酸合酶ALS基因用作选择标记时)选择转化胚。

潮霉素(HPT)选择

在轰击后，将组织置于新鲜的SB196培养基中，并如上所述培养。在轰击后6天，用含30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196更换SB196。选择培养基每周更新。选择后4-6周，可观察到绿色的转化组织由未转化的坏死性胚发生丛生长出来。取出分离的绿色组织，并接种入多孔板中，以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。氯磺隆(ALS)选择

在轰击后，将组织分配在具有新鲜SB 196培养基的2个烧瓶之间，并如上所述培养。在轰击后6-7天，用含100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196更换SB196。选择培养基每周更新。选择后4-6周，可观察到绿色的转化组织由未转化的坏死性胚发生丛生长出来。取出分离的绿色组织，并接种入含SB 196的多孔板中，以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。

大豆体细胞胚再生为植株

为了由胚发生悬浮培养物获得全株，必须再生组织。

胚成熟

将胚于26℃在冷白色荧光(Phillips冷白色EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40Agro)灯泡(40瓦)下以16∶8小时光周期和90-120uE/m2s光强度在SB 196中培养4-6周。在此时间后，取出胚簇至固体琼脂培养基SB 166达1-2周。然后将簇传代培养至培养基SB103达3周。在此阶段当中，可由该簇取出单独的胚，并基于使用的目标多核苷酸筛选预期表型。应当指出的是，由目标基因表达产生的任何可检测表型都可在此阶段筛选出来。

胚脱水和发芽

成熟的个体胚通过置于空的小培养皿(35×10mm)中约4-7天脱水。用纤维带密封平板(产生小湿润腔)。将脱水胚置于SB71-4培养基中，在该培养基中使它们在上述的相同培养条件下发芽。由发芽培养基取出发芽的小植株，并用水彻底清洗，然后种植在24室包装托盘中的人工土壤中，用透明塑料圆顶覆盖。2周后，移开圆顶，植物再进行1周的锻炼。如果小植株看起来强壮，则将它们移植至10″人工土壤盆，每盆最多3棵小植株。10-16周后，收集成熟种子，削片并分析蛋白。

培养基配方

SB 196-FN低盐液体增殖培养基(每升)-

MS FeEDTA-100x母液1 10ml

MS硫酸盐-100x母液2 10ml

FN低盐卤化物-100x母液3 10ml

FN低盐P，B，Mo-100x母液4 10ml

B5维生素(1ml/L) 1.0ml

2，4-D(10mg/L终浓度) 1.0ml

KNO₃ 2.83g

(NH₄)₂SO₄ 0.463g

天冬酰胺 1.0g

蔗糖(1％) 10g

pH 5.8

FN低盐母液

母液# 1000ml 500ml

1 MS Fe EDTA 100x 母液

Na₂EDTA^* 3.724g 1.862g

FeSO₄-H₂O 2.784g 1.392g

^*先加入，在搅拌的同时溶解在深色瓶中

2 MS硫酸盐100x母液

MgSO₄-7H₂O 37.0g 18.5g

MnSO₄-H₂O 1.69g 0.845g

ZnSO₄-7H₂O 0.86g 0.43g

CuSO₄-5H₂O 0.0025g 0.00125g

3 FN低盐卤化物100x母液

CaCl₂-2H₂O 30.0g 15.0g

KI 0.083g 0.0715g

CoCl₂-6H₂O 0.0025g 0.00125g

4 FN低盐P，B，Mo 100x母液

KH₂PO₄ 18.5g 9.25g

H₃BO₃ 0.62g 0.31g

Na₂MoO₄-2H₂O 0.025g 0.0125g

SB1固体培养基(每升)含有：1pkg MS盐(Gibco/BRL-目录号#11117-066)；1ml B5维生素1000X母液；31.5g蔗糖；2ml 2，4-D(20mg/L终浓度)；pH 5.7；和8g TC琼脂。

SB 166固体培养基(每升)含有：1pkg MS盐(Gibco/BRL-目录号#11117-066)；1ml B5维生素1000X母液；60g麦芽糖；750mg MgCl₂六水合物；5g活性炭；pH 5.7；和2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)。

SB 103固体培养基(每升)含有：1pkg MS盐(Gibco/BRL-目录号#11117-066)；1ml B5维生素1000X母液；60g麦芽糖；750mg MgCl₂六水合物；pH 5.7；和2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)。

SB 71-4固体培养基(每升)含有：1瓶Gamborg B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-目录号#21153-036)；pH 5.7；和5g TC琼脂。

2，4-D母液得自预制的Phytotech目录号#D 295-浓度是1mg/ml。

以等份试样储存于-20℃的B5维生素母液(每100ml)包含：10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸吡哆醇；和1g硫胺素。如果溶液无法足够快速地溶解，则经热搅动板施加低水平加热。氯磺隆母液包含1mg/ml的0.01N氢氧化铵溶液。

本说明书和所附权利要求书所用的术语前未加数词修饰时包括复数形式。举例来说，“元素”意指一种或多种元素。

在说明书中提及的所有出版物和专利申请都说明本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在此引入作为参考，其程度如同每个单独的出版物或专利申请具体地和单独地被指出引入作为参考。

尽管为了清楚理解已利用阐述和实施例详细描述了前述发明，但显而易见，可在随附权利要求的范围内实施某些改变和修改。

序列表

<110>McCutchen，Billy Fred

Hazel，Christine B.

Liu，Donglong

Lu，Albert L.

Mehre，Wayne J.

Olson，Paul D.

Wong，James F.H.

<120>表达目标多核苷酸的方法和组合物

<130>035718/315230

<150>60/710,854

<151>2005-08-24

<150>60/817,011

<151>2006-06-28

<160>18

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>438

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<220>

<221>增强子

<222>(0)...(0)

<223>35S增强子

<400>1

cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420

caagtggatt gatgtgat 438

<210>2

<211>534

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<220>

<221>启动子

<222>(0)...(0)

<223>具有最小核心启动子的S35增强子

<400>2

cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420

caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactaagct 480

tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac aggg 534

<210>3

<211>52

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<220>

<221>启动子

<222>(0)...(0)

<223>最小核心启动子

<400>3

gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagaggacag gg 52

<210>4

<211>162

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<400>4

catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 60

catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 120

ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactaagct tc 162

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<400>5

atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactaag cttc 44

<210>6

<211>1991

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含ZmUBI PRO-5’UTR-ZMUBI内含子1的启动子序列

<400>6

gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag 60

ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc 120

tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata 180

tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt 240

attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt 300

ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt 360

ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag 420

cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata 480

aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa 540

ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg 600

agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg 660

gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac 720

ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg 780

caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc 840

tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt 900

ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc 960

cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc 1020

tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg 1080

tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg 1140

tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat 1200

ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg 1260

gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc 1320

ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1380

atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt 1440

gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg 1500

ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc 1560

ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa 1620

tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca 1680

tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 1740

gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct 1800

aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga 1860

tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat 1920

acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt 1980

acttctgcag g 1991

<210>7

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的GAT序列(GAT4602)

<221>CDS

<222>(1)...(441)

<400>7

atg ata gag gtg aaa ccg att aac gca gag gat acc tat gaa cta agg 48

Met Ile Glu Val Lys Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Glu Leu Arg

1 5 10 15

cat aga ata ctc aga cca aac cag ccg ata gaa gcg tgt atg ttt gaa 96

His Arg Ile Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe Glu

20 25 30

agc gat tta ctt cgt ggt gca ttt cac tta ggc ggc tat tac ggg ggc 144

Ser Asp Leu Leu Arg Gly Ala Phe His Leu Gly Gly Tyr Tyr Gly Gly

35 40 45

aaa ctg att tcc ata gct tca ttc cac cag gcc gag cac tca gaa ctc 192

Lys Leu Ile Ser Ile Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu Leu

50 55 60

caa ggc cag aaa cag tac cag ctc cga ggt atg gct acc ttg gaa ggt 240

Gln Gly Gln Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Met Ala Thr Leu Glu Gly

65 70 75 80

tat cgt gag cag aag gcg gga tcg agt cta att aaa cac gct gaa gaa 288

Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Ile Lys His Ala Glu Glu

85 90 95

att ctt cgt aag agg ggg gcg gac ttg ctt tgg tgt aat gcg cgg aca 336

Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Leu Leu Trp Cys Asn Ala Arg Thr

100 105 110

tcc gcc tca ggc tac tac aaa aag tta ggc ttc agc gag cag gga gag 384

Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Lys Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly Glu

115 120 125

gta ttc gac acg ccg cca gta gga cct cac atc ctg atg tat aaa agg 432

Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys Arg

130 135 140

atc aca taa 441

Ile Thr *

145

<210>8

<211>444

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的GAT序列--GAT4621

<221>CDS

<222>(1)...(444)

<400>8

atg gct att gag gtt aag cct atc aac gca gag gat acc tat gac ctt 48

Met Ala Ile Glu Val Lys Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Asp Leu

1 5 10 15

agg cat aga gtg ctc aga cca aac cag cct atc gaa gcc tgc atg ttt 96

Arg His Arg Val Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe

20 25 30

gag tct gac ctt act agg agt gca ttt cac ctt ggt gga ttc tac gga 144

Glu Ser Asp Leu Thr Arg Ser Ala Phe His Leu Gly Gly Phe Tyr Gly

35 40 45

ggt aaa ctg att tcc gtg gct tca ttc cac caa gct gag cac tct gaa 192

Gly Lys Leu Ile Ser Val Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu

50 55 60

ctt caa ggt aag aag cag tac cag ctt aga ggt gtg gct acc ttg gaa 240

Leu Gln Gly Lys Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Val Ala Thr Leu Glu

65 70 75 80

ggt tat aga gag cag aag gct ggt tcc agt ctc gtg aaa cac gct gaa 288

Gly Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Val Lys His Ala Glu

85 90 95

gag att ctc aga aag aga ggt gct gac atg atc tgg tgt aat gcc agg 336

Glu Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Met Ile Trp Cys Asn Ala Arg

100 105 110

aca tct gct tca gga tac tac agg aag ttg gga ttc agt gag caa gga 384

Thr Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Arg Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly

115 120 125

gag gtg ttc gat act cct cca gtt gga cct cac atc ctg atg tat aag 432

Glu Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys

130 135 140

agg atc aca taa 444

Arg Ile Thr*

145

<210>9

<211>3359

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>与ZmUbiPRO-5UTR-ZmUbi内含子1启动子有效连接的3X35S ENH；

反向的35S增强子

<400>9

atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 60

cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc 120

ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac 180

aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg 240

ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta 300

gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa 360

gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg 420

aatctttgac tccatggacg gtatcgataa gctagcttga tatcacatca atccacttgc 480

tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 540

tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga 600

tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct 660

gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc 720

ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagcgt gtcgtgctcc 780

accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg tatgaactgt 840

tcgccagtct ttacggcgag ttctgttagg tcctctattt gaatctttga ctccatgatc 900

gaattatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg 960

atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg 1020

atggcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc 1080

ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc 1140

ctttgttgaa aagtctcaat tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg 1200

gagtagacaa gcgtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt 1260

cgtaagagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct 1320

atttgaatct ttgactccat gggaattcct gcagcccagc ttgcatgcct gcagtgcagc 1380

gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 1440

ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 1500

tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 1560

agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 1620

caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 1680

cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 1740

tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 1800

aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 1860

aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 1920

atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 1980

acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc 2040

tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct 2100

gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct 2160

cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt 2220

tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc 2280

gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc 2340

tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg 2400

cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc 2460

gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac 2520

acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc 2580

gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg 2640

cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct 2700

tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag 2760

aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 2820

catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 2880

atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 2940

tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 3000

aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 3060

tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 3120

ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 3180

acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 3240

tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 3300

tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgca 3359

<210>10

<211>1343

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<220>

<221>增强子

<222>(0)...(0)

<223>反向的35S增强子3X

<400>10

atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 60

cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc 120

ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac 180

aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg 240

ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta 300

gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa 360

gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg 420

aatctttgac tccatggacg gtatcgataa gctagcttga tatcacatca atccacttgc 480

tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 540

tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga 600

tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct 660

gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc 720

ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagcgt gtcgtgctcc 780

accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg tatgaactgt 840

tcgccagtct ttacggcgag ttctgttagg tcctctattt gaatctttga ctccatgatc 900

gaattatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg 960

atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg 1020

atggcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc 1080

ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc 1140

ctttgttgaa aagtctcaat tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg 1200

gagtagacaa gcgtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt 1260

cgtaagagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct 1320

atttgaatct ttgactccat ggg 1343

<210>11

<211>2479

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>35S ENH(+)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1；正向的35S增强子

<400>11

cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420

caagtggatt gatgtgatat caagcttatc gataccgtcg acctcgaggg ggggcccagc 480

ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 540

catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 600

tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 660

tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 720

acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 780

tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc 840

catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat 900

tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa 960

tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa 1020

attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac 1080

gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc 1140

gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc 1200

accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga 1260

gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct 1320

ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca 1380

caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc 1440

caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct 1500

ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg 1560

ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg 1620

atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga 1680

atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc 1740

gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg 1800

tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg 1860

gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg 1920

atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata 1980

tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct 2040

ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat 2100

cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt 2160

gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg 2220

tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt 2280

catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt 2340

ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc 2400

ctgccttcat acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt 2460

gtttggtgtt acttctgca 2479

<210>12

<211>3331

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3X35S ENH(+)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1；正向的35S增强子

<400>12

cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420

caagtggatt gatgtgataa ttcgatcatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca 480

gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag 540

aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacgcttg tctactccaa aaatatcaaa 600

gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 660

aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 720

gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 780

tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 840

gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatcaagct tatcgatacc 900

gccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 960

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 1020

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 1080

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 1140

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 1200

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 1260

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 1320

caagtggatt gatgtgatgt ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga 1380

taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg 1440

tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat 1500

aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac 1560

atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt 1620

gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt 1680

tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta 1740

catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt 1800

tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat 1860

accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc 1920

agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc 1980

gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga 2040

gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag 2100

cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta 2160

cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag 2220

acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa 2280

ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc 2340

cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 2400

gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 2460

gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 2520

tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 2580

tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 2640

tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 2700

tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt 2760

tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga 2820

tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata 2880

tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca 2940

ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg 3000

aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg 3060

atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat 3120

gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt 3180

tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg 3240

atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat 3300

gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc a 3331

<210>13

<211>2454

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>35S ENH(-)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1；反向的35S增强子

<400>13

atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 60

cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc 120

ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac 180

aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg 240

ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta 300

gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa 360

gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg 420

aatctttgac tccatgggaa ttcctgcagc ccagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac 480

ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc 540

acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt 600

aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga 660

atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga 720

ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca 780

cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt 840

tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa 900

aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata 960

aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt 1020

tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc 1080

aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt 1140

cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg 1200

catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc 1260

tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct 1320

tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt 1380

gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc 1440

ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 1500

cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 1560

tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 1620

ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 1680

gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 1740

ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 1800

ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc 1860

tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat 1920

tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 1980

gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg 2040

tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta 2100

cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga 2160

gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact 2220

gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta 2280

tctattataa taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg 2340

gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc 2400

ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgca 2454

<210>14

<211>3359

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3X35S ENH(-)：ZmUBI PRO-5UTR-UBI内含子1；反向的35S增强子

<400>14

atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 60

cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc 120

ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac 180

aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg 240

ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta 300

gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa 360

gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg 420

aatctttgac tccatggacg gtatcgataa gctagcttga tatcacatca atccacttgc 480

tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 540

tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga 600

tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct 660

gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc 720

ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagcgt gtcgtgctcc 780

accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg tatgaactgt 840

tcgccagtct ttacggcgag ttctgttagg tcctctattt gaatctttga ctccatgatc 900

gaattatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg 960

atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg 1020

atggcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc 1080

ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc 1140

ctttgttgaa aagtctcaat tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg 1200

gagtagacaa gcgtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt 1260

cgtaagagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct 1320

atttgaatct ttgactccat gggaattcct gcagcccagc ttgcatgcct gcagtgcagc 1380

gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 1440

ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 1500

tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 1560

agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 1620

caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 1680

cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 1740

tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 1800

aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 1860

aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 1920

atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 1980

acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc 2040

tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct 2100

gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct 2160

cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt 2220

tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc 2280

gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc 2340

tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg 2400

cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc 2460

gtgtttgtgttagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac 2520

acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc 2580

gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg 2640

cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct 2700

tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag 2760

aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 2820

catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 2880

atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 2940

tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 3000

aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 3060

tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 3120

ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 3180

acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 3240

tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 3300

tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgca 3359

<210>15

<211>1340

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>止向的3X35S增强子

<400>15

cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420

caagtggatt gatgtgataa ttcgatcatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca 480

gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag 540

aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacgcttg tctactccaa aaatatcaaa 600

gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 660

aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 720

gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 780

tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 840

gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatcaagct tatcgatacc 900

gccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 960

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 1020

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 1080

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 1140

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 1200

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 1260

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 1320

caagtggatt gatgtgatgt 1340

<210>16

<211>438

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒

<220>

<221>其他特征

<222>(0)...(0)

<223>反向的1X 35S增强子

<400>16

atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 60

cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc 120

ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac 180

aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg 240

ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta 300

gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa 360

gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg 420

aatctttgac tccatggg 438

<210>17

<211>1344

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向的3X 35S增强子

<400>17

cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60

cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120

gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180

gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240

gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300

cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420

caagtggatt gatgtgataa ttcgatcatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca 480

gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag 540

aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacgcttg tctactccaa aaatatcaaa 600

gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 660

aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 720

gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 780

tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 840

gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatcaagct agcttatcga 900

taccgtccat ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg 960

gcgaacagtt catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca 1020

tggtggagca cgacacgctt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc 1080

aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt 1140

gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat 1200

gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca 1260

aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 1320

caaagcaagt ggattgatgt gatg 1344

<210>18

<211>1344

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向的3X 35S增强子

<400>18

catcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc 60

tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg 120

cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca 180

caataaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt 240

gttgaaaagt ctcaattgcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt 300

agacaagcgt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta 360

agagactctg tatgaactgt tcgccagtct ttacggcgag ttctgttagg tcctctattt 420

gaatctttga ctccatggac ggtatcgata agctagcttg atatcacatc aatccacttg 480

ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc 540

atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttcaacgatg gcctttcctt tatcgcaatg 600

atggcatttg taggagccac cttccttttc cactatcttc acaataaagt gacagatagc 660

tgggcaatgg aatccgagga ggtttccgga tattaccctt tgttgaaaag tctcaattgc 720

cctttggtct tctgagactg tatctttgat atttttggag tagacaagcg tgtcgtgctc 780

caccatgttg acgaagattt tcttcttgtc attgagtcgt aagagactct gtatgaactg 840

ttcgccagtc tttacggcga gttctgttag gtcctctatt tgaatctttg actccatgat 900

cgaattatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac 960

gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttcaac 1020

gatggccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccactat 1080

cttcacaata aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc cggatattac 1140

cctttgttga aaagtctcaa ttgccctttg gtcttctgag actgtatctt tgatattttt 1200

ggagtagaca agcgtgtcgt gctccaccat gttgacgaag attttcttct tgtcattgag 1260

tcgtaagaga ctctgtatga actgttcgcc agtctttacg gcgagttctg ttaggtcctc 1320

tatttgaatc tttgactcca tggg 1344

Claims

1.一种表达目标多核苷酸的方法，所述方法包括将至少一种包含嵌合转录调节区的DNA构建体导入到细胞中，所述嵌合转录调节区包含至少一个增强子结构域及与其有效连接的异源启动子，所述嵌合转录调节区与目标多核苷酸有效连接，其中所述增强子结构域选自：

(a)包含SEQ ID NO：1、17的核苷酸序列；

(b)与SEQ ID NO：1或17具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸具有转录调节活性；和

(c)包含SEQ ID NO：1或17的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列。

2.权利要求1的方法，其中所述增强子结构域不包含示于SEQ IDNO：5的序列。

3.权利要求1或2的方法，其中所述嵌合转录调节区包含至少两个拷贝或至少三个拷贝的所述增强子。

4.权利要求3的方法，其中

a)所述拷贝的所述增强子彼此紧密邻接；或，

b)至少一个所述增强子相对于所述启动子以正向或反向定向。

5.权利要求1、2、3或4中任一项的方法，其中所述目标多核苷酸编码多肽。

6.权利要求1、2、3、4或5中任一项的方法，其中所述目标多核苷酸包含选择标记。

7.权利要求6的方法，其中所述选择标记包含赋予对除草剂耐受性的多核苷酸。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞。

9.权利要求7的方法，其中所述方法还包括将所述细胞在含有效浓度的除草剂的培养基中进行培养。

10.权利要求8的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

11.权利要求10的方法，其中所述双子叶植物为大豆、小麦、油菜、向日葵、棉花或苜蓿。

12.权利要求8的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

13.权利要求12的方法，其中所述单子叶植物为玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。

14.一种选择具有目标多核苷酸的细胞的方法，所述方法包括

a)提供细胞群；

b)将含有目标多核苷酸并还含有嵌合转录调节区的DNA构建体导入所述群的至少一个细胞中，所述嵌合转录调节区包含至少一个增强子结构域及与其有效连接的第一异源启动子，所述嵌合转录调节区与选择标记有效连接，其中所述增强子结构域选自：

i)包含SEQ ID NO：1或17的核苷酸序列；

ii)与SEQ ID NO：1或17具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸具有调节转录活性；和

iii)包含SEQ ID NO：1或17的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列；

c)使所述细胞群接触有效浓度的适宜选择剂；和

d)选择表达所述选择标记的植物，并由此鉴别具有目标多核苷酸的植物。

15.权利要求14的方法，其中所述增强子结构域不包含示于SEQID NO：5的序列。

16.权利要求14或15的方法，其中所述嵌合转录调节区包含至少两个拷贝或至少三个拷贝的所述增强子。

17.权利要求16的方法，其中

a)所述增强子的拷贝彼此紧密邻接；或，

18.权利要求14、15、16或17中任一项的方法，其中所述选择标记编码赋予对除草剂耐受性的多肽。

19.权利要求18的方法，其中所述选择剂包括除草剂。

20.权利要求14-19中任一项的方法，其中所述细胞包括植物细胞。

21.权利要求20的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

22.权利要求21的方法，其中所述双子叶植物为大豆、小麦、油菜、向日葵、棉花或苜蓿。

23.权利要求20的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

24.权利要求23的方法，其中所述单子叶植物为玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。

25.权利要求14的方法，其中所述DNA构建体按5′→3′方向或3′→5′方向包含：第一目标多核苷酸、第二异源启动子、至少一个所述增强子结构域、第一异源启动子和选择标记，其中第一目标多核苷酸与第二异源启动子有效连接，第二异源启动子与至少一个所述增强子结构域有效连接，至少一个所述增强子结构域与第一异源启动子有效连接，第一异源启动子与选择标记有效连接，其中所述第一目标多核苷酸和所述选择标记以相异方向表达。

26.一种含有嵌合转录调节元件的多核苷酸，所述嵌合转录调节元件含在细胞中驱动表达的启动子，所述启动子与至少一个拷贝的异源增强子结构域有效连接，其中所述增强子结构域选自：

(a)包含SEQ ID NO：1或10的核苷酸序列；

(b)与SEQ ID NO：1或17具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸具有调节转录活性；和

(c)包含SEQ ID NO：1或17的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列。

27.权利要求26的多核苷酸，其中所述增强子结构域不含SEQ IDNO：5的序列。

28.权利要求26或27的多核苷酸，其中所述嵌合转录调节区包含至少两个拷贝或至少三个拷贝的所述增强子。

29.权利要求27的多核苷酸，其中

a)所述增强子的拷贝彼此紧密邻接；

30.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求26、27、28或29中任一项的多核苷酸。

31.一种细胞，所述细胞包含权利要求26、27、28、29或30中任一项的多核苷酸。

32.权利要求31的细胞，其中所述细胞是植物细胞。

33.权利要求32的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

34.权利要求33的细胞，其中所述双子叶植物为大豆、小麦、油菜、向日葵、棉花或苜蓿。

35.权利要求32的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

36.权利要求35的细胞，其中所述单子叶植物为玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。

37.一种植物，所述植物包含权利要求26、27、28或29中任一项的多核苷酸。

38.权利要求37的植物，其中所述植物为双子叶植物。

39.权利要求38的植物，其中所述双子叶植物为大豆、小麦、油菜、向日葵、棉花或苜蓿。

40.权利要求37的植物，其中所述植物为单子叶植物。

41.权利要求40的植物，其中所述单子叶植物为玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。

42.一种改善转化效率、增加单拷贝整合事件或提高植物的转化效力的方法，所述方法包括：

a)将含有嵌合转录调节区的表达盒导入植物中，所述嵌合转录调节区包含至少一个增强子结构域及与其有效连接的异源启动子，所述嵌合转录调节区与选择标记有效连接，其中所述增强子结构域选自：

i)包含SEQ ID NO：1或17的核苷酸序列；

iii)包含SEQ ID NO：1或17的至少100个连续核苷酸的核苷酸序列；

b)使所述植物接触有效浓度的适宜选择剂；和

c)选择表达所述选择标记的植物。

43.权利要求42的方法，其中所述增强子不包含示于SEQ IDNO：5的序列。

44.权利要求42或43的方法，其中所述嵌合转录调节区包含至少两个拷贝或至少三个拷贝的所述增强子。

45.权利要求44的方法，其中

a)所述增强子的拷贝彼此紧密邻接；

46.权利要求42、43、44或45中任一项的方法，其中所述表达盒还包含目标多核苷酸。

47.权利要求42、43、44、45或46中任一项的方法，其中所述选择标记赋予对除草剂的耐受性。