CN102892888A - 在植物中导入并调节表达基因的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了在植物中导入基因并调节表达基因的组合物和方法。组合物包括启动子构建体，该启动子构建体提供了用于调节表达位点特异性重组酶、同时避免过早切除的活性水平。进一步提供了编码新babyboom多肽的分离的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达框和植物。提供了将基因导入植物的方法，包括质体转化的方法以及来自成熟种子和叶的组织的转化方法。

Description

在植物中导入并调节表达基因的方法和组合物
关于通过EFS-WEB以文本文件提交的序列表的参考
序列表的正式拷贝是以ASCII码格式序列表形式通过EFS-Web电子提交的，文件名为400069SEQLIST.TXT，创建于2010年12月29日并具有534千字节大小，且与本说明书同时提交。包含在ASCII码格式文件中的序列表是说明书的一部分并通过引用以其整体纳入本发明。
发明领域
本发明涉及植物遗传学和分子生物学领域。更特别地，所述组合物和方法涉及在植物中导入基因并调节表达基因。
发明背景
目前的转化技术提供了设计有所需特征的植物的机会。植物转化中的主要进展发生在过去几年中。然而，多数转化方法依赖于将多核苷酸导入正在快速增殖的胚组织。允许更成熟组织转化的方法会节约大量时间和金钱。因此，本领域中需要增加植物转化效率并允许更成熟组织转化的方法。
此外，由于转基因可能对植物的生长或生殖力有消极影响，经常需要降低转基因的活性。重组系统可以被用于切除转基因，其中位点特异性重组酶的表达由诱导型启动子调节。通常这些系统与过早切除相关。因此，本领域中需要以有限的过早切除来有效切除掉转基因的方法。
发明简述
提供了在植物中导入基因并调节表达基因的组合物和方法。组合物包含启动子构建体，启动子构建体用于可操作连接的编码序列表达的调节诱导。在特别的实施方式中，启动子构建体包含玉米rab17启动子或其活性变体或片段以及附着B(attB)位点。修饰的rab17启动子构建体可用于调节包括位点特异性重组酶在内的各种编码序列表达的方法，位点特异性重组酶能将植物中目的多核苷酸的过早切除最小化。
进一步提供了转化质体、如叶绿体的方法，其包括导入编码细胞增殖因子如babyboom(BBM)多肽的异源多核苷酸。提供了新BBM序列，和将该序列导入植物的方法以及包含新BBM序列的植物。也提供了制备和转化成熟胚外植体及叶组织的方法。
附图简述
图1提供了对与玉米babybbom(BBM)同源的50个序列的系统发育分析的描述。
图2A-2M分别显示了在本发明描述的分析中发现的共有基序序列1-10，14，15和19，以及用于生成共有基序的各多肽区域的比对。
图3描述了与玉米BBM(ZmBBM)同源的50个序列中发现的基序。
图4显示了各种BBM多肽的氨基酸序列比对：玉米babyboom 2(ZmBBM2，SEQ ID NO：12)，高粱babyboom 2(SbBBM2，SEQ ID NO：28)，稻babyboom2(OsBBM2，SEQ ID NO：18)，稻babyboom 3(OsBBM3，SEQ ID NO：20)，稻babyboom 1(OsBBM1，SEQ ID NO：16)，玉米babyboom(ZmBBM，SEQID NO：10)，高粱babyboom(SbBBM，SEQ ID NO：4)，稻babyboom(OsBBM，SEQ ID NO：14)，芸苔属(Brassica)babyboom 1(BnBBM1，SEQ ID NO：24)，芸苔属babyboom2(BnBBM2，SEQ ID NO：26)，拟南芥(Arabidopsis)babyboom(AtBBM，SEQ ID NO：22)，苜蓿(medicago)babyboom(MtBBM，SEQ ID NO：8)，大豆babyboom(GmBBM，SEQ IDNO：2)，以及葡萄babyboom(VvBBM，SEQ ID NO：6)。
图5提供了对babyboom多肽中发现的基序的描述。
发明详述
本发明公开的组合物和方法用于在植物中导入基因并调节表达基因。组合物包括启动子构建体，该启动子构建体提供了用于包括位点特异性重组酶在内的各种编码序列调节表达的活性水平。进一步提供了包含新babyboom(BBM)多核苷酸和多肽序列的组合物以及包含该多核苷酸和多肽序列的植物。提供了将基因导入植物的方法，包括将新BBM多核苷酸和多肽导入植物的方法，增强质体转化的方法，和转化来自成熟种子的组织的方法。
具有SEQ ID NO：45中所显示序列的表达框(expression cassette)，其由玉米rab 17启动子、attB位点、和位点特异性重组酶FLP的编码序列构成，能够在诱导下以降低过早切除的方式表达FLP。不受任何理论或作用机制的约束，认为attB位点的存在改变了启动子的活性，允许紧密调节可操作连接的编码序列表达的诱导。因此，组合物包含启动子构建体，该启动子构建体含有修饰的玉米rab 17启动子或其活性变体或片段。在这些实施方式中的某些中，启动子构建体含有玉米rab 17启动子或其活性变体或片段以及attB位点或其变体或片段。在这些实施方式中的某些中，玉米rab 17启动子有SEQ ID NO：29中显示的序列或其活性变体或片段。
本发明中使用的术语“启动子”包括对DNA的区域的提及，其参与RNA聚合酶及其他蛋白的识别和结合以启动编码序列的转录。启动子可以是自然发生的启动子，其变体或片段，或合成得到。“启动子构建体”是多核苷酸，其包含启动子和任选位于表达框中启动子和编码序列之间的、转录起始所不必要的序列或编码序列的部分序列。这些插入序列可以包括调谐子、限制性位点、5’未翻译区域(5′-UTR)序列，其是被转录、但不被翻译成多肽的转录子区域，以及重组位点。
启动子构建体中的启动子是玉米rab17启动子或其活性变体或片段。玉米rab17(对脱落酸反应)基因(GenBank登录号.X15994；Vilardell等.(1990)Plant Mol Biol 14：423-432；Vilardell等.(1991)Plant Mol Biol 17：985-993；每一篇整体纳入本发明)在晚期胚中表达，但其表达可以被暴露于脱落酸或水胁迫诱导。玉米rab 17启动子序列对应于Vilardell等.(1990)Plant Mol Biol14：423-432中公开的GenBank登录号.X15994的1-558位核苷酸并在SEQ IDNO：126中显示。另一种玉米rab 17启动子在美国专利号7,253,000和7,491,813中公开并SEQ ID NO：29中显示，每篇通过引用整体纳入本发明。rab 17启动子含有5个推定的脱落酸反应元件(ABRE)(Busk等(1997)Plant J 11：1285-1295，其通过引用整体纳入本发明)。推定的ABRE元件可在玉米rab 17启动子中约-208至-203(SEQ ID NO：29的304到309位核苷酸)、-162到-157(SEQ ID NO：29的348到353位核苷酸)、-147到-142(SEQ ID NO：29的363到368位核苷酸)、-141到-136(SEQ ID NO：29的369到374位核苷酸)以及-96到-91(SEQ ID NO：29的414到419位核苷酸)处找到。rab 17启动子也包含干燥反应元件(DRE)，其中的核心序列与拟南芥中的DRE(干燥反应)和CRT(冷反应元件)元件相同。干燥反应元件在玉米rab 17启动子中-213至-206(SEQ ID NO：29的299到306位核苷酸)、-190到-185(SEQ IDNO：29的322到327位核苷酸)处找到。CAAT和TATAA盒可以分别在SEQID NO：29的395到398以及479到484位核苷酸处找到。
在某些实施方式中，为本发明公开的启动子构建体一部分的玉米rab 17启动子具有SEQ ID NO：29中所显示的序列或其活性变体或片段。在其他实施方式中，为本发明公开的启动子构建体一部分的玉米rab 17启动子具有SEQ IDNO：125或126中所显示的序列或其活性变体或片段。
在方法和组合物的某些实施方式中，启动子构建体包含玉米rab 17启动子的活性变体或片段。玉米rab 17启动子的活性变体或片段(如SEQ ID NO：29，125，126)是保持了起始转录能力的多核苷酸变体或片段。在某些实施方式中，玉米rab 17启动子的活性片段可以包括SEQ ID NO：29、125或126的至少约50、100、150、200、250、300、350、400、450、或500个连续核苷酸，或者可以与SEQ ID NO：29、125、或126有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同性。在特定的实施方式中，玉米rab17启动子的活性变体或片段能够对脱落酸(ABA)反应来起始转录。在这些实施方式的某些中，启动子包含至少一个ABRE元件。在特定的实施方式中，组合物和方法的启动子包含玉米rab 17启动子的从约-219到约-102(对应SEQ IDNO：29的291到408位核苷酸)，其被显示足以赋予ABA反应性(Vilardell等.(1991)Plant Mol Biol 17：985-993，其通过引用整体纳入本发明)。
在其他实施方式中，玉米rab 17启动子的活性变体或片段能够对干燥反应来起始转录。在这些实施方式的某些中，启动子包含至少一个DRE元件。
在特定实施方式中，活性玉米rab 17启动子片段包含玉米rab 17启动子的从约-219到约-80(SEQ ID NO：29的291到430位核苷酸)，其包含所有推定的DRE和ABRE元件。
不受任何理论或作用机制的约束，认为包含玉米rab 17启动子和位点特异性附着B(attB)位点的启动子构建体(其序列在SEQ ID NO：30中显示)相比没有attB位点的启动子，由于attB位点的存在和/或其相对启动子的定位，具有修饰过的活性水平。因此，认为attB位点作为玉米rab 17启动子的调谐子作用。因此，提供了包含玉米rab 17启动子或其片段或变体，和attB位点的启动子构建体，而在这些实施方式的某些中，attB位点修饰了启动子的活性。在其他实施方式中，启动子构建体包含玉米rab 17启动子或其片段或变体以及修饰玉米rab 17启动子活性的调谐子。
本发明中使用的“调谐子”是指当存在于启动子和编码序列之间时能增加或降低启动子活性的多核苷酸。调谐子的非限制性例子包括重组位点、操纵子和绝缘子。
附着位点是病毒和细菌基因组中发现的位点特异性重组位点，其帮助将病毒基因组整合入或切除出其宿主基因组。使用附着位点的病毒和细菌宿主系统的非限制性例子为λ噬菌体和大肠杆菌系统(Weisberg和Landy(1983)Lambda II，eds.Hendrix等.(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)pp.211-250)。启动子构建体的调谐子可以是大肠杆菌附着位点B(attB)。attB位点可以是自然发生的大肠杆菌attB位点，或其活性变体或片段或者合成得到的序列。合成得到的attB位点以及或自然发生的attB位点的活性变体或片段是能够与λ噬菌体P附着位点重组的那些，该过程由λ噬菌体整合酶(Int)和大肠杆菌整合宿主因子(IHF)蛋白催化(Landy(1989)Ann Rev Biochem 58：913-949，其通过引用整体纳入本发明)。AttB位点通常有约25个核苷酸的长度，有涉及实际交换事件的15个碱基对核心序列。此外，自然发生的attB位点的活性变体和片段是当其存在于启动子构建体中时，能够调节启动子活性的那些。可以使用的attB位点的非限制性例子包括attB1(SEQ ID NO：31)，attB2(SEQID NO：32)，attB3(SEQ ID NO：33)，和attB4(SEQ ID NO：34)，及其变体或片段。在某些实施方式中，调谐子是能够调节(即增加、降低)启动子活性、但不能与附着位点P重组的attB位点活性变体或片段。这样的attB位点活性变体的非限制性例子包括具有SEQ ID NO：107，108，或109中所显示序列的变体。
在某些实施方式中，调谐子距启动子的距离影响调谐子调整启动子活性的能力。调谐子可以与启动子和/或目的多核苷酸连续。在其他实施方式中，连接序列将启动子序列与调谐子分开。本发明中使用的“连接序列”是核苷酸序列，当其存在于启动子构建体中时其作用是连接一个功能序列与另一个功能序列，而不会从其他方面有助于目的多核苷酸的表达或翻译。因此，连接序列的实际序列可以改变。连接序列可以包括质粒序列，限制性位点，和/或启动子来源基因的5′-未翻译区域(5′-UTR)的区域。将启动子和调谐子分开的连接序列可以具有约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，400，500，1000个核苷酸或更大的长度。在特定实施方式中，约133个核苷酸的连接序列将启动子和调谐子分开。在某些实施方式中，连接序列包括rab175′-UTR的片段。5′-UTR的片段可以是约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100个核苷酸长度，或更长。在特定实施方式中，启动子构建体包含将启动子和调谐子分开的连接序列，该连接序列包括玉米rab 17 5′-UTR的95个核苷酸。这些实施方式的某些中，该95个核苷酸序列具有SEQ ID NO：35中显示的序列。在特定实施方式中，启动子和调谐子之间的连接序列具有SEQID NO：36中显示的序列或其变体或片段。
在某些实施方式中，启动子构建体包含将调谐子与目的多核苷酸分开的连接序列。该连接的长度和序列也可以变化，可以是约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，400，500，1000个核苷酸长或更长。在特定实施方式中，约61个核苷酸的连接序列将调谐子与目的多核苷酸分开。在特定实施方式中，调谐子和目的多核苷酸之间的连接序列具有SEQID NO：37中显示的序列或其变体或片段。在其他实施方式中，约25个核苷酸的连接序列将调谐子与目的多核苷酸分开。在特定实施方式中，调谐子和目的多核苷酸之间的连接序列具有SEQ ID NO：123中显示的序列。
在特定实施方式中，启动子构建体具有SEQ ID NO：30中显示的序列或其变体或片段。
启动子构建体可以与编码表达框中的多核苷酸或多肽的目的多核苷酸可操作连接。“可操作连接”表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸与启动子之间的可操作连接是功能性的连接，其允许目的多核苷酸的表达。可操作连接的元件可以是连续的或非连续的。表达框可以包括表达所需的其他5’或3’调控元件。
可以包括在表达框中目的多核苷酸5’的调控元件包括5’前导序列。这样的前导序列可以作用以增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的并包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(ElroyStein等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等(1995)Gene 165(2)：233-238)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology154：9-20)，以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等(1989)Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；以及玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus)前导序列(MCMV)(Lommel等(1991)Virology 81：382-385)。还参见于Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968。也可以使用已知增强翻译的其他方法或序列，例如内含子等。
表达框也可包括在植物中有功能的转录和/或翻译终止区。终止区可以对转录起始区域(即启动子)是天然的，可以对可操作连接的目的多核苷酸是天然的，可以对植物宿主是天然的，或可以衍生自另外的来源(即，对启动子，目的多核苷酸，植物宿主，或其任意组合是外源的)。方便的终止区域可以是从马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因或根癌农杆菌的Ti-质粒中得到，如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区域。还参见于Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903以及Joshi等(1987)-15：9627-9639。在某些实施方式中，pinII终止序列具有能够终止植物细胞中的转录和/或翻译的、SEQ ID NO：38中显示的序列或其活性变体或片段。
在特定实施方式中，表达框可以包括重组位点，如目的核苷酸3’端的附着位点。在这些实施方式的某些中，重组位点是第二attB位点。在那些启动子包含第一attB位点的实施方式中的某些中，目的多核苷酸后的第二attB位点与调谐子attB是不相同的。在那些调谐子attB位点是attB1(SEQ ID NO：31)的实施方式中的某些中，目的多核苷酸3’端的第二attB位点可以具有SEQ ID NO：31(attB1)，SEQ ID NO：32(attB2)，SEQ ID NO：(attB3)，或SEQ ID NO：34(attB4)中显示的序列，或其活性变体或片段。
当存在时，目的核苷酸3’端的重组位点可以在终止区域5’或3’端。如果存在，重组位点可以与目的多核苷酸和/或终止序列连续。然而，在某些实施方式中，连接序列将目的多核苷酸和重组位点分开。连接序列的长度可以变化，但在某些实施方式中，其为约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，或90个核苷酸的长度。在特定的实施方式中，将目的多核苷酸和重组位点分开的连接序列约16个核苷酸。在特定的实施方式中，重组位点和目的多核苷酸被具有SEQID NO：39所显示的核苷酸序列或其变体或片段的连接序列分开。在其他实施方式中，将重组位点和目的多核苷酸分开的连接序列为约8个核苷酸。在特定实施方式中，重组位点和目的多核苷酸被具有SEQ ID NO：124所显示的核苷酸序列或其变体或片段的连接序列分开。
在其中表达框上存在终止区域且表达框进一步包括目的核苷酸3’端的重组位点的实施方式的某些中，终止区域在目的多核苷酸3’端，并且连接序列将重组位点和终止区域分开。该连接序列长度可以变化，但在某些实施方式中，其为约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，或90个核苷酸的长。在特定实施方式中，将重组位点和终止区域分开的连接序列约14个核苷酸。在特定的实施方式中，重组位点和终止区域被具有SEQ ID NO：40所显示的核苷酸序列或其变体或片段的连接序列分开。
表达框包括本发明公开的调节目的多核苷酸表达的启动子构建体。目的多核苷酸可以是编码多核苷酸(如反义，siRNA)或编码多肽的任意多核苷酸。在是适当的情况下，目的核苷酸可以被优化以在转化的植物中增加表达。即，可以使用改进表达的植物优选密码子来合成目的多核苷酸。参见，例如讨论宿主优选密码子使用的Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。本领域中可得用于合成植物优选基因的方法。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其通过参考纳入本发明。
另外的序列修饰已知在细胞宿主中增强基因表达。这些包括消除编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子拼接位点信号、转座子样重复的序列，以及其他这样充分表征对基因表达有害的序列。序列的G-C含量可以被调整到给定细胞宿主中平均的水平，该水平参考宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰该序列以避免预测到的发夹二级mRNA结构。
在某些实施方式中，目的多核苷酸包括编码位点特异性重组酶的多核苷酸。位点特异性重组酶，本发明中也被称为重组酶，是催化其相容的重组位点之间保守的位点特异性重组的多肽，并包括天然多肽以及保持活性的衍生物、变体、和/或片段，和编码保持活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体、和/或片段。用于所述方法和组合物中的重组酶可以是天然重组酶或重组酶的生物活性片段或变体。位点特异性重组酶及其识别位点的综述参见Sauer(1994)CurrOp BiotechnoI5：521-527；和Sadowski(1993)FASEB 7：760-767，每一篇通过引用整体纳入本发明。
任何重组酶系统可以被用于所述方法和组合物。位点特异性重组酶的非限制性例子包括FLP，Cre，SSV1，λInt，phi C31 Int，HK022，R，Gin，Tn1721，CinH，ParA，Tn5053，Bxb1，TP907-1，U153以及其他本领域已知的位点特异性重组酶，包括在Thomson和Ow(2006)Genesis 44：465-476中描述的那些，该文献通过引用整体纳入本发明。用于植物的位点特异性重组系统的例子可以在美国专利号5,929,301、6,175,056、6,331,661中，以及国际申请公开号WO99/25821，WO 99/25855，WO 99/25841，和WO 99/25840中找到，每一篇的内容通过引用纳入本发明。
在某些实施方式中，目的多核苷酸编码来自整合酶或解离酶家族的重组酶，包括其活性变体和片段。重组酶的整合酶家族有超过一百个成员并包括，例如FLP，Cre，λ整合酶，和R。对于整合酶家族的其它成员，参见，例如Esposito等(1997)Nucleic Acids Res 25：3605-3614；和Abremski等(1992)ProteinEng 5：87-91，其每一篇通过引用整体纳入本发明。其他重组系统包括，例如，链霉菌噬菌体phi C31(Kuhstoss等(1991)J Mol Biol 20：897-908)；来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的SSV1位点特异性重组系统(Maskhelishvili等(1993)Mol Gen Genet 237：334-342)；和基于逆转录病毒整合酶的整合系统(Tanaka等(1998)Gene 17：67-76)。在某些实施方式中，重组酶不需要辅因子或超螺旋底物。这样的重组酶包括Cre，FLP，或其活性变体或片段。
FLP重组酶是催化位点特异性反应的蛋白，该反应涉及DNA复制期间酿酒酵母的2微米质粒拷贝数的扩增。FLP重组酶催化两个FRT位点间的位点特异性重组。FLP蛋白已经被克隆并表达(Cox(1993)Proc Natl Acad Sci USA80：4223-4227，其通过引用整体纳入本发明)。用于所述方法和组合物中的FLP重组酶可以源自酵母属。在某些实施方式中，使用经修饰包含了更植物优选密码子的重组酶多核苷酸。已知由包含玉米优选密码子的核苷酸序列编码的重组的FLP酶(FLPm)，其能催化位点特异性重组事件(其多核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：41和42中显示，见例如，美国专利5,929,301，其通过引用整体纳入本发明)，另外的FLP功能性变体和片段也已知(Buchholz等(1998)Nat Biotechnol16：657-662；Hartung等(1998)J Biol Chem 273：22884-22891；Saxena等(1997)Biochim Biophys Acta 1340：187-204；Hartley等(1980)Nature 286：860-864；Voziyanov等(2002)Nucleic Acids Res 30：1656-1663；Zhu& Sadowski(1995)J Biol Chem 270：2304423054；和美国专利号7,238,854，其每一篇通过引用整体纳入本发明)。
噬菌体重组酶Cre催化两个lox位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶是已知的(Guo等(1997)Nature 389：40-46；Abremski等(1984)J Biol Chem259：1509-1514；Chen等(1996)Somat Cell Mol Genet 22：477-488；Shaikh等(1977)J Biol Chem 272：5695-5702；和Buchholz等(1998)NatBiotechnoI16：657-662，其每一篇通过引用整体纳入本发明)。Cre多核苷酸序列也可以使用植物优选密码子合成，例如，这样的序列(moCre；其多核苷酸和多肽序列在分别SEQ ID NO：43和44中显示)在，例如国际申请公开号WO99/25840中描述，其通过引用整体纳入本发明。Cre重组酶的变体是已知的(参见，例如美国专利号6,890,726；Rufer & Sauer(2002)Nucleic Acids Res30：2764-2772；Wierzbicki等(1987)J Mol Biol 195：785-794；Petyuk等(2004)J Biol Chem 279：37040-37048；Hartung & Kisters-Woike(1998)J BiolChem 273：22884-22891；Santoro & Schultz(2002)Proc Natl Acad Sci USA99：4185-4190；Koresawa等(2000)J Biochem(Tokyo)127：367-372；和Vergunst等(2000)Science 290：979-982，其每一篇通过引用整体纳入本发明)。
在某些实施方式中，目的多核苷酸编码嵌合重组酶。嵌合重组酶是重组的融合蛋白，其能够催化源自不同重组系统的重组位点间的位点特异性重组。例如，如果重组位点组包括FRT位点和LoxP位点，可以使用嵌合FLP/Cre重组酶或其活性变体或片段，或是分开提供两种重组酶。产生和使用这样的嵌合重组酶或其活性变体或片段的方法在，例如国际申请公开号WO 99/25840；和Shaikh & Sadowski(2000)J Mol Biol 302：27-48中描述，其每一篇通过引用整体纳入本发明。
在其他实施方式中，使用变体重组酶。修饰重组酶和变体的动力学，辅因子相互作用和需求，表达，最佳条件，和/或识别位点特异性的方法和筛选重组酶和变体活性的方法是已知的，参见例如Miller等(1980)Cell 20：721-9；Lange-Gustafson和Nash(1984)J Biol Chem 259：12724-32；Christ等(1998)J Mol Biol 288：825-36；Lorbach等(2000)J Mol Biol 296：1175-81；Vergunst等(2000)Science 290：979-82；Dorgai等(1995)J Mol Biol 252：178-88；Dorgai等(1998)J Mol Biol 277：1059-70；Yagu等(1995)J Mol Biol252：163-7；Sclimente等(2001)Nucleic Acids Res 29：5044-51；Santoro和Schultze(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：4185-90；Buchholz和Stewart(2001)Nat Biotechnol19：1047-52；Voziyanov等(2002)Nucleic Acids Res30：1656-63；Voziyanov等(2003)J Mol Biol 326：65-76；Klippel等(1988)EMBO J 7：3983-9；Arnold等(1999)EMBO J 18：1407-14；和国际申请公开号WO 03/08045，WO 99/25840，and WO 99/25841；其每一篇通过引用整体纳入本发明。
在特定的实施方式中，表达框具有SEQ ID NO：45中显示的序列或其变体或片段。
表达框可以是包含多个表达框或多个基因，如可选择标志基因的载体的一部分。可以使用可选择的标志基因以识别转化的细胞或组织。标志基因包括编码抗生素抗性的基因如那些新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物如草铵膦铵盐、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)抗性的基因。通常参见，Yarranton(1992)CurroOpin.Biotech.3：506-511；Christopherson等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318；Yao等(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等(1980)The Operon，pp.177-220；Hu等(1987)Cell 48：555-566；Brown等(1987)Cell 49：603-612；Figge等(1988)Cell52：713-722；Deuschle等(1989)Proc.Natl.Acad.Ad USA 86：5400-5404；Fuerst等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等(1990)Science248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Bairn等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等(1988)Biochemistry27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等(1988)Nature334：721-724。这些公开通过引用纳入本发明。上面的选择标记基因列表不意味着限制。可以使用任何选择标记基因。
在某些实施方式中，包含本发明公开的启动子构建体的表达框可以进一步包含编码细胞增殖因子的多核苷酸。本发明中使用的“细胞增殖因子”是多肽或多核苷酸，其能刺激细胞或组织的生长，包括但不限于促进细胞周期进程，抑制细胞死亡，如凋亡，刺激细胞分裂，和/或刺激胚生成。该多核苷酸可以分为若干类，包括但不限于细胞周期刺激多核苷酸，发育多核苷酸，抗凋亡多核苷酸，激素多核苷酸，或针对抗细胞周期抑制物或促凋亡因子的沉默结构。下面提供的是每类的非限制性例子，而不是每类有用的多核苷酸的完整列表：1)细胞周期刺激多核苷酸，包括植物病毒复制酶基因，如RepA，细胞周期蛋白，E2F，prolifera，cdc2和cdc25；2)发育多核苷酸如Lec1，Kn1家族，WUSCHEL，Zwille，BBM，Aintegumenta(ANT)，FUS3，和Knotted家族的成员，如Kn1，STM，OSH1，和SbH1；3)抗凋亡多核苷酸，如CED9，Bcl2，Bcl-X(L)，Bcl-W，A1，McL-1，Mac1，Boo，和Bax-抑制物；4)激素多核苷酸如IPT，TZS，以及CKI-1；和5)沉默结构，其针对细胞周期抑制物，如Rb，CK1，prohibitin，和wee1，或凋亡刺激物，如APAF-1，bad，bax，CED-4，和半胱天冬酶-3，以及植物发育过渡抑制物，如包括FIE和Medea在内的Pickle和WD多梳基因。可以通过任何已知的方法，如反义，RNA干扰，共抑制，嵌合修复，或转座子插入来沉默该多核苷酸。
细胞增殖因子可以通过导入编码增殖因子的多核苷酸而被导入细胞。使用术语“多核苷酸”不是为了将组合物限制到包含DNA的多核苷酸。多核苷酸可以包括核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括自然发生的分子和合成的类似物。多核苷酸也包括所有形式的序列，包括但不限于单链，双链，或多链形式，发夹型，茎-环结构，环状质粒等。编码细胞增殖因子的多核苷酸可以对细胞可以是天然的或异源的。天然多肽或多核苷酸包括自然发生的氨基酸序列或核苷酸序列。关于多肽或多核苷酸序列的“异源”是指源自不同种类的多肽或序列，或者如果源自相同种类，通过故意人工干预从其在组合物中和/或基因座中的天然形式进行了大幅修饰的多肽或序列。
“分离的”或“纯化”多核苷酸或蛋白或其生物活性部分，基本上或大体没有如在其自然发生环境中发现的、通常伴随或与所述多核苷酸或蛋白相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白当通过重组技术产生时基本没有其他细胞物质，或培养基，或者当化学合成时基本没有化学前体或其他化学物质。最优的，“分离的”多核苷酸不具有在多核苷酸来源的生物基因组DNA中自然位于该多核苷酸两侧的序列(即位于多核苷酸5’和3’端的序列)(最优的，蛋白编码序列)。例如，在各种实施方式中，分离的多核苷酸可以含有小于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的。在多核苷酸来源的基因组DNA 中自然位于该多核苷酸两侧的核苷酸序列。基本没有细胞物质的蛋白包含具有小于约30％，20％，10％，5％，或1％(按干重计算)污染蛋白的蛋白制品。当蛋白或其生物活性部分重组产生时，最优的，培养基显示有小于约30％，20％，10％，5％，或1％(按干重计算)的化学前体或非目的蛋白化学物质。
可以使用多种细胞增殖因子中的任意。在某些实施方式中，使用那些能够刺激胚生成的细胞增殖因子以增强定向的多核苷酸修饰。这样的细胞增殖因子在本发明中被称为胚生成刺激多肽，其包括但不限于babyboom多肽。
在某些实施方式中，细胞增殖因子是AP2/ERF蛋白家族的成员。AP2/ERF蛋白家族是一类植物特异的推定转录因子，其调节多种发育过程，并且特征在于存在AP2DNA结合域，该结构域预测形成结合DNA的两亲性α-螺旋(PFAM登录号PF00847)。AP2域首先是在APETALA2中被识别，APETALA2是一种调节分生组织决定、花器官特化、种皮发育和花同源异型基因表达的拟南芥蛋白。基于保守区域的存在AP2/ERF蛋白已被细分为不同的亚家族。最初，该家族基于DNA结合域的数目被分为两个亚家族，有一个DNA结合域的ERF亚家族，和有两个DNA结合域的AP2亚家族。随着更多的序列被识别，家族随后被细分为5个亚家族：AP2，DREB，ERF，RAV，和其他(Sakuma等(2002)Biochem Biophys Res Comm 290：998-1009)。
APETALA2(AP2)蛋白家族的成员在多种生物事件中起作用，包括但不限于，发育，植物再生，细胞分裂，胚生成，和细胞增殖(参见例如Riechmann和Meyerowitz(1998)Biol Chem 379：633-646；Saleh和Pages(2003)Genetika35：37-50以及在daft.cbi.pku.edu.cn的拟南芥转录因子数据库)。AP2家族包括，但不限于AP2，ANT，Glossyl5，AtBBM，BnBBM，和玉米ODP2/BBM。
本发明提供了与玉米BBM序列(也被称为玉米ODP2或ZmODP2，玉米BBM的多核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：9和10中；另一种ZmBBM的多核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：121和122中)同源的五十个序列的分析。分析识别了发现于所有BBM同系物中的三条基序(基序4-6；在SEQ ID NO：51-53中显示)，以及AP2域(基序2和3；在SEQ ID NO：49和50中显示)以及桥接AP2域的连接序列(基序1；SEQ ID NO:48)。因此，基序1-6将这些BBM同系物从其他含有AP2域的蛋白中区分出来(例如，WRI，AP2，和RAP2.7)，而这些同系物包含AP2蛋白家族的一个亚类，在本发明中被称为BBM/PLT亚类。在某些实施方式中，用于所述方法和组合物的细胞增殖因子是含AP2域多肽的BBM/PLT类成员。在这些实施方式中，细胞增殖因子包含两个AP2域和基序4-6(SEQ ID NO：51-53)或其片段或变体。在这些实施方式的某些中，AP2域有SEQ ID NO：49和50中显示的序列或其片段或变体，而在特定的实施方式中，进一步包括SEQ ID NO：48的连接序列或其片段或变体。在其他的实施方式中，细胞增殖因子包括基序4-6或其片段或变体中的至少一个，以及两个AP2域，两个AP2域在某些实施方式中具有SEQ IDNO：49和/或50中显示的序列或其片段或变体，而在特定的实施方式中具有SEQID NO：48的连接序列或其片段或变体。基于本发明中提供的系统发育分析，BBM/PLT多肽亚类可以被细分为BBM，AIL6/7，PLT1/2，AIL1，PLT3，和ANT多肽类。
在某些实施方式中，细胞增殖因子是babyboom(BBM)多肽，其为AP2转录因子家族的成员。拟南芥的BBM蛋白(AtBBM)优先在发育的胚和种子中表达，并且已经显示在调节胚特异性途径中起到中心作用。AtBBM的过表达已显示诱导幼苗上体细胞胚和子叶样结构的自发形成。参见Boutiler等(2002)The Plant Cell 14：1737-1749。玉米BBM蛋白也诱导胚生成并促进转化(参见美国专利号7,579,529，其通过引用整体纳入本发明)。因此，BBM多肽刺激增殖，诱导胚生成，增强植物再生能力，增强转化，并如本发明中证明的，增强定向的多核苷酸修饰率。本发明中使用的“再生”是指形态发生反应，其导致从单个细胞或细胞组生成新组织，器官，胚，整个植物或整个植物的部分。再生可以通过愈伤组织阶段间接进行或直接的，没有中间愈伤组织阶段来进行。“再生能力”是指植物细胞进行再生的能力。
在某些实施方式中，babyboom多肽包含两个AP2域以及基序7和10(分别在SEQ ID NO：54和57中显示)或其变体或片段中至少一个，在某些实施方式中，AP2域是基序3和2(分别为SEQ ID NO：50和49)或其片段或变体，在特定实施方式中，babyboom多肽进一步包含AP域1和2之间的具有基序1(SEQ ID NO：48)或其片段或变体的连接序列。在特定的实施方式中，BBM多肽进一步包含基序4-6(SEQ ID NO：51-53)或其片段或变体。BBM多肽可以进一步包括基序8和9(分别为SEQ ID NO：55和56)或其片段或变体，而在某些实施方式中，包括基序10(SEQ ID NO：57)或其变体或片段。在这些实施方式的某些中，BBM多肽也包括基序14(SEQ ID NO：58中显示)，基序15(SEQ ID NO：59中显示)，和基序19(SEQ ID NO：60中显示)或其变体或片段中的至少一个。特定的氨基酸基序的变体可以是与本发明公开的基序具有至少约40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高的序列同一性的氨基酸序列。另外，特定的氨基酸基序的变体可以是与氨基酸基序有1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸区别的氨基酸序列。
可以用于所述方法和组合物中的Babyboom多核苷酸和多肽的非限制性例子包括，拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtBBM(SEQ ID NO：21和22)，油菜(Brassica napus)BnBBM1(SEQ ID NO：23和24)，油菜BnBBM2(SEQID NO：25和26)，截形苜蓿(Medicago truncatula)MtBBM(SEQ ID NO：7和8)，大豆(Glycine max)GmBBM(SEQ ID NO：1和2)，葡萄(Vitis vinifera)VvBBM(SEQ ID NO：5和6)，玉米(Zea mays)ZmBBM(SEQ ID NO：9和10，以及SEQ ID NO：68中显示的基因组序列；或者SEQ ID NO：121和122，以及SEQ ID NO：116中显示的基因组序列)和ZmBBM2(SEQ ID NO：11和12)，水稻(Oryza sativa)OsBBM(SEQ ID NO：13和120中显示的多核苷酸序列；SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列；以及SEQ ID NO：117中显示的基因组序列)，OsBBM1(SEQ ID NO：15和16)，OsBBM2(SEQ ID NO：17和18)，和OsBBM3(SEQ ID NO：19和20)，高粱(Sorghum bicolor)SbBBM(SEQ ID NO：3和4以及SEQ ID NO：69中显示的基因组序列)和SbBBM2(SEQ ID NO：27和28)或活性片段或变体。在特定的实施方式中，细胞增殖因子是玉米BBM多肽(SEQ ID NO：10，122，或12)或其变体或片段，或是由玉米BBM多核苷酸(SEQ ID NO：9，68，121，116，或11)或其变体或片段编码。
因此，在某些实施方式中，编码细胞增殖因子的多核苷酸具有与SEQ IDNO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69中所显示核苷酸序列有至少40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性的核苷酸序列，或者细胞增殖因子具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122或28中所显示氨基酸序列有至少40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在这些实施方式的某些中，细胞增殖因子在babyboom多肽中对应的氨基酸残基位置具有基序7和10(分别在SEQ ID NO：54和57中显示)或其变体或片段中至少一个。在其他实施方式中，细胞增殖因子在babyboom多肽中对应的氨基酸残基位置进一步包括基序14(SEQ ID NO：58中显示)，基序15(SEQ ID NO：59中显示)，和基序19(SEQID NO：60中显示)或其变体或片段中的至少一个。
在其他实施方式中，其他细胞增殖因子，如Lec1，Kn1家族，WUSCHEL(如WUS1，其多核苷酸和氨基酸序列在SEQ ID NO：61和62中显示；WUS2，其多核苷酸和氨基酸序列在SEQ ID NO：63和64中显示；WUS2 alt，其多核苷酸和氨基酸序列在SEQ ID NO：114和115中显示；WUS3，其多核苷酸和氨基酸序列在SEQ ID NO：105和106中显示)，Zwille，和Aintegumeta(ANT)可以单独使用，或者与babyboom多肽或其他细胞增殖因子组合。参见，例如美国申请公开号2003/0135889，国际申请公开号：WO03/001902，以及美国专利号6,512,165，其每一篇通过引用纳入本发明。当使用多个细胞增殖因子时，或当babyboom多肽与任何上述多肽一起使用时，编码每个因子的多核苷酸可以存在于相同的表达框中或在单独的表达框中。当通过单独的表达框编码两个或更多因子时，表达框可以被同时或顺序提供给植物。
在某些实施方式中，可以通过使用程序，如BLAST筛选序列数据库来识别与已知babyboom多核苷酸或多肽具有同源性，和/或分享保守功能域的多核苷酸或多肽。查询数据库可以使用全长序列，或者使用片段，包括，但不限于，保守域或基序。在某些实施方式中，可以进一步使用比对程序表征从检索得到的序列以快速识别并比较保守功能域，高同源性区域，和序列间核苷酸和/或氨基的不同点，包括插入，缺失，或取代，包括在本发明其他地方更详细描述的那些方案。也可以使用计算机程序评价得到的序列以分析并输出序列间的系统发育关系。
在其他实施方式中，与已知babyboom多核苷酸或多肽或本发明已公开的多核苷酸或多肽具有同源性，和/或分享保守功能域的多核苷酸或多肽，可以使用标准核酸杂交技术来识别，如在本发明其他地方更详细描述的那些技术。对核酸杂交的扩展指南包括Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1部分，第2章(Elsevier，NY)；Ausubel等，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，NY)；和，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，NY)。
组合物进一步包括分离的BBM多核苷酸和分离的BBM多肽及其变体和片段，包含其的表达框，以及包含其的植物。组合物可以包括编码GmBBM(SEQID NO：1)，SbBBM(SEQ ID NO：3)，MtBBM(SEQ ID NO：7)，或OsBBM2(SEQ ID NO：17)或其活性变体或片段分离的多核苷酸。分离的多肽包括那些具有SEQ ID NO：2，4，8，或18(分别为GmBBM，SbBBM，MtBBM，或OsBBM2)或其活性变体或片段的多肽。新BBM多肽序列与那些本领域已知序列的同一性百分数显示于表1中。
表1.14种babyboom多肽每一个之间的序列同一性百分数
Figure BPA00001625021800181
通过“片段”，意指多核苷酸的一部分，或者氨基酸序列以及由此编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可以保持天然多核苷酸的生物活性，并且，例如具有启动子活性(即能够起始转录)，或者能够刺激增殖，诱导胚生成，或改变植物的再生能力。在那些多核苷酸编码多肽的实施方式中，多核苷酸的片段可以编码保持天然蛋白生物活性的蛋白片段。另外，用作杂交探针的多核苷酸片段通常不保持生物活性或编码保持有生物活性的蛋白片段。因此，多核苷酸序列片段范围可以从至少约20，50，100，150，200，250，300，400，500个核苷酸变化，或更大。
编码细胞增殖因子生物活性片段的多核苷酸片段，例如，编码至少15，25，30，50，100，150，200，250，300，400，500个连续的氨基酸，或上至全长细胞增殖因子中存在的氨基酸总数。用作杂交探针或PCR引物的细胞增殖因子多核苷酸片段一般不需要编码细胞增殖因子的生物活性部分。
“变体”是指意为基本相似的序列。对多核苷酸，变体包括多核苷酸，其在5’和/或3’端有缺失；在天然多核苷酸中一个或多个内部位点有一个或多个核苷酸的缺失和/或添加；和/或在天然多核苷酸中一个或多个位点有一个或多个核苷酸的取代。本发明中使用的“天然”多核苷酸或多肽分别包括自然发生的核苷酸序列或氨基酸序列。对于编码多肽的多核苷酸，由于遗传密码的简并性，保守变体包括那些编码多肽的氨基酸序列(如细胞增殖因子)的序列。诸如这些的自然发生的变体可以使用公知的分子生物学技术，如，例如，使用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来识别。变体多核苷酸也包括合成得到的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变生成的多核苷酸。通常，按通过序列比对程序和参数确定，特定的变体与该特定的多核苷酸有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列同一性。
也可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽与特定的多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分数来评价编码多肽的特定的多核苷酸的变体。可以使用序列比对程序或参数来计算任意两多肽间的序列同一性百分数。当通过其编码的两多肽共有的序列同一性百分数比较来评价任意给定多核苷酸对时，两个编码的多肽间同一性百分数至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列同一性。
“变体”蛋白是指意为从天然蛋白衍生得到的蛋白，衍生是通过在天然蛋白的N-末端和/或C-末端缺失一个或多个氨基酸；在天然蛋白一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个氨基酸；和/或在天然蛋白一个或多个位点取代一个或多个氨基酸。变体蛋白保持天然蛋白所需的生物活性。例如，变体细胞增殖因子刺激增殖而变体babyboom多肽能刺激增殖，诱导胚生成，改变植物再生能力，增加植物中的转化效率，增加或保持在非生物胁迫下的植物产量，在植物中产生无性衍生的胚，和/或增强定向的多核苷酸修饰率。这样的变体可以从例如基因多态性或者从人为操纵得到。按通过序列比对程序和参数确定，天然细胞增殖因子的生物活性变体与天然蛋白氨基酸序列有40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列同一性。细胞增殖因子蛋白的生物活性变体可以与该蛋白有从少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，如6-10个，少至5个，少至4，3，2，或甚至一个氨基酸残基的不同。
在某些实施方式中，BBM多肽的变体或片段在分别对应SEQ ID NO：4中311，312，和313位的位置上有缬氨酸，酪氨酸，亮氨酸的氨基酸残基，或者BBM多核苷酸的变体或片段编码在分别对应SEQ ID NO：4中311，312，和313位的位置上有缬氨酸，酪氨酸，亮氨酸的氨基酸残基的多肽。在某些实施方式中，BBM多肽的变体或片段在分别对应SEQ ID NO：18中337，338，和339位的位置上有缬氨酸，酪氨酸，亮氨酸的氨基酸残基，或者BBM多核苷酸的变体或片段编码在分别对应SEQ ID NO：18中337，338，和339位的位置上有缬氨酸，酪氨酸，亮氨酸的氨基酸残基的多肽。在其他实施方式中，BBM多肽的变体或片段在分别对应SEQ ID NO：8中1，2，和3位的位置上有蛋氨酸，丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，或者BBM多核苷酸的变体或片段编码在分别对应SEQ ID NO：8中1，2，和3位的位置上有蛋氨酸，丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基的多肽。
Babyboom多核苷酸和多肽可以被引入植物或植物细胞以刺激胚生成，改变植物再生能力，增加植物转化效率，增加或保持在非生物胁迫下的植物产量，和/或增强定向的多核苷酸修饰率。可以在与导入目的多核苷酸同时或者在其之前将Bayboom多核苷酸或多肽给供给植物以便于使用目的多核苷酸转化植物。此外，可以给单倍体植物细胞提供新的babyboom多肽或多核苷酸以产生单倍体植物胚(参见美国专利号7,579,529，其通过引用整体纳入本发明)。
细胞增殖因子多核苷酸可以与在植物中活性的启动子可操作连接。各种启动子可以被用于调节细胞增殖因子的表达。可以基于要求的结果或表达方式选择启动子(植物启动子的综述参见Potenza等(2004)In Vitro Cell Dev Biol 40：1-22)。
组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及WO 99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)；农杆菌胭脂碱合酶(NOS)启动子(Bevan等(1983)Nucl.Acids Res.11：369-385)，等。其他组成型启动子在，例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6，177,611中描述。
在某些实施方式中，可以使用诱导型启动子，如来自病原诱导启动子的。这样的启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的启动子，病程相关蛋白是在病原体感染后诱导出的，如PR蛋白，SAR蛋白，β-1，3-葡聚糖酶，几丁质酶等。参见，例如Redolfi等(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等(1992)Plant Cell 4：645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。还参见WO 99/43819，其通过应用纳入本发明。在病原感染位点原位或其附近表达的启动子包括，例如，Marineau等(1987)Plant Mol.Biol.9：335342；Matton等(1989)Mol Plant-Microbe Interact 2：325-331；Somsisch等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。也见，Chen等(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2507-2511；Warner等(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等(1989)PlantCell 1：961-968；美国专利5,750,386(线虫诱导)；以及其中引用的参考文献。另外的启动子包括玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达被病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见，例如Cordero等(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。伤口诱导启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等(1996)NatBiotechnoI14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(McGurl等(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等(1993)FEBS Lett 323：73-76)；MPI基因(Corderok等(1994)Plant J.6：141-150)等，通过引用纳入本发明。另一诱导型启动子是玉米In2-2启动子(deVeylder等(2007)Plant Cell PhysioI38：568-577，通过引用纳入本发明)。
可以使用化学调控启动子来通过使用外源化学调节剂在植物中调节基因表达。启动子可以是化学诱导启动子，其中化学物质的使用诱导基因表达，或化学抑制启动子，其中化学物质的抑制诱导基因表达。化学诱导启动子是本领域已知的并包括，但不限于被苯磺酰胺除草安全剂激活的玉米In2-2启动子(DeVeylder等(1997)Plant Cell Physiol.38：568-77)，被作为芽前除草剂使用的疏水性电化合物激活的玉米GST启动子(GST-II-27，WO 93/01294)，被BTH或苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(benxo(1，2，3)thiaidazole-7-carbothioic acids-methyl ester)激活的PR-1启动子(Cao等(2006)Plant Cell Reports6：554-60)，被水杨酸激活的烟草PR-la启动子(Ono等(2004)Biosci.Biotechnol.Biochem.68：803-7)，铜诱导ACE1启动子(Mett等(1993)PNAS90：4567-4571)，乙醇诱导AlcA启动子(Caddick等(1988)Nature Biotechnol16：177-80)，雌二醇诱导启动子(Bruce等(2000)Plant Cell 12：65-79)，XVE雌二醇诱导启动子(Zao等(2000)Plant J24：265-273)，VGE甲氧虫酰肼诱导型启动子(Padidam等(2003)Transgenic Res 12：101-109)，和TGV地塞米松诱导启动子(Bohner等(1999)Plant J 19：87-95)，其他目的化学调控启动子包括类固醇反应的启动子(参见，例如chena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导启动子)和四环素诱导及四环素抑制的启动子(参见例如Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237；Gatz等(1992)Plant J2：397-404；和美国专利号5,814,618和5,789,156)，其通过引用纳入本发明。
可以使用组织优选启动子以在特定植物组织中靶向增强目的序列的表达。组织优选启动子包括Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)：495-505。
叶优选启动子是本领域中已知的，参见，例如Yamamoto等(1997)PlantJ.12：255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778；Gotor等(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23：1129-1138；以及Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9586-9590。此外也可以使用cab和rubisco启动子。参见，例如Simpson等(1958)EMBO J4：2723-2729和Timko等(1988)Nature318：57-58。
根优选启动子是已知的并可以从许多可用的中选择。参见，例如，Hire等(1992)Plant Mol.Biol.20：207-218(大豆根特异谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3：1051-1061(法国菜豆GRP1.8基因中根特异控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14：433443(根癌农杆菌甘露碱合成酶基因(MAS)的根特异启动子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3：11-22(编码内谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆根和根瘤中表达)。也可参见Bogusz等(1990)Plant Cell 2：633-641，其中描述了从固氮非豆科糙叶山黄麻和非固氮非豆科山油麻的血红蛋白基因中分离了两个根特异性启动子。Leach和Aoyagi(1991)描述了毛根农杆菌高表达rolC和rolD基因根诱导基因的启动子分析(见Plant Sci(Limerick)79：69-76)。Teeri等(1989)使用与LacZ的基因融合显示了编码章鱼碱合成酶的农杆菌T-DNA的基因在根尖表皮特别活跃，而TR2’基因在整个植物中是根特异性的并由叶组织中的伤口刺激(参见EMBO J.8：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1’基因显示相同的特征。其它的根优选启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等(1995)Plant Mol.Biol.29：759-772)；和rolB启动子(Capana等(1994)Plant Mol.Biol.25：681-691)。也可参见，美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。另一根优选启动子包括菜豆蛋白基因启动子(Murai等(1983)Science 23：476-482和Sengopta-Gopalen等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3320-3324)。
种子优选启动子包括种子发育期间活动的那些启动子以及种子萌发期间活动的那些启动子。参见Thompson等(1989)BioEssays 10：108，其通过引用纳入本发明。这样的种子优选启动子包括，但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的消息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合成酶)；(参见WO 00/11177和美国专利号6,225,529，其通过引用纳入本发明)。对双子叶植物，种子优选启动子包括，但不限于，菜豆-β-菜豆蛋白，芸苔素，β-伴大豆球蛋白，大豆凝集素，cruciferin，等。对单子叶植物，种子优选启动子包括，但不限于，玉米15kDa玉米蛋白，22k Da玉米蛋白，27k Da gamma玉米蛋白，waxy，shrunken 1，shrunken 2，球蛋白1，油脂蛋白，nuc1等。也可参见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子；其通过引用纳入本发明。
当需要低水平表达时，使用弱启动子。通常，通过“弱启动子”，意指驱动编码序列低水平表达的启动子。通过低水平，意指在约1/1000转录本到约1/100,000转录本到约1/500,000转录本的水平。另外，应认识到弱启动子也包括仅在少数细胞中而不在其他细胞中表达以得到总低水平表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平表达时，可以缺失或修饰部分启动子序列以降低表达水平。这样弱组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利号6,072,050)，核心35ScaMV启动子，等。
其他目的启动子包括Rab16启动子(Mundy等(1990)PNAS 87：1406-1410)，芸苔属LEA3-1启动子(美国申请公开号US 2008/0244793)，大麦的HVAls，Dhn8s，和Dhn4s，以及稻的wsil8j，rab16Bj(Xiao and Xue(2001)Plant Cell Rep 20：667-73)，以及棉花的D113(Luo等(2008)Plant Cell Rep27：707-717)。
在某些实施方式中，编码细胞增殖因子(如bayboom多肽)的多核苷酸与玉米泛素启动子或玉米油脂蛋白启动子可操作连接(如SEQ ID NO：65或其变体或片段)。
在那些载体包含与编码位点特异性重组酶的多核苷酸可操作连接的本发明公开的启动子构建体的实施方式的某些中，以及载体包含与编码babyboom多肽的多核苷酸可操作连接的本发明公开的启动子构建体的实施方式的某些中，所述载体进一步包含编码Wuschel多肽的多核苷酸(参见国际申请公开号WO01/23575和美国专利号7,256,322，其每一篇通过引用整体纳入本发明)。在某些实施方式中，编码Wuschel多肽的多核苷酸具有SEQ ID NO：61，63，114，或105(分别为WUS1，WUS2，WUS2 alt，或WUS3)中所显示的序列或其活性变体或片段。在特定的实施方式中，Wuschel多肽具有SEQ ID NO：62，64，l 15，或106(分别为WUSl，WUS2，WUS2 alt，或WUS3)中显示的序列或其活性变体或片段。在这些实施方式的某些中，编码Wuschel多肽的多核苷酸与在植物中活性的启动子可操作连接，包括但不限于玉米In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子。在这些实施方式的某些中，位点特异性重组酶，babyboom多肽，和Wuschel多肽的表达框两侧均有直接重复的位点特异性重组位点，重组位点被由本发明公开的启动子构建体调节表达的位点特异性重组酶识别，使得位点特异性重组酶的表达导致三个表达框的切除。
在某些实施方式中，载体包含与位点特异性重组酶(如Cre，FLP)可操作连接的本发明公开的启动子(带attB1位点的玉米Rab17启动子)；与细胞增殖因子(如babyboom多肽)可操作连接的第二启动子；与目的多核苷酸，如本发明其他地方公开的那些多核苷酸(如性状基因)可操作连接的第三启动子，或者与一个或多个启动子可操作连接的多个目的多核苷酸；以及在某些实施方式中，与WUS基因可操作连接的第四启动子。在这些实施方式的某些中，位点特异性重组酶，细胞增殖因子，和，Wuschel多肽的表达框两侧均有直接重复的位点特异性重组位点，重组位点被由位点特异性重组酶识别，使得位点特异性重组酶的表达导致三个表达框的切除，留下后面的目的多核苷酸(如性状基因)。在其他实施方式中，目的多核苷酸(如性状基因)与载体一起或随载体后被引入，载体包含与位点特异性重组酶可操作连接的本发明公开的启动子，并且至少一个细胞增殖因子(如babyboom多肽，Wuschel多肽)可操作连接一个或多个启动子，其中目的多核苷酸存在于独立于位点特异性重组酶和细胞增殖因子表达框的载体上。在这些实施方式的某些中，位点特异性重组酶和细胞增殖因子表达框两侧有被位点特异性重组酶识别的重组位点。细胞增殖因子的表达有助于目的多核苷酸(如性状基因)的转化，而位点特异性重组酶的表达导致位点特异性重组酶和细胞增殖因子表达框的切除。
本发明公开的启动子构建体，表达框，和载体可以被引入宿主细胞。通过“宿主细胞”，意指包含异源核酸序列的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母，昆虫，两栖类，或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞。在特定实施方式中，单子叶植物宿主细胞是玉米宿主细胞。
例如，可以使用中间宿主细胞来增加克隆载体的拷贝数和/或来介导不同宿主细胞的转化。随着拷贝数增加，包含目的核酸的载体可以以导入所需植物细胞的显著量被分离。在一个实施方式中，使用不引起细菌中多肽表达的植物启动子。
原核生物中最频繁出现的是各种菌株的大肠杆菌；然而，也可以使用其他微生物菌株。通常使用的本发明中定义包括转录起始启动子，可选的，与核糖体结合序列一起的操纵子的原核对照序列，包括这些通常使用的启动子如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang等(1977)Nature 198：1056)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)，和λ衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等(1981)Nature292：128)。掺入在大肠杆菌中转染的DNA载体中的选择标记也是有用的。这样的标记的例子包括专门抗氨苄青霉素、四环素或氯霉素的基因。
选择载体以允许导入适合的宿主细胞。细菌载体通常是质粒或噬菌体来源的。适合的细菌细胞被感染上噬菌体载体颗粒或者以裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，细菌细胞以质粒载体DNA转染。表达蛋白的表达系统可以使用芽孢杆菌和沙门氏菌(Palva等(1983)Gene 22：229-235)；Mosbach等(1983)Nature 302：543-545)得到。
在植物中表达目的多核苷酸的方法包括导入表达框或载体。此外，所述方法可以包括导入启动子构建体，其中启动子构建体被稳定整合入植物基因组中并与目的多核苷酸可操作连接。
“导入”意为是指以序列得以进入生物的细胞内部或进入细胞本身的方式将多核苷酸或多肽呈递给生物，如植物，或细胞。所述方法和组合物不依赖于将序列导入生物或细胞的特定方法，只要多核苷酸或多肽得以进入生物至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽导入植物的方法是本领域已知的，包括，但不限于，稳定转化方法，瞬时转化方法，病毒介导方法，和有性育种。
“稳定转化”意为是指导入植物的核苷酸构建体整合入植物基因组并能被其后代继承，“瞬时转化”意为是指多核苷酸被导入植物而不整合入该植物基因组，或者将多肽导入植物。
将多肽或多核苷酸序列导入植物的方法可以依据要转化的植物或植物细胞的类型而变化，即单子叶或双子叶。将多肽或多核苷酸序列导入植物细胞的适合方法包括显微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)，农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)，直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3：2717-2722)，和弹道粒子加速(参见，例如美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和5,932,782；Tomes等(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926)，和Lec1转化(WO 00/28058)。也可参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等(1987)Particulate Scienceand Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology8：736-740(稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783；和5,324,646；Klein等(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；HooykaasVanSlogteren等(1984)Nature 311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等(1990)Plant CellRep 9：415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(须晶介导的转化)；D′Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Rep 12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407413(玉米)；Osjoda等(1996)Nat BiotechnoI14：745-750(通过根癌农杆菌的玉米)，其所有通过引用纳入本发明。
在特定的实施方式中，可以使用各种瞬时转化方法将序列提供给植物。这样的瞬时转化方法包括，但不限于将目的多肽直接导入植物或者将编码目的多肽的多核苷酸导入植物。这样的方法包括，例如，显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180 andHush等(1994)J Cell Sci 107：775-784，其所有通过引用纳入本发明。此外，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转入植物。这样的技术包括病毒载体系统和以排除随后DNA释放的方式沉淀多核苷酸。因此，从颗粒结合的DNA的转录可以发生，但其释放成为整合入基因组的频率大幅降低。这样的方法包括使用聚乙亚胺(PEl；Sigma #P3143)包被的颗粒。
在其他的实施方式中，可以通过让植物与病毒或病毒核酸接触来将多核苷酸导入植物。通常，这样的方法包括将病毒DNA或RNA分子中的核苷酸构建体掺入。应认识到细胞增殖因子最初可以被合成为病毒多蛋白的一部分，其随后可以在体内或体外被蛋白水解处理来产生想要的重组蛋白。此外，应认识到启动子也包括用于由病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。将多核苷酸导入植物并表达其编码的蛋白，包括病毒DNA或RNA分子的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,889,191，5,889,190，5,866,785，5,589,367，5,316,931，和Porta等(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；通过引用纳入本发明。
可以使用将多核苷酸导入植物的其他方法，包括质体转化方法，和将多核苷酸导入来自幼苗或成熟种子的组织的方法。
本领域已知在植物基因组中特定位置定向插入多核苷酸的方法。在一个实施方式中，将多核苷酸插入到基因组所需位置是使用位点特异性重组系统实现的。参见，例如WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855，和WO99/25853，其所有通过引用纳入本发明。简而言之，多核苷酸可以被包含在两侧有两个非引起重组的重组位点的转移框中。转移框被导入植物，植物已经稳定的将靶位点掺入其基因组，靶位点两侧有对应转移框位点的两个非引起重组的重组位点。提供了适合的重组酶而转移框被整合在靶位点。由此目的多核苷酸被整合在植物基因组中特定的染色体位置。
在特定的实施方式中，提供了从植物中的靶位点切除目的多核苷酸的方法，其中目的多核苷酸两侧有第一和第二重组位点，其相对彼此发生重组并直接重复。所述方法包括将表达框导入植物，表达框含有与位点特异性重组酶可操作连接的本发明公开的启动子构建体(如SEQ ID NO：30或其变体或片段)，表达重组酶，使得重组酶在目的多核苷酸两侧的重组位点识别并实施重组，由此切除目的多核苷酸。表达框可以包括任何连接序列，attB位点，终止区域等，如本发明中公开的那些。
本发明中交换使用的术语“靶位点”，和“靶序列”是指存在于生物，如植物细胞内的多核苷酸序列，其包含至少一个位点特异性重组位点。靶位点可以是生物天然基因组的一部分或者整合入其中或者存在于附加体多核苷酸上。基因组靶序列可以在任何染色体的任何区域上，并且可能在或可能不在编码蛋白或RNA的区域中。靶位点可以对细胞可以是天然的或异源的。在某些实施方式中，异源靶序列可以已经被转基因插入生物基因组，并可能在任何染色体的任何区域，包括人工或卫星染色体，并且可能在或可能不在编码蛋白或RNA的区域中。应认识到细胞或生物可以包含多个靶位点，其可以位于染色体中或跨染色体的一个或多个基因座上。
从植物中靶位点上切除目的多核苷酸的其他方法包括提供包含靶位点的植物，靶位点以可操作连接包含：第一位点特异性重组位点，第一启动子，目的多核苷酸，第二启动子，编码位点特异性重组酶的多核苷酸，和第二位点特异性重组位点。第一和第二位点特异性重组位点相对彼此发生重组并直接重复。目的多核苷酸及其可操作连接启动子可以在编码位点特异性重组酶的多核苷酸及其可操作连接的启动子之前或之后。第二启动子是本发明公开的启动子构建体(如SEQ ID NO：30或其变体或片段)之一。所述方法包括表达位点特异性重组酶，以此位点特异性重组酶在第一和第二位点特异性重组位点识别并实施重组，由此切除目的多核苷酸和编码位点特异性重组酶的多核苷酸。
在某些实施方式中，靶位点进一步包含与编码Wuschel多肽的多核苷酸可操作连接的第三启动子。三个表达框可以是任意顺序，但在某些实施方式中，靶位点以可操作连接包含：第一位点特异性重组位点，第三启动子，编码Wuschel多肽的多核苷酸，第一启动子，目的多核苷酸，第二启动子，编码位点特异性重组酶的多核苷酸，和第二位点特异性重组位点，其中重组酶的表达导致所有三个表达框的切除。表达框可以包含下列任何：连接序列，attB位点，终止区域等，如本发明描述的那些。
提供了方法以增加质体转化效率，其包括将编码细胞增殖因子的异源多核苷酸导入植物细胞并在使用目的多核苷酸转化植物细胞质体之前，期间，或之后马上表达异源多核苷酸。编码细胞增殖因子的异源多核苷酸可以与目的多核苷酸共同转移或者可以先将细胞增殖多核苷酸导入植物，随后导入目的多核苷酸。
本发明中使用的“质体”是指植物细胞中存在的细胞器，其储存并制造细胞使用的化学化合物，如淀粉，脂肪酸，萜烯类，并且其是从前质体衍生得到。因此，植物质体通常具有相同的遗传内容物。质体包括负责光合作用的叶绿体，淀粉体，色质体，平衡石，白色体，造油体，和造蛋白体。
质体基因组为环形并且在植物种类间从约120到约217千碱基对(kb)大小变化。基因组通常包括大的反向重复，可以包含上至约76千碱基对，但是更通常在约20到约30千碱基对的范围中。存在于不同生物质体基因组中的反向重复已经被描述(Palmer(1990)Trends Genet 6：115-120)。
质体转化可以导致同质状态，其中基本上植物细胞中的所有质体将导入的DNA整合入质体基因组。这通过选择过程发生，由此那些包含足够数量转化质体(其具有被导入的选择标记基因)的细胞通过转化的质体基因组的复制并在选择培养基中存活。质体可以在植物细胞中以非常高的拷贝数存在，对于叶绿体基因组每细胞存在上至50,000拷贝(Bendich(1987)BioEssays 6：279-282)。因此通过质体转化，植物细胞可以被工程化以在非常高的拷贝数保持导入的目的基因。
尽管在烟草中通过叶轰击质体转化是常规的并且相对有效，在重要作物种类中使用质体转化技术并非常规，例如，玉米和小麦中的质体转化还没有被报导。质体转化在大豆中是可能的，但使用带有性状基因载体的转化频率低。质体转化在稻中是可能的，但同质事件还没有被恢复。
可以导入并表达编码细胞增殖因子的多核苷酸来增加质体转化效率。可以使用任何本领域已知的或本发明其他地方描述细胞增殖因子包括babyboom多肽来增强质体转化。在某些实施方式中，使用胚生成刺激多肽来增强质体转化。
本领域已知将基因导入质体基因组的方法。参见，例如Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606；以及美国专利号5,451,513和5,545,818；其每一篇通过引用整体纳入本发明。
一种方法涉及通过同源重组将目的多核苷酸整合入质体基因组。这样的方法涉及将两侧有与质体基因组区同源的区域的目的多核苷酸导入植物细胞。将目的多核苷酸转移入植物细胞可以通过任何本领域已知的转化方法，包括本发明其他地方描述的那些。这些包括，但不限于，粒子枪转移(Svab，Z.等(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc Natl Acad SciUSA 90：913-917；以及Staub和Maliga(1993)EMBO J 12：601-606；以及美国专利号5,451,513和5,545,818，其每一篇通过引用整体纳入本发明)和农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)，在某些种类中，原生质体也可以用于叶绿体转化(O′Neill等(1993)Plant J3：729-38；和Spoerlein等(1991)Theor Appl Gen 82：717-722；其每一篇通过引用整体纳入本发明)。一旦两侧有同源区域的目的多核苷酸进入细胞，目的多核苷酸会被整合入质体基因组。
目的多核苷酸两侧的同源区域、和在某些实施方式中其可操作连接的启动子、和在特定实施方式中以及选择标记基因的长度可以变化。在某些实施方式中，与质体基因组同源区域为约50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000碱基对或更长。在大多数情况下，重组频率和由此获得具有转化质体的植物的频率，随着同源区域大小的降低而降低。在某些同源区域存在于质体基因组反向重复区域中的实施方式中，每个转化的质体预期有两个目的多核苷酸拷贝。
在某些实施方式中，目的多核苷酸与在质体中活性的选择标记基因共同转移。选择标记基因和目的多核苷酸可以存在于单个的DNA构建体或分开的构建体上。已经发展出许多用于植物细胞的标记，如氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。赋予卡那霉素(NPTII或AphA6)抗性的基因已经被用作质体转化的选择标记(Carrer等(1993)Mol Gen Genetics 241：49-56；和Huang等(2002)Mol Gen Genomics 268：19-27；其每一篇通过引用整体纳入本发明)。其他编码叶绿体代谢中产物的基因也可以用作选择标记。
用于质体转化的选择标记基因的另一个例子是赋予对物质抗性的选择标记基因，该物质抑制质体的蛋白合成，使得通过将细胞与抑制质体的蛋白合成的物质相接触来选择出已经获得表型的细胞。编码非致命性选择表型的质体DNA可以包括，突变以赋予对链霉素，或对壮观霉素，或者同时对两种抗生素作用抗性的16S核糖体DNA。通过磷酸化、腺苷酰化或乙酰化来修饰非致命性抗生素如链霉素或壮观霉素的异源基因的表达也适合质体转化事件的选择。赋予对链霉素和壮观霉素抗性的基因的另外非限制性例子为编码链霉素/壮观霉素腺苷酰转移酶的细菌aadA基因(Svab等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：913-917)。aadA基因产物使得在链霉素或壮观霉素存在下，其叶绿体包含选择标记基因产物的细胞持续生长和绿色化。不含选择标记基因产物的细胞被漂白。因此aadA基因标记的选择基于在植物生长基质中识别没有被链霉素或壮观霉素的存在漂白的植物细胞。
选择标记基因的其他例子为赋予对包括光系统II除草剂在内的除草剂，如三嗪除草剂，特别是三嗪除草剂莠去津抗性的那些基因。该表型不仅提供非致命性选择，也提供除草剂抗性。提供对植物除草剂如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮抗性的基因可以用作选择标记基因。这样的基因已经被报导(Stalker等(1985)J Biol Chem 260：4724-4728(抗草甘膦EPSP)；Stalker等(1985)JBiol Chem 263：6310-6314(抗溴苯腈腈水解酶基因)；和Sathasivan等(1990)Nucl Acids Res 18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)；其每一篇通过引用整体纳入本发明)。
选择标记基因和/或目的多核苷酸可以被置于叶绿体5’启动子和3’转录终止区域如烟草16SrRNA启动子rrn区域和rps163’终止区域的调节控制之下。许多另外的启动子区域可以被使用以驱动选择标记基因和/或目的多核苷酸的表达，包括已显示在植物质体中起作用的各种质体启动子和细菌启动子。此外，如果不需要选择标记基因和或目的多核苷酸的核表达，质体内含子可以被掺入选择标记基因和/或目的多核苷酸。某些类别的质体内含子在细胞核中不能被正确拼接，由此防止了选择标记基因和/或目的多核苷酸在细胞核中表达。目的多核苷酸和/或编码细胞增殖因子的异源多核苷酸可以为在叶绿体中表达而优化以解决植物细胞核和该细胞器之间密码子使用的差异。以这种方式，可以使用叶绿体优选的密码子合成多核苷酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，通过引用纳入本发明。
另外的质体转化方法通过沉默的质体携带转基因的反式激活来发生，反式激活由核编码并导向质体的RNA聚合酶的组织优选表达引起。这样的系统已经在McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中报道，其通过引用整体纳入本发明。在这些方法中，编码细胞增殖因子的异源多核苷酸被导入细胞并在导向质体的RNA聚合酶表达之前，期间或之后马上表达。
为了选择具有转化的质体的那些细胞，将叶绿体转化载体导入之后，经处理的组织被置于含有适合选择剂的组织培养基上。在选择培养基上培育适合的时间后，转化的细胞可被识别并生长至允许整个植物再生的阶段。再生过程与用于标准核转化事件的那些基本相同。要特别注意以确保选择和再生条件促进多数野生型叶绿体基因组的消除。可以通过标准分子技术，包括Southern和PCR分析来监测野生型与转化的叶绿体基因组的比率状态。
对烟草和许多其他种类，叶是质体转化的优选靶。在某些实施方式中，可以使用一种或多种细胞增殖因子(如babyboom多肽)来触发玉米和其他种类叶的组织培养反应。为了提高叶绿体转化，在诱导型启动子控制下的编码细胞增殖因子的多核苷酸可以通过标准核转化方法被导入目的种类。包含转基因的事件的特征可以在于诱导型胚生成刺激多肽的表达。随后，诱导编码细胞增殖因子的多核苷酸的表达，由此刺激胚生成性组织培养反应。例如，叶可以被置于含有适合浓度多西环素的培养基上以诱导表达，叶来自使用编码细胞增殖因子多核苷酸转化的、并在四环素阻遏系统的控制之下的植物。叶可以被保持在诱导培养基上以允许细胞分裂和胚生成性愈伤组织起始的发生。叶的质体可以使用目的多核苷酸转化，并且在某些实施方式中，选择标记基因是刚在编码细胞增殖因子的多核苷酸诱导之前，诱导期间，或诱导后立即。此外，可以使用本发明其他地方公开的方法来转化叶组织。质体转化之后，可以通过在选择培养基上培育叶组织来选择质体转化事件。选择之后，所述叶或植物细胞在刺激愈伤组织形成的培养基上生长。
提供了制备并转化干成熟种子、成熟胚和成熟胚外植体的方法，成熟胚外植体是从成熟胚上切下的组织，成熟胚是具有授粉后至少约18日龄的胚。制备成熟胚的方法包括从成熟种子上切下成熟胚，而制备成熟胚外植体的方法进一步包括制备成熟胚的切片(如纵向切片)。成熟胚外植体包括至少一种下列组织：叶原基，胚轴，芽顶端分生组织，和根原基。在某些实施方式中，成熟胚外植体包括叶原基，胚轴，和根原基。在这些实施方式中的某些中，成熟胚外植体进一步包括芽顶端分生组织。可以使用本领域已知的任何方法或适合的装置制备切片，包括以手术刀手工制备的切片。在某些实施方式中，每个成熟胚被使用手术刀切成约3到4个薄切片。使用解剖显微镜可以辅助成熟胚的切片。
成熟胚或成熟胚外植体来源的成熟种子可以是任何植物的种子。在某些实施方式中，成熟的种子来自单子叶植物。在特定实施方式中，成熟的种子来自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，燕麦，或粟。在特定实施方式中，成熟的种子是来自顽拗类植物，如优良玉米自交系。本发明中使用的“顽拗类组织”或“顽拗类植物(recalcitrant plant)”是指使用传统转化方法时，如本发明其他地方公开的那些，具有低转化率的组织或植物。在某些实施方式中，顽拗类组织或植物在没有细胞增殖因子的情况下不能被转化。在其他实施方式中，顽拗类组织或植物具有小于约20％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约1％，小于约0.1的％，小于约0.01％，小于约0.001％，或更小的转化成功率。
可以从干燥成熟的种子来制备成熟的胚或成熟的胚外植体。干燥的成熟种子可以包含相比没有被干燥的成熟种子约90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，1％，0.1％或更少的水。可以让干燥的成熟种子吸收水溶液足够长的时间来让干燥的成熟种子软化以使得可以从种子上切下成熟的胚，并且在某些实施方式中，可以从成熟的胚制备成熟的胚外植体片。在某些实施方式中，干燥的种子在水溶液中吸水约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48小时或更长。在特定实施方式中，水溶液是水。在某些实施方式中，干燥的成熟种子吸水足够长的时间以诱导种子萌发。萌发的种子是其中出现根的种子。
可以通过提供细胞增殖因子(如babyboom多肽)使用目的多核苷酸来转化成熟的胚和成熟的胚外植体。向成熟的胚外植体中导入编码细胞增殖因子的异源多核苷酸是在导入目的多核苷酸之前或同时。可以在同一表达框或单独的表达框中提供编码细胞增殖因子的异源多核苷酸和目的多核苷酸。
可以使用任何本领域已知的方法将多核苷酸导入成熟的胚外植体，包括但不限于，农杆菌介导的转化。
在某些实施方式中，可以识别转化的成熟胚外植体。可以使用任何方法来识别包含目的多核苷酸的植物细胞或组织。在某些实施例中，可以使用下列技术中一种或多种来识别包含目的多核苷酸的植物细胞或组织，包括但不限于，PCR方法，杂交的方法，如Southern或Northern印迹，限制性酶切分析，或DNA测序。在某些实施方式中，可以通过在允许愈伤组织生长的条件下培育成熟的叶胚外植体来识别转化的成熟胚外植体。在某些实施方式中，那些显著增殖，能够生长为愈伤组织的成熟胚外植体表明那些胚外植体已经被转化。在其他实施方式中，可以通过将选择标记基因导入成熟的胚外植体并表达来识别和选择转化的成熟胚外植体。
本发明还提供了转化可以是叶基部的叶组织的方法。叶基部是第一叶基节上的叶组织。叶组织可以来自任何植物。在某些实施方式中，叶组织来自单子叶植物。在特定的实施方式中，叶组织来自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，燕麦，或粟。在某些实施方式中，叶组织来自顽拗类植物，如优良玉米自交系。
叶基部可以来自成熟的叶或幼苗的叶。本发明中使用的“幼苗”是指萌发的种子或萌发的胚，或从体外系统(如，从愈伤组织)中生成的植株。可以通过萌发种子或从成熟种子上切下成熟胚来萌发以制备幼苗。在某些实施方式中，成熟胚从已经如本发明所述吸收水溶液的干燥的成熟种子上切下。
在某些实施方式中，从叶组织上除去胚鞘并纵向切下叶片段，而随后做水平切片以将叶片段交叉切成叶组织块。在特定实施方式中，叶组织块约1到2mm长。
可以通过提供细胞增殖因子(如babyboom多肽)来使用目的多核苷酸转化叶组织。可以使用任何本领域已知的技术将多核苷酸导入叶组织，包括但不限于，农杆菌介导的转化。编码细胞增殖因子的目的异源多核苷酸的导入是在导入目的多核苷酸之前或同时。表达编码细胞增殖因子的异源多核苷酸。可以在同一表达框或单独的表达框中提供编码细胞增殖因子的异源多核苷酸和目的多核苷酸。
在某些实施方式中，可以识别转化的叶组织。可以使用任何方法识别包含目的多核苷酸的植物细胞或组织。在某些实施例中，可以使用下列技术中一种或多种来识别包含目的多核苷酸的植物细胞或组织，包括但不限于，PCR方法，杂交的方法，如Southern或Northern印迹，限制性酶切分析，或DNA测序。在某些实施方式中，可以通过在允许愈伤组织生长的条件下培育叶组织来识别转化的叶组织。在某些实施方式中，那些显著增殖，能够生长为愈伤组织的叶组织表明那些叶组织已经被转化。在其他实施方式中，可以通过将选择标记基因导入叶组织并表达来识别和选择转化的叶组织。
被转化的细胞可以按照常规方法被培育成植物。参见，例如McCormick等(1986)Plant Cell Rep 5：81-84。这些植物可以被培育，并或者以相同的转化株或者不同的株授粉，由此得到具有识别出的所需表型特征的组成型表达的杂交株。可以培育两代或更多代以确保所需表型特征表达被稳定的保持并遗传，随后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以这种方式，提供了转化的种子(也被称为“转基因种子”)，其具有被稳定整合入种子基因组的核酸构建体，例如表达框。因此，本发明的组合物包括包含本发明公开的多核苷酸、多肽、启动子构建体、表达框或载体的植物细胞、植物组织、植物部分和植物。同样的，本发明的方法可以在植物细胞，植物组织，植物部分和植物中进行。
在某些实施方式中，在从具有目的多核苷酸的细胞或组织再生植物之前，细胞增殖因子(如babyboom多肽，Wuschel)的活性或水平被降低。在这些实施方式的某些中，编码细胞增殖因子的多核苷酸在植物再生之前被切除。在某些实施方式中，可操作连接到编码细胞增殖因子的异源多核苷酸上的启动子或其他调节元件与细胞增殖因子编码序列一起被切除。在某些实施方式中，编码细胞增殖因子的多核苷酸两侧有重组位点，并将适合的重组酶导入成熟的胚外植体或由此培育的愈伤组织以在成熟胚外植体或愈伤组织再生成植物之前切除编码细胞增殖因子的多核苷酸。在那些将babyboom多肽和Wuschel多肽都提供给植物细胞的实施方式的某些中，编码babyboom多肽的多核苷酸和编码Wuschel多肽的多核苷酸都被切除。这两种多核苷酸可以存在于同一或不同表达框中，并由此可以在一个或两个不同的切除反应中切除。在这些实施方式的某些中，编码用于切除babyboom和Wuschel多核苷酸的位点特异性重组酶的多核苷酸可以与babyboom和Wuschel多核苷酸位于同一表达框中，且可以通过位点特异性重组酶活性切除所有三种多核苷酸。
为了控制细胞增殖因子的切除，可以以晚期胚启动子或诱导型启动子控制负责切除的位点特异性重组酶的表达。在某些实施方式中，晚期胚启动子是GZ(Uead等(1994)Mol Cell Biol 14：4350-4359)，γ-kafarin启动子(Mishra等(2008)Mol Biol Rep 35：81-88)，G1b1启动子(Liu等(1998)Plant Cell Reports17：650-655)，ZM-LEG 1(美国专利号7,211,712)，EEP1(美国专利申请号US2007/0169226)，B22E(Klemsdal等(1991)Mol Gen Genet 228：9-16)，或EAP1(美国专利号7,321,031)。在某些实施方式中，调节位点特异性重组酶表达诱导型启动子是热休克、光诱导启动子、干燥诱导启动子，包括但不限于Hval(Straub等(1994)Plant Mol Biol 26：617-630)，Dhn，以及WSIl8(Xiao & Xue(2001)Plant Cell Rep 20：667-673)。在其他实施方式中，位点特异性重组酶的表达受玉米rab17启动子，或本发明公开的启动子构建体(如玉米rab17启动子和attB位点)之一的调控。在某些实施方式中，切除编码细胞增殖因子的多核苷酸的位点特异性重组酶是FLP或Cre。
可以转化任何植物种类，包括，但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物种类的例子包括，但不限于，玉米(玉米)，芸苔属物种(例如，甘蓝型油菜，芜菁，芥菜型油菜)，特别是那些用作种子油料来源的芸苔种类，苜蓿(截型苜蓿)，稻(亚洲稻)，黑麦(黑麦)，高粱(双色高粱，高粱)，粟(例如，珍珠粟(珍珠狼尾草)，黍(黍)，稷(稷)，龙爪稷(龙爪稷)，向日葵(油葵)，红花(红花)，小麦(小麦)，大豆(大豆)，烟草(烟草)，土豆(马铃薯)，花生(花生)，棉花(海岛棉，陆地棉)，红薯(甘薯)，木薯(木薯)，咖啡(咖啡属)，椰子(椰子)，凤梨(菠萝)，柑桔树(柑橘属)，可可(可可)，茶树(茶树)，香蕉(香蕉)，鳄梨(鳄梨)，无花果(无花果)，芭乐(番石榴)，芒果(芒果)，油橄榄(油橄榄)，木瓜(木瓜)，腰果(腰果)，澳洲坚果(澳洲坚果)，杏树(杏树)，甜菜(甜菜)，甘蔗(甘蔗属)，燕麦(燕麦)，大麦(大麦)，拟南芥，风倾草，蔬菜，观赏植物，草，和针叶树。
蔬菜，包括西红柿(番茄)，生菜(如莴苣)，绿色豆类(菜豆)，利马豆(大菜豆)，豌豆(山黧豆属物种)，和黄瓜属的成员，如黄瓜(黄瓜)，香瓜(香瓜)，和甜瓜(甜瓜)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花属物种)，绣球花(绣球花)，芙蓉(芙蓉)，玫瑰(玫瑰属)，郁金香(郁金香属物种)，水仙(水仙属)，矮牵牛(矮牵牛)，香石竹(香石竹)，一品红(一品红)，和菊花。
可以用于实施本发明的针叶树，包括，例如，松树，如火炬松(火炬松)，湿地松(湿地松)，黄松(黄松)，黑松(黑松)，和辐射松(辐射松)，花旗松(花旗松)，西部铁杉(西部铁杉)，云杉(云杉)；红木(红杉)，真杉树，如银杉(银杉)和香脂冷杉(香脂冷杉)；以及杉树，如西红杉(西红杉)和阿拉斯加黄杉(阿拉斯加黄杉)。在特定实施方式中，本发明的植物是作物植物(例如，玉米，苜蓿，向日葵，芸苔，大豆，棉花，红花，花生，高粱，小麦，谷子，烟草等)。在其它实施方式中，玉米和大豆以及甘蔗植物是最优的，而在另外的其他实施方式中，玉米植物是最优的。
其他目的植物包括提供目的种子的谷粒植物，油料种子植物，和豆科植物。目的种子包括谷粒种子，如玉米，小麦，大麦，稻，高粱，黑麦等。油料种子植物包括棉花，大豆，红花，向日葵，芸苔，玉米，苜蓿，棕榈，椰子等。豆科植物包括大豆和豌豆。豆类包括瓜尔豆，刺槐豆，葫芦巴，大豆，花园豆，豇豆，绿豆，利马豆，蚕豆，扁豆，鹰嘴豆等。
本发明中使用的术语植物也包括植物细胞，植物原生质体，植物可以从中再生的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物团块，以及在植物或植物部分中整体的植物细胞，如胚，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果，核，穗，芯，壳，秆，根，根尖，花药等。谷粒意为是指商业种植者为了非培育和再生种类的用途而生产的成熟种子。再生的植物的后代，变体，和突变体也包括在本发明的范围中，只要这些部分包括导入的多核苷酸。
如果目的多核苷酸被导入生物中，其可以在生物中，特别是植物中引起各种变化，包括，但不限于植物脂肪酸组成的变化，改变植物氨基酸含量，改变病原体抗性等。可以通过提供异源产物的表达，植物中内源产物表达的增加，或植物中内源产物表达的抑制来实现这些结果。
目的多核苷酸一般类别包括，例如，涉及信息的那些基因，如锌指蛋白，涉及通信的那些，如激酶，涉及生物合成途径的那些，涉及管家中的那些，如热休克蛋白。转基因更具体的类别，例如，包括编码农业经济重要性状，抗虫，抗病，抗除草剂，不育，谷粒特征，油，淀粉，糖类，植酸，蛋白质，营养，代谢，消化，核大小，蔗糖负荷，和商业产出的序列。
除了使用传统育种方法外，可以从基因改变性状如油，淀粉，蛋白含量。改变包括增加油酸，饱和和不饱和油的含量，增加赖氨酸和硫水平，提供必需氨基酸，也包括淀粉的修饰。改变氨基酸水平的蛋白修饰在美国专利号5,703,049，5,885,801，5,885,802，和5,990,389以及WO 98/20122中描述，其通过引用纳入本发明。
抗虫基因可以编码对虫，如根虫，地老虎，欧洲玉米螟等的抗性。这样的基因，包括，例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利号5366892；5747450；5737514；5723756；5593881；和Geiser等(1986)Gene 48：109)；凝集素(VanDamme等(1994)Plant Mol.Biol.24：825)等。
编码抗病性状的基因包括解毒基因，如抗fumonosin(美国专利号5,792,931)；无毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)等。
抗除草剂性状可以包括其作用能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)，特别是磺酰脲型除草剂作用的编码除草剂抗性的基因(如ALS中S4和/或Hra突变)；其作用能抑制谷氨酰胺合成酶，如草丁膦或巴斯达作用的编码除草剂抗性的基因(例如，bar基因)；提供对草甘膦抗性的基因，如GAT(草甘膦N-乙酰基转移酶；美国专利6395485)，EPSPS(烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶；美国专利6867293，5188642，5627061)，或GOX(草甘膦氧化还原酶；美国专利号5463175)，或本领域已知的其他这样的基因。nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性。
不育基因也可以在表达框中被编码并提供物理去雄的替代选择。这样使用的基因的例子包括美国专利号5,583,210中描述的雄性组织优选基因和有雄性不育表型如QM的基因。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒性的化合物的那些基因。
商业性状也可以在基因上编码或者是能例如增加用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白表达的基因。
特定基因活性的降低(也被称为基因沉默或基因抑制)在植物基因工程的若干方面是理想的。许多基因沉默技术对本领域技术人员公知，包括但不限于反义技术(参见，例如Sheehy等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：8805-8809；和美国专利号5,107,065；5,453,566；和5,759,829)；共抑制(如Taylor(1997)Plant Cell 9：1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12)：340-344；Flavell  (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Finnegan等(1994)Bio/Technology 12：883-888；和Neuhuber等(1994)Mol.Gen.Genet.244：230-241)；RNA干扰(Napoli等(1990)Plant Cell 2：279-289；美国专利号5,034,323；Sharp(1999)Genes Dev..13：139-141；Zamore等(2000)Cell 101：25-33；Javier(2003)Nature 425：257-263；和Montgomery等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15502-15507)；病毒诱导基因沉默(Burton，等(2000)Plant Cell 12：691-705；和Baulcombe(1999)Curro Op.Plant Bio.2：109-113)；靶RNA特异性核酶(Haseloff等(1988)Nature 334：585-591)；发夹结构(Smith等(2000)Nature 407：319-320；WO 99/53050；WO 02/00904；和WO 98/53083)；核酶(Steinecke等(1992)EMBO J.11：1525；美国专利号4,987,071；和Perriman等(1993)Antisense Res.Dev.3：253)；寡核苷酸介导靶向修饰(如WO 03/076574和WO 99/25853)；锌指靶向分子(如WO01/52620；WO 03/048345；和WO 00/42219)；以及其他方法或上述本领域技术人员已知方法的组合。
使用下列术语来描述两个或更多个多核苷酸或多肽间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，和(d)“序列同一性百分数”。
(a)本发明中使用的“参考序列”用作序列比较基础的定义序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。
(b)本发明中使用“比较窗口”涉及多核苷酸序列连续和指定的片段，其中相比两个多核苷酸最优比对的参考序列(其不包含添加和缺失)，比较窗口中的多核苷酸可以包含添加和缺失(即，空位)。通常，比较窗口为至少20个连续核苷酸长，和可选的30，40，50，100个或更长。本领域技术人员理解为了避免由于将空位掺入多核苷酸序列引起的与参考序列的高相似性，空位罚分通常被引入并从匹配数目中减去。
用作比较的序列比对方法是本领域公知的。因此，可以使用数学算法来完成对任意两个序列间的同一性百分数的确定。这样的数学算法的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CAB/OS4：11-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部比对搜索方法；如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：58735877中修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法。
这些数学算法的计算机实施可以被用于序列比较以确定序列同一性。这样的实施包括，但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，Mountain View，California获得)；ALIGN程序(2,0版本)和GCG WisconsinGenetics Software Package，版本10中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA(可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA获得)。可以使用默认参数进行使用这些程序的比对。Higgins等(1988)Gene73：237-244(1988)；Higgins等(1989)CAB/OS5：151-153；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等(1992)CAB/OS 8：155-65；和Pearson等(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331详细描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)supra的算法。当比较氨基酸序列时，可以在ALIGN程序中使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，和4的空位罚分。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)supra的算法。可以以BLASTN程序，分数＝100，字长＝12来进行BLAST核苷酸检索以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以使用BLASTX程序，分数＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白检索以获得与本发明蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为获得比较目的跳空比对，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中的描述使用GappedBLAST(BLAST 2.0版本中)。另外，可以使用PSI-BLAST来进行检测分子间远距关系的迭代检索。参见Altschul等(1997)supra。当使用BLAST，GappedBLAST，PSI-BLAST时，可以使用各程序的默认参数(例如核苷酸序列的BLASTN，蛋白的BLASTX)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对也可以通过检视人工进行。
除非另有说明，本发明提供的序列同一性/相似性值是指使用版本10的GAP使用下列参数获得的值：核苷酸序列％同一性和％相似性使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp得分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62得分矩阵；或任何其等同的程序。通过“等同程序”，意指任何序列比较程序，对于任意两个所比较的序列，当与GAP版本10生成的对应比对相比较时，其产生有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分数的比对。
GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法来寻找能将匹配数最大化并将空位数最小化的两个完整序列比对。GAP考虑所有可能的比对和空位位置并创建有最大匹配碱基数目和最少空位的比对。其允许提供匹配碱基单元中的空位创建罚分和空位延伸罚分。GAP必须对于其插入的每个空位从匹配的空位创建罚分数目获利。此外，如果选择了大于零的空位延伸罚分，GAP必须对每个插入的空位，从对空位延伸罚分计时的空位长度获利。版本10的GCG Wisconsin Genetics Software Package中对蛋白序列默认空位创建罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对核苷酸序列默认空位创建罚分为50而默认空位延伸罚分为3。空位创建和空位延伸罚分可以被表达为选自从0到200组成的整数组的整数。因此，例如，空位创建和空位延伸罚分可以是0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或更大。
GAP代表最佳比对家族的一个成员。该家族中有许多成员，但没有其他成员具有更好的质量。GAP显示比对的四个优势指标数值：质量，比率，同一性，和相似性。质量是最大化以对齐序列的度量。比率是在较短片段中除以碱基数目的质量。同一性百分数是实际匹配的符号百分数。相似性百分数是相似符号的百分数。忽略从空位跨越的符号。当符号对的得分矩阵值大于或等于0.50的相似性阙值时，对相似性评分。用于版本10的GCG Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的得分矩阵是BLOSUM62(见Henikoffand Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
(c)本发明中对于两个多核苷酸或多肽序列使用的“序列同一性”或“同一性”涉及当在指定的比较窗口上以最大对应性对齐时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数被用于涉及蛋白时，应认识到不相同的残基位置经常有保守氨基酸取代的不同，其中氨基酸残基被其他有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸残基所取代并由此不改变分子的功能特性。当序列因保守取代不同时，序列同一性百分数可以被向上调整到取代保守性质的校正。有这样保守取代区别的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。做这样调整的方式是本领域技术人员公知的。通常这包括作为部分而非完整错配来对保守取代评分，由此增加序列同一性百分数。因此，例如，当给予相同的氨基酸1的分数并给予非保守取代零的分数时，保守取代被给予零到1之间的分数。保守取代的分数被计算，如按照PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，California)中实施的。
(d)本发明中使用的“序列同一性百分数”表示通过在比较窗口中比较两个最优对齐的序列确定的数值，其中相比两个序列最优比对的参考序列(其不包含添加或缺失)，比较窗口中的多核苷酸序列部分可能包括添加和缺失(即，空位)。百分数的计算是通过确定相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中发生的位置数目以得到匹配的位置数目，将匹配的位置数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100来得到序列同一性百分数。
在杂交技术中，已知多核苷酸的所有或部分被用作探针，探针能选择性杂交存在于来自所选生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体(即基因组或cDNA文库)中的其他对应多核苷酸。杂交探针可以是基因组DNA片段，cDNA片段，RNA片段，或其他寡核苷酸，并可以以可检测的基团如32P，或任何其他可检测标记物来标记。因此，例如，可以通过标记基于babyboom多核苷酸的合成寡核苷酸来制造杂交探针。制备杂交探针以及构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并在Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)中公开。
例如，整个babyboom多核苷酸，或其一个或多个部分可以被用作能够特异性杂交对应babyboom多核苷酸和信使RNA的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包括babyboom多核苷酸序列中独有的序列，而探针优选至少约10个核苷酸长，并且最优选至少约20个核苷酸长，这样的探针可以被用于通过PCR从所选植物扩增对应babyboom多核苷酸。该技术可以被用于从所需植物中分离额外的编码序列，或者用作确定植物中编码序列存在的诊断测试方法。杂交技术包括铺板的DNA文库(噬菌斑或菌落，参见，例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)的杂交筛选。
这样序列的杂交可以在严格条件下进行。通过“严格条件”或“严格杂交条件”，意指探针与其靶序列杂交到比与其他序列杂交时可检测的更高程度(如，至少是背景的2倍)。严格条件取决于序列并且在不同的环境下会不同。通过控制杂交和/或清洗条件的严格性，可以识别与探针100％互补的靶序列(同源探针检测)。此外，严格条件可以被调整到允许序列中的某些错配，以使得能检测到较低的相似程度(异源探针检测)。通常，探针小于约1000个核苷酸长，最优小于约500个核苷酸长。
通常，严格条件是那些条件，其中在pH7.0到8.3，盐浓度小于约1.5M Na离子，通常为约0.01到1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，而温度对短探针(如10到50个核苷酸)为至少约30℃而对长探针(如大于50个核苷酸)为至少约60℃。也可以加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。示例性的低严格性条件包括以30％到35％的甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，和在1X到2X的SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50到55℃清洗。示例性的中度严格性条件包括在40％到45％的甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中在37℃杂交，和在0.5X到1X的SSC中在55到60℃清洗。示例性的高严格性条件包括在50％的甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中在37℃杂交，和在0.1X的SSC中在60到65℃清洗。可选的，清洗缓冲液可以包含约0.1％到约1％SDS。杂交持续时间一般小于约24小时，经常约4到约12小时。清洗时间持续至少足够达到平衡的时间长度。
特异性通常是杂交后清洗的函数，关键因素是最终清洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L的公式近似得到；其中M是一价阳离子摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，和L是以碱基对计杂交体的长度。Tm是一个温度(在规定的离子强度和pH下)，在该温度下50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交。每有1％的错配Tm降低约1℃；因此，可以调整Tm、杂交和/或清洗条件以与所需同一性的序列杂交。例如，如果要寻找有≥90％同一性序列，Tm可以被降低10℃。通常，严格条件选择为在规定的离子强度和pH值下低于特定序列及其互补序列热熔点(Tm)约5℃的温度。然而，高度严格条件可以使用在低于热熔点(Tm)1，2，3，或4℃的温度下的杂交和/或清洗；中度严格条件可以使用在低于热熔点(Tm)6，7，8，9，或10℃的温度下的杂交和/或清洗；低严格性条件可以使用在低于热熔点(Tm)ll，12，13，14，15，或20℃的温度下的杂交和/或清洗。使用该公式，杂交和清洗组合物，和需要的Tm，技术人员会理解到杂交和/或清洗溶液严格性的变化也被固有的描述。如果所需错配程度得到小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，最好增加SSC浓度以使得可以使用更高的温度。对核酸杂交的扩展指导可在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcidProbes，第1部分，第2章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)中找到。见Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)。
应当注意术语“a”或“an”实体是指一个或多个该实体；例如“a polypeptide”被理解为表示一个或多个多肽。如此术语“a”(或“an”)，“一个或多个”，和“至少一个”可以被交换使用。
在本说明书和权利要求中，除非上下文另有需要，词语“包含”、“包括”、“含有”，可以以未排他的意思使用。
本发明中使用的术语“约”，当指数值时意为涵盖在某些实施方式中±50％、在某些实施方式中±20％、在某些实施方式中±10％、在某些实施方式中±5％、在某些实施方式中±1％、在某些实施方式中±0.5％、和在某些实施方式中±0.1％的变化，这是由于这样的变化适合实施公开的方法或使用公开的组合物。
此外，当量，浓度，或其他值或参数以范围，优选的范围，或较高优选值和较低优选值的列表给出时，这被理解为明确公开了任何较高范围界限或优选值以及任何较低范围界限或优选值的任意对形成的所有范围，无论范围是否被单独公开。当本发明中叙述数值范围时，除非另有说明，范围意为包括其端点，以及范围中的所有整数和小数。当定义范围时并不意味着目前公开的主题的范围被限定到所述具体值。
以说明而非限制的方式提供下面的实施例。
实验
实施例1 调节基因表达的修饰的Rab 17启动子
使用GatewayTM技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)将GatewayTM重组位点置于启动子和编码序列之间，以及编码序列和终止子之间。以这种方式创建的GatewayTM反应产物将attB位点留在那些位置。
Rab17启动子被识别为调节在组织培养中切除编码细胞增殖因子的多核苷酸的FLP重组酶表达的候选物。测试了其在培养中FLP/FRT切除细胞增殖因子基因。构建了PHP31004质粒，其具有下列可操作连接的组分：Rab17启动子-attB1::FLPm-attB2::PinII+Ubi启动子-FRT1::CFP::PinII+Ubi启动子::ZmBBM::PinIIFRT1::YFP::PinII+Ubi启动子::moPAT：PinII。PHP31004质粒中FLPm基因表达框的序列在SEQ ID NO：46中提供。
在被FLP重组酶切除之后，PHP31004质粒具有下列可操作连接的组分：Rab17启动子(Pro)-attB1::FLPm-attB2::PinII+Ubi启动子-FRT1::YFP::PinII+Ubi启动子::moPAT::PinII。
构建缺少attB位点，但含有FLPm基因的质粒(PHP30642)。PHP30642具有下列可操作连接的组分：Rab17启动子::FLPm::Gz-W64A项(term)+Ubi启动子-FRT1::CFP::PinII+Ubi启动子::ZmBBM::PinII-FRT1::YFP::PinII+Ubi启动子::moPAT::PinII。PHP31004质粒中FLPm基因表达框的序列在SEQ ID NO：47中提供。
在被FLP重组酶切除之后，PHP30642质粒具有下列可操作连接的组分：Rab17启动子::FLPm::Gz-W64A项+Ubi启动子-FRT1::YFP::PinII+Ubi启动子::moPAT::PinII。缺少attB位点的结构导致了细胞增殖因子基因的频繁过早切除。
实施例2 玉米未成熟胚的转化
可以通过各种已知在植物中有效的方法来实现转化，包括粒子介导转移，农杆菌介导转化，PEG介导转移，和电穿孔。
a粒子介导转移
使用粒子转移的玉米未成熟胚转化如下进行。培养剂配方如下。
穗被去皮并在加入0.5％微去垢剂的30％Clorox漂白液中表面消毒20分钟，并用无菌水清洗两次。未成熟的胚被切下并胚轴侧向下(盾片面向上)，每盘25个胚放置于560Y培养基上4小时，随后在准备轰击的2.5cm靶区域中对齐。
包含与启动子可操作连接的Zm-BBM(也被称为Zm-ODP2)编码序列(SEQID NO：9中所显示)的质粒被构建。这可以是弱启动子如nos，组织特异性启动子，如球蛋白-1或油脂蛋白，诱导型启动子如In2，或强启动子如泛素加含选择标记基因膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT；Wohlleben等(1988)Gene 70：25-37)的质粒，膦丝菌素N-乙酰基转移酶能赋予对除草剂双丙氨膦的抗性。通过混合100μL水中的制备好的钨团粒、10μL(1μg)Tris-EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)、1001μL 2.5M CaCl2和10μL 0.1M亚腈胺，使用氯化钙(CaCl2)沉淀过程，将含有选择标记基因PAT的质粒DNA和BBM质粒沉淀在1.1μm(平均直径)的钨团粒上。随着混合将每种试剂顺序添加到钨颗粒团粒悬液中。最终混合物短暂超声处理并被允许在恒定漩涡下孵育10分钟。在沉淀期之后，短暂的离心管，去除液体，而颗粒以500ml 100％的乙醇清洗，随后离心30秒。再次去除液体，向最终钨颗粒团粒中加入105μl 100％的乙醇。为了粒子枪轰击，钨/DNA颗粒被短暂超声。10μl钨/DNA颗粒被点在每个大载体中心，在此之后，点上的颗粒被允许在轰击前干燥2分钟。
使用Biorad Helium Gun在#4水平轰击样品盘。所有样品接受450PSI的单次轰击，从每管制备的颗粒/DNA中取总数10等份。
轰击之后，胚在560Y培养基上培育2天，随后转移到含有3mg/升双丙氨膦的560R选择培养基中，并每2周再次培养。在约10周选择之后选择抗性愈伤组织克隆被转移到288J培养基中以启始植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，发育良好体细胞胚被转移到萌发培养基中并转移到光照培养室中，约7-10天后，正发育的植株被转移到管中272V无激素培养基中7-10天直至植株已经良好建立。随后植物被转移到含有栽培土壤的平层插板(相当于2.5″的盆)中并在培养室中培育1周，随后在温室中再培育1-2周，随后被转移到经典的600盆(1.6加仑)中并培育至成熟。监测并评分植物的转化效率，和/或再生能力的改变。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l的N6基础盐(SIGMA C-1416)，1.0ml/l的Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)，0.5mg/l的盐酸硫胺素，120.0g/l蔗糖，1.0mg/l 2，4-D，和2.88g/l的L-脯氨酸(以KOH调整到pH5.8后使用D-I H2O加到体积)；2.0g/l的脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)(在使用D-IH2O加到体积后添加)；和8.5mg/l的硝酸银(在消毒培养基并冷却至室温后添加)。
选择培养基(560R)包含4.0g/l的N6基础盐(SIGMA C-1416)，1.0ml/l的维生素混合物(1000X SIGMA-1511)，0.5mg/l的盐酸硫胺素，30.0g/l蔗糖，和2.0mg/l 2，4-D(以KOH调整到pH5.8后使用D-I H2O加到体积)；3.0g/l的脱乙酰吉兰糖胶(在使用D-I H2O加到体积后添加)；和0.85mg/l的硝酸银和3.0mg/l的双丙氨膦(在消毒培养基并冷却至室温后添加)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)，5.0ml/l MS的维生素储备液(0.100g烟酸，0.02g/l盐酸硫胺素，0.10g/l盐酸吡哆醇，和0.40g/l甘氨酸，使用精炼的D-I H2O加至体积)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)，100mg/l肌醇，0.5mg/l玉米素，60g/l蔗糖，和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(调整至pH5.6后使用精炼的D-I H2O加至体积)；3.0g/l的脱乙酰吉兰糖胶(在使用D-I H2O加到体积后添加)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l的双丙氨膦(在消毒培养基并冷却至60℃后添加)。
无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)，5.0ml/l MS的维生素储备液(0.100g烟酸，0.02g/l盐酸硫胺素，0.10g/l盐酸吡哆醇，和0.40g/l甘氨酸，使用精炼的D-I H2O加至体积)，0.1g/l肌醇，和40.0g/l蔗糖(调整至pH5.6后使用精炼的D-I H2O加至体积)；以及6g/l的琼脂粉(在使用精炼的D-IH2O加至体积后添加)，灭菌并冷却到60℃。
b 农杆菌介导的转化
农杆菌介导的转化基本按照Djukanovic等(2006)Plant Biotech J 4：345-57中描述的进行。简而言之，10-12日龄的未成熟胚(0.8-2.5mm大小)被从消毒的核上切下并置于液体培养基中(4.0g/L的N6基础盐(Sigma C-1416)，1.0ml/L的Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)，1.0mg/L的盐酸硫胺素，1.5mg/L2，4-D，和0.690g/L的L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36.0g/L葡萄糖，pH5.2)。收集胚后，培养基被替换以1ml 0.35-0.45 OD550的农杆菌。玉米胚与农杆菌在室温下温育5分钟，随后混合物被倒在含有4.0g/L的N6基础盐(Sigma C-1416)，1.0ml/L的Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)，1.0mg/L的盐酸硫胺素，1.5mg/L2，4-D，和0.690g/L的L-脯氨酸，30.0g/L蔗糖，0.85mg/L硝酸银，0.1nM乙酰丁香酮，和3.0g/L脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.8的培养基平板上。胚被轴向下在黑暗中20℃培育3天，随后在黑暗中28℃培育4天，随后被转移到含有4.0g/L的N6基础盐(SigmaC-1416)，1.0ml/L的Eriksson维生素混合物(SigmaE-1511)，1.0mg/L的盐酸硫胺素，1.5mg/L 2，4-D，和0.69g/L的L-脯氨酸，30.0g/L蔗糖，0.5g/L的MS缓冲液，0.85mg/L硝酸银，3.0mg/L双丙氨膦，100mg/L羧苄青霉素，和6.0g/L琼脂，pH 5.8的新培养基平板上。每三周再次培养胚直至识别到转基因事件。通过将少量组织转移到再生培养基上(4.3g/L MS盐(Gibco 11117)，5.0ml/L的MS维生素储备液，100mg/L肌醇，0.1μM ABA，1mg/L IAA，0.5mg/L玉米素，60.0g/L蔗糖，1.5mg/L双丙氨膦，100mg/L羧苄青霉素，3.0g/L脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.6)并在黑暗中28℃培育2周来诱导体细胞胚生成。有可见的芽和根的所有材料被转移到含有4.3g/l MS盐(Gibco 11117)，5.0ml/l的MS维生素储备液，100mg/L肌醇，40.0g/L蔗糖，1.5g/L脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.6的培养基上，并在人工光线下28℃培育。一周后，植株被移入含有相同培养基的玻璃管并培育直至其被采样和/或移植入土壤。
实施例3 BBM瞬时表达增强转化
可以修改转化方法的参数以确保BBM活性是瞬时的。一种这样的方法包括以允许转录和表达但阻止随后DNA释放的方式，例如通过使用化学品PEI，来沉淀含BBM的质粒。
在一个实施例中，使用PEI将BBM质粒沉淀到金颗粒上，而要被整合的转基因表达框(UBI::moPAT～GFPm::PinII；moPAT是玉米优化的PAT基因)被使用标准氯化钙方法沉淀到金颗粒上。
简而言之，如下以PEI包被金颗粒。首先清洗金颗粒。在微量离心管中称出35mg，平均直径1.0(A.S.I.#1620010)的金颗粒，加入1.2ml无水EtOH并漩涡一分钟。所述管在室温下温育15分钟并使用微量离心机在4℃下高速离心15分钟。弃去上清并加入新鲜的1.2ml等份乙醇(EtOH)，漩涡一分钟，离心一分钟，并再次弃去上清(这样重复两次)。加入新鲜的1.2ml等份EtOH，该悬液(EtOH中的金颗粒)被保存在-20℃下数周。为了以聚乙亚胺(PE1；Sigma#P3143)包被颗粒，250μl清洗过的金颗粒/EtOH混合物被离心并弃去EtOH。颗粒在100μlddH2O中清洗一次以去除残留的乙醇。加入250μL 0.25mM的PEI，随后脉冲超声处理以悬浮颗粒，随后将管插入干冰/EtOH浴中以速冻悬液，随后将其冻干过夜。到此时，干燥的，包被的颗粒可以被储存在-80℃下至少3周。使用之前，使用250μl等份的2.5mM HEPES缓冲液，pH7.1，以1x脉冲超声处理冲洗颗粒三次，随后在每次离心前快速漩涡。随后颗粒被悬浮在终体积250μl的HEPES缓冲液中。在贴附DNA之前将25μl等份的颗粒加入到新管中。为了贴附未包被的DNA，将颗粒脉冲超声处理，随后加入1μgDNA(在5μl水中)，随后通过使用Pipetteman上下吹打几次混合并温育10分钟。简单旋转颗粒(即10秒)，去除上清，并加入60μlEtOH。带PEI-沉淀的DNA-1的颗粒被在60μlEtOH中清洗两次。离心颗粒，弃去上清，将颗粒重悬浮于45μl水中。为贴附第二DNA(DNA-2)，使用了以TFX-50的沉淀。简单超声处理45μl颗粒/DNA-1悬液，随后加入5μl 100ng/μl的DNA-2和2.5μl的TFX-50。溶液被置于旋转摇床上10分钟，10,000g离心1分钟。去除上清，将颗粒重悬浮在60μl EtOH中。溶液被点到大载体上，并使用PDS-100的标准方案，将DNA-1和DNA-2已经顺序贴附其上的金颗粒转入10DAP Hi-II未成熟胚盾片细胞。对于这个实验，DNA-1质粒含有UBI::RFP::pinII表达框，而DNA-2含有UBI::CFP::pinII表达框。轰击后两天，由未成熟胚表面的众多红和蓝细胞观察到CFP和RFP荧光标记物的瞬时表达。随后将胚置于非选择性培养基上并在评分稳定细胞群落前使其生长3周。这三周之后，相比仅一个红色细胞群落，观察到10个多细胞、稳定表达的蓝色细胞群落。这证明了PEI-沉淀可以被用于有效的导入瞬时表达DNA，同时显著降低PEI导入DNA的整合并由此降低RFP表达的转基因事件的恢复。以这种方式，PEI-沉淀可以被用于提供BBM和/或WUS2的瞬时表达。
例如，首先使用PEI以UBI::BBM::pinII包被颗粒，随后使用TFX-50以UBI::moPAT～YFP包被颗粒，并随后轰击入未成熟胚上的盾片细胞。PEI介导的沉淀得到在未成熟胚表面上高频率的瞬时表达细胞，以及特别低频率的稳定转化体恢复(相对TFX-50方法)。因此，预期PEI沉淀的BBM框瞬时表达并刺激组织轰击表面上(即，盾片表面)的胚生成生长爆发，但该质粒不整合。从Ca++/金颗粒释放的PAT～GFP质粒预期会整合并以会导致转基因事件大幅改进恢复的频率来表达选择标记物。作为对照处理，将含有UBI::GUS::pinII(代替BBM)的PEI-沉淀的颗粒与PAT～GFP/Ca++颗粒混合。来自两种处理的未成熟胚被移至含有3mg/l双丙氨膦的培养基上。在6-8周后，预期在PEI/BBM处理组中观察到相对对照处理组(PEI/GUS)高得多频率的GFP+、双丙氨膦抗性愈伤组织。
作为替代方法，使用PEI将BBM质粒沉淀到金颗粒上，并随后导入未成熟胚表面上的盾片细胞，并且接下来BBM基因的瞬时表达引起胚生成性生长的快速增殖。在此诱导的生长期间，使用对玉米的标准方法(见实施例1)以农杆菌处理外植体，而随T-DNA传入细胞导入转基因表达框如UBI::moPAT～GFPm::pinlI。在共培养之后，使外植体在标准培养基上恢复，并随后被移动到含有3mg/l双丙氨膦的培养基上。在6-8周后，预期在PEI/BBM处理组中观察到相对对照处理组(PEI/GUS)高得多频率的GFP+、双丙氨膦抗性愈伤组织。
通过瞬时表达BBM和/或WUS2多核苷酸产物来“脚踏启动”愈伤组织生长可能是理想的。这可以通过传送BBM和WUS25’加帽多聚腺苷酸化RNA，含有BBM和WUS2DNA的表达框，或BBM和/或WUS2蛋白质来完成。可以使用生物弹道粒子枪来传输所有这些分子。例如，可以使用Ambion′smMessage mMachine试剂盒在体外容易的制造5’加帽多聚腺苷酸化BBM和/或WUS2RNA。RNA被随DNA共转移，DNA含有目的多核苷酸和用于选择/筛选的标记物，如Ubi::moPAT～GFPm::PinII。预期接受RNA的细胞会马上开始更快的分裂，这些中的一大部分会整合农艺性状基因。这些事件可以进一步证实为是转基因克隆群落，这是由于其也表达PAT～GFP融合蛋白(并因此会在适合的光照下显示绿色的荧光)。随后可以从这些胚再生的植物中筛选目的多核苷酸的存在。
实施例4 表面细胞增殖因子的基因的切除
aRab17::CRE
构建下列T-DNA：RB-Ubi启动子-loxP::Rab17启动子-attBl::CreattB2::PinII+NOS::ZmWUS2::PinII+Ubi启动子::ZmBBM::PinII-IoxP::YFP::PinII+Ubi启动子::moPAT::PinII-LB。作为对照，构建含有Ubi启动子::moPAT::PinII的T-DNA。使用标准的农杆菌介导转化方法将这些T-DNA导入玉米自交系PHH5G的未成熟胚(约0.8-2.5mm长)。该自交系非转化的未成熟胚膨胀并起始小体积愈伤细胞，但在通常用于玉米组织培养的培养基组合物中不发生增殖(例如，605J培养基，其包含4.3g/l MS盐，0.6g/l Shenk & Hildebrand维生素，100mg/l氯化钙，275mg/l硫酸铵，275mg/l硫酸铵，240mg/l磷酸钾，100mg/l硫酸镁，3.4g/l硝酸钾，1.8mg/l硼酸，6mg/l硫酸锰，0.15mg/l钼酸钠，0.5mg/l碘化钾，22mg/lEDTA二钠，17mg/l硫酸亚铁，3.4mg/l硝酸银，1g/l L-脯氨酸，0.2mg/l烟酸，0.4mg/l硫胺素，0.2mg/l吡哆醇，0.8mg/l甘氨酸，100mg/l羧苄青霉素，0.8mg/l 2-4D，1.2mg/l麦草畏，0.3g/l酪蛋白水解物，20g/l蔗糖，0.6g/l葡萄糖，和6g/l TC琼脂，pH 5.8)。同样的，无论是否提供双丙氨膦选择，单以Ubi启动子::moPAT::PinII转化的PHH5G未成熟胚不产生健康的，生长的愈伤组织。因此，仅导入Ubi启动子::moPAT::PinII(或以Ubi启动子::moPAT::PinII+Ubi启动子::YFP::PinII)之后没有产生转化事件。相反，当编码细胞增殖因子(BBM和WUS2)的基因+Ubi启动子::moPAT::PinII被导入PHH5G未成熟胚时，从45％处理过的胚中恢复出活跃生长的愈伤组织转化体。为去除表面细胞增殖因子的基因，可以通过暴露于20mM的脱落酸(ABA)，20-30％的蔗糖，或干燥来诱导Rab17启动子。在该实验中，愈伤组织被置于干燥的滤纸上三天以诱导切除，并随后被转移到再生培养基中。如果愈伤组织没有被处理以诱导Cre重组酶的表达，编码细胞增殖因子基因的切除没有发生，而且没有再生出成活的植株。然而，对于通过干燥处理发生的事件，Cre切除在超过90％的单拷贝事件中发生(激活YFP)而且随后的再生没有被抑制。使用PCR引物的组合来来筛选转基因植物，PCR引物设计为检测Ubi启动子-loxP::YFP连接点的存在，该连接点是作为切除以及moPAT(不受切除影响)，以及Cre、WUS2和BBM不存在的结果形成。其中完成了切除的植物被培育至成熟并自交或与野生型植物异型杂交。通过黄色荧光表型容易的识别出转基因后代种子，而可通过BASTA抗性或黄色荧光容易的追踪植物。T1和T2代中的PCR分析表明仅有切除的基因座显示于单基因组拷贝中而且没有显示出农杆菌质粒骨架。
FLP和Cre重组酶都已经被成功的用于在再生之前切除编码细胞增殖因子的基因。下面两种构建体显示了重组酶如何被用于控制切除的例子。
PHP32371-FLP/FRT
RB-Ubi-FRT1::CFP::PinII-attB4+Rab17启动子-attB1::FLP-attB2::PinII+Nos::Zm WUS2::PinII+Ubi::ZmBBM::PinII-FRT1::YFP::PinII+Ubi::moPAT::PinII-LB
PHP32371的T-DNA序列显示于SEQ ID NO：110中。
PHP35648-Cre/LoxP
RB-Ubi-LoxP::CFP::PinII-attB4+Rab17启动子-attb1::CreattB2::PinII+Nos::Zm WUS2::PinII+Ubi::ZmBBM::PinIILoxP::YFP::PinII+Ubi::MOPAT::PinII-LB
PHP35648的T-DNA序列显示于SEQ ID NO：111中。
对于两种重组酶，表达受具有aab1位点的Rab17启动子(Vilardell等(1991)Plant Mol.Biol 17：985-993)控制。
对于两种构建体，可容易的恢复转基因愈伤组织事件，而两种构建体在切除包含编码细胞增殖因子基因的表达框上表现良好(见表2)。在暴露于3天干燥处理的愈伤组织总数目中，61％(Cre)和29％(FLP)得到的植物显示正常野生表型。作为切除的确认，在T1和T2代中的PCR分析表明仅有切除的基因座显示于单基因组拷贝中而且没有显示出农杆菌质粒骨架。
表2 再生之前，干燥诱导的重组酶，BBM & WUS表达框切除。
Figure BPA00001625021800531
生成了另外的使用Cre/LoxP的构建体
PHP46446：RB-LoxP-Rab17启动子-attB1::Cre-attB2::PinII+Nos::Zm-WUS2::PinII::GZW64A Term-attB2+Ubi::ZmBBM::PinII-LoxP-LB
PHP48733：RB-LoxP-Rab17启动子-attB1::Cre-attB2::PinII+Nos：ZmWUS2::PinII+Ubi::ZmBBM::PinII-LoxP-LB
PHP46446和PHP48733的T-DNA序列分别显示于SEQ ID NO：112和113中。
通过农杆菌将PHP35648，PHP48733，或PHP46446导入PHH5G未成熟玉米胚分别导致了46％，67％，或37％的转化率。
表3 使用玉米BBM和WUS2细胞增殖因子来转化PHH5G未成熟玉米胚
  构建体   穗数   胚数   愈伤组织事件数   愈伤组织水平转化频率
  PHP35648   14   589   268   45.5
  PHP48733   14   584   389   66.6
  PHP46446   14   547   203   37.1
使用PHP35648，PHP48733，PHP46446，和PHP32371构建体(其所有包含带attb1位点的、调节重组酶表达的Rab17启动子(Vilardell等(1991)PlantMol.Biol 17：985-993))，与使用PHP31004构建体的实施例1中显示的结果相似，没有导致频繁的细胞增殖因子基因过早切除。
b 四环素诱导的CRE
其中已经接近TATA盒导入三个四环素操纵子序列(Top3)的35S启动子(Gatz等(1992)Plant J2：397-404)被与下面T-DNA中CRE结构基因可操作连接，如下该T-DNA也包含的四环素阻遏物(TETR)，BBM，WUS2，和moPAT的表达框：
RB-IoxP-35S::Top3::CRE::PinII+Ubi启动子::TETR::PinII+NOS::ZmWUS2::PinII+UBI::ZmBBM::PinII-IoxP+UBI::moPAT::PinII-LB
在农杆菌介导的12个DAP PH581未成熟胚转化之后在3mg/l双丙氨膦中选择6周后，向其中导入对照T-DNA(RB-UBI::moPAT::PinII-LB)的胚以1％的频率发生转化事件。相反，当含有ZmBBM & ZmWUS2的上面T-DNA被转化入从相同的PH581穗收获的未成熟胚时，转基因愈伤组织以15％的频率恢复。在再生植物之前，愈伤组织被移动到含0.5mg/l四环素的培养基上1周以诱导CRE介导的CRE、WUS和BBM表达框切除。随后容易的再生出草胺磷抗性植物。
实施例5 使用调节的启动子控制BBM和WUS表达以增加转化频率
a OLE启动子::BBM
在PH581玉米自交系中，导入UBI::ZmBBM+NOS:ZmWUS2将转化频率从对照处理组(单独UBI PRO::moPAT::PinII)中的不足1％增加到15％。然而，这样强的BBM过表达对植株再生产生消极影响。因此，在愈伤组织中具有高表达水平，在植物生长期间很少至没有活性的油脂蛋白启动子被用于表达BBM。当OLE::ZmBBM::PinII+NOS::ZmWUS2::PinII在第一T-DNA上被导入PH581中而UBI启动子::moPAT::PinII在第二T-DNA上被导入相同的细胞时，愈伤组织以25％的频率恢复。正常的，可育植物被再生并与野生型PH581杂交。容易的恢复出T1后代，其中细胞增殖因子基因座已经与UBIPRO::moPAT::PinII基因座隔离开。
b 四环素诱导的BBM和WUS2
其中已经接近TATA盒导入三个四环素操纵子序列的35S启动子(Gatz等(1992)Plant J2：397-404)被与BBM和WUS2基因可操作连接，这三个表达框与四环素阻遏物(TETR)表达框一起被如下放入T-DNA
RB-35S-Top3::ZmBBM::PinII+35S-Top3::ZmWUS2::PinII+UBI::moPAT::PinII-LB
在农杆菌介导的Hi-II未成熟玉米胚转化之后，胚被转移到有3mg/l双丙氨膦+/-0.5mg/l四环素的560R选择培养基上。在其中仅导入UBI::moPAT::PinII表达框的对照处理组中，转化频率通常约5-10％。对于其中诱导型BBM和WUS2基因被导入的胚，向培养基中添加四环素时转化频率预期会大幅增加。
实施例6 再转化的BBM和WUS2表达调节
在PHH5G中产生了稳定的转基因事件，其以受调节的方式表达ZmBBM和ZmWUS2，例如，分别具有OLE和NOS启动子控制下的BBM和WUS2，或者具有受四环素诱导启动子驱动的这些基因。随后收获未成熟的胚并使用农杆菌再转化以输送UBI::moPAT::PinII。不表达BBM和WUS2的PHH5G胚(即，野生型对照胚)不产生转基因事件。然而，表达OLE启动子::ZmBBM::PinII和NOS启动子::ZmWUS2::PinII的胚预期产生高得多频率的双丙氨膦抗性事件。编码细胞增殖因子基因的表达调节预期能增强正常、可育植物的再生频率，而细胞增殖基因座应该容易的与新产生的“性状”基因座(这里以UBI::moPAT::PinII基因座表示)隔离开。同样的，当四环素诱导的，编码细胞增殖因子的基因被添加0.5mg/l的四环素刺激时，输送RB-UBI::moPAT::PinII-LBT-DNA的农杆菌介导转化预期能得到增强的转化频率。
实施例7 两个T-DNA共转化以单独输送编码细胞增殖因子的基因和性状基因
修饰农杆菌以包含两种工程化质粒，每种含有单独的T-DNA。T-DNA-1是PHP35648(描述见实施例4)，而T-DNA-2(PHP41877)含有RB-attB4-UBI::moPAT::PinII+UBIFRT1::RFP::PinII-attB1+UBI::GAT::PinII-attB2-FRT87-attB3-LB(GAT＝草甘膦-N乙酰转移酶)，显示了含有想要的性状基因组的T-DNA。PHH5G未成熟玉米胚的农杆菌介导转化之后是草甘膦选择。由于只有当ZmWUS2和ZmBBM基因存在时PHH5G培养生长才会发生，只有具有整合的T-DNA-1的胚才能生长。仅有包含T-DNA-2的胚是草甘膦抗性的并显示红色荧光。因此，只有被以两种T-DNA共转化的胚在草甘膦上生长。
实施例8 BBM基序的识别
使用玉米BBM氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，通过对注释的蛋白序列(参见，图1)查询的同源检索识别出来自不同植物种类的五十个基因。人工检查基因结构和这些BBM同系物的序列并在可能时与EST/cDNA比对来比较。这五十个多肽显示于SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，67，和70-104中。为了系统识别BBM同系物中可能的基序，这五十个同系物的蛋白序列被以下列具体参数提交到万维网上meme.nbcr.net/meme4_l/cgibin/meme.cgi处可用的MEME web服务器：
不同基序数目：20
最小基序宽度：5
最大基序宽度：300
最小位点数目：5
所有其他参数使用默认值。人工将MEME得到的原始结果与使用clustalw生成的多序列比对比较。仅有那些显示出与序列比对有良好一致性的候选者被考虑为做进一步分析的基序。
对五十个基因进行系统发育分析，并识别出总数六个亚组，包括BBM，PLT3，PLT1/2，AIL6/7，AIL1，和ANT(参见图1)。图3描述了具有使用MEMEweb服务器识别的每一个基序的所有50个序列。图2提供了基序共有序列以及被MEME web服务器用于生成共有基序的各种多肽的比对。有少数例外，基序1-6，如本发明下面马上定义的，存在于所有五十个基因中。这包括基序1-3(分别为SEQ ID Nos 48-50)，其表示两个AP2域以及连接两个域的序列(连接序列)。基序4，其有PK[L/V][E/A][DIN]FLG(SEQ ID NO：51)的共有序列，是到两个AP2域的氨基末端。基序5(SEQ ID NO：52)在多肽羧基末端的两个AP2域两侧。基序6在接近多肽氨基末端处，其有NWL[G/S]FSLSP(SEQ ID NO：53)的共有序列。
有对同源序列BBM亚组(本发明中被称为BBM多肽)相对特异的基序。BBM多肽的比对可以在图4中找到。基序7在所有BBM多肽中多肽氨基末端处被发现，并具有[G/E]LSMIK[TIN]WLR(SEQ ID NO：54)的共有序列。存在于除来自芸苔和来自拟南芥多肽外的所有BBM多肽中的另一基序是基序10。基序10具有WCK[Q/P]EQD(SEQ ID NO：57)的共有序列并位于AP2域下游。
还有三个对BBM组多肽特异的基序，包括基序15(SEQ ID NO：59)，其仅在BBM直系同源物中出现，但不在单子叶BBM2多肽中出现；单子叶特异性基序(基序19；SEQ ID NO：60)；和一般BBM特异性基序(基序14；SEQID NO：58)，其出现在除芸苔和豆类分支外的BBM同系物中。
图5提供了BBM同系物基序结构的概览。氨基末端的基序4和6和AP2两侧的基序5将BBM同源序列与其他含有两个AP2域的同源物，如WRI，AP2，和RAP2.7区分开来。因此，基序1-6可以被认为做BBM/PLT家族核心基序。许多BBM/PLT家族亚组(BBM，PLT1/2，AIL1，和ANT)也具有羧基端基序(基序8；SEQ ID NO：55)和第三氨基端基序(基序9；SEQ ID NO：56)。
BBM多肽在氨基端均有一个另外的基序(基序7；SEQ ID NO：54)，而除了芸苔和拟南芥外所有BBM同系物具有AP2下游基序(基序10；SEQ ID NO：57)。某些其他BBM/PLT家族成员(如单子叶AIL1)可以有与基序7相似的基序，但是它们中没有成员还具有基序9。基序10仅在BBM多肽中出现。综合起来，MEME预测基序1-10可以被视为BBM多肽基序。所有单子叶植物BBM多肽(玉米，高粱，和稻)也具有基序14，15，和19(参见图3)。某些双子叶植物BBM多肽和第二单子叶植物BBM组(BBM2)具有这些基序中的一个或两个，但是其中没有多肽具有所有三个基序。
实施例9 使用玉米BBM和WUS2来增加稻中转化。
a亚洲稻籼稻亚种(Oryza sativa L.ssp.Indica)
使用农杆菌以T-DNA转化成熟和未成熟的籼稻胚，农杆菌含有PHP46911质粒(未成熟胚对照；参见本发明下面紧接的描述)，PHP32269质粒(成熟胚对照；参见本发明下面紧接的描述)，或PHP35648。
PHP46911：RB-CaMV35S::Hyg::Nos项+Ubi-FRT1::Zs-yellowl::PinII-FRT87-LB
PHP32269：RB-Ubi::PMI::PinII+Ubi::mo-PAT～Zs-yellowl::PinII-LB(PMI＝磷酸甘露糖异构酶)
i 未成熟的胚转化
使用国际申请公开号WO/1995/06722以及Hiei和Komari(2006)Plant Cell，Tissue and Organ Culture 85：271-283中公开的方法转化专利籼稻株851G的未成熟胚，其每一篇通过引用整体纳入本发明。结果显示于本发明下面表4中。
表4 感染了含PHP35648农杆菌的亚洲稻籼稻亚种851G未成熟胚中的转化事件。
  胚号   片数目/胚   事件总数目/胚
  1   2   1(100％)
  2   3   1(100％)
  3   6   3(300％)
  4   2   2(200％)
  5   3   3(300％)
  6   3   2(200％)
  7   6   2(200％)
  8   7   2(200％)
  9   11   6(600％)
  10   3   3(300％)
  11   5   3(300％)
  12   3   3(300％)
  总计   54   31(258％)
合计，以含PHP35648质粒的农杆菌感染12个未成熟籼稻胚得到31个转化事件，258％事件/胚的转化频率。这31个事件源自54片胚，对应57％事件/胚片的转化率。另一方面，以含PHP46911的农杆菌感染九个胚仅得到一个单独转化事件和11％的整体转化率。
ii 成熟胚转化
使用下列方法转化籼稻株IRV95和851G的成熟胚。将健康的稻种子去壳并浸泡于滴有Tween20的50ml无菌水中5分钟。以75％的乙醇消毒种子2-3分钟，随后浸泡在50ml滴有Tween20的次氯酸钠中15-20分钟。种子被冲洗，随后在愈伤组织诱导培养基中(4.3g/l MS盐，10ml/l B5维生素(100X)，2mg/l 2，4-D，500mg/l L-脯氨酸，30g/l蔗糖，0.3g/酪蛋白水解物，3g/l脱乙酰吉兰糖胶(使用D-I H2O加到体积后添加并且PH值调整至5.8)于连续光照下32℃12天起始愈伤组织。
通过将愈伤组织与农杆菌温育10-15分钟来使用农杆菌转化建立的愈伤组织。随后倾倒出农杆菌溶液并将12-15个种子置于以0.5ml含有50μM乙酰丁香酮的AAM培养基(50ml/l AA大量元素(20X)，10ml/l AA微量元素(B5微量元素；100X)，10ml/l AA维生素(B5维生素；100X)，5ml/l Fe-EDTA-B5(200X)，1mg/l 2，4-D，100ml/l氨基酸，68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，500mg/l酪蛋白氨基酸，在pH5.2)预先湿润的滤纸盘上。种子和预先湿润的滤纸在黑暗中于含有200μM乙酰丁香酮的ACCM培养基上(4.3g/l MS盐，10ml/l B5维生素(100X)，2mg/l 2，4-D，20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，0.5g/酪蛋白水解物，3g/l脱乙酰吉兰糖胶(使用D-I H2O加到体积并调pH至5.2后添加)21℃培养72小时。愈伤组织被清洗并被转移到含有250mg/l羧苄青霉素的静息ASM培养基中(100ml/l580S主要盐(10X)，10ml/l 580S次要盐(100X)，5ml/l 580S FeEDTA-L(200X)，5ml/l 580S维生素(200X)，100mg/l肌醇，300mg/l酪蛋白水解物，30g/l麦芽糖，2mg/l 2，4-D，500mg/l L-脯氨酸，0.5g/l MES缓冲液，8g/l琼脂(使用D-I H2O加到体积并调pH至5.8后添加)15天。培育15天之后，愈伤组织被转移到含200mg/l羧苄青霉素和2mg/l双丙氨膦选择培养基(100ml/l 580S主要盐(10X)，10ml/l 580S次要盐(100X)，5ml/l 580S FeEDTA-L(200X)，5ml/l 580S维生素(200X)，100mg/l肌醇，300mg/l酪蛋白水解物，30g/l蔗糖，2mg/l 2，4-D，500mg/lL-脯氨酸，0.5g/l MES缓冲液，8g/l琼脂(使用D-I H2O加到体积并调pH至5.8后添加)中，并每隔15天再培育一次直至转化事件出现。
事件随后在滤纸上在28℃干燥48小时以切除发育基因。基于显微镜下可见的Zs-黄色表达来识别干燥的事件。干燥的事件被转移到再生培养基中(100ml/lN6主要盐(10X)，10ml/l FeEDTA(100X)，10ml/l B5次要盐(100X)，10mg/lB5维生素(100X)，1mg/l 1-萘乙酸，3mg/l 6-苯苄基氨基嘌呤，30g/l麦芽糖，0.3g/l脯氨酸，0.3mg/l维生素测定酪蛋白氨基酸，4g/l 1型琼脂糖，30mg/l谷氨酰胺(将调pH至5.8并消毒后添加)并在32℃光照下培养。1-1.5个月后，绿色的芽从愈伤组织中出现并被转移到生根培养基中(100mg/l MS主要盐(10X)，10ml/l FeEDTA(100X)，10ml/l MS次要盐(100X)，10ml/l MS维生素(100X)，2mg/l吲哚-3-丁酸，15g/l蔗糖，1g/l维生素测定酪蛋白氨基酸，10XAA氨基酸，在pH5.8)。再过15-20天后，生根的植物在pH5.2的Y-培养基中稳定化(1.25ml储备液A(9.14g//100ml硝酸铵(HIMEDIARM5657))，1.25ml/l储备液B(4.03g/100ml磷酸氢钠(HIMEDIA 58282))，1.25ml/l储备液C(7.14g/100ml硫酸钾((HIMEDIA 29658-4B))，1.25ml/l储备液D(8.86g/100ml氯化钙(HIMEDIAC5080))，1.25ml/l储备液E(3.234g/100ml硫酸镁(HIMEDIARM683))，1.25ml/l储备液F(15mg/100ml四水合氯化镁(HIMEDIA 10149)，6.74mg/100ml钼酸胺(HIMEDIA 271974)，9.34mg/100ml硼酸(SIGMA 136768)，0.35mg/100ml七水合硫酸锌(HIMEDIARM695)，0.31mg/100ml七水合硫酸铜(HIMEDIA C8027)，0.77mg/100ml六水合氯化铁(SIGMA 236489)，119mg/100ml单水合柠檬酸(HIMEDIA C4540))。
结果显示于本发明下面的表5中。
表5 亚洲稻籼稻亚种851G和IRV95成熟胚得出的愈伤组织中的转化事件
aN/A：未获得数据；愈伤组织正在被干燥，所以未获得再生事件数目或百分数数据。
b日本晴稻(cv.Kitake)
从亚洲稻日本晴，cv.Kitake成熟胚起始愈伤组织，并且使用在T-DNA边界之间含有UBI::ZmBBM::PinII和NOS启动子::ZmWUS2::PinII的农杆菌株LBA4404转化建立的愈伤组织。玉米愈伤组织培养基由N6盐，Eriksson′s维生素，0.5mg/l硫胺素，2mg/l 2，4-D，2.1g/l脯氨酸，30g/l蔗糖，300mg/l酪蛋白水解物，100mg/l肌醇，和3g/l脱乙酰吉兰糖胶组成，pH5.8。农杆菌感染5天之后，在落射荧光显微镜下观察愈伤组织。对于单使用UBI::ZS-绿::PinII转化的愈伤组织，所有可见荧光焦点的为单细胞，有少数可能的2-4细胞焦点。当使用NOS::ZmWUS2::PinII+UBI::ZmBBM::PinII+UBI::ZS-绿::PinII转化愈伤组织并在5天后观察时，存在许多快速生长的，绿色荧光的，多细胞群落。
实施例10 稻，高粱和葡萄BBM基因增加玉米中的转化频率。
进行生长测试以检测来自各个种的BBM基因是否在玉米中刺激生长。对于这些实验，使用含UBI启动子::moPAT～GFP::pinII表达框的第一质粒，加上含35S::GUS::pinII(对照处理)或由泛素启动子驱动的BBM基因的质粒，来轰击基因型PH581的10-13个DAP胚。为将DNA贴附到金颗粒上，在贴附DNA之前将25μl等份的0.6μm颗粒(0.01mg/μl)加入新管中。为贴附未包被的DNA，将颗粒脉冲超声处理，随后加入每种DNA500ng(在5μl水中)，随后混合(使用Pipetteman上下吹打几次)。随后，加入2.5μlTFX-50，并将溶液置于旋转摇床上10分钟。在10,000g离心1分钟后，去除上清液，并将颗粒重悬浮于60μl EtOH中，随后温育10分钟。简单旋转颗粒(即10秒)，去除上清，并加入60μlEtOH。溶液被点到大载体上，而使用DuPont PDS-1000 Helium Gun的标准方法将DNA已经贴附其上的金颗粒输送到10-13个DAP未成熟胚的盾片细胞中。在培养基上4-5周后，检查胚并计数表达GFP的多细胞群落的数目。
a OsBBM
基于稻BBM基因组序列(SEQ ID NO：117)，使用TIGR软件预测内含子剪切，并且得到的cDNA序列(OsBBM(MOD1)显示于SEQ ID NO：118中。使用粒子枪将含有稻BBM(MOD1)基因表达框(UBI启动子::OsBBM(MOD1)::PinII)的质粒与UBI::moPAT～GFP::PinII共转移入13个DAPPH581未成熟胚中。当使用35S::GUS导入UBI启动子::moPAT～GFP::pinII框时，观察到很少的多细胞生长部分(参见表6-10)。当与UBI::moPAT～GFP::PinII一起导入UBI::ZmBBM::PinII时，观察到的生长的多细胞群落总数和有多个生长群落的胚数目证实了观察到生长的刺激。尽管在编码的玉米蛋白和由预测的OsBBM cDNA编码的蛋白之间有许多保守的氨基酸基序，在与PAT～GFP框一起导入稻表达框UBI::OsBBM(MOD 1)::PinII时，相对对照组(35S::GUS)没有观察到生长刺激(参见表6和7)。基于玉米和稻MOD1氨基酸序列的比较，以及对稻基因组序列更仔细的分析，确定TIGR软件不能预测编码第一AP2域中VYL氨基酸序列的9-bp外显子周围的剪切。在重合成的稻cDNA(OsBBM(MOD2))中包括该9-bp外显子；显示于SEQ ID NO：120中，并将该外显子在表达框UBI::OsBBM(MOD2)::PinII中导入时，观察到与玉米BBM基因观察到的生长刺激相似的生长刺激(表7，8，9，和10)。
表6 使用UBI::moPAT～GFP加每种处理中显示的质粒轰击后六周绿色荧光多细胞群落数目。
Figure BPA00001625021800611
表7 每种处理中显示的使用UBI::moPAT～GFP加质粒轰击后五周绿色荧光多细胞群落数目。
Figure BPA00001625021800612
Figure BPA00001625021800621
表8 每种处理中显示的使用UBI::moPAT～GFP加质粒轰击后五周绿色荧光多细胞群落数目。
表9 每种处理中显示的使用UBI::moPAT～GFP加质粒轰击后五周绿色荧光多细胞群落数目。
Figure BPA00001625021800623
表10 每种处理中显示的使用UBI::moPAT～GFP加质粒轰击后五周绿色荧光多细胞群落数目。
Figure BPA00001625021800624
b SbBBM
基于高粱基因组BBM序列(SEQ ID NO：69)，使用TIGR软件预测内含子剪切，而得到的cDNA序列(SbBBM(MOD1)显示于SEQ ID NO：3中。使用粒子枪将含有高粱BBM(MOD1)基因表达框(UBI启动子::SbBBM(MOD1)::PinII)的质粒与UBI::moPAT～GFP::PinII共转移入13个DAP PH581未成熟胚中。当使用35S::GUS导入UBI启动子::moPAT～GFP::pinII框时，观察到很少的多细胞生长部分(参见表10)。不像在这个实验中产生类似正生长刺激的UBI::ZmBBM和UBI::OsBBM(MOD2)，UBI::SbBBM(MOD1)::PinII不能刺激生长。假定在SbBBM(MOD1)合成cDNA中有某些未知的缺陷，高粱基因组BBM被使用PCR克隆并测序以验证保真度。在较早的实验中，玉米基因组BBM(SEQ ID NO：116)被置于UBI启动子之后，并且当与UBI::ZmBBM cDNA构建体比较时，其产生相似程度的生长刺激(表9)。使用基因组高粱克隆[UBI::SbBBM(GEN)]，也观察到相似水平的生长刺激(表11和12)。
表11 每种处理中显示的使用UBI::moPAT～GFP加质粒轰击后五周绿色荧光多细胞群落数目。
Figure BPA00001625021800631
表12 每种处理中显示的使用UBI::moPAT～GFP加质粒轰击后五周绿色荧光多细胞群落数目。
c VvBBM
取得提供玉米良好密码子使用的核苷酸序列，但其表达葡萄BBM氨基酸序列(VvBBM SEQ ID NO：5)。使用粒子枪将含有合成葡萄BBM基因表达框(UBIPRO::VvBBM::PinII)的质粒与UBI::moPAT～GFP::PinII共转移入10个DAPPH581未成熟胚中。当UBI启动子::moPAT～GFP::PinII框被单独引入时，没有观察到(表12)或很少观察到多细胞生长部分(见表9和11)。当UBI::VvBBM::PinII+UBI::moPAT～GFP::PinII被共同导入时，4周后观察到许多RFP+多细胞群落在被轰击的胚表面生长。如具有经由玉米，稻和高粱BBM基因的生长刺激，UBI::VvBBM::PinII框带来的生长刺激由多细胞群落总数增加，以及生长在单一胚上的多细胞群落数增加来显示(参见表9，11和12)。当包含VvBBM序列的构建体，其中编码AP2域中VYL的9-bp序列被去除，被导入玉米时，与用缺少该相同外显子的稻BBM基因所作观察类似，没有观察到生长刺激(表11和12)。
d 玉米ANT基因
下列构建体被用于比较：OLE启动子::ZmBBM::pinII，和OLE启动子::ZmANT::pinII。ZmANT的核苷酸和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：66和67中。使用粒子枪将这些质粒的每一个与UBI::moPAT～GFP::pinII共转移入10个或13个DAP PH581未成熟胚中。当UBI启动子::moPAT～GFP::PinII框被单独引入时，没有观察到(表6)或很少观察到多细胞生长部分(见表7和8)。当OLE::ZmBBM::pinII+UBI::moPAT～GFP::pinII被共同导入时，5周后观察到带有GFP+多细胞群落的胚数大幅增长(即相对于对照处理)，其中的多细胞群落生长在每个被轰击胚表面。此外，支持多个GFP+群落的胚数增长。以OLE::ZmANT::pinII+UBI::moPAT::pinII共轰击的胚表现与对照处理组相同(表6，在每种处理中没有多细胞群落)或相似(图6和7，群落形成仅有2倍增加，而有许多单独的GFP+细胞(表示仅瞬时表达但没有分裂)，以及相对BBM处理组降低的GFP+群落数目)。在用相同处理(没有BBM的对照或ANT，Olc::BBM或Olc::ANT)的第二个实验中，每个处理中轰击的44个胚里，三周后对照和ANT处理没有产生GFP+群落而BBM处理产生了14个群落。
实施例11，玉米BBM和WUS基因的表达改善了高粱中的转化
根癌农杆菌LBA4404和以pSB 1及pSB 11构建的超级双元载体(Komari等(1996)Plant J 10：165-174；Thompson等(1987)EMBO J 6：2519-2523)被用于高粱的转化(Zhao(2006)在″Agrobacterium Protocols，″vol.1，Kan Wang，ed.Hamana Press，Totowa，NJ；美国专利号6,369,298；和国际申请公开号WO98/49332)。超级双元载体包含选择标记物基因，BAR(Chalfie等(1994)Science263：802-805)，以及可视标记物基因，如红色荧光蛋白(RFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，或内含子-GFP(Jefferson等(1986)Proc Nat！Acad Sci USA83：8447-8451)。
最小AB培养基包括50ml/l储备液A，50ml/l储备液B，5g/l蔗糖，9g/l植物琼脂。对于用于该方法的农杆菌菌株，在高压灭菌后加入50mg/l的壮观霉素。储备液A包含60g/l K2HP04和20g/l NaH2P04，pH7.0。储备液B是20g/l NH4Cl，6g/l MgSO4 7H2O，3g/l KCl，0.2g/lCaCl2，和0.5g/l FeSO4 H2O。YP培养基包含5g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，5g/lNaCl，和15g/l细菌琼脂。对于用于该方法的农杆菌菌株，在高压灭菌后加入50mg/l的壮观霉素。
PHI-I培养基包含4.3g/l MS盐(GIBCO BRL目录号11117-874)，0.5mg/l烟酸，0.5mg/l HCl吡哆醇，1mg/l HCl硫胺素，0.1g/l肌醇，1g/l维生素测定酪蛋白氨基酸，1.5mg/l 2，4-D，68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，pH5.2。使用之前加入100μM乙酰丁香酮。
PHI-T培养基包含蔗糖降低到20g/l，而葡萄糖降低到10g/l，2，4-D增加到2mg/l的PHI，并加入0.5g/l MES缓冲液，0.7g/l L-脯氨酸，10mg/l抗坏血酸，100μM乙酰丁香酮和8g/l琼脂，pH5.8。
PHI-U培养基包含没有葡萄糖和乙酰丁香酮的PHI-T，并加入1.5mg/l 2，4-D，100mg/l羧苄青霉素，和5mg/lPPT(草铵膦-NH4)。
PHI-RF包含4.3g/l MS盐(GIBCO BRL 11117-874)，0.5mg/l烟酸，0.1mg/lHCl硫胺素，0.5mg/l HCl吡哆醇，2.0mg/l甘氨酸，0.1g/l肌醇，0.49μM硫酸铜，0.5mg/l玉米素(Sigma Z-0164)，1mg/l IAA，26.4μg/L ABA，0.1mg/L赛苯隆，60g/l蔗糖，3mg/l双丙氨膦，100mg/L羧苄青霉素，和8g/l琼脂，pH5.6。
PHI-Z培养基包含2.15g/l MS盐，2.5ml/l MS维生素混合物，20g/l蔗糖，和3g/l脱乙酰吉兰糖胶，pH5.6。
未成熟胚感染悬液由PHI-I培养基中的100μM乙酰丁香酮组成(预热至室温)。以消毒的菌环将细菌从工作平板上刮下，并将其置于有100μM乙酰丁香酮的PHI-I中。剧烈漩涡悬液以打破团块并形成视觉检查确定的均一悬液。取1ml农杆菌悬液以测定550nm光密度。以PHI-I加100μM乙酰丁香酮稀释悬液至109cfu/ml(OD在0.7)。
在温室，生长室，或田间中培育高粱植物。健康的高粱植物对于成功的转化总是很重要。依据生长条件授粉后9-13天收获未成熟穗。用于转化的未成熟合子胚的大小范围从0.8到2.5mm长。未成熟核被以真空从穗中移出并以50％漂白液和0.1％Tween-20消毒30分钟，随后以无菌水冲洗核3次。在分离胚之前，核被保存在无菌水中。胚被从每个消毒的高粱核上无菌切下并被置于2-ml微管中，管中包含2ml带100μM乙酰丁香酮的PHI-I。通常，每个管中约放置100个胚。
使用1ml微量移液器将PHI-I液体培养基从包含胚的管中移出并替代以1ml农杆菌悬液。管被轻轻倒置几次以混合好，并在室温下温浴5分钟。使用1ml微量移液器将农杆菌悬液移出管。使用无菌抹刀将胚从管上刮下。未成熟胚被转移到100x15mm皮氏培养皿中的PHI-T培养基平板上。胚取向胚轴向下在培养基表面。这些胚在黑暗中21-25℃培育3天。胚被以相同的取向转移到减去PPT的PHI-U中，并在黑暗中28℃培育4天。
胚被转移到PHI-U培养基中并在黑暗中28℃培育2-3周，并每2到3周再培养约10-20周以获得足够的再生成植物的愈伤组织。
这些愈伤组织被转移到PHI-RF培养基中并在黑暗中28℃培育约2-3周以发育芽。当芽形成时，这些培养物被移到16小时光(270μEm-2sec-1)和8小时黑暗，25℃条件下的光照培养室中。芽(约3-5cm高)被转移到含有PHI-Z培养基的塑料盒中(10x9x10cm)。这些芽在相同的光照和温度条件下被培养3-5天。每个盒含有源自单一胚的芽。当植株达到8-10cm高并有健康的根时，这些植株被转移到温室中有Universal Mix(trong-Lite，Seneca，IL61360)的盆中。
从发育的高粱种子收获胚并使用提供PHP32371 T-DNA的农杆菌转化(参见实施例4)。作为对照处理，使用RB-Ubi::moPAT+Ubi:CFP-LB转化胚。愈伤组织在3mg/l双丙氨膦上选择，并检测其荧光以帮助识别转基因部分。使用Ubi:moPAT+Ubi:CFP的高粱转化频率平均为0.5％。通过比较，在六个实验中，以PHP32371转化了总数393个胚，产生了18.3％的平均转化率(参见表13)。第一个实验的愈伤组织(起始总数140个胚中有30个事件)被用于测试Rab17启动子控制的干燥诱导切除以及随后的植物再生。21个事件被在干滤纸上干燥三天并随后通过标准再生方法进行。21个事件中的15个产生了总数81株植物，其中许多个体事件再生了多株植物。这些之中，60％包含整合的DNA的单拷贝，而在单拷贝事件中，91％产生了表明细胞增殖因子基因完全切除的PCR结果。从切除的事件中，容易的再生出缺少FLP和WUS2的正常表型植物。
表13 农杆菌介导以PHP32371转化后的转化效率
  实验号   胚数目   转化事件数目   转化频率(％)
  1   140   30   21.4
  2   40   3   7.5
  3   60   8   13.3
  4   40   7   17.5
  5   61   12   19.7
  6   52   12   23.1
  平均   18.3
实施例12 玉米BBM和WUS基因的表达改善了甘蔗中的转化。
有ZmBBM/ZmWUS2基因框的发育基因双元载体与含有moPAT加上DsRED或YEP，而没有ZmBBM/ZmWUS2基因框的标准载体比较，比较使用两种农杆菌株AGL1和LBA4404时在CP89-2376和CP01-1372甘蔗品种中的转化频率。发育基因双元载体含有Ubi::LoxP::CFP+Rab1 7启动子--attB1::Cre-attB2::PinII+Nos::ZmWUS2::PinII+Ubi::ZmBBM::PinII-LoxP::YFP+Ubi::MOPAT::PinII。含有CFP::Cre::WUS::BBM的Lox框可以被Rab17启动子控制的Cre重组酶切除。CP89-2376和CP01-1372品种的愈伤组织被诱导并保存在DBC3培养基上。使用10mM MgSO4加100μM乙酰丁香酮中含发育基因双元载体的农杆菌感染组织，随后将其以液体DBC3(M5G)培养基加100μM乙酰丁香酮在皮氏培养皿中的滤纸上21℃黑暗中共培养。共培养3天后，组织被转移到对AGL1组含100mg/l的头孢噻肟和150mg/l特美汀的DBC3中，对LBA4404组含100mg/l羧苄青霉素的DBC3中，并在26℃(±1℃)黑暗中或暗光下培育3-7天。之后，组织被转移到加上3或5mg/L双丙氨膦的，与之前步骤相同的培养基中。起始该实验两月后，通过将显示CFP表达的组织数除以农杆菌感染的外植体数来计算转化频率。表14显示AGL1在CP89-2376和CP01-1372中甚至比LBA4404转化上更有效。转化效率上也有基因型的差别；使用两株农杆菌株中任一株，CP89-2376都具有比CP01-1372高得多的转化频率。
在使用5个不同品种(CP96-1252，CP01-1372，CP89-2376，CPCL97-2730和HoCP85-845)的另一组实验中，包含发育基因载体的AGL1也被用于测试甘蔗种质筛选。测试的所有5个品种的愈伤组织被诱导并保存在DBC3培养基上，并使用含发育基因双元载体的AGL1感染的组织。使用发育基因显著增加了测试的所有5个品种中的转化频率。在最适合该方法处理的品种CP89-2376中，使用标准双元载体的转化频率平均为116.7％(56/48)(表14)。相反，使用发育基因双元载体，该品种5个实验中的平均转化频率为＞2,512.5％(＞1,005事件/40个感染的组织)。剩余4个品种CP96-1252，CP01-1372，CPCL97-2730和HoCP85-845中也得到了相似结果；在这4个品种中转化频率范围从62.5％到187.5％，而使用没有BBM/WUS基因框的标准载体在这些品种中没有得到转基因事件。
表14 使用发育基因ZmBBM和ZmWUS2在甘蔗中的转化频率。
Figure BPA00001625021800681
每种转化处理有8个0.4-0.5cm大小的愈伤组织片
DGa：有BBM/WUS基因框的发育基因载体
Stdb：没有BBM/WUS基因框的标准载体
n.t.e：未测试
将转基因愈伤组织在干滤纸上干燥3天以诱导含有CFP::Cre::WUS::BBM的Lox框的切除，切除由Rab17启动子驱动的Cre重组酶进行。通过观察干燥的转基因愈伤组织事件上的YGP表达来观察作为切除结果形成的UBI:loxP:YFP连接点的存在，以监测切除。在87个转基因时间的83个中(95.4％)发生了Cre切除(表15)。来自这些转基因事件的植物切除后在加1mg/l双丙氨膦和抗生素的MSB中再生。
表15 转基因甘蔗事件中干燥诱导的BBM/WUS基因框切除效率
Figure BPA00001625021800691
DGa：有BBM/WUS基因框的发育基因载体
实施例13 单独转化的BBM和WUS2基因的互补
Nos::ZmWUS2::PinII和Rab17-attB1::CRE::PinII被整合入自交系玉米植物的基因组。与启动子可操作连接的LoxP-UBI::BBM::PinII-LoxP+性状基因被作为单独T-DNA重转入自交系。BBM和WUS2基因会互补，在两者都存在的细胞中刺激快速生长。随后切除BBM并再生出正常可育植物。之后，WUS2/CRE基因座被与基因组分隔开。
实施例14 成熟干玉米种子的转化
细胞增殖因子可以被用于在顽拗植物和/或靶组织，如成熟种子中增加转化和/或恢复频率。
构建了包含可切除构建体的T-DNA，可切除构建体包含玉米BBM和玉米WUS基因。
PHP38333：RB-Ubi-LoxP::CFP::PinII-attB4+Rab17启动子-attb1::Cre-attB2::PinII+Nos::ZmWUS2::PinII+Ubi::ZmBBM::PinII-LoxP::YFP::PinII+Ubi::moPAT::PinII-LB。
作为对照处理，使用PHP32269：RBUbi::moPAT-FP::PinII-LB转化胚。
带有载体PHP38333或对照载体的胸苷营养缺陷型突变体农杆菌菌株LBA4404甘油储备液使用之前被储存在-80℃下。将接种环浸于甘油储备液中并在100x15皮氏培养皿中有50mg/l胸苷的12V固体培养基上(对PHP38333)或有50mg/l壮观霉素的12S固体培养基上(对于对照质粒)划线来制造主平板。主平板在28℃黑暗中培育2-3天(倒置)以产生单菌落。模板被储存在4℃下长至4周并被用于起始转化用的新鲜培养物。多个菌落被从模板上挑取出并在有50mg/l胸苷的810F固体培养基上划线，并在28℃黑暗中培育一天而新鲜的农杆菌被用于转化。
为制备农杆菌悬液，20ml带50mg/l胸苷的700液体培养基被加入50ml扣帽管中。加入乙酰丁香酮(AS)储备液以达到200μM终浓度并加入Silwet L-77储备液以达到0.04％的终浓度。从1天培养平板中收集农杆菌并将其悬浮于700液体培养基中。管被漩涡直至农杆菌培养物团块被完全打散并均匀分布于溶液中。将1ml悬液转移到分光光度管中，并通过添加更多的农杆菌或更多的相同悬液培养基将悬液550nm处的OD调整至0.7。
玉米自交系PHN46被用作转化测试的起始基因型。干种子被置于有盖玻璃罐中，在80％乙醇溶液中搅拌5分钟。倾倒掉乙醇溶液并加入有几滴表面活性剂Tween-20的50％漂白剂溶液，在漂白剂溶液中的种子被搅拌30分钟并在无菌通风罩中以无菌水清洗3次。表面消毒的种子在室温下被浸于无菌水中约24小时，其足够引起萌发。24小时后，软化的种子被以50％漂白剂溶液再次消毒5分钟，随后在无菌通风罩中以无菌水清洗3次。
从软化并消毒的核上切下成熟的胚。使用10号手术刀在解剖镜下将每个成熟的胚人工切成3-4个薄片。每个外植体包含暴露的叶原基，胚轴和根原基区域。胚片上的这些区域是农杆菌介导的转化期间T-DNA输送的靶区域并包含培养响应的细胞。切下的外植体被转移到含有4ml 700液体培养基的6孔培养板上。每个孔放置约45个外植体以作农杆菌感染。
6孔板中的液体培养基被从外植体上移除并替代以4ml制备的农杆菌悬液。6孔板被转移到透明聚碳酸酯干燥器中。干燥器被盖上并被置于以100RPM速度旋转并与内部真空系统相连的摇床平台上30分钟。感染之后，从孔中抽出农杆菌悬液并将外植体转移到有50mg/l胸苷的固体710I共培养培养基上。固体培养基上感染的胚外植体在21℃黑暗中被培育3天。记录感染的外植体数目以之后计算转化效率。
为评价T-DNA传送效率，使用没有编码细胞增殖因子基因的对照载体以及有编码细胞增殖因子基因的载体来感染胚外植体。在3天共培养后，所有片被转移到605J培养基上做连续培养。农杆菌感染约5天后评价T-DNA输送。颜色标记物YFP(对照载体)或CFP(测试载体PHP38333)的瞬时表达是T-DNA输送效率的可靠指标。一般情况下，30％-50％感染的外植体显示T-DNA在正确的靶组织或细胞中输送。使用优化的感染培养基和方法，得到70％-80％到靶区域的输送效率。感染的外植体每3周被再培养到新鲜培养基中。培养6周之后，从已经被含编码细胞增殖因子基因的载体PHP38333感染的那些外植体中，识别出健康的，活跃生长的，胚生成型1愈伤组织。这些生长的愈伤组织代表被颜色标记物(CFP)表达确认的转化的事件。未转化的组织没有显示生长或显示非常有限的生长。挑取胚生成型1愈伤组织并将其转移到新鲜培养基上以在植物再生之前让愈伤组织增殖(10-12周)。按每感染的外植体总数中恢复的事件数计算，愈伤组织水平上PHP38333的转化效率范围从12％到20％(表16)。基于感染的细胞中瞬时YFP表达，以对照载体PHP32269感染的胚外植体也显示良好的T-DNA输送。然而，这些细胞不显示显著的增殖，而且在连续培养中没有形成健康的愈伤组织。
表16 PHN46胚片中PHP38333的转化频率。
  实验号   感染的片数   GFP(+)事件数目   转化频率(％)
  1   137   23   16.8％
  2   134   19   14.2％
  3   149   20   13.4％
  4   140   25   17.9％
  5   148   18   12.2％
  6   137   26   19.0％
  7   129   27   20.9％
  8   136   20   14.7％
  9   137   21   15.3％
  10   147   24   16.3％
  总计   1393   223   16.0％
以下面两种干燥方法中的一种处理转化的愈伤组织以在植物再生之前诱导编码细胞增殖因子基因的切除。
1)通过自然空气交换干燥：转化的愈伤组织被转移到空的60mmx 25mm皮氏培养皿中，培养皿含有高压蒸汽灭菌的玻璃滤纸片并以盖盖住但不密封。有愈伤组织的皮氏培养皿被置于有松散盖的培养盒中。盒子被保持在黑暗中28℃3天。
2)在含有饱和盐溶液的室中干燥：转化的愈伤组织被转移到空的60mmx25mm皮氏培养皿中，培养皿含有高压蒸汽灭菌的玻璃滤纸片并以盖盖住但不密封。有愈伤组织的皮氏培养皿被置于有紧密密封盖的容器中。含有饱和(NH4)2SO4盐溶液的无盖玻璃罐被置于该容器中。容器被保持在黑暗中28℃3天(期间容器内空气中的水分被饱和盐溶液吸收，愈伤组织逐渐失水并经历干燥胁迫)。
在三天干燥处理之后，愈伤组织被转移到黑暗中的289L再生培养基中2-3周。当约1-2cm长的芽形成时，带芽的愈伤组织被转移到光照培养室里无激素272V培养基中以进一步使芽和根发育。当植株已经形成了发育良好的芽和根时，评价植物再生效率。植物再生效率(用于植物再生的愈伤组织事件总数中产生植物的愈伤组织数)在10个初始试验中从45％-75％变化。在该阶段，从来自每个愈伤组织事件的植株收集叶样品以做分子分析。进行详细的PCR分析以确定转基因拷贝数，以及确认编码细胞增殖因子的基因被切除并且不存在于再生的转基因植物中。
基于来自162个事件的316个T0植物的分子分析，约60％的转基因植物含有转基因的单拷贝。这些单拷贝转基因植物在干燥处理诱导下显示出非常有效的编码细胞增殖因子基因的切除(参见表17中的结果)。一般情况下，编码细胞增殖因子基因完全切除的植物在管中以及之后在温室中的发育阶段也显示正常的表型。相反，其中切除没有发生(或切除不完全)的T0植物显示不正常的表型，如加厚的根。
基于PCR分析结果，可以去除嵌合或不完全切除的T0植物，而仅将完全切除(没有编码细胞增殖因子基因)的事件送入温室。
表17 T0植物编码细胞增殖因子基因切除的分析
  事件/T0植物数目   单拷贝   完全切除
  162(事件)   103(63.6％)   94(91.3％)
  316(植物)   189(59.8％)   173(91.5％)
实施例15 叶组织的转化
a 农杆菌和玉米叶外植体的制备
如实施例14所描述的制备农杆菌悬液。先锋玉米自交系PHN46，PHR03和PHEJW被用作转化测试的初始基因型。干种子被如上面描述的消毒并吸水过夜。
消毒的种子被置于272V固体培养基中以直接萌发。可选的，从软化并消毒的种子上切下成熟胚并将其置于272V固体培养基中以更快的萌发。有种子或分离胚的平板被置于培养盒中并在28℃黑暗中培养3-7天。在无菌条件下切下苗第一叶基节上面约2-3cm长的芽段。去除胚鞘并首先纵向切叶片段，随后将其交叉切成更小的段(0.5到2mm)。可选的，使用手术刀将上述苗第一叶基节上面2-3cm长的段简单切块产生小的叶片段。小的叶片段被转移入含有4ml 700液体培养基的6孔培养板。
有叶片的6孔板中的液体培养基被抽出并以4ml制备的农杆菌悬液替代。6孔板被转移到透明聚碳酸酯干燥器中。干燥器被盖上并被置于以100RPM速度旋转并与内部真空系统相连的摇床平台上15分钟。感染之后，从孔中抽出农杆菌悬液并将叶组织转移到有50mg/l胸苷的固体710I共培养培养基上，并在21℃黑暗中被培育3天。
在3天共培养后，所有叶组织被转移到13152C培养基上。农杆菌感染约5天后评价T-DNA输送。颜色标记物YFP(对照载体)或CFP(测试载体PHP38333)的瞬时表达是T-DNA输送效率的可靠指标。在所有三个测试的自交系中，10％-25％感染的叶片段显示多个荧光细胞沿切割边缘或叶片段的表面。感染的叶组织每2周被亚培养。培养6-8周后，可以识别稳定转化的愈伤组织事件。这些稳定转化愈伤组织的转基因性质由荧光基因的表达来表示。有显著增殖的愈伤组织事件被施以干燥处理，并转移到再生培养基上2-4周。从两个测试的玉米自交系，PNH46和PHR03中再生出稳定的转基因植株。多个实验中的结果清楚的表明可以从苗组织的转化中产生出稳定的转基因植物，其中使用表达编码细胞增殖因子基因的载体进行转化。基于瞬时YFP表达，以对照载体感染的叶组织也显示良好的T-DNA输送，但感染的细胞不显示任何随后的增殖而且从该处理中没有识别出稳定的愈伤组织事件。
实施例16 使用细胞增殖因子来增强叶绿体转化
对于烟草和许多其他种类，叶是叶绿体转化的优选靶。细胞增殖因子被用于引发来自玉米和其他种类的叶的组织培养响应。为提高叶绿体转化，通过标准核转化方法将诱导型启动子控制下的细胞增殖因子基因导入目的种类。含有转基因的事件的特征在于诱导的细胞增殖因子基因的表达。例如，将来自转化植物的玉米叶置于含有适合浓度多西环素的培养基上，其中转化是以四环素阻遏系统控制下的细胞增殖因子基因进行。多西环素随后激活细胞增殖因子基因并由此诱导胚生成性组织培养响应。叶被保持在该培养基上7-21天，在此期间会发生细胞分裂和胚生成性愈伤组织起始。在导入细胞增殖基因之前，导入期间或刚导入后，使用带有aadA选择标记基因和性状基因的叶绿体转化载体轰击叶。使用叶绿体转化载体轰击1到7天后，组织被置于皮氏培养皿中，培养皿含补充了壮观霉素的琼脂糖固化培养基。随后板在28℃光照下培育。每两周将组织转移到新鲜培养基中。培育约8周后，观察到绿色愈伤组织。该组织被在13152培养基中进一步增殖(4.3g/l MS盐，0.25g/l肌醇，1.0g/l酪蛋白水解物，1mg/l硫胺素，1mg/l 2，4-D，30g/l麦芽糖，0.69g/l脯氨酸，1.2mg/l硫酸铜，和3.5g/l植物凝胶)并使用包括PCR和Southern分析在内的适合方法分析组织中转基因的存在。
在可选的方法中，包含四环素诱导的BBM和WUS基因的表达框被与带有aadA选择基因的叶绿体转化载体共轰击。叶外植体或者建立的绿色组织愈伤组织被用作轰击的靶组织。粒子轰击后，加入浓度0.5到2.0mg/l的四环素或多西环素到培养基中(13152)。已经接受到DNA的细胞中BBM和WUS的表达在四环素(或多西环素)存在于培养基期间刺激愈伤组织生长率。受BBM&WUS刺激加速的生长会导致同种转基因事件的恢复改善，而可以通过将T0植物与野生型植物异交并在T1代中选择没有BBM/WUS的植物来去除核整合的BBM/WUS基因。
在输送BBM和WUS的粒子枪方法的另一个变化中，UBI::BBM::PinII和nos::WUS2::pinII被与叶绿体转化载体共转移。
在另一个可选的方法中，通过农杆菌溶液的真空渗入将细胞增殖因子基因输送入叶组织。细胞增殖因子基因在强组成型启动子如ubi或act或病毒启动子如35S(Gardner等(1981)Nucl Acids Res 9：2871-2888)，MMV(Dey和Maiti(1999)Plant Mol Biol 40：771-782)，或BSV(Shenk等(2001)Plant Mol Biol47：399-412)的控制下。细胞增殖因子基因被装载在方便从细菌到植物细胞转移的双元载体上。在真空渗入之后，组织被培育适合的时间以让叶组织中的细胞增殖因子基因表达。通过农杆菌输送的细胞增殖因子基因的瞬时表达预期能对细胞分裂和组织培养响应提供强推动。在以农杆菌真空渗入之后，所述组织以携带aadA选择标记基因的叶绿体转化载体轰击。所述组织随后被转移到含壮观霉素的培养基中并选择转基因事件。预期农杆菌输送的细胞增殖因子基因不会被整合到大多数恢复事件的核基因组中。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示了本申请所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用以相同的程度纳入本发明，如同每个单独的出版物或专利申请被专门的和单独的表示通过引用纳入。
这些发明所属领域技术人员在前面的描述和相关附图中展示的教导受益之下，会想到本文显示的发明的许多修改和其他实施方式。因此应当理解本发明不限于公开的特定实施方式，修改和其他实施方式也应包括在所附权利要求的范围中。尽管本发明使用了特定术语，其仅是以通用的和描述性的意思使用，并非为了限制的目的。
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Claims (176)

1.启动子构建体，其包含启动子，所述启动子后随有第一附着B(attB)位点，其中启动子选自：
a)包含核苷酸序列的启动子，该核苷酸序列具有SEQ ID NO：29中所显示序列；
b)包含核苷酸序列的启动子，该核苷酸序列与SEQ ID NO：29中所显示序列具有至少70％的序列同一性；和
c)包含SEQ ID NO：29中所显示序列的至少50个连续核苷酸的启动子；以及
其中所述第一attB位点具有SEQ ID NO：31中所显示的核苷酸序列。
2.权利要求1的启动子构建体，其中所述第一attB位点调节所述启动子的活性。
3.权利要求1或2的启动子构建体，其中所述启动子包含SEQ ID NO：29的291-430核苷酸中所显示的序列，或与SEQ ID NO：29的291-430核苷酸中所显示的序列具有至少70％序列同一性的序列。
4.权利要求1-3任意一项的启动子构建体，其中所述启动子构建体进一步包含将所述启动子与所述第一attB位点分开的连接序列。
5.权利要求4的启动子构建体，其中将所述启动子与所述第一attB位点分开的所述连接序列约133个核苷酸长。
6.权利要求4或5的启动子构建体，其中将所述启动子与所述第一attB位点分开的所述连接序列包含玉米rab175’未翻译区域(5’-UTR)的核苷酸。
7.权利要求6的启动子构建体，其中将所述启动子与所述第一attB位点分开的所述连接序列包含SEQ ID NO：35中所显示的核苷酸序列。
8.权利要求4的启动子构建体，其中将所述启动子与所述第一attB位点分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：36中所显示的序列，或者与SEQ ID NO：36中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
9.表达框，其包含与目的多核苷酸可操作相连的权利要求1-8任意一项中的启动子构建体。
10.权利要求9的表达框，其中所述表达框进一步包括将所述第一attB位点与所述目的多核苷酸分开的连接序列。
11.权利要求10的表达框，其中将所述第一attB位点与所述目的多核苷酸分开的所述连接序列具有约25个或约61个核苷酸的长度。
12.权利要求10的表达框，其中将所述第一attB位点与所述目的多核苷酸分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：37或123中所显示的序列，或者与SEQID NO：37或123中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
13.权利要求9-12任意一项的表达框，进一步包含第二位点特异性附着B(attB)位点，其中所述第一和第二attB位点位于目的多核苷酸两侧。
14.权利要求13的表达框，其中所述第一和第二attB位点不相同。
15.权利要求13或14的表达框，其中所述第二attB位点具有选自SEQ IDNO：32、33和34的核苷酸序列。
16.权利要求13-15任意一项的表达框，进一步包含将所述目的多核苷酸与所述第二attB位点分开的连接序列。
17.权利要求16的表达框，其中将所述目的多核苷酸与所述第二attB位点分开的所述连接序列为约8个或约16个核苷酸长。
18.权利要求16的表达框，其中将所述目的多核苷酸与所述第二attB位点分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：39或124中所显示的序列，或者与SEQID NO：39或124中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
19.权利要求13-18任意一项的表达框，其中所述表达框进一步包含所述第二attB位点之后的终止序列。
20.权利要求19的表达框，其中所述终止序列包括来自马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因的终止区域。
21.权利要求19的表达框，其中所述终止序列具有SEQ ID NO：38中所显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：38有至少70％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列终止在植物细胞中的转录。
22.权利要求19-21任意一项的表达框，进一步包括将所述第二attB位点与所述终止序列分开的连接序列。
23.权利要求22的表达框，其中将所述第二attB位点与所述终止序列分开的所述连接序列约14个核苷酸长。
24.权利要求22的表达框，其中将所述第二attB位点与所述终止序列分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：40中所显示的序列，或者与SEQ ID NO：40中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
25.权利要求9-24任意一项的表达框，其中所述目的多核苷酸为编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。
26.权利要求25的表达框，其中所述位点特异性重组酶选自FLP，Cre，SSV1，λInt，phi C31 Int，HK022，R，Gin，Tn1721，CinH，ParA，Tn5053，Bxb1，TP907-1，和U153。
27.权利要求25的表达框，其中编码所述位点特异性重组酶的所述核苷酸序列选自由：
a)SEQ ID NO：41或43中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：41或43有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：42或44中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：42或44有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，
组成的列表。
28.表达框，其具有SEQ ID NO：45中显示的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO：45有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
29.载体，其包含权利要求1-8任意一项的启动子构建体或者权利要求9-28任意一项的表达框。
30.权利要求29的载体，进一步包含编码babyboom多肽的多核苷酸。
31.权利要求30的载体，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2域以及下列氨基酸序列中至少一个：
a)SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列。
32.权利要求30的载体，其中编码所述babyboom多肽的所述多核苷酸具有选自：
a)SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
的核苷酸序列。
33.权利要求30-32任意一项的载体，其中编码所述babyboom多肽的所述核苷酸序列与在植物中活性的第二启动子可操作连接。
34.权利要求33的载体，其中所述第二启动子是玉米泛素启动子或玉米油脂蛋白启动子。
35.权利要求34的载体，其中所述玉米油脂蛋白启动子具有SEQ ID NO：65中显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：65有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
36.权利要求30-35任意一项的载体，其中所述载体进一步包括编码Wuschel多肽的多核苷酸。
37.权利要求36的载体，其中编码所述Wuschel多肽的所述多核苷酸具有选自：
a)SEQ ID NO：61，63，114，或105中显示的核苷酸序列；和
b)与SEQ ID NO：61，63，114，或105有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：62，64，115，或106中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：62，64，115，或106有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
的核苷酸序列。
38.权利要求36或37的载体，其中编码所述Wuschel多肽的所述多核苷酸与玉米In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子可操作地连接。
39.宿主细胞，其包含权利要求1-8任意一项的启动子构建体或者权利要求9-28任意一项的表达框，或权利要求29-38任意一项的载体。
40.植物细胞，其包含权利要求1-8任意一项的启动子构建体，权利要求9-28任意一项的表达框，或权利要求29-38任意一项的载体。
41.包含权利要求的40植物细胞的转基因的植物种子，其中所述种子包含所述启动子构建体、所述表达框或所述载体。
42.植物细胞，其包含表达框，该表达框含有与编码位点特异性重组酶的多核苷酸可操作相连的权利要求1-8任意一项的启动子构建体，其中所述植物细胞进一步包含两侧有第一和第二重组位点的目的多核苷酸，其中所述第一和第二重组位点相对彼此发生重组并直接重复，而其中所述位点特异性重组酶可以在所述第一和所述第二重组位点识别并实施重组，由此切除所述目的多核苷酸。
43.权利要求42的植物细胞，其中所述表达框进一步包含将所述第一attB位点与编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸分开的连接序列。
44.权利要求43的植物细胞，其中将所述第一attB位点与编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸分开的所述连接序列具有约25个或约61个核苷酸的长度。
45.权利要求43的植物细胞，其中将所述第一attB位点与编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：37或123中显示的序列，或者与SEQ ID NO：37或123中显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
46.权利要求42-45任意一项的植物细胞，其中所述表达框进一步包含第二位点特异性附着B(attB)位点，其中所述第一和所述第二attB位点位于编码所述位点特异性重组酶的多核苷酸两侧。
47.权利要求46的植物细胞，其中所述第一和所述第二attB位点不相同。
48.权利要求47的植物细胞，其中所述第二attB位点具有选自SEQ ID NO：32、33和34的核苷酸序列。
49.权利要求46-48任意一项的植物细胞，其中所述表达框进一步包含将编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸与所述第二attB位点分开的连接序列。
50.权利要求49的植物细胞，其中将编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸与所述第二attB位点分开的所述连接序列为约8个或约16个核苷酸长。
51.权利要求49的植物细胞，其中将编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸与所述第二attB位点分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：39或124中所显示的序列，或者与SEQ ID NO：39或124中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
52.权利要求46-51任意一项的植物细胞，其中所述表达框进一步包含所述第二attB位点之后的终止序列。
53.权利要求52的植物细胞，其中所述终止序列包括来自马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因的终止区域。
54.权利要求52的植物细胞，其中所述终止序列具有SEQ ID NO：38中所显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：38有至少70％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列终止在植物细胞中的转录。
55.权利要求52-54任意一项的植物细胞，其中所述表达框进一步包括将所述第二attB位点与所述终止序列分开的连接序列。
56.权利要求55的植物细胞，其中将所述第二attB位点与所述终止序列分开的所述连接序列约14个核苷酸长。
57.权利要求55的植物细胞，其中将所述第二attB位点与所述终止序列分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：40中所显示的序列，或者与SEQ ID NO：40中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
58.权利要求42-57任意一项的植物细胞，其中所述位点特异性重组酶选自FLP，Cre，SSV1，λInt，phi C31Int，HK022，R，Gin，Tn1721，CinH，ParA，Tn5053，Bxb1，TP907-1，和U153。
59.权利要求58的植物细胞，其中编码所述位点特异性重组酶的所述核苷酸序列选自由：
a)SEQ ID NO：41或43中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：41或43有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：42或44中显示氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：42或44有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，组成的列表。
60.权利要求42-59任意一项的植物细胞，其中所述第一和所述第二重组位点是FRT重组位点或lox重组位点。
61.权利要求42-60任意一项的植物细胞，其中所述目的多核苷酸是编码细胞增殖因子的多核苷酸。
62.权利要求61的植物细胞，其中所述细胞增殖因子包括babyboom多肽。
63.权利要求62的植物细胞，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2域以及下列氨基酸序列中至少一个：
a)SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列。
64.权利要求62的植物细胞，其中编码所述babyboom多肽的所述多核苷酸具有选自：
a)SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
的核苷酸序列。
65.权利要求61-64任意一项的植物细胞，其中编码所述细胞增殖因子的所述多核苷酸与在所述植物细胞中活性的启动子可操作连接。
66.权利要求65的植物细胞，其中所述启动子是玉米泛素启动子或玉米油脂蛋白启动子。
67.权利要求66的植物细胞，其中其中所述玉米油脂蛋白启动子具有SEQID NO：65中显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：65有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
68.权利要求42-67任意一项的植物细胞，其中所述目的多核苷酸被稳定的整合进所述植物细胞基因组中。
69.权利要求42-68任意一项的植物细胞，其中所述植物是双子叶植物。
70.权利要求42-68任意一项的植物细胞，其中所述植物是单子叶植物。
71.权利要求70的植物细胞，其中所述单子叶植物选自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，粟，燕麦，甘蔗，草坪草，和风倾草。
72.来自包含权利要求的42-71任意一项所述植物细胞的植物的转基因种子，其中所述种子包含所述表达框和所述目的多核苷酸。
73.在植物细胞中表达目的多核苷酸的方法，所述方法包括将表达框或载体导入所述植物细胞，其中所述表达框是根据权利要求8-29任意一项的表达框，或其中所述载体是权利要求29-38任意一项的载体。
74.从植物细胞中的靶位点切除目的多核苷酸的方法，其中所述靶位点包含第一位点特异性重组位点、所述目的多核苷酸、和第二位点特异性重组位点，其中所述第一和所述第二位点特异性重组位点相对彼此发生重组并直接重复，所述方法包括：
a)将表达框导入所述植物细胞，表达框含有与编码位点特异性重组酶的多核苷酸可操作相连的第一启动子，其中所述第一启动子包括权利要求1-7任意一项的启动子构建体；和
b)表达编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸，其中所述位点特异性重组酶在所述第一和所述第二位点特异性重组位点识别并实施重组，由此切除所述目的多核苷酸。
75.权利要求74的方法，其中所述表达框进一步包含将所述第一attB位点与编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸分开的连接序列。
76.权利要求75的方法，其中将所述第一attB位点与编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸分开的所述连接序列具有约25个或约61个核苷酸的长度。
77.权利要求75的方法，其中将所述第一attB位点与编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：37或123中显示的序列，或者与SEQ ID NO：37或123中显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
78.权利要求74-77任意一项的方法，其中所述表达框进一步包含第二位点特异性附着B(attB)位点，其中所述第一和所述第二attB位点位于编码所述位点特异性重组酶的多核苷酸两侧。
79.权利要求78的方法，其中所述第一和所述第二attB位点不相同。
80.权利要求78或79的方法，其中所述第二attB位点具有选自SEQ ID NO：32、33和34的核苷酸序列。
81.权利要求78-80任意一项的方法，其中所述表达框进一步包含将编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸与所述第二attB位点分开的连接序列。
82.权利要求81的方法，其中将编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸与所述第二attB位点分开的所述连接序列为约8个或约16个核苷酸长。
83.权利要求81的方法，其中将编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸与所述第二attB位点分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：39或124中所显示的序列，或者与SEQ ID NO：39或124中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
84.权利要求78-83任意一项的方法，其中所述表达框进一步包含所述第二attB位点之后的终止序列。
85.权利要求84的方法，其中所述终止序列包括来自马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因的终止区域。
86.权利要求84的方法，其中所述终止序列具有SEQ ID NO：38中所显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：38有至少70％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列终止在植物细胞中的转录。
87.权利要求84-86任意一项的方法，进一步包括将所述第二attB位点与所述终止序列分开的连接序列。
88.权利要求87的方法，其中将所述第二attB位点与所述终止序列分开的所述连接序列约14个核苷酸长。
89.权利要求87的方法，其中将所述第二attB位点与所述终止序列分开的所述连接序列具有SEQ ID NO：40中所显示的序列，或者与SEQ ID NO：40中所显示的序列有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
90.权利要求74-89任意一项的方法，其中所述目的多核苷酸与在所述植物细胞中活性的第二启动子可操作连接，其中所述第一和所述第二重组位点位于所述目的多核苷酸和所述第二启动子的两侧。
91.权利要求90的方法，其中所述第二启动子是玉米泛素启动子或玉米油脂蛋白启动子。
92.权利要求91的方法，其中所述玉米油脂蛋白启动子具有SEQ ID NO：65中显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：65有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
93.权利要求74-89任意一项的方法，其中所述靶位点以可操作连接包括：所述第一重组位点，第二启动子，编码Wuschel多肽的多核苷酸序列，第三启动子，编码babyboom多肽的多核苷酸，和所述第二重组位点，其中在靶位点中编码所述Wuschel多肽的所述多核苷酸及其可操作连接的第二启动子可以在编码所述babyboom多肽的所述多核苷酸及其可操作连接的第三启动子之后或之前。
94.权利要求93的方法，其中所述第二启动子是玉米In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子
95.权利要求93或94的方法，其中所述第三启动子是玉米泛素启动子或玉米油脂蛋白启动子。
96.权利要求95的方法，其中所述玉米油脂蛋白启动子具有SEQ ID NO：65中显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：65有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
97.权利要求74-96任意一项的方法，其中所述靶位点被稳定地整合进所述植物细胞的基因组。
98.从植物细胞中的靶位点切除目的多核苷酸的方法，其中所述靶位点以可操作连接包含：第一位点特异性重组位点，第一启动子，所述目的多核苷酸，第二启动子，编码位点特异性重组酶的多核苷酸，和第二位点特异性重组位点；其中所述第一和所述第二位点特异性重组位点相对彼此发生重组并直接重复；其中所述第二启动子包含权利要求1-7任意一项的启动子构建体，其中在靶位点中目的多核苷酸及其可操作连接的第一启动子可以在编码位点特异性重组酶的多核苷酸及其及其可操作连接的第二启动子之后或之前；所述方法包括表达编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸；其中所述位点特异性重组酶在所述第一和所述第二位点特异性重组位点识别并实施重组，由此切除所述目的多核苷酸和编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸。
99.权利要求98的方法，其中所述第一启动子是玉米泛素启动子或玉米油脂蛋白启动子。
100.权利要求99的方法，其中所述玉米油脂蛋白启动子具有SEQ ID NO：65中显示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：65有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
101.权利要求98-100任意一项的方法，其中所述靶位点进一步包含与编码Wuschel多肽的多核苷酸可操作相连的第三启动子，其中靶位点以可操作连接包含：所述第一位点特异性重组位点，所述第三启动子，编码Wuschel多肽的所述多核苷酸，所述第一启动子，所述目的多核苷酸，所述第二启动子，编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸，和所述第二位点特异性重组位点，其中在靶位点中编码Wuschel多肽的多核苷酸及其可操作连接的第三启动子、目的多核苷酸及其可操作连接的第一启动子和编码所述位点特异性重组酶的多核苷酸及其可操作连接的第二启动子可以是任何顺序。
102.权利要求101的方法，其中靶位点以下列顺序包含：所述第一位点特异性重组位点，所述第三启动子，编码Wuschel多肽的所述多核苷酸，所述第一启动子，所述目的多核苷酸，所述第二启动子，编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸，和所述第二位点特异性重组位点。
103.权利要求74-102任意一项的方法，其中所述位点特异性重组酶选自FLP，Cre，SSV1，λInt，phi C31 Int，HK022，R，Gin，Tn1721，CinH，ParA，Tn5053，Bxb1，TP907-1，和U153。
104.权利要求74-102任意一项的方法，其中编码所述位点特异性重组酶的所述核苷酸序列选自由：
a)SEQ ID NO：41或43中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：41或43有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：42或44中显示氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：42或44有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，
组成的列表。
105.权利要求74-102任意一项的方法，其中所述第一和所述第二重组位点是FRT重组位点或lox重组位点。
106.权利要求74-105任意一项的方法，其中所述目的多核苷酸是编码细胞增殖因子的多核苷酸。
107.权利要求106的方法，其中所述细胞增殖因子包括babyboom多肽。
108.权利要求的107方法，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2域以及下列氨基酸序列中至少一个：
a)SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列。
109.权利要求107的方法，其中编码所述babyboom多肽的所述多核苷酸具有选自：
a)SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
的核苷酸序列。
110.权利要求74-109任意一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。
111.权利要求74-109任意一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
112.权利要求111的方法，其中所述单子叶植物选自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，粟，燕麦，甘蔗，草坪草，和风倾草。
113.使用目的多核苷酸转化植物细胞质体的方法，所述方法包括：
a)将编码细胞增殖因子的异源多核苷酸导入植物细胞；
b)表达编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸；和
c)将包含所述目的多核苷酸的载体导入所述植物细胞的质体，其中编码所述细胞增殖因子的异源多核苷酸是在将包含所述目的多核苷酸的载体导入所述质体之前、期间或之后表达。
114.权利要求113的方法，其中细胞增殖因子是babyboom多肽。
115.权利要求114的方法，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2域以及下列氨基酸序列中至少一个：
a)SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列。
116.权利要求114的方法，其中编码所述babyboom多肽的所述多核苷酸具有选自：
a)SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
的核苷酸序列。
117.权利要求113-116任意一项的方法，其中编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸与启动子可操作连接。
118.权利要求117的方法，其中所述启动子是组成型启动子，组织优选型启动子，诱导型启动子，和发育调控启动子。
119.权利要求117的方法，其中所述启动子是四环素-阻遏物系统的一部分，而表达所述异源多核苷酸包括给所述植物细胞提供多西环素。
120.权利要求113-119任意一项的方法，其中所述目的多核苷酸与所述质体中有功能的启动子可操作连接。
121.权利要求113-120任意一项的方法，其中包含所述目的多核苷酸的所述载体进一步包含在所述质体中活性的选择标记基因。
122.权利要求121的方法，其中在所述质体中活性的选择标记基因是aadA基因。
123.权利要求121的方法，其中在所述质体中活性的选择标记基因是能够赋予所述细胞除草剂抗性的基因。
124.权利要求113-123任意一项的方法，其中将所述目的多核苷酸导入所述质体包括将所述目的多核苷酸同源重组进所述质体基因组的区域。
125.权利要求124的方法，其中所述质体基因组的所述区域的同源区域位于所述目的多核苷酸两侧。
126.权利要求113-125任意一项的方法，其中所述质体是叶绿体、淀粉质体或色质体。
127.权利要求113-126任意一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。
128.权利要求113-126任意一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
129.权利要求128的方法，其中所述单子叶植物选自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，粟，燕麦，甘蔗，草坪草，和风倾草。
130.将目的核苷酸导入成熟种子的成熟胚外植体的方法，所述方法包括：
a)从成熟的种子上切下成熟的胚；
b)将所述成熟的胚切片以制备所述成熟的胚外植体，其中所述成熟的胚外植体包括至少一个选自叶原基、胚轴、芽顶端分生组织和根原基的组织；以及
c)导入所述成熟的胚外植体：
i)编码细胞增殖因子的异源多核苷酸并表达编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸；和
ii)目的多核苷酸。
131.权利要求130的方法，其中成熟的胚外植体包括叶原基、胚轴和根原基。
132.权利要求130或131的方法，其中通过让成熟的干种子吸收水溶液足够长时间来预备所述成熟的种子，以使得能从成熟的种子上切下成熟的胚。
133.权利要求132的方法，其中所述成熟的干种子已吸收水约24小时。
134.权利要求130-133任意一项的方法，其中所述方法进一步包括在允许愈伤组织生长的条件下培育所述成熟的胚外植体，其中所述愈伤组织生长表明成熟的胚外植体转化。
135.权利要求134的方法，其中所述方法进一步包括从所述愈伤组织中再生植物。
136.权利要求135的方法，其中所述重组位点位于编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸两侧，并且其中所述方法进一步包括将编码位点特异性重组酶的多核苷酸导入所述成熟的胚外植体，该位点特异性重组酶能够在所述重组位点识别并实施重组；以及表达编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸，由此在从所述愈伤组织中再生植物之前切下编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸。
137.权利要求136的方法，其中所述编码位点特异性重组酶的所述多核苷酸与根据权利要求1-8的启动子构建体中任意一个可操作连接。
138.权利要求130-137任意一项的方法，其中所述多核苷酸通过农杆菌介导转化被导入所述成熟的胚外植体。
139.将目的多核苷酸导入叶组织并从中再生植物的方法，所述方法包括：
a)从第一叶基节上面的叶上切下叶段；
b)将所述叶片段剥离成叶组织；
d)导入所述叶组织：
i)两侧有重组位点的编码细胞增殖因子的异源多核苷酸；
ii)包含根据权利要求1-8的启动子构建体中任意一个的表达框，该启动子构建体与编码位点特异性重组酶的多核苷酸可操作连接，该位点特异性重组酶能够在所述重组位点识别并实施重组；和
iii)目的多核苷酸
e)表达编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸；
f)在允许愈伤组织生长的条件下培育所述叶组织；
g)表达编码所述位点特异性重组酶的所述多核苷酸，由此切下编码所述细胞增殖因子的所述异源多核苷酸；
h)从所述愈伤组织再生植物。
140.权利要求139的方法，其中所述叶组织约1到约2mm长。
141.权利要求139或140的方法，其中所述叶段从幼苗上切下。
142.权利要求139-141任意一项的方法，其中所述多核苷酸通过农杆菌介导转化被导入所述叶组织。
143.权利要求的136-142任意一项方法，其中所述位点特异性重组酶选自FLP，Cre，SSV1，λInt，phi C31 Int，HK022，R，Gin，Tn1721，CinH，ParA，Tn5053，Bxb1，TP907-1，和U153。
144.权利要求136-142任意一项的方法，其中编码所述位点特异性重组酶的所述核苷酸序列选自由：
a)SEQ I DNO：41或43中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：41或43有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：42或44中显示氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：42或44有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，
组成的列表。
145.权利要求130-144任意一项的方法，其中所述细胞增殖因子包括babyboom多肽。
146.权利要求145的方法，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2域以及下列氨基酸序列中至少一个：
a)SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：57中显示的氨基酸序列有一个氨基酸不同的氨基酸序列。
147.权利要求145的方法，其中编码所述babyboom多肽的所述多核苷酸具有选自：
a)SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69中显示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，68，116，117，120，121，或69有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列的多肽；和
d)核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，122，或28中显示的氨基酸序列有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
的核苷酸序列。
148.权利要求130-147任意一项的方法，其中所述成熟的种子或所述叶来自双子叶植物。
149.权利要求130-147任意一项的方法，其中所述成熟的种子或所述叶来自单子叶植物。
150.权利要求149的方法，其中所述单子叶植物选自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，粟，燕麦，甘蔗，草坪草，和风倾草。
151.分离的多肽，包括选自：
a)SEQ ID NO：2，4，8，或18中显示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO：2中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽有BBM活性；
c)与SEQ ID NO：4中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ IDNO：4中311、312和313位的位置有缬氨酸、酪氨酸和亮氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；
d)与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ ID NO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；和
e)与SEQ ID NO：18中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ ID NO：18中337、338和339位的位置有缬氨酸、酪氨酸和亮氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；
的氨基酸序列。
152.分离的多核苷酸，包括选自：
a)包含SEQ ID NO：1，3，7，或17中所显示序列的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：1中所显示序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽；
c)编码SEQ ID NO：2，4，8，或18中所显示氨基酸序列的核苷酸序列；和
d)编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：2中所显示氨基酸序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有BBM活性；
e)编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：4中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ IDNO：4中311、312和313位的位置有缬氨酸、酪氨酸和亮氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；
f)编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ IDNO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；和
g)编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：18中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ IDNO：18中337、338和339位的位置有缬氨酸、酪氨酸和亮氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；
h)a)，b)，c)，d)，e)，f)，或g)的核苷酸序列中任意一个的互补序列；
的核苷酸序列。
153.包含权利要求2的分离的多核苷酸的表达框，其中所述多核苷酸与在植物中驱动表达的启动子可操作连接。
154.植物，其包含与在植物中驱动表达的启动子可操作连接的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
a)包含SEQ ID NO：1，3，5，7，17，或27中显示的核苷酸序列的多核苷酸，或其互补序列；
b)包含与SEQ ID NO：1，3，5，7，17，或27中所显示序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽；
c)编码SEQ ID NO：2，4，6，8，18，或28中所显示氨基酸序列的多核苷酸；
d)编码与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ ID NO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述多核苷酸编码具有BBM活性的多肽；和
e)编码与SEQ ID NO：2，4，6，18，或28中所显示氨基酸序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；其中所述多核苷酸编码具有BBM活性的多肽。
155.权利要求154的植物，其中所述启动子是组成型启动子，组织优选型启动子，诱导型启动子，或发育调控启动子。
156.权利要求154或权利要求155的植物，其中所述植物是单子叶植物。
157.权利要求156的植物，其中所述单子叶植物选自玉米，稻，高粱，大麦，小麦，粟，燕麦，甘蔗，草坪草，和风倾草。
158.权利要求154或权利要求155的植物，其中所述植物是双子叶植物。
159.权利要求154-158任意一项的植物，其中所述异源多核苷酸被稳定的整合进植物基因组中。
160.增加植物中多肽活性的方法，包括给所述植物提供选自：
a)包含SEQ ID NO：2，4，6，18，或28的氨基酸序列的多肽；
b)与SEQ ID NO：2，4，6，18，或28有至少75％序列同一性的多肽，其中所述多肽有BBM活性；和
c)多肽，其包含与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ ID NO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽有BBM活性；
的多肽，以及
其中增加所述多肽的活性在植物中产生选自：
a)在植物中产生无性衍生的胚；
b)改变植物再生能力；
c)在植物中增强转化效率；
d)在非生物胁迫下增加或保持植物的产量；和
e)诱导胚发生；
的表型。
161.权利要求160的方法，其中提供多肽包括将选自：
a)包含SEQ ID NO：1，3，5，7，17，或27的多核苷酸；
b)编码2，4，6，8，18，或28的氨基酸序列的多核苷酸；
c)与SEQ ID NO：1，3，5，17，或27有至少75％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有BBM活性的多肽；
d)编码与SEQ ID NO：2，4，6，18，或28有至少75％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸；其中所述多核苷酸编码具有BBM活性的多肽；和
e)编码与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ ID NO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述多核苷酸编码具有BBM活性的多肽；
的异源多核苷酸导入所述植物。
162.权利要求161的方法，其中所述异源多核苷酸是瞬时表达的。
163.权利要求161的方法，其中所述异源多核苷酸被稳定的整合入植物基因组。
164.权利要求161-163任意一项的方法，其中所述异源多核苷酸与组成型启动子，组织优选型启动子，诱导型启动子，或发育调控启动子可操作连接。
165.瞬时增加植物细胞中多肽活性的方法，所述方法包括步骤：
a)给植物细胞提供选自
i)包含SEQ ID NO：2，4，6，8，18，或28的氨基酸序列的多肽；
ii)与SEQ ID NO：2，4，6，18，或28有至少75％序列同一性的多肽，其中所述多肽有BBM活性；和
iii)具有与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ IDNO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述多肽具有BBM活性；
的多肽；和
b)在从所述植物细胞再生植物之前降低所述植物细胞中所述多肽的活性，水平，或活性和水平。
166.权利要求165的方法，其中提供多肽包括将包含第一核苷酸序列的异源多核苷酸导入所述植物细胞，第一核苷酸序列选自：
a)包含SEQ ID NO：1，3，5，7，17，或27的核苷酸序列；
b)编码2，4，6，8，18，或28的氨基酸序列的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：1，3，5，17，或27有至少75％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽；
d)编码与SEQ ID NO：2，4，6，18，或28有至少75％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽；和
e)编码与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ IDNO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽。
167.权利要求166的方法，其中所述第一核苷酸序列与组成型启动子，组织优选型启动子，诱导型启动子，或发育调控启动子可操作连接。
168.权利要求166或权利要求167的方法，其中所述的在从所述植物细胞再生植物之前降低所述植物细胞中所述多肽的水平包括切除所述第一核苷酸序列。
169.权利要求168的方法，其中第一和第二重组位点位于所述第一核苷酸序列两侧，其中所述第一和所述第二重组位点直接重复。
170.权利要求169的方法，其中所述第一和所述第二重组位点包括frt和loxP位点。
171.权利要求169的方法，其中所述植物细胞进一步包括编码位点特异性重组酶的第二核苷酸序列，其中所述方法进一步包括在从所述植物细胞再生植物之前表达所述重组酶，其中所述位点特异性重组酶在所述第一和所述第二重组位点识别并实施重组。
172.权利要求171的方法，其中所述位点特异性重组酶包括Cre或Flp。
173.权利要求160-172任意一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。
174.权利要求160-172任意一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
175.权利要求174的方法，其中所述单子叶植物是玉米，小麦，稻，大麦，高梁或黑麦。
176.转化植物细胞的方法，包括：
(a)使用目的多核苷酸和包含第一核苷酸序列的异源多核苷酸转化植物细胞，第一核苷酸序列选自：
a)包含SEQ ID NO：1，3，5，7，17，或27的核苷酸序列；
b)编码2，4，6，8，18，或28的氨基酸序列的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：1，3，5，17，或27有至少75％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽；
d)编码与SEQ ID NO：2，4，6，18，或28有至少75％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽；和
e)编码与SEQ ID NO：8中显示的序列有至少75％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列在分别对应SEQ ID NO：8中1、2和3位的位置有蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基，其中所述核苷酸序列编码具有BBM活性的多肽。
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