CN100515571C - 用于制备遗传可转化的植物组织的方法和装置 - Google Patents

Abstract

从种子中机械分离胚胎的方法，用于遗传转化。利用了相对转动的滚筒以及一步或多步的拣取、水化、分离和成活性测试步骤，以提供高产出的能成活的植物转化组织。

Description

用于制备遗传可转化的植物组织的方法和装置

相关申请的交插参考

本申请要求2003年6月16提交的美国临时申请60/320,278的权益，这里引入作为参考。

本发明受到联邦资助

技术领域

本发明涉及植物细胞转化，其中将遗传材料插入到植物细胞中以对所得植物进行改性，并且特别地，本发明涉及用于从可被用于所述转化的种子收集胚组织的装置。

背景技术

植物的遗传转化可以被用来培养具有提高的产量、抗病虫害、对除草剂以及提高的营养价值的作物。在这样的转化中，新的基因被引入到现有植物细胞的染色体材料中。已经发展出多种方法来将基因传递到植物组织中，包括高速显微投影、显微注射、电穿孔、直接DNA摄取以及土壤杆菌介导的基因转化。

一旦基因被成功地引入到植物细胞的染色体材料中，就可以培养出新的可遗传种系组织(如种子)，从而可以繁殖出新的植物。一种可能的方式是通过只选择那些接受了新基因的细胞，并且将这些细胞的愈伤组织在新的成活植物中培育。从单个细胞培养成植物所需的时间很长。

通过直接对预成形植物胚的分生组织进行处理可以得到缩短的培养时间。所述的分生组织是细胞的成形植物组织，其将会分化以产生不同的植物结构，包括种子或种系组织。许多植物胚将会被处理，并且之后将会使用选择或甄别技术来决定这些植物中的哪些已经在其种系组织中被引入了新的遗传信息。

出让给本发明受让人的美国专利U.S.6,384,301(在此引入作为参考)描述了一种大豆(Glycine max)转基因的方法，其使用了直接对大豆胚分生细胞进行的由土壤杆菌介导的基因传递。在这个过程中，种子被浸泡以引起萌芽。在发芽开始后，所述胚被从种子切除并且幼叶组织被除去以暴露大豆胚的分生组织。所述分生组织是成形的植物组织，其将会分化以产生植物的不同部分。

虽然种子是廉价的，涉及切除胚、将遗传物质传递入胚、以及培育所述胚使减少对所述胚的损伤是合适的，所述损伤可以导致被用于组织的努力最终不可行。由于这个原因，所述植物胚的切除是通过手工进行的。

在所述手工方法中，表面灭菌的种子被用戴手套的手一次一个地进行无菌处理。它们被定向从而使种皮以外力冲出。然后子叶被分离并除去，留下了所述种子胚。所述胚叶在靠近所述初生分生组织的区域被除去。即使用这种手工方法，用于遗传转化的适宜胚的回收率也小于100％，并且高质量的种子可能仅为70％。

在切除后所述胚的细菌污染是一个被关注的重要问题。所述胚的手工切除允许所述种皮从所述种子的其余部分及早分离，以防止所述胚被种皮上的细菌污染，所述种皮通常保护所述胚。

进行手工切除的熟练人员常常可以在切除的时候认出不正常的胚并弃去它们，充分地改善了下游收率。

尽管手工切除具有上述优点，将每个植物胚从其种子个别分离是极端劳动密集的，并成为按比例放大所述转化工艺的障碍，在所述工艺中，典型地，必须处理许多植物以产生成功的转化。

所需要的是一种可以在没有不可接受地增加转化总成本的情况下，显著地增加可转化胚可利用率的方法，如果对胚的损伤或所述胚的细菌污染引起大量不能成活胚的无效培养，则转化总成本将会不可接受地增加。

发明内容

本发明的发明人开发了一种用于将可转化组织从种子切除的自动化技术，其充分地减少了胚损伤和细菌污染，其例如会使机械分离变得不可行。机械化的切除机械与任选的种子拣取、改善的种子水化作用、以及胚的自动化分离相结合，使自动切除变得可行。提供了附加的技术，以减少与自动化过程相伴随的，特别是在所述种皮和胚之间的细菌污染。

具体地说，本发明提供了可转化的植物组织的自动化制备，其是通过水化植物种子以软化所述种子组织，然后将所述水化的种子通过机械分离器，所述机械分离器将所述种子分离成子叶、种皮和胚。然后将遗传物质引入所分离胚的细胞中。

本发明的一个目的是提供可转化植物组织的高容量自动化切除。

机械分离器可以提供相对的运动表面，其对所述水化的种子施加剪切力。

本发明的另一个目的是提供简单的机械分离器，其将所述种子组分分离，而不会对所述胚造成过分的损害。在所述水化的种子上的所述剪切力促使所述种子沿它们的天然的分离点分离。

所述相对运动表面可以是具有不同滚动速度的滚筒。

因此，本发明的另一个目的是提供容易制造的剪切表面。

所述滚筒可以是共同旋转的。

本发明的另一个目的是提供适合于连续或半连续分批工艺的机构。

所述滚筒可以具有蛇纹的滚动面。

本发明的另一个目的是提供一个表面，其包封所述种子的外表面以将它们分离并将剪切力均匀地分布以减少对所述胚的损伤。

所述滚筒可以具有弹性体外表面。

因此，本发明的另一个目的是提供改善的夹持，并减少在所述种皮上的压力。

所述运动表面可以包括至少连续两组相对的滚筒。

因此，本发明的另一个目的是提供所述种皮的一系列分级的分离以增加产量。

所述运动表面的分离可以根据所述种子的类型调节。在所述运动表面之间剪切的量也可以根据所述种子的类型来调节。

因此本发明的另一个目的是提供适用于对各种不同种子类型进行加工的机械。

当所述种子通过机械分离器时可以用液体来对其进行喷雾。

本发明的另一个目的是通过用无菌液体或消毒剂溶液对污染物进行恒定的稀释或消毒来减少这种机械分离所易于发生的细菌污染。

可以对所述滚筒喷射液体以在与所述滚筒的旋转相对的方向上对所述滚筒进行冲击。

本发明的另一个目的是提供对所述滚筒的清洗，其使得对所附着胚的损害最小。

种子进入所述机械分离器的体积或质量流量可以被控制在预定恒定值。

本发明的另一个目的是使对所述胚的损伤最小，所述损伤可以由过量数目的种子进入所述滚筒引起。

所述种子在机械分离前可以基于预定的种子特性来拣取，例如颜色、大小、湿度、胚质或密度。

因此本发明的另一个目的是通过在对种子的拒绝相对廉价的阶段对种子类型进行严格控制，来补偿机械切除中人肉眼检查的不足。

所述种子的水化步骤可以包括漂洗种子，然后将其保持至少一个小时，接着对所述种子浸泡。

因此本发明的另一个目的是以减少子叶开裂的方式提供一种水化，所述开裂例如可以助长对所述胚的损害。

所述漂洗、保持和浸泡可以在种子被引入其中的容器中进行，所述容器具有排放口和进口，所述进口与第一漂洗贮液器和不同于漂洗贮液器的第二浸泡液贮存槽相连通，并且在所述进口与所述漂洗贮液器之间，以及所述进口与所述浸泡液贮存槽和所述排放口之间包括阀门位置，所述阀门与用于对所述漂洗、保持和浸泡进行自动控制的电子计时器相连通。

因此本发明的另一个目的是在没有过分种子处理的情况下允许更复杂的用于水化所述种子的程序。本发明的另一个目的是允许使用可向其中引入不同添加剂的贮存槽，以容许不同漂洗和浸泡材料用于所述种子的水化中。

所述漂洗可以包括杀菌剂，例如漂白剂或其它消毒溶液。

因此本发明的目的是减少机械切除上游的细菌负载，所述机械切除可以引起胚的污染。

在所述机械分离之后，子叶、种皮、和胚可以被通入分离机中，以将胚从种皮和子叶中分离。

因此本发明的另一个目的是消除对已分离的种子材料进行手工分类的需要，所述手工分类例如将会减少机械切除的好处。

所述分离机可以包括堰板，其允许所述种皮从所述堰板的顶部冲过并且所述胚和子叶流通到所述堰板的底部。

因此本发明的另一个目的是提供一种分离系统，其与排出所述分离机的液体和种子部分的混合物自然地工作。本发明的另一个目的是在所述分离过程中及早从所述胚分离脏的种皮以减少污染的风险。

所述分离机可以包括从所述胚筛分所述子叶。

因此本发明的另一个目的是减少从所述子叶提取所述胚所需的手工工作。

在所述机械分离之后，本方法可以包括以预定时间段胚在液体介质中培养所述胚的步骤，以拣出不能存活的胚。

因此本发明的另一个目的是提供一种机构，其可以，如果必要的话，在机械分离中容纳更高的不能存活的胚比率，而不引起过度的培养成本。

这些特别的目的和优点可以应用于权利要求范围内的一些实施方案中，因此，其并不是对本发明的范围进行限定。

附图说明

图1是表明本发明主要步骤的流程图，例如可以包括：拣取、水化、切除、分离以及成活性测试；

图2是用于图1的水化步骤的装置的示意图，其允许对种子水化的自动控制；

图3是用于图1的切除步骤的装置的简化示意图，其提供了一系列相对滚筒，所述滚筒通过剪切动作分离所述种子部分；

图4是在图3所述装置上的一个滚筒的透视图；

图5是图3的一对滚筒沿图4的5-5线的剖面图，其显示了使用一种规格的所述滚筒的分离；

图6是图3中的一对相对滚筒的片段放大图，其显示了液体喷射，所述喷射被导向以阻止所述滚筒堵塞，并导向处理流；

图7是在图3中最后的滚筒之后的堰板的正视截面图，所述堰板将种皮从子叶和胚分离；

图8是可跟随图7中的堰板的分离装置的正视截面图，其使用了筛网以从胚分离子叶和残余的种皮；

图9是分离装置替代实施方案类似于图8的图示，所述装置使用了往复式筛分平台；

图10是与图8和9相类似的图示，其显示了替代的分离装置，所述装置使用了具有外周筛网的旋转鼓；

图11是一种蔗糖分离系统的正视横截面图，其中预定密度的蔗糖溶液将胚从种子的剩余部分分离；

图12是接种步骤的流程图，其中将所述胚用土壤活性菌处理，并在培育之前在液体介质中进行多种测试；

图13a和13b是种子路径的简化的正视图，通过所述螺旋进料器进入到图3的设备中，图上添加具有和不具有扩杆的种子分布正视图，该扩杆用于提供更均匀的种子分布。

图14是图8-10使用充气搅拌的分离装置的替代实施方式；

图15是图14中充气搅拌装置的喷嘴组件的第一实施方式；

图16是图14中充气搅拌装置的喷嘴组件的第二实施方式。

具体实施方式

参考图1，通常本发明的机械化方法10接受收获的大豆或其它种子12，可转化的植物组织将从这里提取。理想地将种子12在预定的适合于分离可转化材料的内部湿度下从那里收获，例如，对于大豆来说是8-14％的内部湿度，并且使用前在稳定的储藏条件下保存。

所述种子12可以经受可选择的拣取步骤14，以除去本发明中具有高度细菌或真菌污染的种子12a，以及可能由于任何原因在统计上没有产生成活胚组织的种子12a。后者的原因可以包括参数例如所述种子的尺寸或其它物理性质，其在其它地方将不会被反对并且可以通过所述参数的改变和所述成活组织的最终收率来经验地调节。

优选地，所述拣取步骤14用机械进行，并且可以包括尺寸拣取，其使用能消除低于或高于预定尺寸的种子12的标准选种技术，使用易于通过市售得到的高速光学分拣装置来进行光学分类，例如使用照相机以及视觉系统，以选自颜色，尺寸，形状或密度的一个或多个标准来拒绝种子12。拣取方法的例子可以包括在粒度分选后使用自动分类器，或适合于该目的的光学分类器，如Houston，Texas.的Satake USA Inc.生产的Satake Scan Master II。也可以使用其它拣取技术，包括通过含湿量拣取。拣取也可在水化作用之后发生，因为已测出种皮被损害的种子变得比具有完整种皮的种子吸收更快。

拣取步骤14一部份是用于代替进行手工切除的技术人员对种子的无意选择，和减少细菌和真菌在种子12上的载入，其可能在机械过程中产生胚污染的较大趋势。因为在切除之前的种子12是廉宜的，所以可选择的拣取步骤14可能相当迅速。

胚现在参考图2，经过可选择的拣取步骤14，种子12b移动到克选择的水化步骤16，其中可将液体引入种子12来使子叶以及种皮软化，减少了在接下来的切除步骤18期间胚损伤的可能性。水化步骤16优选自动操作，但也可手工操作。再次参考图2，在优选实施方式中，水化通过使用已消毒的具有四升容量和临时底部22的水化容器20进行，该临时底部22被一系列比种子12b的尺寸更小的洞24打孔。所述洞24通向排水室26，其通过出口软管28和阀30与排水道32相通。

种子12放置在临时底部22的顶部，并且具有洞36的固定盘34也比一般的种子12b更小，其被轻轻放置在种子12b顶部以防止它们漂浮。容器20上面的可移动盖子38提供了两个入口40和42。第一入口40通过阀44与含有消毒液和200ppmClorox溶液的漂洗槽46相通。第二入口42通过阀48与含有合适的植物组织培养介质，如美国专利6384301描述的大豆发芽介质(BGM)的组织培养溶液槽50相通。组织培养介质也可含有杀菌剂如cefotaximine、Bravo、Benlate、Captan和Carbenicillin。其它杀真菌剂、消毒剂、植物激素、抗生素和过氧化氢可选择用在组织培养溶液槽50中。在槽46和50中的液体都保持在室温下。

电子计时器52与阀44、30和48中的每一个相连，并设计为一开始在切除过程之前预定的时间关闭阀30并开启阀44一段预定时间，从而在阀44关闭后用漂洗槽46的漂洗溶液填充容器20。漂洗溶液在适当的位置保持三至十分钟，而将阀30打开通过出口软管28排干容器20。

这个种子12b的第一次漂洗使其开始吸收水分，但不是很明显以导致如由子叶材料在过量液体存在下不均匀膨胀引起的子叶开裂。漂洗还可进一步减少表面污染物。其它用来防止开裂的方法包括在潮湿气氛或种子引发中提前培育。

至少一小时后，优选两小时后，计时器52动作关闭阀30并开启阀48一段预定的时间，从而用组织培养槽50的组织培养介质填充容器20。当计时器52打开阀30排干所述组织培养介质后，所述组织培养介质在室内保持8-13小时。然后将容器20再次用漂洗槽46的漂洗溶液填充(通过计时器52操作的阀44)15-30分钟而不排出(计时器52保持阀30关闭)，用于切除步骤载体或排干(即用于螺旋)的过量溶液如现在所描述。当种子12在组织培养介质中没有循环时，可使用乙烯抑制剂。

本发明中还设想了水化的其他方法，包括好氧方法，其中将液体喷撒在种子上而不累积，或使用通风装置或类似装置将气体鼓泡通过生长介质或可将介质回流。还可预见具有不同入口和出口组合的其他尺寸和形状的容器、不同的从种子分离液体的方法、不同时间的不同溶液，以及类似物也可用于水化目的。

现在参考图1和3，水化后，将种子12b用漂洗液体倾到一起倒入螺旋进料器56的漏斗54中，例如提供种子12b和漂洗液体在自动化切除机械60的漏斗58的可控进料。这种螺旋进料器56在本领域是众所周知的。种子12b的进料速度一开始由目测决定，从而减少种子12b在滚筒上的聚集，并最小化对胚的直观损害。最终这个进料速度可通过使用各种速度并观察胚成活能力由经验决定。螺旋进料器56可以是Wisconsin Whitewater生产的Accurate Feeder。可以使用其他进料系统代替螺旋进料器56，包括例如，泵(种子保持在浆液中)、传送带或震动传送系统如本领域公知的。另外，在放入进料器之前，可将漂洗液体从种子分离。这个步骤还可不用进料器手工进行。

现在参考图3和13a，螺旋进料器56提供了排放管57，沿与如下将描述的滚筒62、66和70旋转轴垂直的水平轴喷射种子12。种子12从排放管57通过漏斗58落入滚筒62之间的沟内，被有限的尺寸和排放管57的圆形孔沿中心线160集中。

种子12的这种空间集中，由种子分布曲线162在中心线附近的峰表示，当多个种子12通过滚筒62时，其可导致种子12被碾碎，所述滚筒62被隔开从而为在滚筒62边缘的种皮胚和子叶提供有效分离。

相应地，参考图13b，转向杆164可放置在排放管57和滚筒62之间，所述滚筒62沿中心线160上的排放管57的轴充分延长通过漏斗58。这个转向杆164减少了新的种子分布162`的峰，提供了比如图13a所示不用转向杆得到的种子分布差异170`更小的种子分布差异170。

如果使用多于一个滚筒对，为使固体流均匀的机械再分布的相似方法可在连接的滚筒装置之前或之间安装。

滚筒62、66和70是本发明中进行切除步骤18的自动化切除机械60的部件，其用于将种子12b分离成胚12c、子叶12d和种皮12e。切除操作可在清洁室中进行，从而将细菌和霉菌的污染最小化。

自动化切除机械60的第一漏斗58将种子12b导入一对水平相对的滚筒62，其每一个绕相互平行的水平轴旋转。所述种子12通过这些滚筒62，被第二漏斗64以及第二对水平相对的具有相互平行水平轴的滚筒66接受。所述种子12通过这些滚筒66并且被第三漏斗68和接下来的第三对水平相对的具有相互平行水平轴的滚筒70接受。

从滚筒70的最后一套装置，种子12落入以下将进一步描述的收集容器72。使用滚筒的三个分离步骤保证了绝大部分种子12组分在其到达收集容器72时被充分分离。

图3描述的左滚筒(即滚筒62b、66a和70a)一致沿顺时针方向旋转，其由与第一马达控制器78连接的第一马达76驱动的交迭的调速带74a驱动。顺时针的方向导致了种子12在滚筒对间向下的前进。

相似地，图3描述的右滚筒(即滚筒62b、66b和70b)由交迭的调速带74b相互连接，并且由具有独立第二马达控制器82的第二马达80驱动。这里，逆时针方向导致了种子12在滚筒对间向下的前进。

马达80上的链轮齿84及其与调速带74的齿的咬合比相应的马达76上的链轮齿86更大，从而与左边的滚筒62a、66a和70a相比，为右边的滚筒62a、66b和70b提供不同(更快)的旋转速率。例如，右边的滚筒可以约30rpm旋转，而左边的滚筒可以约90rpm旋转。可对马达控制器82和78进行调整从而进一步改进速度差。与一对滚筒的两个都接触的种子12从而经受到作用在他们外表皮上的剪切力。

应理解为可使用以受控速度驱动滚筒的其他方法，包括齿轮驱动、直接驱动伺服马达，及其类似物。还应理解可用不同速度转动滚筒。

仍然参考图3，消毒液或消毒剂溶液源可通过液体线87与流量计88相连来测量，通过压力调节器90成为与一套喷头92a至92g相连的多支管。所述液体可进一步包括附加的成分从而进行表面消毒或调节胚的状态，包括但不限于消毒剂、乙烯抑制剂、抗氧化剂和表面活性剂。喷头92a方向向下，通过漏斗58提供稳定的消毒液或消毒剂溶液洗涤，从而洗涤通过切除机械60的种子12，并润滑和定向种子12，并稀释可由种皮12e引入的任何污染。液体流的速率和压力可控制为经验决定的值。

喷头92e至92g分别在滚筒70a、66a和62a的下面喷洒，与滚筒转动的切线方向相反，从而帮助移出卡在滚筒上的种子材料并进一步促进种子通过机械。同样地，喷嘴92c至92f分别在滚筒62b、66b和70b的下面喷洒，与滚筒转动的切线方向相反。

预计可使用其它方法来在这个步骤中引入液体。例子包括但不限于使用多支管、溢流堰板、管道等。

可将空气过滤器96的消毒空气源与液体多支管通过阀98相连，从而在使用间洗涤水线，从而防止生物膜和细菌污染的累积。空气进一步干燥线路并为线路提供正压力，减少了线路污染的风险。

现在参考图4，每个滚筒62、66和70具有通常为圆柱形的中心部件100，显示出蛇形纵向轮廓108。所述圆柱形中心部件100安装在中心纵轴102上。轴102可由传统滚球轴承104的任一端支撑，并且包括在一端的链轮齿106，如与图3描述有关的接受咬合的调速带74a或74b。所述圆柱形中心部件100可用有弹性的材料如氯丁橡胶、Buna-N、氯丁基橡胶、EPDM、Viton等包裹，其可以抗磨损并提供可清洗和清洁的表面，该表面仍然柔软从而稍微顺从种子12b，并提供改善的种子12的抓握。即刻参考图3，可增加弹性材料的柔软度，从而具有滚筒对62a和62b的较低的滚筒对可提供最硬的外表面，而滚筒对70a和70b可提供最软的外表面。例如，上部滚筒的弹性材料可以是下一对滚筒的硬度35、硬度25和35，而底部对均为硬度25。应理解不同种子需要特定的间隙角、形状、结构、外部轮廓、直径或硬度。

现在参考图5，可将每个滚筒62a、66a或70a的蛇形轮廓108与相对的相应滚筒66b、62b和70b的相应的表面蛇形轮廓108`排列，从而在其间创造基本横定宽度的蛇形通道110，当种子12b通过滚筒时其横截面促进种子12b的分离，并且提供弯曲的多重咬合表面，其与种子12b的弯曲外围一致。在滚筒对间的分离装置可带有轴承104的侧部运动111，并且可通过在中心部件的任一边插入测隙规113来使其便利，从而保证滚筒基本平行。

参见图6，轴承104可以被具有耳的轴台112所支承，所述的耳之一被固定在自动切除机械60的框架(未显示)上，并且另一个耳被固定在框架上的伸长孔114，从而允许如图5所示的侧部运动111。所述滚筒分离或直径可以被改变以适应不同种类的种子12，并且可以被提升用于与具有滚筒62a和62b的较低滚筒对提供最窄的蛇纹通道110，以及与滚筒对70a和70b提供最宽的蛇纹通道。

除滚筒之外，其它切割种子的方法可被预期包括盘、带有针的滚筒等，其可以在子叶处刺入并将它们挤压在一起。

参见图7，在(图1)分离工艺117的初始阶段，收集容器72用清洁液体或消毒剂116来填充，所述清洁液体或消毒剂是从喷头92和部分地从水化步骤16中所使用的漂洗液所产生的。在接近所述收集容器72上部边缘的开口118提供了堰口120，通过所述溢流口所述液体116可以从接近收集容器72的地方流出。虽然发明人并不希望通过特别的理论来加以限制，但认为在切割步骤18中种皮12e会携带空气，从而漂浮出堰口120，以与子叶12d和胚12c相分离，而后者会留在收集容器72的底部。在消毒液体或消毒剂的冲洗下种皮12e的早期分离被认为显著地降低了胚12c的细菌和真菌污染，并为后面分离步骤中的沉降胚12c或阻塞分离筛阻挡了种皮12e。

现在参见图8，胚12c可以用带有倾斜的钢丝网128的水性筛(Tyler数为6的筛子)126与种皮12d分离，所述钢丝网具有正方形开口，边长约为1/4英寸。其它可用于钢丝网的类似功能材料包括，例如金属或塑料的穿孔片层、松弛编织或非编织的织物、纤网、格栅及类似物。

倾斜钢丝网128从而将子叶12d和胚12c在消毒液或消毒剂溶液的混合物引入倾斜的钢丝网128的上部边缘，通常向下洗斜面，在此处胚12c通过钢丝网128，而子叶12d随钢丝网到达其边缘并通过排出口132排出。可谓胚12c提供分开的排出口134。

在替换实施方式中，可将子叶12d和胚12c如图9所示，引入到浸入消毒液或消毒剂溶液的盘子中并且具有底部钢丝网128。所述盘子可以在水平方向140往复运动，从而胚12c通过钢丝网128进入外部容器。所述盘子129可从外部容器131移走并恢复胚12c。

现在参考图14，在替换实施方式中，图9的所述盘子129可调整从而提供具有上凸缘的圆柱形墙，允许其停留在圆柱形槽176上边缘的顶部。如前，盘子的底部与钢丝网128相适合。将钢丝网128的尺寸设为阻挡子叶和种皮，但允许胚通过。

用液体填充圆柱形槽176至液面水平186，从而放在盘129(当盘129在槽176中时)中的种子静止地在钢丝网128上浸没在液体中。杯188可适合于在槽176的顶部覆盖盘129，从而防止飞溅。

放置在盘129下面，当所述盘的位置在槽176中时，通风组件190具有中心焦点192，从其上连接水平和放射延伸轮辐194。焦点192提供了与空气线196的连接，其通过由脉冲计时器控制的阀200接受高压空气源。

参考图16，焦点192通常可以是通过与空气管212相适合的较低轴承214与垂直空气管212相连并密封的圆柱形倒杯。轴承214允许焦点192绕垂直轴自由旋转。与所述焦点相连的轮辐194是一端与焦点192内部(从而与垂直空气管212)相通的空心管，并且插入它们相对的末端。轮辐194具有一系列面向上的洞216，允许空气泡210逸出，并且具有至少一个侧向开口洞218。这个侧向开口洞218由其它轮辐194中的其它相似方向的洞加强，其为在空气泡210逸出的反应力下以旋转运动移动轮辐194来保证撞击在钢丝网128底部的空气的均匀分布提供旋转运动。

脉冲计时器202接受为搅拌时间段206和静止时间段208提供的波形204。这些时间段206和208的每个期间可自由调整，从而提供替换的所述盘129中液体的剧烈搅拌时间段，其是由通风组件190排出的空气泡210搅混的液体移动的。

在搅拌时间段206期间，空气的排出是从钢丝网128升高子叶、种皮和胚(图14未示出)。在静止时间段208期间，升高的材料重新通过液体降低，从而胚可通过钢丝网128，而不被在液体中倾向于以不同速率降落的种皮和子叶阻挡。

槽176具有漏斗形的底部180，终结于具有控制阀184的向182的出口。胚选择性地通过钢丝网128，由漏斗形底部180接收，并可在阀184控制下通过向182的出口排出。

参考图15，空气喷射组件190`或者可为固定的环或其它形状，从而引入足够体积的空气泡210提供需要的搅拌。除了气泡，可用螺旋桨或其它泵运系统泵运液体本身，替代空气喷射组件190`。

足够的空气导致液体在所述盘129中剧烈的沸腾，其不仅可以提供改善的种皮、子叶和胚分离，还可提供一些切除。

参考图10，在另一替换实施方式中，鼓135可部分浸没三分之一至二分之一在容器141的液体中。鼓135具有钢丝网128连接到其外部圆周外围，并用子叶12d和胚12c填充溶液，并且如箭头142所示旋转，使胚12c通过鼓135外面，其保留子叶12d。

预计可以使用胚分离的其他方法。例如，可进行手工或自动筛分。手工筛分可用浸在液体中的筛盘进行，并轻轻播动所述盘。

参考图11，在替换分离方法中，可将子叶12d和胚12c引入选择的预定密度的蔗糖溶液146，从而导致胚12c的浮起以及子叶12d和种皮12e的下沉，然后可通过撇去或倾倒出胚12c分离。所述蔗糖溶液应大约为30-40％，优选百分之三十七；但是10-70％的浓度也可提供一些分离。在几分钟后，胚12c升至容器表面。所述蔗糖可由其它生物中性化合物如丙二醇或Ficol代替。

对于这些过程的每一个，取出的胚可能不完美，但是实验表明具有不明显分裂组织的胚仍可转化。这种分离不需要非常完美，因为可转化组织包括具有移除了胚叶的或胚叶完整的，或一部分子叶12d的胚12c。

现在参考图1和12，一旦收集了胚12c，将它们在消毒液或其它溶液中漂洗，并且然后可在基因转化步骤155中用备种技术中的一种接入所需要的基因，例如2002年5月7日授权的美国专利6384301描述的在大豆中采用声波法，由本发明的代理人代理，并在此引入作为参考，或如1992年9月22日授权的美国专利5914451，由本发明的代理人代理，并也在此引入作为参考。单子叶植物可用1997年1月7日授权的美国专利5591616或1995年3月9日发行的PCT应用WO95/06722描述的方法进行转化，在此引入作为参考。棉花可用1998年12月8日授权的美国专利5846797或1991年4月2日授权的美国专利5004863描述的方法进行转化，所有均在此引入作为参考。

可选择的，如在图1中过程模块156所指，在声波处理或其它基因转化步骤155之后，已经移植的胚150可以放入液体培养152中15至30天，从而识别哪些胚12c还能成活。这种培养还允许对胚12c的根和茎尖更容易的识别，用于对在琼脂块154或进一步用于选择液体介质培养的可成活胚的合适培养。到这种成活测试，需要手工劳动的量可以忽略，从而还可将不能成活的胚以相对低的费用除去。除了液体介质，成活性还可在固体或半固体介质上测试。

然后将已证明成活的胚12c在琼脂块154上生长，例如可用化合物或环境条件处理，从而帮助识别那些根据上述参考的美国专利6384301描述的方法已成功接受植入基因的那些胚。

上面描述的技术可以适合于任何植物，其可转化组织可以从种子得到，并且尤其对含油种子植物特别有用，如大豆、canola、油菜籽、红花、以及向日葵，以及其它具有商业价值的植物，如豆类、棉花、玉米、大米和小麦。

通常图1的每个步骤都可独立地用于其它。尤其预计本发明不限制于所述实施方式及其含有的描述，但是包括在以下权利要求范围内那些实施方式的修改形式，包括所述实施方式的部分和不同实施方式元素的组合。

Claims (64)

1.一种批量制备可转化植物组织的方法，包括如下步骤：

(a)收集具有预定含水量的植物种子；

(b)将所述植物种子通过机械分离器，从而将种子分成分离的子叶、种皮和胚；和

(c)通过向分离的胚细胞中引入遗传物质来对所述分离的胚进行转化。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述机械分离器提供了分隔开的表面，所述表面相对运动从而向所述种子施加剪切力。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述机械分离器提供了分隔开的滚筒。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述滚筒具有不同的滚动速度。

5.如权利要求3所述的方法，其中包括根据种子的类型来调节滚筒的滚动速度的步骤。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述滚筒是共旋转的。

7.如权利要求3所述的方法，其中所述滚筒具有蛇纹的滚筒面。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述滚筒被处理以增加其表面摩擦。

9.如权利要求3所述的方法，其中所述滚筒具有外部弹性表面。

10.如权利要求3所述的方法，其包括根据种子的类型来调节滚筒的分离的步骤。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述机械分离器包括至少两组连续的相对滚筒。

12.如权利要求11所述的方法，其中当所述种子行进通过所述连续的滚筒的组时，所述连续的滚筒具有减弱的分离。

13.如权利要求2所述的方法，其包括根据种子的类型来调节被分隔开的表面之间的剪切力的步骤。

14.如权利要求1所述的方法，其包括当所述种子通过所述机械分离器时向所述种子喷射液体的步骤。

15.如权利要求1所述的方法，其中对种子的喷射使用与水线接触的喷嘴，并且包括在使用间用无菌空气来净化水线的步骤。

16.如权利要求15所述的方法，其中机械分离器提供空间分隔的滚筒，并且其中液体喷洒向滚筒从而以与滚筒旋转相对的方向击向滚筒。

17.如权利要求1所述的方法，其包括控制种子进入所述机械分离器的体积流量达到基本上为预定的常数值的步骤。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述机械分离器是一对分隔开的滚筒，所述滚筒绕各自第一轴旋转，并且其中所述种子是垂直于所述第一轴流入机械分离器的。

19.如权利要求18所述的方法，其中通过螺旋进料器对所述种子的体积流量进行控制，所述螺旋进料器具有排放管，并且进一步包括以种子路径为中心的转向杆，从而沿滚筒之间的开口散布种子。

20.如权利要求1所述的方法，包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前的将种子传入拣取机械用于基于预定种子特性拣取种子的拣取步骤，并且只提供拣取留下的种子到机械分离器。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述预定的种子特征是种皮颜色。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述预定的种子特征是种子尺寸。

23.如权利要求20所述的方法，其中所述预定的种子特征是种子密度。

24.如权利要求1所述的方法，其包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前的对种子进行水化的方法，包括步骤：

漂洗，其中所述种皮被润湿预定的时间，之后多余液体被排放走，然后；

保持至少一小时，然后；

浸泡，其中所述种子在液体中浸泡至少30分钟；

这样就降低了所述种子子叶的开裂。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述种子的漂洗、保持和浸泡是在引入了预水化种子的容器进行的，所述容器具有排放口和进口，所述进口与第一漂洗贮液器和不同于漂洗贮液器的第二浸泡液贮存槽相连通，并且在所述进口与所述漂洗贮液器之间、所述进口与所述浸泡液贮存槽之间和所述排放口与排水道之间包括阀门，所述阀门与用于对所述漂洗、保持和浸泡进行自动控制的电子计时器相连通。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述漂洗使用包括抗菌剂的漂洗剂。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述抗菌剂是漂白粉溶液。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述浸泡液体包括发芽介质。

29.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)之后步骤(c)之前包括如下步骤：

将所述子叶、种皮和胚通入分离机器以将所述胚从所述种皮和子叶分离。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述分离机器用液体冲洗来保持胚和子叶从种皮分开。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述分离机器包括堰板，其允许所述种皮从所述堰板的顶部冲过并且所述胚和子叶流通到所述堰板的底部。

32.如权利要求29所述的方法，其中所述分离机器包括将子叶从胚分离的筛网。

33.如权利要求1所述的方法，其在步骤(b)之后步骤(c)之前进一步包括在组织培养介质中将胚培育预定的时间，以拣取出不成活的胚。

34.如权利要求33所述的方法，其进一步包括在拣取后在非液体介质中种植剩余胚的步骤。

35.如权利要求1所述的方法，其中所述种子是双子叶的。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述种子是大豆。

37.用于批量制备可转化植物组织的设备，包含：

(a)用于接收植物种子的接收器；

(b)切除器，其提供了分隔开的运动表面，所述表面向从所述接收器排出的种子施加力，以将种子分成分离的子叶、种皮和胚；和

(c)分离器，其将胚从种皮和子叶分离。

38.如权利要求37所述的设备，其中所述切除器提供了向种子施加剪切力的运动表面。

39.如权利要求37所述的设备，其中所述运动表面是滚筒。

40.如权利要求39所述的设备，其中所述滚筒具有不同的滚动速度以提供剪切力。

41.如权利要求39所述的设备，其中所述滚筒是共旋转的。

42.如权利要求39所述的设备，其中所述滚筒具有蛇纹的滚筒面。

43.如权利要求39所述的设备，其中所述滚筒具有外部磨擦表面。

44.如权利要求39所述的设备，其中所述滚筒具有外部弹性表面。

45.如权利要求37所述的设备，其中所述运动表面包含至少两组连续的相对滚筒。

46.如权利要求45所述的设备，其中当所述种子行进通过所述连续的滚筒的组时，所述连续的滚筒具有减弱的分离。

47.如权利要求37所述的设备，其中所述滚筒具有外部弹性表面，并且当所述种子行进通过所述连续的滚筒的组时其中所述连续滚筒的外部弹性表面具有增大的柔软度。

48.如权利要求37所述的设备，其包括调节装置，所述装置允许根据种子的类型来调节所述运动表面的分离。

49.如权利要求37所述的设备，其包括马达速度控制，允许根据种子的类型来调节所述运动表面之间的剪切。

50.如权利要求37所述的设备，其包括当所述种子通过所述表面时用于向所述种子喷射液体的喷头系统。

51.如权利要求37所述的设备，其中所述运动表面是滚筒并且包括具有用于向滚筒喷洒液体从而以与滚筒旋转相对的方向击向滚筒的喷头的喷头系统。

52.如权利要求37所述的设备，包括种子传送器，所述种子传送器向漏斗提供基本预定的恒定体积速率的种子流。

53.如权利要求52所述的设备，其中切除器是成对的空间隔开的滚筒，所述滚筒绕各自第一轴旋转并且其中种子在种子传送器上流入切除器基本是与第一轴垂直。

54.如权利要求53所述的设备，其中种子传送器具有排放管，并且进一步包括从排放管以种子路径为中心的转向杆，以沿滚筒间的开口散布种子。

55.如权利要求37所述的设备，其包含种子水化器，所述种子水化器包括：

漏斗，和在被漏斗接收前保持种子在其中的容器，所述容器具有出口和入口，所述出口与第一漂洗液体槽和与漂洗液体槽不同的第二浸泡液体槽相通，并且包括放置在入口和漂洗液体槽之间、入口和浸泡液体槽之间以及出口和排水道之间的阀装置，以及阀装置与电子计时器相连，用于自动控制从第一漂洗液体槽和浸泡液体槽以及从容器排水的容器的液体流。

56.如权利要求55所述的设备，其中所述电子计时器操作用于：

润湿所述种皮预定的时间，之后多余液体被排放走；

在润湿后保持所述种子至少一小时；和

在保持后浸泡所述种子至少30分钟。

57.如权利要求55所述的设备，其中所述漂洗贮液器装有抗菌剂。

58.如权利要求57所述的设备，其中所述抗菌剂是漂白粉溶液。

59.如权利要求55所述的设备，其中所述浸泡贮液器装有发芽介质。

60.如权利要求37所述的设备，其包括液体源，并且其中所述分离器用液体冲洗来将胚和子叶从种皮分开。

61.如权利要求60所述的设备，其中所述液体是水。

62.如权利要求60所述的设备，其中所述分离器包括堰板，其允许所述种皮从所述堰板的顶部冲过并且所述胚和子叶流通到所述堰板的底部。

63.如权利要求37所述的设备，其中所述分离器包括将子叶从胚分离的筛网。

64.从批量的种子中自动分离可转化植物组织的方法，其中使用权利要求37所述的设备，所述方法包括如下步骤：

将所述批量的种子收集性地通过分离器，以从所述批量的种子中分离可转化植物组织的流；和

通过向所述可转化植物组织的细胞中引入遗传物质来转化所述可转化植物组织。

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