BR122017021411B1 - Métodos e aparelhos para obtenção de embriões adequados para cultura de tecido e/ou transformação genética - Google Patents
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(54) Título: MÉTODOS E APARELHOS PARA OBTENÇÃO DE EMBRIÕES ADEQUADOS PARA
CULTURA DE TECIDO E/OU TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA (51) lnt.CI.: A01H 4/00; A01C 1/00; C12M 3/08; C12M 3/02; A23N 5/00 (30) Prioridade Unionista: 31/08/2007 US 60/969,287 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): WHITNEY R. ADAMS, JR.; BRANDON DAVIS; LUBOMYR KUCHER; BRENDA LOWE; BRIAN MARTI NELL; JYOTI ROUT (85) Data do Início da Fase Nacional: 05/10/2017
1/99
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS E APARELHOS PARA OBTENÇÃO DE EMBRIÕES ADEQUADOS PARA CULTURA DE TECIDO E/OU TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA.
[001] Dividido do PI0815980-7, depositado em 29.08.2008. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Esse pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. N° de Série 60/969.287, depositado em 31 de agosto de 2007, cuja descrição completa está aqui incorporada por referência.
1. Campo da Invenção [003] A presente invenção refere-se de modo geral a isolar substancialmente tecidos de planta-alvo, tais como embriões, que são adequados para transformação genética ou cultura de tecido.
2. Descrição da Técnica Relacionada [004] A preparação de tecidos para a propagação, regeneração e transformação de planta é desgastante e muito trabalhosa, especialmente quando ela envolve, geralmente, a excisão manual de tecidos de plantas transformáveis ou cultiváveis. Por exemplo, no milho (Zea mays), os embriões imaturos individuais são tipicamente removidos manualmente para fornecer explantes geneticamente transformáveis. A excisão manual de tecidos embrionários é laboriosa e traz risco de lesão ergonômica para o trabalhador. Além disso, quando grandes quantidades de tecido de planta transformável são necessárias para a transformação de alto rendimento e produção de planta, mais trabalhadores devem ser empregados e treinados para alcançar a demanda aumentada. Adicionalmente, pode haver uma variabilidade significativa na qualidade dos tecidos de planta obtidos, dependendo do nível de experiência, cuidado, atenção e fadiga dos trabalhadores individuais. [005] A variabilidade do tecido e a falta de adaptabilidade para a automação em técnicas anteriores para o isolamento de tecidos de
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2/99 planta transformáveis é problemática, por que a baixa qualidade dos tecidos afeta negativamente a cultura do tecido, a transformação genética e a propagação da planta subsequentes. Não obstante, para produzir até uma única planta transgênica adequada para o desenvolvimento comercial e uso na agricultura, pode ser necessário produzir dezenas de milhares de eventos de transformação individuais em uma única espécie. Portanto, há uma grande necessidade na técnica de métodos aperfeiçoados de preparação de tecidos de planta-alvo que sejam mais eficientes, reduzam a sobrecarga ergonômica global sobre os trabalhadores, reduzam a quantidade de trabalho necessário para processar os materiais de planta e/ou que forneçam tecidos de planta que são de qualidade maior e mais consistentes do que os tecidos produzidos manualmente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Em um aspecto, a invenção fornece um método para a obtenção de embriões adequados para a cultura de tecido e/ou transformação genética, compreendendo pelo menos parcialmente remover um embrião de uma semente de planta em um meio líquido que consiste essencialmente em água e/ou um agente osmótico com uma osmolalidade de cerca de 0 mOsm/kg a cerca de 600 mOsm/kg, em que o embrião permanece viável para a cultura de tecido e/ou transformação genética depois da excisão do embrião da semente da planta. O agente osmótico pode ser ainda um agente osmótico inerte. Em uma modalidade adicional, o método compreende remover, pelo menos parcialmente, uma pluralidade de embriões de uma população de sementes de planta ou espigas no meio líquido. O agente osmótico pode ser selecionado do grupo que consiste em manitol, sorbitol, glicose ou outros agentes osmóticos. Em modalidades particulares, o meio consiste essencialmente em água e manitol em uma concentração entre cerca de 0,05 M a cerca de 0,5 M, ou sacarose em uma concentração
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3/99 entre cerca de 0,05 M a cerca de 0,5 Μ. O método pode compreender ainda a(s) etapa(s) de transformar geneticamente o embrião e regenerar a planta transgênica a partir do embrião transformado.
[007] Em certas modalidades do método, a etapa de transformar geneticamente o embrião compreende o uso de um meio de cocultura compreendendo um bactericida. Em modalidades particulares, o bactericida é a carbenicilina. Em outras modalidades, o meio de cocultura compreende cerca de 0,5 a 1,5 mg/l de 2,4-D.
[008] O embrião pode ser um membro das Poaceae, tal como o milho, o arroz, o trigo ou painço. Em modalidades particulares, o embrião é um embrião de milho ou um embrião de painço. Em outras modalidades, o embrião pode ser um embrião de soja, um embrião de algodão ou outro embrião de dicotiledônea.
[009] Em outra modalidade, o método compreende preparar um meio líquido em um sistema de preparação de meios compreendendo: (a) uma entrada de água; (b) uma entrada para o agente osmótico; e (c) uma câmara para misturar a água e o agente osmótico para produzir o meio líquido, em que a entrada de água e a entrada de agente osmótico estão acopladas à câmara para misturação para permitir a liberação da água e do agente osmótico para a câmara para a misturação. Em certas modalidades, a entrada de água e/ou a entrada de agente osmótico são acopladas a uma câmara ou câmaras para contenção da água e/ou do agente osmótico. O método pode compreender ainda o acoplamento da câmara para misturação a um aparelho de jato líquido. Em outras modalidades, o método compreende ainda esterilizar o meio líquido com um esterilizador selecionado do grupo que consiste em um filtro, uma fonte de UV ou radiação gama e uma fonte de calor esterilizante. O esterilizador pode esterilizar a água e/ou o agente osmótico antes de entrar na câmara de misturação. Alternativamente, o esterilizador esteriliza o meio líquido concomitantemente
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4/99 com e/ou depois de entrar na câmara de misturação. Em outra modalidade, o método compreende esterilizar o meio líquido depois que o meio líquido deixa a câmara de misturação.
[0010] O método pode compreender ainda medir o nível completo de uma ou mais câmaras para a contenção da água, a câmara para contenção do agente osmótico ou da câmara para misturação da água e do agente osmótico. Em modalidades adicionais, o método compreende liberar a água e o agente osmótico para a câmara de misturação da água e do agente osmótico. Em modalidades particulares, o método compreende controlar a liberação pela detecção eletronicamente da liberação de água e/ou do agente osmótico.
[0011] Em outro aspecto, o método para a preparação de um embrião de planta adequado para cultura de tecido e/ou transformação genética compreende: (a) colocar um tecido de semente de planta que compreende embriões de planta e/ou tegumentos de semente em um ambiente aquoso; (b) contatar o tecido com um agente que acople seletivamente aos embriões ou tegumentos de semente; e (c) isolar pelo menos um primeiro embrião baseado no acoplamento seletivo do agente ao embrião ou tegumento de semente. Em certas modalidades, o agente compreende bolhas de gás. Em modalidades particulares, as bolhas de gás têm uma dimensão média mais larga do que cerca de 100 mícrons a cerca de 1 mm. Em certas modalidades, as bolhas de gás compreendem um gás selecionado do grupo que consiste em ar, oxigênio, nitrogênio e uma combinação desses. Além disso, em certas modalidades, a etapa (c) compreende isolar o primeiro embrião baseado na flutuabilidade do embrião.
[0012] O método também pode compreender incluir no ambiente aquoso um tensoativo que reduz a coalescência das bolhas uma com a outra. Em certas modalidades, o tensoativo é selecionado do grupo que consiste em um poliéter, PPG (poli(propileno glicol)) e PEG (poPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 12/151
5/99 li(etileno glicol)). Em modalidades particulares, o PPG tem um peso molecular de cerca de 340 a cerca de 3500 Dáltons e o PEG tem um peso molecular de cerca de 100 Dáltons a cerca de 9000 Dáltons. [0013] Em outras modalidades, o agente compreende um segundo líquido que é imiscível com o ambiente aquoso. O segundo líquido pode ser selecionado do grupo que consiste em óleo vegetal, tal como óleo de canola, óleo mineral ou outro líquido hidrofóbico compatível com a sobrevivência e transformação dos embriões.
[0014] Em certas modalidades, o tecido de semente de planta compreende embriões produzidos, pelo menos parcialmente, pela excisão de um embrião de uma semente de planta em um meio líquido (ambiente aquoso) que consiste essencialmente em água e/ou um agente osmótico com uma osmolalidade de cerca de 0 mOsm/kg a cerca de 600 mOsm/kg, em que o embrião permanece viável para cultura de tecido e/ou transformação genética depois da excisão do embrião da semente de planta. Em modalidades particulares, o ambiente aquoso consiste essencialmente em um meio que compreende água e/ou um agente osmótico com uma osmolalidade de cerca de 7 mOsm/kg a cerca de 500 mOsm/kg. O método pode compreender colocar o tecido de semente de planta em um ambiente aquosos sem separar primeiro o embrião do tecido não embrionário. Em uma modalidade particular, o tecido de semente de planta é um tecido de semente de planta de milho. Em outras modalidades, o tecido de semente de planta é tecido de semente de planta de soja ou tecido de semente de planta de algodão.
[0015] Em outro aspecto, a invenção fornece um aparelho para a preparação do tecido de embrião de planta adequado para cultura de tecido e/ou transformação genética, compreendendo: (a) um recipiente para conter o tecido de semente de planta compreendendo uma pluralidade de embriões de planta e tecido não embrionário, tal como teguPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 13/151
6/99 mentos de semente de planta, em um ambiente aquoso; e (b) pelo menos um primeiro injetor para liberação no ambiente aquosos de um agente que se acople seletivamente aos embriões ou tegumentos de semente, em que o injetor produz bolhas de gás com um diâmetro médio entre cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mm. Em certas modalidades, a invenção fornece um aparelho, em que o recipiente é preenchido com o meio e o tecido de planta compreendendo o embrião e o tecido não embrionário. Em modalidades particulares, o aparelho compreende ainda um coletor para separação do tecido embrionário baseado na flutuabilidade dos embriões dentro do ambiente aquoso. Em outras modalidades ainda, as bolhas de gás podem compreender um gás selecionado do grupo que consiste em ar, oxigênio, nitrogênio e uma combinação desses.
[0016] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a preparação de embriões de planta adequados para cultura de tecido e/ou transformação genética compreendendo: (a) direcionar um primeiro jato de meio líquido sobre um grão de milho ou outro tecido compreendendo um embrião de planta para extrair o endosperma do grão ou do tecido; e (b) direcionar um segundo jato de meio líquido sobre o grão ou tecido para extrair um embrião do grão ou do tecido. Em certas modalidades, o meio líquido consiste essencialmente em água ou um agente osmótico com uma osmolalidade de cerca de 7 mOsm/kg a cerca de 500 mOsm/kg. Em uma modalidade particular, o grão pode estar compreendido em uma espiga de milho. Em certas modalidades, o método pode compreender ainda mover a espiga de milho em relação ao primeiro e segundo jato para remover o endosperma e o embrião do grão em sucessão. Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo jato compreendem uma largura menor do que a do grão de milho. Em modalidades particulares, o primeiro e/ou segundo jato compreendem uma largura de cerca de 0,0762 mm (0,003)
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7/99 e uma altura de cerca de 25,4 mm (1) e o primeiro e/ou segundo jato são produzidos em uma pressão entre cerca de 206,8 kPa (30 psi) a cerca de 517,1 kPa (75 psi).
[0017] Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo jato podem ser direcionados a partir de um injetor que produz um fluxo líquido laminar estável em uma distancia de pelo menos 63,5 mm (2,5) do injetor. Em outras modalidades, o grão pode estar posicionado a cerca de 44,45 - 50,8 mm (1 %- 2) da ponta do injetor. Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo jatos contatam cada grão em uma fileira de grãos encontrada na espiga com, substancialmente, a mesma força.
[0018] Em outro aspecto, a invenção fornece um aparelho para obtenção de embriões de milho ou de outras plantas adequados para cultura de tecido e/ou transformação genética compreendendo (a) pelo menos um primeiro jato de líquido para direcionar o meio sobre um grão ou outro tecido de milho que compreende um embrião de planta; e (b) um aparelho para conter o grão ou outro tecido no trajeto do meio. O grão de milho pode estar compreendido sobre uma espiga de milho. Em certas modalidades, o aparelho para contenção do grão ou de outro tecido compreende uma lamina ou uma lamina cilíndrica. Em outras modalidades, o aparelho para contenção do grão ou de outro tecido compreende uma tela ou uma pluralidade de fendas; ou um carne ou parafuso de pressão que aplica força ao tecido a ser contido. A semente ou tecido do fruto podem ser contidos sobre o aparelho para contenção do grão ou de outro tecido por uma força mecânica, por fricção, força centrífuga ou força de sucção. Em modalidades particulares, o suporte pode compreender um carne de pressão, rosca ou parafuso. Em certas modalidades, o aparelho para contenção do grão ou de outro tecido é suspenso em uma fase gasosa, uma fase líquida ou é parcialmente suspenso em fases gasosa e líquida. Em outras modaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 15/151
8/99 lidades, o aparelho para contenção do grão ou de outro tecido é fixado em relação a uma força fluida ou é movível em relação a uma força fluida.
[0019] Outro aspecto da invenção compreende um método para a preparação de embriões de planta adequados para cultura de tecido e/ou transformação genética, em que o aparelho para a contenção do grão ou de outro tecido é centrifugado em um recipiente para aplicar força ao grão ou outro tecido.
[0020] O aparelho pode ser definido ainda como compreendendo um primeiro e segundo jatos líquidos. Adicionalmente, em certas modalidades o dispositivo para a contenção do grão compreende meios para mover a espiga de milho em relação ao primeiro e segundo jatos de líquido para controlar o ângulo de contato entre o primeiro e segundo jatos de líquido e o grão. Em modalidades particulares, o aparelho compreende ainda um detector para identificar o tecido do endosperma e os embriões removidos.
[0021] Em certas modalidades, o aparelho compreende ainda pelo menos um primeiro separador para isolar embriões do tecido não embrionário. Em modalidades particulares, o separador separa embriões adequados para cultura de tecido de tecido não embrionário por um método selecionado do grupo que consiste em exclusão de tamanho, densidade diferencial e hidrofobicidade diferencial. O aparelho pode ser definido ainda como compreendendo uma peneira para separação de embrião de tecido não embrionário baseado no tamanho. Em uma modalidade particular, o aparelho para contenção do grão compreende pelo menos um primeiro motor para mover a espiga de milho em relação ao jato de líquido ou vice versa.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0022] Figura 1 descreve uma modalidade de um aparelho fornecido pela invenção que usa pressão mecânica positiva para substanciPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 16/151
9/99 almente isolar os embriões, como descrito no Exemplo 4.
[0023] Figura 2 descreve uma modalidade de um aparelho fornecido pela invenção que usa pressão positiva no jato de líquido para desalojar os embriões das sementes como descrito no Exemplo 7. Legenda: (A) robô com movimentação nas dimensões X, Y e Z, (B) motor para girar a espiga de milho, (C) fixador, (D) punho para segurar a espiga de milho, (E) defletor para evitar que o material respingue para cima, (F) flange para evitar que o material respingue para cima, (G) abertura para direcionar o líquido, (H) tubo transparente, (I) espiga de milho, (J) tela de agitação, (K) gaze de algodão ou outro material poroso e (L) recipiente para rejeitos.
[0024] Figura 3 descreve uma modalidade de um mecanismo de montagem que usa um punho magnético pelo qual a espiga de milho pode ser atada a um braço robótico, como descrito no Exemplo 7. [0025] Figura 4 descreve uma modalidade de um injetor útil em certos aspectos da invenção, como descrito no Exemplo 7. Esse injetor gera um jato de líquido substancialmente uniforme, como uma lamina plana.
[0026] Figura 5 descreve uma modalidade de um aparelho útil nos métodos da invenção, como descrito no Exemplo 13. Esse aparelho inclui um injetor para geração de jato de líquido substancialmente laminar e um cabeçote de sucção opcional. A Figura 5 (acima) representa um corte transversal de uma modalidade de tal aparelho, mostrando como o injetor, o cabeçote de sucção opcional e a espiga de milho podem ser posicionados um em relação ao outro. A Figura 5 (abaixo) representa esquematicamente uma espiga de milho posicionada no aparelho. Legenda (A) base, (B) injetor, (C) eixo acoplado a base da espiga, (D)cabeçote de sucção, (E) espiga de milho e (F) abertura para orientação do fluxo de líquido.
[0027] Figura 6 representa uma modalidade de um componente
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10/99 útil para aplicação de pressão negativa útil nos métodos da invenção, como descrito no Exemplo 13. Legenda: (A) uma ou mais aberturas para orientação do fluxo de líquido.
[0028] Figuras 7A-C representam aspectos diferentes de uma modalidade de um aparelho que usa uma combinação de forças e é útil em certos aspectos da invenção, como descrito em detalhes no Exemplo 13. Esse aparelho inclui uma bomba com um bordo de ataque capaz de aplicar uma quantidade pré-definida de pressão mecânica na base dos grãos que previamente tiveram o pericarpo aberto ou truncado e um componente para aplicar líquido com pressão negativa. Esse aparelho pode incluir ainda um meio para dispersão de líquido ou para direcionamento do fluxo de líquido.
[0029] Figura 8 representa uma modalidade da invenção, na qual o topo de um cilindro é completamente, parcialmente ou substancialmente revestido com uma membrana ou uma lamina de material flexível que é discretamente menor do que o diâmetro da espiga de milho e o punho ao qual a espiga de milho é acoplada. Especificamente, é mostrada uma membrana de borracha de silicone antirrespingo (espessura de 0,79375 mm (1/32)) de McMaster-Carr (McMaster-Carr, Atlanta, GA; por exemplo, cat. n° 9010K11). Um orifício de 25,4 mm (1) de diâmetro foi feito na membrana. A espiga de milho foi capaz de se mover para baixo através da abertura e também de volta para cima através dela.
[0030] Figura 9 representa um cilindro graduado de polimetilpenteno de 1 litro com o fundo cortado. Três jatos de líquido são passados em orifícios cortados na parede do cilindro. O aparelho completo pode ser autoclavado antes do uso. Para a operação, o topo do cilindro pode ser guarnecido com um defletor antirrespingo e a espiga de milho baixada dentro do cilindro tal que os jatos de líquido desalojem os conteúdos de cada grão. O material desalojado cai depois no fundo do
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11/99 cilindro para processamento posterior.
[0031] Figura 10 representa uma espiga de milho mostrando a localização do embrião dentro de um grão individual. Também é mostrada uma modalidade da invenção na qual um jato de líquido é direcionado para o lado basipetal do grão, em oposição ao lado acrópeto onde o embrião está localizado.
[0032] Figura 11 ilustra uma modalidade de um Sistema de Preparação de Meio fornecido pela invenção.
[0033] Figura 12 ilustra uma vista geral da câmara de misturação de um sistema de preparação de meio fornecido pela invenção.
[0034] Figura 13 ilustra uma vista de perto da câmara de misturação.
[0035] Figura 14 representa um zoom da câmara de misturação, com um dispositivo de posicionamento e uma placa de suporte.
[0036] Figura 15 representa um zoom da porção inferior do Sistema de Preparação de Meio em posição de funcionamento.
[0037] Figura 16 representa um zoom da porção superior do Sistema de Preparação de Meio em posição de funcionamento.
[0038] Figura 17 representa uma vista em corte transversal de um aparelho para separação em fases de embriões de milho.
[0039] Figura 18 ilustra um dispositivo de madeira de tília para dispersão de bolhas em forma de espiral.
[0040] Figura 19 ilustra embriões flutuando no alto da espuma produzida por um dispositivo de madeira de tília para dispersão de bolhas em forma de espiral.
[0041] Figura 20 ilustra a separação de embriões dos endospermas pelo uso de um processo de flutuação.
[0042] Figura 21 representa um dispositivo de filtro a vácuo usado para coletar os embriões da espuma na superfície de uma interface arlíquido de um separador de embrião.
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12/99 [0043] Figura 22 compreende um diagrama esquemático de um dispositivo de separação de embrião como descrito no Exemplo 19. [0044] Figura 23 representa um dispositivo alternativo para separação de embriões pela flutuação como descrito no Exemplo 20.
[0045] Figura 24 ilustra uma vista superior de um extrator de embrião em um dispositivo de combinação para extração e separação de tecido de embrião de milho de tecido de cultura.
[0046] Figura 25 representa uma vista inferior de um extrator para rotação e extração de embriões de múltiplas espigas.
[0047] Figura 26 ilustra uma vista lateral de um separador de embrião.
[0048] Figura 27 ilustra um regulador de nível líquido exemplar.
[0049] Figura 28 ilustra uma tela metálica e fixadores de fendas para tecido de semente e/ou fruto.
[0050] Figura 29 representa uma folha e uma modalidade cilíndrica de um fixador de semente ou fruto.
[0051] Figura 30 ilustra uma modalidade de um fixador de semente ou fruto compreendendo um carne ou parafuso de pressão.
[0052] Figura 31 ilustra um separador de explante compreendendo um dispositivo de madeira de tília para dispersão de bolhas utilizado para a separação de tecido embrionário de algodão.
[0053] Figura 32 representa explantes de algodão flutuando na superfície da espuma produzida no dispositivo de dispersão de microbolhas mostrado na Figura 31.
[0054] Figura 33 representa uma comparação da pureza de explantes de algodão produzidos tanto através da excisão e peneiração (esquerda) quanto da excisão, peneiração e depois purificação adicional usando a tecnologia de micro-bolhas (direita).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0055] A menos que definido de outra maneira, todos os termos
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13/99 técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente compreendido por aquele versado na técnica a qual essa invenção pertence, quando empregados no contexto do presente pedido. Onde houver inconsistências entre o texto do pedido e o material incorporado por referência, são propostas as definições e significados fornecidos no presente pedido. A nomenclatura usada aqui e a fabricação ou procedimentos de laboratório descritos abaixo são bem conhecidos e comumente empregados por aqueles versados na técnica. [0056] As frases substancialmente isolado ou extraído referemse ao processamento de um tecido-alvo (por exemplo, um embrião ou outro explante de tecido) que reside ou forma parte de um complexo de tecido principal (por exemplo, uma semente), tal que o tecido-alvo está fisicamente separado de pelo menos metade do complexo principal. Em algumas modalidades, um tecido-alvo substancialmente isolado pode ser fisicamente separado de pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% do complexo principal ou qualquer fração desse. Em outras modalidades, o tecido-alvo está fisicamente separado de mais do que cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 90% a cerca de 100% ou cerca de 99% a cerca de 100% do complexo principal ou qualquer fração intermediária. Em algumas modalidades, o tecido-alvo pode ser fisicamente separado de cerca de 100% do complexo principal.
[0057] Embora um tecido-alvo substancialmente isolado esteja fisicamente separado de alguma percentagem do complexo principal, ele não precisa necessariamente ser purificado a partir daquele complexo. Em outras palavras, o tecido-alvo substancialmente isolado pode permanecer em um lote com o complexo de tecido principal, desde que o tecido-alvo esteja fisicamente separado do complexo (como descrito acima). Em algumas modalidades, entretanto, pode ser desejável remover um pouco ou todo o complexo separado do tecido-alvo
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14/99 substancialmente isolado. Todas tais modalidades estão dentro do escopo da presente invenção.
[0058] A frase tecido de planta-alvo refere-se a uma porção de um tecido de planta ou semente que se procura isolar substancialmente. Na presente invenção, o tecido de planta-alvo refere-se a quaisquer porções de uma planta ou semente de planta que podem ser substancialmente isoladas e usadas para transformação genética ou cultura de tecido. Em algumas modalidades, o tecido de planta-alvo é um embrião, tal como um embrião imaturo de uma monocotiledônea tal como o milho. Em outras modalidades, o tecido de planta-alvo é de uma planta dicotiledônea tal como a soja (Glycine sp. incluindo Glycine max) ou algodão (Gossypium sp. incluindo G. hirsutum).
[0059] A frase adequado para transformação genética e adequado para cultura de tecido refere-se a tecidos de planta que são competentes para a transformação ou crescimento sob condições adequadas para cultura de planta, respectivamente. Aquele versado na técnica pode rapidamente determinar se um tecido-alvo em particular é adequado para a transformação genética ou cultura de tecido pelo uso da experimentação de rotina. Por exemplo, uma amostra de um lote de tecidos-alvo substancialmente isolados pode ser cultivada sobre meios adequados para planta (também conhecidos por aqueles versados na técnica) para determinar se os tecidos são capazes de desenvolvimento e regeneração. Similarmente, amostras de tecidosalvo substancialmente isolados podem ser submetidas à transformação e selecionados quanto à presença de uma molécula de ácido nucleico heterólogo. Tais técnicas são de rotina e podem rapidamente identificar quais tecidos são competentes para transformação ou cultura de tecido e quais, se houver, não são.
ISOLANDO SUBSTANCIALMENTE TECIDOS DE PLANTA-ALVO [0060] A presente invenção fornece métodos para isolar substanPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 22/151
15/99 cialmente tecidos de planta-alvo para transformação genética e/ou cultura de tecido. Em algumas modalidades, o tecido de planta-alvo é um embrião. Em uma modalidade, os embriões são embriões de monocotiledônea, tais como de milho. Em algumas modalidades, o tecido de planta-alvo substancialmente isolado pode ser isolado totalmente ou em parte. Por exemplo, um lote de embriões imaturos substancialmente isolados pode incluir embriões intactos, embriões parciais ou suas misturas. Preferivelmente, os tecidos intactos e/ou parciais são adequados para transformação genética, propagação de tecido, regeneração de planta ou outras aplicações de cultura de tecido.
[0061] Como os tecidos são isolados usando, por exemplo, fluxos de um meio selecionado, deve ser fornecido um receptáculo coletor. Em algumas modalidades, é útil fornecer uma cobertura para tais receptáculos coletores, a fim de aperfeiçoar a eficiência do aparelho, reduzir a desordem, evitar o respingo indesejável do fluxo do jato e/ou limitar a fuga de tecidos extraídos durante a coleta. Qualquer receptáculo adequado ou cobertura de receptáculo podem ser empregados. Exemplos são dados em outro lugar nesse pedido e também são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0062] Coberturas adequadas para o receptáculo podem incluir aquelas feitas de metais, madeira, vidro, telas, tecidos, plásticos, borrachas, látex, acrílicos e materiais funcionalmente equivalentes. Em algumas modalidades, o material é flexível de maneira a permitir a penetração e a remoção de uma espiga de milho, enquanto mantém um lacre substancialmente estanque a água durante o processo de extração. O material pode ser fornecido com uma abertura adequada para permitir a entrada e a remoção de uma espiga de milho. Em algumas modalidades, o material é sólido e contém um orifício flexível para receber e conter a espiga durante a extração. Em outras modalidades, o material é flexível. Tais materiais flexíveis podem ser esticados sobre o
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16/99 receptáculo para formar um encaixe estanque para o líquido, mas permitindo a inserção de uma espiga tanto pela penetração do material quanto pelo fornecimento de uma abertura para receber a espiga de milho. Em outras modalidades ainda, o material é uma rede ou uma tela que tem uma abertura flexível.
[0063] As coberturas podem ser removíveis ou acopladas semipermanentemente. Em algumas modalidades, os materiais são seguros por uma banda elástica ou meios de segurança equivalentes. Em outras modalidades, a cobertura é mantida no lugar por pesos, anéis de fricção, ganchos, molas ou outros meios de segurança funcionalmente equivalentes.
[0064] A cobertura pode ser feita de material flexível e ter espessuras variáveis. Esses fatores podem ser variados a fim de se obter os efeitos desejados para inserção e extração de espigas de milho. A tabela a seguir (Tabela 1) ilustra alguns parâmetros de dureza e densidade de coberturas de silicone. A invenção, entretanto, não está limitada a essas poucas escolhas.
Tabela 1. Parâmetros de dureza e densidade de coberturas.
Dureza de durômetro
10A
10A
20A
20A
40A
40A
Espessura da membrana (polegadas)
1/32
1/16
1/32
1/16
1/32
1/16 [0065] Em uma modalidade, o receptáculo coletor é coberto com uma membrana ou folha de material flexível que é discretamente menor do que o diâmetro da espiga de milho e do punho ao qual ela está acoplada. Em uma modalidade alternativa, são feitas pequenas incisões na membrana para fornecer maior flexibilidade. A membrana pode ser acoplada ao cilindro por meios tais como uma banda elástica ou
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17/99 um anel de fricção ajustado ou semelhantes. A Figura 8 ilustra uma modalidade de cobertura e meio de acoplamento descrito acima.
[0066] Em algumas modalidades, o material é autoclavável. Materiais autoclaváveis são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um material flexível tal como uma lamina de borracha de silicone macia pode ser usada. Aquele versado na técnica está ciente dos materiais possíveis e arranjos físicos que permitirão a extração enquanto fornecem um vaso coletor que reduza o escape do tecido extraído e evite respingos indesejáveis.
[0067] Procedimentos adequados para cultura e regeneração de tecido de planta são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Número 5.550.318 de Adams et al., Patente dos Estados Unidos Número 5.780.708 de Lundquist et al., Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0210958 de Duncan et al., Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0016030 de Lowe et al., e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0244075 de Cai et al., que descrevem métodos de transformação úteis com milho e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2003/0024014 de Cheng et al. que descreve métodos de transformação úteis com trigo, todos os quais estão incorporados por referencia aqui em sua totalidade. As aplicações de cultura de tecido podem incluir pelo menos um processo selecionado a partir de transformação, formação de calo, formação de tecido de planta diferenciado, formação de pelo menos uma planta madura, formação de pelo menos uma planta madura fértil e combinações desses processos. As plantas regeneradas dos embriões extraídos imaturos podem ser regeneradas, por exemplo, através da diferenciação de tecido (calos) desdiferenciados. Plantas regeneradas podem ser cultivadas até a maturidade para fornecer plantas maduras, incluindo plantas maduras férteis. Os emPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 25/151
18/99 briões imaturos extraídos e tecidos não embrionários extraídos também podem ser usados para outros propósitos, tais como, mas não limitado à análise genética ou bioquímica.
[0068] Os métodos e aparelhos da presente invenção podem ser aplicados a quaisquer plantas monocotiledôneas de interesse. As monocotiledôneas preferidas incluem, mas não são limitadas a membros da família Poaceae, incluindo culturas de grãos tais como milho, trigo, cevada, aveia, centeio, sorgo, painço e arroz. As monocotiledôneas particularmente preferidas incluem a espécie Zea incluindo milho (Zea mays) e painço (por exemplo, Pennisetum glaucum, Pennisetum sp. Setaria sp, Panicum sp.) que têm grãos múltiplos (sementes) tipicamente ordenados em fileiras sobre uma espiga.
[0069] Em geral, as sementes de monocotiledôneas a partir das quais os tecidos-alvos são substancialmente isolados são fornecidas de qualquer maneira adequada. Por exemplo, as sementes podem estar acopladas à espiga ou ao punho sobre o qual as sementes se desenvolvem; em algumas modalidades, as sementes de monocotiledônea podem ser removidas a partir da espiga ou punho antes de substancialmente purificar o tecido-alvo.
[0070] Em algumas modalidades, uma abertura no pericarpo ou no revestimento da semente das sementes de monocotiledônea é fornecida. Isso pode ser obtido por qualquer técnica adequada, tal como, mas não limitado a fazer um furo, uma punção ou uma incisão com uma agulha, furador, lâmina ou outro implemento adequado. Em algumas aplicações do método, nenhum tecido de pericarpo precisa ser removido; em outras modalidades, a abertura no pericarpo pode incluir a remoção de pelo menos parte do pericarpo e possivelmente de algum tecido não embrionário (por exemplo, endosperma). Preferivelmente, a abertura é suficiente para separar substancialmente o embrião da semente. Em algumas modalidades, pode ser necessário
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19/99 apenas enfraquecer o pericarpo suficientemente (por exemplo, pela abrasão ou por outro tratamento físico, químico ou enzimático) tal que a aplicação de força à semente resulta em isolamento substancial do tecido-alvo, tal como o embrião.
[0071] Em tal método, a força é geralmente aplicada às sementes o suficiente para isolar substancialmente o tecido-alvo, tal como um embrião imaturo, em que o tecido-alvo substancialmente isolado é adequado para transformação genética e cultura de tecido. A força pode ser aplicada a múltiplas sementes consecutivamente ou simultaneamente. A força aplicada pode ser contínua ou não contínua (por exemplo, pulsátil ou ondulatória) e é geralmente aplicada mecanicamente, ou seja, através do uso de um aparelho ou máquina ao invés da mão humana. A quantidade de força aplicada é preferivelmente suficiente para ultrapassar a adesão do alvo (por exemplo, embrião) e do não alvo (por exemplo, tecido não embrionário tal como endosperma) um do outro, permitindo assim a separação dos tecidos de alvo e não alvo. Qualquer força ou forças podem ser empregadas para a remoção do tecido-alvo de sua semente e múltiplas forças podem ser usadas em combinação, sequencialmente ou simultaneamente. As forças adequadas incluem, mas não são limitadas a jato de fluido com pressão positiva, jato de líquido com pressão positiva, pressão positiva mecânica, pressão negativa, força centrífuga, aceleração linear, desaceleração linear, cisalhamente fluido, fluxo fluido turbulento e fluxo fluido laminar. As forças fluidas podem ser exercidas por qualquer fluido, por exemplo, gases ou líquidos ou uma combinação de ambos.
[0072] Como um embrião de milho está localizado no lado acrópeto de um grão, é possível direcionar um jato de líquido para o lado basipetal do grão, se desejado, para ejetar o embrião com sucesso (Veja, por exemplo, Figura 10). Em tal arranjo, a força total do jato geralmente não impacta diretamente o embrião. Particularmente, a quantidade
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20/99 substancial da força é aplicada apenas indiretamente ao próprio embrião. Portanto, forças maiores podem ser aplicadas no aparelho para acelerar a remoção de embriões sem aumentar substancialmente o dano aos embriões a serem removidos.
[0073] Forças de grande impacto podem ser fornecidas forçando grandes quantidades de líquido através do aparelho da presente invenção. Em algumas modalidades, entretanto, forças de grande impacto podem ser geradas sem usar mais líquido. Por exemplo, em algumas modalidades, o tamanho da abertura do jato é reduzida tal que o mesmo volume de líquido pode ser usado com maior velocidade. Como a energia de um objeto em movimento é proporcional ao quadrado da velocidade, um jato com o mesmo volume pode ter uma energia muito maior. Uma equação simples para energia cinética de um objeto em movimento é igual a (1/2)(m)(v2). O cálculo do impacto de energia real de um jato de líquido pode levar em consideração outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. Além disso, algumas modalidades podem usar uma combinação de fluido aumentado e alterações no tamanho das aberturas do jato para se obter a força ou energia desejadas.
[0074] Injetores com graduações gpm de cerca de 0,01 a cerca de 0,25, por exemplo, podem ser usados na presente invenção, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,2, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,1, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 ou 0,015 ou qualquer número inteiro ou fração entre essas quantidades. Em algumas modalidades, podem ser usados injetores com baixas graduações gpm, como 0,033 ou 0,021 gpm. Quando tais injetores são usados com alta pressão, mas direcionados para o lado oposto do grão do embrião, pode ser obtida a coleta acelerada do embrião enquanto se evita o dano ao embrião.
[0075] Em algumas modalidades, são fornecidos jatos múltiplos
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21/99 em um aparelho da presente invenção. Tal aparelho é útil para equalizar a força exercida pelos jatos de fluido enquanto diminui o tempo necessário para coletar os embriões a partir de uma espiga de milho. [0076] Em algumas modalidades, o aparelho pode ter 2, 3, 4, 6, 8, 10 ou mais aberturas/injetores de jato como desejado para conduzir a força do fluido. Em uma modalidade há três aberturas. Tal aparelho está representado na Figura 9. Em algumas modalidades, as aberturas são fornecidas como fluxos de jato laminar de ângulo estreito, orientados horizontalmente. Entretanto, outras modalidades das aberturas de jato são fornecidas em outro lugar através desse pedido. Os componentes do injetor de spray em aço inoxidável que se conectam diretamente no cilindro graduado de polimetil pente no representado na Figura 9 são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2. Componentes do injetor de spray.
| Descrição do componente | Sistemas de Spray N° de cat. | Comentários |
| Adaptador do suporte da parede | 4865 SS | Roscas na parede do cilindro |
| Extremidade do spray, fluxo sólido | TP000067-SS | ângulo do spray 0°, 0,067 gal/min (~253 ml/min) |
| Filtro da tela (trama 200) | 6051-SS-200 | Remove resíduos que podem obstruir a ponta do spray |
| Corpo da fêmea | CP1321-SS | Fornece conexão a rosca macho do tubo de 6,35 mm (1/4) NPT |
[0078] Os componentes restantes são principal mente tubulações e conexões com um adaptador macho de conexão rápida na fonte de fluido à direita da foto (Figura 9).
[0079] Um método e um aparelho da invenção podem fornecer ainda a separação do tecido-alvo substancialmente isolado, tal como embriões imaturos, de tecido não embrionário tal como endosperma,
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22/99 glumas e revestimento de semente ou tecidos do pericarpo. A separação pode ser obtida por uma ou mais técnicas adequadas, incluindo, mas não limitadas à separação por exclusão de tamanho (por exemplo, pela filtração em uma ou mais etapas de filtração), separação baseada em hidrofobicidade, hidrofilicidade ou outras forças e separação por diferenciais de massa ou densidade (por exemplo, separação por centrifugação, assentamento e decantação). A etapa ou etapas de separação podem ser opcionais, por exemplo, onde nenhum isolamento adicional de embriões intactos ou parciais é necessário para seu uso em cultura de tecido.
[0080] A invenção é particularmente adequada para aplicações onde um grande número de tecidos-alvo deve ser fornecido, por exemplo, em processos de alto rendimento ou seleção ou no processamento de um lote para transformação genética ou cultura de tecido. A automação do método é possível, por exemplo, pelo emprego da robótica ou do manuseio mecânico das espigas ou sementes de milho, abertura do pericarpo, aplicação de força a semente ou etapas de separação opcionais. Tal automação pode usar sensores ópticos ou mecânicos para auxiliar no posicionamento das espigas ou sementes de milho em relação à força ou forças aplicadas ou na etapa de separação. Em uma modalidade, o método fornece embriões substancialmente isolados em uma taxa entre cerca de 250 a 50.000 ou mais embriões por dia ou entre cerca de 500 a cerca de 100.000, ou entre cerca de 250 a cerca de 50.000, ou entre cerca de 250 a cerca de 20.000, ou entre cerca de 250 a cerca de 10.000, ou entre cerca de 250 a cerca de 5000, ou entre cerca de 250 a cerca de 3000, ou entre cerca de 250 a cerca de 1000 embriões por dia; ou entre cerca de 1000 a cerca de 50.000 embriões por dia e semelhantes, incluindo qualquer fração ou número inteiro entre qualquer uma das faixas mencionadas acima. Como observado acima, a presente invenção supera as limitações de
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23/99 rendimento significativas da excisão manual de embriões.
APARELHOS PARA ISOLAR SUBSTANCIALMENTE TECIDOS DE
PLANTAS-ALVO [0081] A presente invenção também fornece um aparelho para isolar substancialmente os tecidos-alvo, tais como embriões de milho, que são adequados para transformação genética e cultura de tecido. Em uma modalidade de separação de embriões de milho, tal aparelho pode compreender pelo menos uma abertura para direcionar um fluxo de fluido, em que o fluxo de fluido contata os grãos de uma espiga de milho e isola substancialmente os embriões dos grãos. Geralmente, é preferido que o fluxo de fluido contate o máximo de grãos em um dado período de tempo conforme for conveniente, de maneira a isolar os embriões mais rapidamente. A abertura pode incluir uma abertura única ou múltiplas aberturas, por exemplo, injetores únicos ou múltiplos, que podem incluir injetores que produzem jatos de fluido planar, redondo, oval, em forma de leque ou outros padrões, e injetores ajustáveis, móveis ou estacionários, e que podem gerar um fluxo de fluido de qualquer tamanho e meio adequados. Os fluidos podem ser gases, tais como ar, nitrogênio ou misturas de gases, líquidos, tais como água, salina fisiológica ou vários meios de cultura, meios como descritos abaixo, ou combinações. Fluxos de fluido adequados incluem, mas não são limitados a jatos fluidos, tais como jatos colunares únicos ou múltiplos; jatos ou sprays planares, em forma de cone ou em forma de leque; e jatos semelhantes a lâminas, fluxo de fluido laminar e fluxo de fluido turbulento. Fluxos de fluidos adequados podem resultar em uma variedade de forças para remover o embrião do seu grão, incluindo pressão positiva ou pressão negativa ou ambas; tais forças podem ser uniformes ou não uniformes, contínuas ou não contínuas (tais como força pulsátil ou ondulatória) ou qualquer combinação dessas.
[0082] Um aparelho da invenção pode incluir ainda um meio para
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24/99 mover o tecido-alvo a ser substancialmente purificado e o fluxo de fluido, em relação um ao outro. Por exemplo, tanto a espiga de milho que contém as sementes quanto o fluxo de fluido ou ambos podem se movidos. Várias modalidades do aparelho podem ser usadas com espigas de milho únicas ou múltiplas, intactas ou parciais. Por exemplo, a espiga ou espigas de milho podem ser acopladas a um suporte ou punho, que é movido em relação ao fluxo de fluido. Em outras modalidades, entretanto, a espiga ou espigas de milho não precisam ser acopladas individualmente a um fixador, mas podem ser movidas livremente de maneira a permitir que múltiplos grãos sejam contatados pela força usada para remover os embriões dos grãos. Os recursos para mover pelo menos uma espiga de milho em relação ao fluxo de fluido podem girar a espiga de milho e a abertura uma em relação à outra, ou podem mover o fluxo de fluido ao longo do eixo longitudinal da espiga de milho ou podem fornecer qualquer movimento tridimensional da espiga de milho e da abertura, uma em relação à outra, tal como uma combinação de rotação e movimento longitudinal.
[0083] A invenção fornece ainda um separador para separar os tecidos-alvos dos tecidos não-alvo. Por exemplo, os embriões podem ser separados de tecidos não embrionários, em que os embriões separados compreendem pelo menos alguns embriões de milho adequados para transformação genética ou cultura de tecido. Os separadores podem funcionar por um mecanismo que inclui, mas não se limita a separação por exclusão de tamanho (por exemplo, usando uma tela, peneira, superfície perfurada ou outro dispositivo capaz de excluir objetos de um certo tamanho), separação baseada em hidrofobicidade ou outras forças de atração (por exemplo, usando um material sólido ou fluido que possa atrair ou repelir os embriões) e separação por diferenciais de massa ou de densidade (por exemplo, usando uma centrífuga ou usando soluções para assentamento diferencial). Em certas modaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 32/151
25/99 lidades, o separador pode ser opcional, por exemplo, onde nenhum isolamento adicional de embriões intactos ou parciais é necessário para seu uso na transformação genética ou cultura de tecido.
[0084] Os embriões imaturos substancialmente isolados incluem pelo menos alguns embriões, tais como embriões imaturos intactos ou parciais, adequados para aplicações em cultura de tecido, formação de calo, embriogênese direta, formação de tecido de planta diferenciado, formação de pelo menos uma planta madura, formação de pelo menos uma planta madura fértil e combinações desses processos, como descrito acima. Os embriões imaturos substancialmente isolados e tecidos não embrionários também podem ser usados para outros propósitos, tais como, mas não limitados a análise genética ou bioquímica.
[0085] A presente invenção fornece ainda um aparelho para isolar substancialmente em um processo mecânico múltiplos embriões de milho adequados para transformação genética ou cultura de tecido a partir de pelo menos uma espiga de milho imatura. Em uma modalidade, o aparelho compreende pelo menos um componente selecionado de (a) pelo menos uma superfície sólida para aplicar pressão mecânica positiva ao exterior dos grãos de uma espiga de milho imatura; (b) uma abertura para orientar um fluxo de fluido, em que o fluxo de fluido contata os grãos sobre a espiga de milho; e (c) uma abertura para aplicação de pressão negativa ao fluido que contata os grãos sobre a espiga; em que o componente aplica força suficiente para isolar substancialmente embriões dos grãos adequados para transformação genética ou cultura de tecido. As forças podem ser aplicadas a múltiplas sementes consecutivamente ou simultaneamente, de uma maneira contínua ou não contínua e são geralmente aplicadas mecanicamente e não manualmente. Múltiplas forças podem ser usadas em combinação, sequencialmente ou simultaneamente. Forças adequadas incluPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 33/151
26/99 em, mas não são limitadas a jato de fluido com pressão positiva, jato de líquido com pressão positiva, pressão mecânica positiva, pressão negativa, força centrífuga, aceleração linear, desaceleração linear, cisalhamento fluido, fluxo de fluido turbulento e fluxo de fluido laminar. As forças fluidas podem ser exercidas sobre qualquer fluido, gases ou líquidos ou combinações de ambos.
[0086] Aparelhos de combinação da invenção podem incluir opcionalmente um meio para mover pelo menos uma espiga de milho em relação à fonte ou fontes de força para isolamento de embriões ou partes desses. A espiga ou espigas podem ser movidas em relação à fonte de força tal que a força ou forças contate o máximo de grãos em um dado período de tempo quanto for conveniente, de maneira a isolar os embriões mais rapidamente.
[0087] Aparelhos de combinação da invenção podem incluir ainda pelo menos um meio para separação posterior dos embriões imaturos substancialmente isolados adequados para transformação genética ou cultura de tecido. Os separadores podem funcionar por um mecanismo que inclui, nas não é limitado a separação por exclusão de tamanho, separação baseada em forças de atração e separação por diferenciais de massa ou densidade.
MEIO LÍQUIDO PARA EXCISÃO DE EMBRIÕES DE MILHO OU OUTRAS PLANTAS [0088] A presente invenção fornece em uma modalidade, meios e métodos para isolar substancialmente tecidos de planta-alvo adequados para transformação genética ou cultura de tecido. Por exemplo, um aparelho de jato fluido utiliza líquido para excisão de embriões, requerendo quantidades substanciais de líquido para excisão. Assim, por exemplo, cerca de 20 I de um meio líquido podem ser necessários para separar embriões de uma espiga de milho. Portanto, o meio é, preferivelmente, facilmente preparado (consistindo essencialmente em um
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27/99 ou dois ingredientes), esterilizável, por exemplo, através de uma unidade de filtração em linha, e pode fluir através de um aparelho de jato fluido que opera em uma pressão de cerca de 206,8 - 517,1 kPa (cerca de 30-75 psi), por exemplo, cerca de 275,18 - 413,7 kPa (cerca de 40-60 psi). Além disso, preferivelmente, ele não requer ajuste de pH antes do uso. Para economizar recursos e custos, também é, preferivelmente, reutilizável.
[0089] Meios de cultura tais como o meio de inoculação Lynx #1013 e Lynx #1902 (metade da concentração de Lynx #1013) têm sido usados com sucesso em um método automatizado e em um aparelho para excisão de embriões de milho para uso em cultura de tecido. Entretanto, esses meios têm múltiplos ingredientes e requerem ajuste de pH antes do uso. Assim, os presentes inventores desenvolveram meios que podem ser usados para otimizar a eficiência de um método automatizado de excisão de embrião para cultura de tecido. Surpreendentemente, os inventores descobriram, em particular, que meios que consistem essencialmente em água e/ou um agente osmótico, com uma osmolalidade de cerca de 0 mOsm/kg a cerca de 600 mOsm/kg, são úteis.
[0090] Em certas modalidades, uma osmolalidade de cerca de 0 mOsm/kg a cerca de 600 mOsm/kg para o agente osmótico é preferida, incluindo cerca de 7 mOsm/kg a cerca de 500 mOsm/kg, cerca de 13 mOsm/kg a cerca de 300 mOsm/kg, cerca de 25 mOsm/kg a cerca de 300 mOsm/kg, cerca de 50 mOsm/kg a cerca de 300 mOsm/kg, cerca de 13 mOsm/kg a cerca de 200 mOsm/kg, cerca de 13 mOsm/kg a cerca de 100 mOsm/kg ou cerca de 100 mOsm/kg a cerca de 300 mOsm/kg. Em modalidades específicas, os meios fornecidos consistem essencialmente em água destilada estéril, cloreto de cálcio diluído (por exemplo, cerca de 10 ppm), MES 0,05%, pH 5.4 a 5.8, cerca de 5% de sacarose +/- sais MS, ou cerca de 0,05 a 0,5 M de manitol, inPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 35/151
28/99 cluindo soluções de manitol 0,1 a 0,2 M. Embora a frequência de transformação (FT) de embriões de planta separados pelo uso de alguns de tais meios líquidos possa estar, às vezes, reduzida em relação àquela encontrada quando se usa, por exemplo, o Meio de Inoculação Lynx #1013, as eficiências significativas em tempo e custos que surgem do uso de meios mais simples podem sobrepujar qualquer redução de FT pela permissão da produção de mais explantes usando a mesma quantidade de recursos.
[0091] Em modalidades específicas da invenção, um meio para excisão compreende como um agente osmótico manitol e/ou sacarose, tais meios consistindo essencialmente em manitol 0,05 a 0,5M. Tais meios foram encontrados ser capazes de produzir explantes viáveis. Em modalidades particulares, um meio para excisão consiste essencialmente em cerca de 0,1 a 0,2M de manitol. A osmolalidade de uma solução de manitol 0,2 M em água é, por exemplo, cerca de 225 mOsm/kg. Em outras modalidades, água destilada estéril, assim como sacarose 5% (peso/volume) também foram descobertos serem meios simples, ainda eficazes, para uso com a invenção.
SISTEMA DE PREPARAÇÃO DE MEIOS [0092] Um Sistema de Preparação de Meios (MPS) para uso com um aparelho de jato fluido é outra modalidade dessa invenção. O MPS, por exemplo, pode ser usado para fornecer um meio de excisão descrito acima. O MPS pode consistir em uma caixa (MPSH) e uma câmara de misturação (MC). O MPS pode ser feito a partir de qualquer material adequado, tal como alumínio (por exemplo, alumínio aeronáutico classe 7075) ou aço. A câmara de misturação geralmente compreende um tanque com uma extremidade superior e inferior e pode compreender um flange e uma placa de cobertura. A placa de cobertura foi fornecida geral mente com um ou mais anéis de vedação ou outros meios de vedação que vedem a câmara de misturação. A placa de
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29/99 cobertura compreende aberturas para inserção e remoção de líquido e de outros ingredientes dos meios. O líquido e os outros ingredientes dos meios podem ser adicionados através de uma ou mais entradas, compreendidas na câmara de misturação, que podem se comunicar com uma câmara e/ou uma linha de suprimento que contem e/ou libera um suprimento dos ingredientes. A placa de cobertura também pode compreender um sensor eletrônico para monitorizar um volume especificado do meio que está sendo preparado. A câmara de misturação pode ser orientada sobre uma placa de suporte e mantida em posição de funcionamento por meios de fixação, tais como pinos de montagem e suportes de posicionamento. A placa de suporte pode ser conectada por deslizamento ao MPSH. Em certas modalidades, uma câmara de misturação é conectada a um aparelho de jato fluido, por exemplo, através de uma tubulação de aço ou policarbonato.
[0093] Um conjunto misturador pode ser acoplado à placa de cobertura ou à outra parte da câmara de misturação. O conjunto pode compreender um impulsor e um eixo montados em um meio para suspensão tal como rolamento para alta temperatura. O misturador pode ser autoclavado antes do uso. O MPS pode compreender ainda um Controlador Lógico Programável (PLC) em comunicação com os sensores para monitorizar o ingresso de componentes, a preparação do meio e a subsequente remoção dos meios, por exemplo, através de um tubo de saída de fluido para o aparelho de jato fluido. Um ou mais tubos de entrada e saída de fluido podem compreender uma unidade de filtração em linha para esterilizar os meios preparados.
APARELHOS PARA EXCISÃO DE EMBRIÕES EM FASE [0094] Os métodos e aparelhos para a preparação de múltiplos embriões adequados para cultura de tecido são modalidades da invenção, cujos métodos compreendem o uso de pelo menos dois fluxos de fluido para extrair substancialmente um embrião e o endosperma
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30/99 de uma semente, e o aparelho compreende pelo menos uma abertura para orientar um primeiro fluxo de fluido e um segundo fluxo de fluido, para extrair substancialmente um embrião de um núcleo de semente. Em certas modalidades, a semente ou o núcleo da semente é uma espiga de milho ou grão de milho.
[0095] Os fluxos de fluido podem ser fluxos de gás ou fluxos líquidos. Em certas modalidades, os fluxos de fluido compreendem um líquido e, em modalidades particulares, o líquido consiste essencialmente em água destilada, cerca de 5% de sacarose ou cerca de 0,05 M - 0,5 M de manitol, por exemplo, cerca de 0,1-a0,2 M de manitol. O fluxo de fluido pode exercer uma força para extrair substancialmente um embrião, compreendendo uma ou mais forças selecionadas do grupo que consiste em um jato de fluido com pressão positiva, jato de líquido com pressão positiva, pressão positiva mecânica, pressão negativa, força centrífuga, aceleração linear, desaceleração linear, cisalhamento fluido, fluxo fluido turbulento e fluxo fluido laminar. O fluxo de fluido pode ser contínuo ou pulsátil. Em modalidades particulares, o fluxo de fluido é estéril.
[0096] Um aparelho da invenção pode compreender ainda um meio para detectar o endosperma removido e o tecido do embrião e um meio para canalização de endospermas ou embriões para automação. Os meios para detecção e os meios para canalização podem estar ligados, por exemplo, eletronicamente, para auxiliar na automação. O aparelho também pode compreender, pelo menos, um separador para a separação dos embriões do tecido não embrionário, em que os embriões separados são embriões adequados para cultura de tecido. O separador pode separar embriões de tecidos não embrionários por hidrofobicidade diferencial, por exclusão de tamanho ou por diferencial de densidade. O tecido embrionário pode ser cultivado, transformado e/ou regenerado para fornecer pelo menos uma planta fértil. Em modaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 38/151
31/99 lidades particulares, o embrião é um embrião de milho e a planta é uma planta de milho.
SEPARAÇÃO DE EMBRIÕES POR FLUTUAÇÃO [0097] A invenção fornece ainda um aparelho e métodos para a separação de embriões baseados na afinidade diferenciada de um agente selecionado em relação a tecido não embrionário de semente. Em certas modalidades, os embriões, tais como embriões de milho produzidos por um processo de excisão com jato de fluido, são contatados e acoplados a bolhas através de interações hidrofóbicas. Em outras modalidades, os revestimentos da semente são contatados e acoplados a bolhas. As bolhas podem compreender um ou mais gases selecionados do grupo que consiste em um gás inorgânico, tal como argônio, ar, O2, N2; e um gás orgânico covalente tal como metano, etano ou propano, que não afetam seriamente a viabilidade e a transformabilidade dos embriões removidos.
[0098] O tamanho da bolha foi descoberto desempenhar um papel importante na eficiência do processo de separação. Na prática, bolhas (de gás) que apresentam uma faixa de tamanhos podem ser geradas. Entretanto, qualquer tamanho de bolha que seja adequado para o acoplamento aos embriões ou revestimentos de semente e os eleve para a superfície do fluido está dentro do escopo dessa invenção. [0099] A distribuição por tamanho das bolhas pode variar com vários fatores tais como:
[00100] Uniformidade da frita: as aberturas entre as partículas que compõem uma frita podem ser variáveis, permitindo que se formem bolhas de tamanhos diferentes.
[00101] Taxa de fluxo de gás: a taxa de fluxo de gás através da frita que gera bolhas também afeta o tamanho da bolha - por exemplo, um fluxo rápido de gás resulta em bolhas maiores.
[00102] Tensoativos e suas concentrações: aditivos para os meios,
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32/99 tais como manitol e PEG, assim como proteínas e outras substâncias com propriedades tensoativas liberadas dos grãos de milho rompidos podem afetar o tamanho da bolha.
[00103] Fusão das bolhas: conforme as bolhas sobem em direção ao topo do tanque, algumas delas se fundem com outras bolhas. [00104] Pressão hidrostática: as bolhas próximas do fundo de um tanque de flutuação serão, em média, discretamente menores por causa da maior pressão no fundo do tanque, embora esse efeito possa ser pequeno em vista do tamanho do tanque de flutuação.
[00105] Além disso, não é necessário que uma única bolha carregue um único embrião ou revestimento de semente por todo o trajeto até a superfície. Ao invés disso, um embrião ou revestimento de semente pode ser apenas parcialmente transportado até a superfície por uma única bolha, para ser transportado depois por um acoplamento sequencial de outras bolhas. Um embrião ou revestimento de semente também pode não alcançar a superfície e tornar-se embebido na espuma na primeira vez, mas pode circular várias vezes antes de chegar a interface das fases ar-líquido (por exemplo, a espuma).
[00106] Bolhas grandes, por exemplo, com cerca de 1 mm de diâmetro (isto é, se esféricas; ou com dimensões maiores se não esféricas) ou maiores, não atingem boa separação por várias razões. Por exemplo, tais bolhas se movem rápido o suficiente, de modo que elas empurram hidrodinamicamente os embriões assim como os resíduos para fora de seu caminho. Assim, tais bolhas grandes tendem a não contatar adequadamente os embriões. Tais bolhas também não têm tempo de contato suficiente com os embriões ou revestimentos de semente para permitir um acoplamento eficiente da bolha. Finalmente, tais bolhas geram uma força de cisalhamento alta o suficiente, enquanto sobem para a superfície do fluido que quaisquer embriões que estão aderidos às bolhas tendem a ser deslocados antes de atingir a
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33/99 superfície.
[00107] Bolhas pequenas, por exemplo, bolhas entorno de 100 micra de diâmetro ou menos, se acoplam a resíduos assim como a embriões. Isso por que as bolhas se movem tão lentamente através do fluido que elas não empurram materiais menores (por exemplo, fragmentos de endosperma) para fora do caminho. Assim, tais bolhas contatam e se acoplam a embriões assim como a outros resíduos menores. Finalmente, tais bolhas não geram força de cisalhamento suficiente para deslocar eficientemente os resíduos acoplados.
[00108] Bolhas de tamanho médio (entre 100 μίτι e 1 mm de tamanho) foram comparativamente mais eficientes na obtenção de purificação de embrião. Tais bolhas aparentemente produzem um deslocamento hidrodinâmico pequeno o suficiente para permitir que a bolha contate os embriões, permitindo assim que o acoplamento ocorra. Além disso, tais bolhas não geram força de cisalhamento suficiente para deslocar embriões acoplados.
[00109] Outro aspecto do processo de separação refere-se a natureza física do gás presente nas bolhas, isto é, a seletividade das bolhas de gás pelos embriões ou revestimentos de semente. O ar tem aproximadamente 21% de oxigênio e 78% de nitrogênio. Oxigênio e nitrogênio são, ambos, moléculas diatômicas covalentemente ligadas e que têm um forte afinidade pelas porções ceráceas similarmente covalentes (não polares) dos embriões, tais como embriões de algodão. Ao contrário, tais gases são menos eficientes no acoplamento com resíduos de endosperma relativamente polares, que permanecem flutuando no meio. Em resumo, as bolhas competem com o fluido aquoso (por exemplo, água ou manitol/água) pelo acoplamento com a superfície cerácea do embrião. Como ambas as moléculas de oxigênio e nitrogênio excedem as moléculas de água em seu caráter covalente, elas se acoplam preferencial mente à superfície do embrião. Assim, a
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34/99 natureza relativamente lipofílica do oxigênio e do nitrogênio e a natureza relativamente hidrofílica do meio aquoso explicam a ligação das bolhas as porções lipofílicas, por exemplo, da superfície do embrião de algodão. Alternativamente, foram encontradas bolhas que se acoplam eficientemente a revestimentos de sementes de soja que subiram até a espuma na interface líquido-ar, enquanto que os embriões, incluindo eixos embrionários de soja e cotilédones, foram encontrados permanecendo na fase líquida. Portanto, agentes que se acoplam diferencialmente a vários componentes da semente e os direcionam para localizações distintas, fases ou frações podem ser utilizados para enriquecer uma dada localização, fase ou fração para um componente de semente, tal como um embrião ou uma porção de um embrião.
[00110] Em uma modalidade, é usado o ar para preparação de bolhas. Outros gases úteis na prática da invenção incluem O2 ou N2, assim como gases inorgânicos covalentes incluindo gases nobres, tal como o argônio. Gases orgânicos covalentes tais como o metano, etano e propano e outros gases lipofílicos ou misturas de gases que não afetam seriamente a viabilidade e a transformabilidade dos embriões de milho também podem ser usados.
[00111] No sentido mais amplo, as bolhas podem ser de qualquer material que exiba uma ligação preferencial com os embriões, incluindo sólidos ou líquidos ou misturas desses que se acoplam seletivamente a superfícies de embrião. Formatos, tais como uma superfície plana móvel, por exemplo, uma esteira ou um disco aos quais os embriões podem seletivamente se acoplar pode ser utilizado. Em uma modalidade, embriões flutuando na superfície do meio líquido foram preferencialmente acoplados a uma folha de papel de filtro hidrofóbica (papel para separação de fase repelente a água Whatman PS, impregnado com silicone). Em outra modalidade, óleo de canola misturado com uma suspensão de embrião e resíduos se acoplou preferenciPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 42/151
35/99 almente aos embriões e transportou-os até a superfície conforme o óleo subiu até a superfície.
[00112] Bolhas que entram em contato uma com a outra podem se fundir em milissegundos. Estabilizar as bolhas conforme elas se erguem preserva uma distribuição de tamanho de bolha apropriada assim como promove uma espuma estável no topo do líquido de flutuação. Vários tensoativos foram mostrados ser úteis na prevenção da coalescência e na estabilização das bolhas. Preferivelmente, o tensoativo é um tensoativo iônico ou não-iônico, tal como um poliéter. O poliéter pode ser PEG. O PEG pode ter um peso molecular médio de cerca de 100, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500, 8000 e 9000. Preferivelmente, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 8000. O PEG é usado em uma concentração solúvel em água suficiente para prevenir a coalescência prematura das bolhas. Outro poliéter adequado é PPG. O PPG tem um peso molecular de cerca de 340 a cerca de 3500. Preferivelmente, o PPG tem um peso molecular de 340. O PPG pode ser usado em uma concentração solúvel em água suficiente para prevenir a coalescência das bolhas.
[00113] Em uma modalidade, as bolhas podem ser produzidas por um tubo de dispersão de vidro fritado de poro fino (Chemglass, NJ, USA) conectado a uma bomba de aquário para o bombeamento de ar através de um filtro estéril e para o tubo de dispersão de vidro para a criação de bolhas. O tubo de dispersão pode ser colocado em um recipiente tal como um cilindro graduado ou um béquer contendo uma mistura de embriões e resíduos em suspensão. Entretanto, as fortes correntes de convecção criadas pela grande população de bolhas geradas por esse dispositivo produziram força de cisalhamento suficiente para reduzir sua eficácia na separação de embriões dos resíduos. Alternativamente, as bolhas podem ser produzidas por outro método, tal como um gerador de bolha com fonte de múltiplos pontos (por exemPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 43/151
36/99 pio, um dispositivo de dispersão de bolha que utiliza fragmentos de madeira de tília para ou uma superfície cerâmica com poros).
[00114] Em algumas modalidades, um tensoativo pode ser usado para estabilizar as bolhas e evitar sua coalescência. O tensoativo pode ser um tensoativo iônico ou não-iônico.
[00115] O tensoativo é usado em uma concentração solúvel em água suficiente para prevenir a coalescência das bolhas. Em certas modalidades, o tensoativo é um poliéter. Em modalidades particulares, o tensoativo pode ser PEG ou PPG. O peso molecular do tensoativo de PEG pode estar entre cerca de 100 a cerca de 9000 Dáltons, por exemplo, cerca de 100, 300, 400, 600, 900, 1000, 1450, 3350, 4500, 8000 e 9000 Dáltons. Alternativamente, o tensoativo pode ser PPG e o peso molecular do PPG pode estar entre cerca de 340 a 3500 Dáltons, por exemplo, cerca de 340 Dáltons.
[00116] As bolhas podem ser produzidas por um método de criação e dispersão de bolhas. Por exemplo, um tubo de dispersão de vidro de poro fino ou um aspersor pode ser conectado a uma bomba de aquário e colocado em um recipiente contendo uma mistura de embriões e resíduos em suspensão. Em certas modalidades, o dispositivo de produção e dispersão de bolha compreende fontes de múltiplos pontos de bolhas, tal como um fragmento individual de tília. Os fragmentos podem ser inseridos em uma matriz, tal como no comprimento de uma tubulação de silicone e opcionalmente enrolado em uma espiral e fixado.
[00117] Quando os embriões forem carregados para uma interface líquida pelas bolhas, eles podem ser removidos da superfície da espuma por um método adequado, tal como drenagem pela gravidade ou um escumador ou dispositivo à vácuo. O dispositivo pode ser automatizado.
DISPOSITIVO DE COMBINAÇÃO E MÉTODOS PARA EXTRAÇÃO E
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SEPARAÇÃO DE EMBRIÕES [00118] Em modalidades adicionais, a invenção fornece um dispositivo de combinação para extração e separação de embriões adequados para cultura de tecido. O extrator pode estar em comunicação com o separador ou eles podem funcionar separadamente. O extrator compreende um ou mais jatos de fluido para extrair um embrião, tal como um embrião de milho de uma semente. A semente pode estar em um grão sobre uma espiga de milho. Mais do que um jato de fluido pode ser direcionado sobre uma única espiga e mais do que uma espiga pode ser colocada simultaneamente no extrator.
[00119] Depois da extração dos embriões dos grãos, embriões e resíduos podem cair ou serem conduzidos para um separador de embrião compreendendo, por exemplo, uma câmara de flutuação. O método para a condução para e da câmara de flutuação pode ser uma esteira ou esteiras condutoras teladas ou uma tela que pode separar os resíduos dos embriões através da exclusão de tamanho. A esteira ou tela podem ser um termoplástico trançado ou moldado. Depois de adicionar os embriões a câmara de flutuação, os embriões são preferivelmente separados de outros resíduos, por exemplo, através do método de bolhas descrito, e flutuam para a superfície onde eles podem ser removidos através de uma abertura ou canaleta.
[00120] Portanto, as espigas de milho podem ser colhidas e os embriões podem ser removidos usando um jato de fluido. O ápice do grão pode ser removido a fim de facilitar a excisão do embrião pelo jato de fluido e os conteúdos do grão são substancialmente removidos do grão pelo jato. O jato do fluido pode ser um jato de líquido que compreende o meio de excisão descrito com uma osmolalidade de cerca de 0-600 mOsm/kg. Em modalidades particulares, o meio de excisão é uma solução estéril, por exemplo, manitol 0,1-0,2 Μ. O tecido do embrião assim como o não embrionário (por exemplo, endosperma) pode
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38/99 ser extraído da espiga e do grão pelo jato. Subsequentemente, os embriões podem ser substancialmente separados do tecido não embrionário, por exemplo, pelos métodos de separação e aparelhos descritos, usando forças de cisalhamento incluindo a flutuação de embriões, pela peneiração ou semelhantes. Entretanto, mesmo os embriões ou grupos de embriões que não são separados de outro tecido que compreende um grão, podem ser de utilidade pra a cultura de tecido subsequente, incluindo a transformação e a regeneração de plantas transgênicas.
[00121] Se um método de flutuação é usado para a separação, um tensoativo pode ser adicionado ao meio nos qual os embriões são separados. O tensoativo, tal como PEG ou PPG, reduz a coalescência das bolhas, mantendo um tamanho médio eficaz da bolha para promover a separação eficiente de embriões do tecido não embrionário, e a deposição de embriões na interface ar-líquido onde eles podem ser coletados por fluxo de líquido, por um escumador, por um dispositivo à vácuo ou semelhantes. Por tais métodos, embriões de planta substancialmente removidos e separados podem ser obtidos, adequados para a produção de tecido transformado e plantas transformadas.
PLANTAS TRANSFORMADAS E MÉTODOS PARA SUA PRODUÇÃO [00122] A presente invenção também fornece uma planta transformada, tal como uma planta de milho, algodão ou planta de soja, produzida pelas etapas que incluem (a) fornecer pelo menos um tecidoalvo transformável usando um ou todos os métodos ou aparelhos aqui descritos; (b) introduzir uma molécula de ácido nucleico selecionado no tecido-alvo transformável para produzir um explante transformado; e (c) cultivar a planta monocotiledônea transformada a partir do explante transformado. As plantas preferidas da invenção incluem membros da família Poaceae, incluindo culturas de grãos tais como milho, painço, trigo e arroz; assim como plantas dicotiledôneas transformadas
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39/99 tais como algodão ou plantas de soja.
[00123] Plantas monocotiledôneas particularmente preferidas incluem espécies de Zea, tal como Zea mays. O milho transformado contém pelo menos uma molécula de ácido nucleico heterólogo capaz de conferir uma característica desejada ao milho transformado, tal como resistência a herbicida, resistência à praga, tolerância à germinação no frio, tolerância à deficiência de água, produtividade aumentada, rendimento aumentado e semelhantes. Métodos práticos de transformação e materiais para fazer plantas monocotiledôneas transgênicas dessa invenção (por exemplo, vários meios e células-alvos receptores, transformação de embriões imaturos e subsequente regeneração de plantas transgênicas férteis) estão descritos, por exemplo, em Patente dos Estados Unidos Número 6.194.636 para McElroy et al., Patente dos Estados Unidos Número 6.232.526 para McElroy et al., Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0216189 para Houmard et al., Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0244075 para Cai et al., que descrevem métodos úteis para o milho, e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2003/0024014 para Cheng et al., que descreve métodos úteis para o trigo, todas as quais estão incorporadas aqui por referência. Moléculas de ácido nucleico heterólogo únicas ou múltiplas podem ser usadas para a transformação de plantas monocotiledôneas da invenção; por exemplo, construtos para a diminuição ou aumento coordenado de expressão de gene estão descritos na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0126845 para Van Eenennaam et al., que está incorporado aqui por referência. Numerosos métodos para transformação de outras plantas, incluindo plantas dicotiledôneas, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos para transformação de plantas de soja e algodão estão descritos no Pedido de Patente U.S. Número de Série 12/045.502 ou na Patente
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U.S. 7.002.058, cada um dos quais está incorporado aqui por referencia.
[00124] Em certas modalidades, por exemplo, quando um método de transformação genética mediado por Agrobacterium ou outras bactérias é utilizado, a resposta da cultura ou a frequência de transformação do tecido embriogênico isolado pelos métodos da presente invenção podem ser intensificados pelo uso de um meio de cocultura compreendendo um bactericida tal como a carbenicilina e/ou 2,4-D em uma concentração de cerca de 0,5-1,5 mg/l. Em uma modalidade particular, o meio de cocultura compreende os ingredientes do Meio 1898 da Tabela 9.
[00125] As sementes das plantas transgênicas férteis resultantes da invenção podem ser coletadas e usadas para desenvolver gerações de progênie, incluindo gerações híbridas, de plantas transformadas que incluem a molécula de ácido nucleico heterólogo em seu genoma. Portanto, a presente invenção inclui ambas as plantas transformadas primárias (plantas R0, produzidas pelos embriões transformantes fornecidos por um método da invenção) e sua progênie que carrega a molécula de ácido nucleico heterólogo. Tal progênie de plantas transgênicas pode ser preparada pelo cruzamento de uma planta monocotiledônea transformada da invenção que tem uma molécula de ácido nucleico heterólogo com uma segunda planta que não tem o construto. Uma planta transformada da invenção também pode ser cruzada com uma linhagem de planta que tem outras moléculas de ácido nucleico heterólogo que confere outra característica, para produzir uma progênie de plantas que tem moléculas de ácido nucleico heterólogo que confere múltiplas características.
[00126] A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do pedido e das reivindicações, incluindo o escopo dado a tais expressões, as seguintes definições são fornecidas.
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41/99 [00127] Embrião é a parte de uma semente que consiste em tecidos precursores (tecidos meristemáticos) para folhas, caule e raiz, assim como um ou mais cotilédones. Uma vez que o embrião começa a se desenvolver (germinar), ele se torna uma plântula.
[00128] Meristema ou tecido meristemático consiste em células indiferenciadas, as células meristemáticas, que se diferenciam para produzir múltiplas estruturas da planta incluindo caule, raízes, folhas, tecido germinativo e sementes. As células meristemáticas são os alvos para a transformação para se obter plantas transgênicas.
[00129] Explante é uma expressão usada para se referir ao material alvo para a transformação. Portanto, ele é usado alternativamente com tecido meristemático ou embrião nas modalidades desse. EXEMPLOS [00130] Aqueles versados na técnica apreciarão as várias vantagens dos métodos e composições fornecidos pela presente invenção. Os exemplos a seguir estão incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser considerado por aqueles versados na técnica que os métodos descritos nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos inventores que funcionam bem na prática da invenção e portanto podem ser considerados como constituindo os modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem considerar, a luz da presente descrição, que várias alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que estão descritas e ainda se obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Todas as referências aqui citadas estão incorporadas por referência à medida que elas complementam, explicam, fornecem um suporte ou ensinam uma metodologia, técnicas ou composições aqui empregadas.
Exemplo 1: Método para extrusar múltiplos embriões de milho [00131] Esse exemplo descreve um método que usa pressão mePetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 49/151
42/99 cânica positiva de um dispositivo extrusor para produzir embriões adequados para cultura de tecido ou transformação genética.
[00132] Os ápices dos grãos foram removidos de maneira estéril de uma espiga de milho imatura (Zea mays) com um descascador de vegetal. O descascador foi pressionado da extremidade basal da espiga de milho para a extremidade apical usando um movimento de serração delicado para obter uma truncação rápida, exata, dos grãos. Apesar de nesse exemplo os grãos individuais serem truncados para expor os tecidos internos, em outras modalidades pode ser necessário apenas garantir que uma abertura (tal como um furo, uma incisão ou abrasão) seja feita no pericarpo sem a remoção real do material do pericarpo. Onde são desejados embriões intactos (por exemplo, embriões intactos para transformação), o tamanho de qualquer abertura é preferivelmente o suficiente para permitir a remoção sem embrião sem danificálo. A abertura do pericarpo pode ser obtida com o uso de qualquer dispositivo adequado, incluindo, mas não limitado a laminas e materiais abrasivos. Por exemplo, um descascador de vegetal é considerado ser relativamente seguro e rápido de usar; ele tem uma profundidade de corte regulada e também requer menos experiência para usar do que um bisturi. Outras ferramentas com funções similares podem ser empregadas. Os dispositivos para abertura do pericarpo são preferivelmente esterilizáveis, por exemplo, em autoclave ou por aquecimento ou por esterilização química. Esses processos de tratamento do pericarpo podem ser automatizados; por exemplo, uma lamina ou laminas ou um raspador podem ser motorizados.
[00133] Um extrusor estéril (nesse caso, uma haste com 4 mm de diâmetro) foi empurrado contra a base dos grãos truncados. Outros dispositivos adequados para extrusão podem ser empregados. Preferivelmente, tais dispositivos devem ter um tamanho e forma capazes de aplicar uma força relativamente localizada a Base dos grãos trunPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 50/151
43/99 cados para ejetar os embriões e endospermas. Preferivelmente, a força aplicada é de magnitude suficiente e é aplicada em uma direção adequada tal que o avanço do extrusor não cavalga sobre os grãos adiante. A lâmina posterior do extrusor preferivelmente também fornece uma superfície sobre a qual os embriões ejetados e endosperma se acumulam; por exemplo, uma peça plana de aço inoxidável com a borda frontal arredondada pode ser usada. Nesse exemplo, os embriões são delicadamente espremidos para fora do pericarpo, seguidos pelos endospermas. Os embriões e endospermas extrusados se depositaram no topo da haste do extrusor e não foram esmagados durante o processo.
[00134] A mistura de embriões e endospermas foi lavada com um meio líquido aquoso (por exemplo, água, meio líquido ou salina) sobre uma tela esterilizada que tem aberturas em forma de losango (cerca de 2 x 3 milímetros). Os endospermas foram observados ser amplamente retidos e os embriões menores e alguns resíduos menores de endosperma foram lavados através da peneira para um receptáculo coletor. Os embriões coletados foram lavados duas vezes para remover os resíduos pequenos.
[00135] Os embriões lavados foram purificados depois por um processo de flutuação. Na primeira etapa do processo de flutuação, o meio de fluido aquoso foi totalmente retirado do receptáculo coletor, que foi deixado secar rapidamente (por exemplo, cerca de um minuto), tal que o meio aquoso remanescente saiu da superfície cerácea dos embriões, expondo-os diretamente ao ar. Foi adicionado um novo meio aquoso e a maioria dos embriões flutuou por que suas superfícies ceráceas não foram umedecidas novamente pelo fluido. Os tecidos não embrionários, tal como os resíduos de endosperma, permaneceram submersos no meio e foi obtida uma nítida separação de embriões e tecidos não embrionários. A flutuação dos embriões extrusaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 51/151
44/99 dos pode ser aperfeiçoada pela remoção mais rápida, completa ou reprodutível do meio aquoso, tal como através do uso de aspiração ou pela ação capilar (por exemplo, uso de um absorvente estéril colocado no receptáculo coletor para absorver o fluido para fora dos embriões extrusados).
[00136] Uma produção de aproximadamente 100 embriões foi isolada nesse experimento preliminar, em que apenas uma porção do material embrião-endosperma de toda a espiga foi processada. Esses resultados demonstram que os métodos da presente invenção são práticos e convenientes para coletar um grande número de embriões imaturos de espigas de milho.
[00137] Os embriões isolados pelo método da invenção podem ser usados depois em procedimentos para cultura de tecido, por exemplo, métodos de regeneração para gerar plantas de milho transgênicas. A transferência dos embriões isolados para o meio de cultura foi feita facilmente pela colocação de uma pinça, com as pontas fechadas juntas, debaixo dos embriões flutuantes, elevando-os livres do líquido com a pinça e colocando-os sobre um meio de cultura. Outra técnica pode ser retirar os embriões isolados com um instrumento que tem uma superfície hidrofóbica. Uma técnica adicional pode ser transferir os embriões pela hidrofobicidade, por exemplo, transferindo-os para a superfície de um meio através de um pequeno sopro de ar ou um movimento mecânico súbito, tal que suas energias cinéticas excedam a força hidrofóbica que os segura no instrumento.
Exemplo 2: Confirmação visual do tamanho do embrião [00138] Esse exemplo descreve um aperfeiçoamento para uma modalidade do método da presente invenção, como descrito no Exemplo 1. Usando a abordagem descrita no Exemplo 1, embriões imaturos de milho precisam estar o mais próximo possível da parte truncada do grão a fim de serem ejetados em grande número. A variação no tamaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 52/151
45/99 nho do embrião imaturo de milho é uma consideração importante na aferição da quantidade de ápice de grão a ser removido. Os embriões tendem a ser mais largos na seção média da espiga, com embriões às vezes menores em direção as extremidades. Embriões menores, por exemplo, menores do que cerca de 1,5 milímetros de comprimento são mais difíceis de remover a menos que eles estejam próximos da truncagem.
[00139] Uma maneira de assegurar que o máximo do grão foi decapitado acima dos embriões de tamanhos variáveis é observar a espiga durante o processo de decapitação sob aumento mínimo. Por exemplo, óculos com aumento mínimo (por exemplo, ampliador binocular Donegan Opf/-VISOR equipado com lentes N° 7, que fornece aumento de 2,75 X) foram usados para auxiliar a confirmação visual do tamanho do embrião e da truncagem adequada do pericarpo. Se o primeiro corte não removeu o suficiente do ápice do grão, pode ser feito um segundo corte. Outros dispositivos de ampliação, usando aumentos iguais ou similares podem ser usados. Por exemplo, as lentes disponíveis para o Opf/-VISOR fornecem ampliação que varia entre 1,5 a 3,5 X.
Exemplo 3: Extrusão de embriões e endospermas [00140] Esse exemplo descreve um aperfeiçoamento para uma modalidade do método da presente invenção, como descrito no Exemplo 1. Dispositivos motorizados podem ser usados para auxiliar na extrusão de embriões e endospermas. Por exemplo, uma talhadeira elétrica tal como uma talhadeira elétrica WeCheer 320 (WeCheer Industrial Co., Taichung Hsien, Taiwan, R.O.C), adaptada com um dispositivo redondo para extrusão pode se usada para reduzir a força que uma pessoa precisa exercer para ejetar os embriões e endospermas. Outros dispositivos elétricos estão disponíveis e podem ser similarmente usados. Preferivelmente, a porção da talhadeira de tal ferramenta (ou
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46/99 qualquer parte da ferramenta que possa entrar em contato com os embriões) pode ser convenientemente esterilizada, por exemplo, pela inserção em uma esfera de esterilização.
[00141] Em um experimento, a lâmina de uma espátula de pesagem de aço inoxidável foi curvada para trás sobre si mesma para fornecer um dispositivo extrusor que tem uma lamina frontal arredondada. Depois da inserção em um talhadeira elétrica WeCheer 320, uma porção com cerca de 10 centímetros de comprimento projetou-se do mandril da talhadeira elétrica. Esse conjunto foi usado para ejetar os embriões e endospermas das fileiras individuais de grãos decapitados. Conforme o dispositivo extrusor (espátula modificada) era movido para baixo de uma fileira de grãos, foi observada uma discreta tendência da espátula de escorregar para a esquerda ou direita; entretanto, essa tendência pode ser corrigida pela inclusão de uma extensão da espátula semelhante a uma pequena quilha sobre cada borda externa. Exemplo 4: Extrusão mecanizada do embrião [00142] Esse exemplo descreve um aperfeiçoamento de uma modalidade do método da presente invenção, como descrito no Exemplo 1. A mecanização do processo de extrusão do embrião pode ser obtida pelo uso de um dispositivo adequado, tal como, mas não limitado ao dispositivo descrito aqui e representado esquematicamente na Figura 1. Esse dispositivo inclui dois motores. O primeiro motor (D) é um motor de passo que pode girar a espiga de milho (A) tal que novas fileiras de grãos são expostas as duas hastes de extrusão (G), que aplicam força para espremer os embriões e endospermas para fora dos seus pericarpos.
[00143] As hastes (G) estão convenientemente localizadas em lados opostos da espiga a fim de equilibrar a pressão aplicada a espiga em relação ao eixo longitudinal da espiga. Entretanto, uma única haste pode ser usada ou mais do que duas hastes; onde múltiplas hastes
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47/99 são usadas, é preferível que elas estejam posicionadas de maneira a distribuir uniformemente a pressão mecânica resultante entorno da espiga. A haste não necessita ser uma haste reta; em uma modalidade do dispositivo, um anel flexível circundando a circunferência da espiga é usado ao invés de uma haste rígida. Em outra modalidade, múltiplas hastes curtas ou rolamentos são arranjados em uma configuração flexível, circular que pode deslizar ao longo do eixo longitudinal da espiga, aplicando pressão mecânica a várias ou a todas as fileiras de grãos simultaneamente.
[00144] O segundo motor é conectado a engrenagem de pinhão (E) que se conecta a um suporte (F) tal que ocorra um movimento linear para cima e para baixo da espiga. A base da espiga está fixada firmemente a um punho (B) por meio de um parafuso que se estende do punho para a base da espiga. A porção media estreita do punho é quadrada tal que ela não girará a menos que o suporte (C) ao qual está acoplado seja girado pelo motor de passo (D).
[00145] Antes da inserção na máquina, os ápices dos grãos são decapitados como no Exemplo 1 tal que os embriões e endospermas possam ser espremidos. Para iniciar o processo, a espiga é baixada até que as duas hastes (G) estejam próximas da base da espiga logo abaixo do punho (B). Depois, as hastes são pressionadas contra ambos os lados da espiga e conjunto do suporte e pinhão puxa a espiga para cima. Conforme isso ocorre, os embriões e endospermas são removidos de um par de fileiras, caem para baixo no prato coletor (H) permanecendo na base (I) e se acumulam em uma pilha (J). Quando as hastes abordam a extremidade apical da espiga, a espiga é retraída para cima para sua posição inicial original e levemente girada pelo motor de passo até que novas fileiras de grãos fiquem em posição.
[00146] Vários graus de automação dessa máquina são possíveis, incluindo sensores para justar automaticamente as posições verticais
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48/99 de inicio e fim assim como as posições rotatórias inicial e final. Um suporte e um pinhão não é o único método pelo qual pode ser obtido um movimento linear. Pneumáticos ou hidráulicos podem ser preferidos para algumas aplicações. As hastes (G) podem ser abertas automaticamente por um mecanismo adequado. Quando uma nova espiga é carregada, pode ser preferível elevar a espiga para uma posição alta o suficiente para limpar as hastes.
Exemplo 5: Separação hidrofóbica de embriões [00147] Esse exemplo descreve uma modificação para uma modalidade do método da presente invenção, como descrito no Exemplo 1. Em aplicações de separação, o material de interesse frequentemente aparece na interface de fases dissimilares (por exemplo, entre os solventes aquoso e lipofílico). A remoção do material de interesse de tal interface pode apresentar problemas e foi, no passado, um processo manual que envolvia contato íntimo com o extrator e o material a ser extraído. Muitas vezes, a única maneira de separar com sucesso um componente é usar um material da mesma polaridade ou hidrofobicidade/hidrofilicidade. No caso de embriões imaturos de milho extrusados por um método da invenção, os embriões são encontrados na interface aquosa/ar. A superfície dos embriões de milho é cerácea, isto é, lipofílica ou hidrofóbica, e quando uma cutícula do embrião é contatada com uma substância de hidrofobicidade similar, o embrião tende a se aderir a superfície hidrofóbica. A hidrofobicidade do embrião reduz a tensão superficial da água entorno dele, o que ajuda o embrião a flutuar na superfície da interface aquosa/ar.
[00148] Uma abordagem que tira vantagem dessas características físicas pode ser tocar os embriões flutuantes com um material hidrofóbico tal como um papel de filtro hidrofóbico, por exemplo, papel Whatman N° 1 PS, que é um papel para separação de fase repelente a água impregnado de silicone (Whatman pie, Brentford, Middlesex,
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U.K.). E um exemplo, um pedaço de papel de filtro hidrofóbico estéril pode ser baixado sobre um recipiente inteiro de embriões flutuantes e removê-los todos de uma vez. Em outro exemplo, um pequeno pedaço do papel hidrofóbico pode ser usado para remover sucessivamente vários embriões e transferi-los para o próximo recipiente. Em um terceiro exemplo, tanto um pequeno pedaço de papel hidrofóbico quanto a ponta de uma pipeta hidrofóbica podem ser usados para contatar e remover embriões individuais e depois dispensá-los com um sopro de ar do pipetador. Pontas de pipeta comuns também podem ser modificadas para tal uso pela inserção da ponta da pipeta em uma curta extensão de um tubo hidrofóbico (por exemplo, um tubo de silicone), o embrião poderá então ser removido pela atração hidrofóbica para a extremidade distai do tubo hidrofóbico e depois liberado através de um sopro de ar pela pipeta. A tensão superficial reduzida entorno dos embriões hidrofóbicos os ajuda a flutuar sobre uma superfície aquosa, e os embriões flutuantes podem também ser transportados pela movimentação deles sobre a superfície aquosa (por exemplo, por um jato de ar direcionado para os embriões). A remoção e a dispensa de embriões podem ser automatizadas usando modificações de dispositivos existentes, tal como máquinas desenhadas para remoção de colônia ou para resgatar pontos de proteína sobre géis bidimensionais corados de proteína.
Exemplo 6: Métodos adicionais de ejeção ou extrusão de embriões [00149] O método da presente invenção abrange o uso de vários tipos de força ou combinação de forças, para a separação do embrião de sua semente. Esse exemplo descreve modalidades adicionais. Em um método básico como descrito no Exemplo 1, a pressão mecânica positiva é aplicada à base da semente truncada (tal como um grão de milho) para ejetar o embrião através do ápice truncado da semente. [00150] Em outra modalidade, pode ser usada a força centrífuga
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50/99 para ejetar o embrião. Por exemplo, uma espiga de milho (cujos grãos foram previamente truncados) pode ser girada sobre seu eixo longitudinal em uma velocidade suficiente para ejetar os embriões e/ou endospermas em uma trajetória radial. A rotação pode ser obtida por qualquer técnica adequada, tal como, mas não limitada a contatar a extremidade apical de uma espiga de milho com um cone que gira livremente, em que a rotação da espiga é mantida dentro de uma faixa longitudinal limitada, por exemplo, pelo acoplamento da extremidade basal da espiga a um punho que é inserido depois em um suporte dentro do qual ele pode girar. Em uma modalidade exemplar que usa a força centrífuga, cerca de um terço do ápice de cada grão sobre uma espiga de milho é removido com um bisturi e a espiga é rolada sobre uma superfície para soltar o embrião e o endosperma dentro dos grãos. A espiga foi quebrada em dois pedaços, cada um com cerca de 750 milímetros de comprimento. Cada pedaço foi colocado em uma garrafa centrífuga de 250 mililitros com cerca de 100 mililitros de água. Essas foram centrifugadas por 15 minutos a 5000 rpm para ejetar os embriões. O exame das espigas depois da centrifugação mostrou que, em algumas porções da espiga, todos os embriões foram removidos pela centrifugação, enquanto que em outras áreas, poucos ou nenhum embrião foram removidos. O material ejetado foi centrifugado e o sobrenadante removido para deixar uma pasta, que continha embriões intactos (estimada incluir cerca de 20 por cento do número total de embriões). Em outro exemplo, uma espiga imatura de milho foi colhida (tipicamente entre cerca de 10 a cerca de 14 dias após a polinização). A espiga é desinfetada e sob condições estéreis o ápice de cada grão é cortado. A espiga é montada sobre uma broca em uma furadeira elétrica (ou um dispositivo similar) e a espiga é circundada por um grande vaso coletor estéril (por exemplo, um grande béquer de vidro). A espiga é girada em uma rotação suficiente para ejetar os embriões imatuPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 58/151
51/99 ros e os tecidos ejetados são coletados do recipiente estéril. Os embriões imaturos são coletados, por exemplo, por coleta manual, ou pelo enxágue do recipiente com meio de cultura estéril e recuperação da fração enriquecida contendo os embriões (por exemplo, por peneiração, pelo uso de um gradiente de densidade líquida ou por outros métodos para separar embriões de tecido não embrionário como descrito em outro lugar nessa descrição). Os embriões imaturos (ou calos derivados de embriões imaturos) podem ser usados, subsequentemente, para transformação. Os resultados aperfeiçoados com o uso desses e outros métodos de centrifugação podem ser obtidos pela determinação de tempos e velocidades de centrifugação preferidos por teste de rotina.
[00151] Outra modalidade emprega a maceração de uma massa de grãos. Uma espiga imatura de milho é colhida (tipicamente entre cerca de 10 a cerca de 14 dias após a polinização). A espiga é desinfetada. O pericarpo pode ser aberto sob condições estéreis ou os grãos podem ser deixados intactos. Os grãos são removidos da espiga por qualquer procedimento adequado, incluindo, mas não limitado ao uso de um bisturi ou outra ferramenta com lamina. Uma vez separados da espiga, os grãos são colocados em meio de cultura de tecido. A mistura grão-meio pode ser submetida à ruptura posterior de tecido usando um dispositivo cortante adequado, tal como, mas não limitado a um misturador. Os embriões imaturos são coletados, por exemplo, por coleta manual ou pelo enxágue do recipiente com meio de cultura de tecido estéril e recuperação da fração enriquecida contendo os embriões (por exemplo, por peneiração, pelo uso de um gradiente de densidade líquida ou por outros métodos para separar embriões de tecido não embrionário como descrito em outro lugar nessa descrição). Os embriões imaturos (ou calos derivados de embriões imaturos) podem ser usados, subsequentemente, para transformação.
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52/99 [00152] Em uma modalidade adicional, jatos de fluidos (de gases ou líquidos ou suas combinações) podem ser usados para desalojar os embriões. Um exemplo dessa abordagem é girar automaticamente uma espiga de milho de uma maneira gradativa ou contínua (helicoidal) para além de um jato estacionário, coletando o material ejetado contendo os embriões e depois isolar os embriões se necessário, por exemplo, por separação por tamanho em uma tela ou peneira ou semelhantes. Onde a espiga de milho está orientada verticalmente (com relação ao seu eixo longitudinal), pode ser preferido girar a espiga em uma direção helicoidal ascendente, ou mover de outra maneira a espiga em relação ao jato tal que os embriões extraídos tendem a fluir para baixo.
[00153] Em outra modalidade, a desaceleração linear ou a aceleração linear podem ser empregadas para desalojar ou ejetar os embriões. Por exemplo, uma espiga de milho pode ser tratada com um choque paralelo ao eixo longitudinal da espiga e com força suficiente para ejetar os embriões e endospermas. Uma espiga de milho pode ser encerrada em um suporte resistente a alto impacto estéril adequado, que pode ser submetido à aceleração ou desaceleração súbitas, por exemplo, por um impacto vigorosos (por exemplo, como o de um martelo de madeira).
[00154] Outro aperfeiçoamento do método pode ser facilitar a ejeção ou extrusão do embrião de uma semente truncada. Por exemplo, os embriões podem ser desprendidos ou deslocados das suas posições nativas dentro da semente pela aplicação de uma força nos ápices das sementes intactas(por exemplo, pela aplicação de pressão aos ápices das fileiras de grãos de milho em uma espiga intacta ou pela rolagem ou prensagem das próprias espigas sobre uma superfície antes da decapitação dos ápices dos grãos). Os embriões também podem ser desprendidos dentro da semente pela aplicação de vibraPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 60/151
53/99 ção, por exemplo, por ultrassom. Outra abordagem pode ser a remoção de tecido não embrionário adicional, tal como o material adicional da parede lateral (pericarpo), antes da ejeção ou extrusão do embrião. Por exemplo, uma faca em forma de V ou outro instrumento pode ser usado para remover um pouco das paredes laterais de grãos de milho em fileiras na espiga.
Exemplo 7: Isolamento automatizado do embrião usando jato de fluido com pressão positiva [00155] Esse exemplo descreve uma modalidade adicional da presente invenção. Nesse exemplo, um dispositivo automatizado usa um jato de fluido com pressão positiva para desalojar embriões das sementes. Com referência à Figura 2, um fixador robótico C (preferivelmente capaz de se movimentar em três dimensões por meio de um robô A e um motor B ou por um meio equivalente) apanha uma espiga de milho I (por um punho D que tem um defletor E) em uma posição definida por um bastidor sobre o estrado do robô. O robô insere a espiga de milho no tubo H (opcionalmente feito de material transparente para facilitar a observação visual) em uma posição de partida abaixo do flange F. O jato de fluido com pressão positiva é introduzido através da abertura G e a espiga é simultaneamente elevada (na dimensão Y) e girada pelo robô A e o motor B, respectivamente, resultando preferivelmente na espiga de milho sendo golpeada pelo jato de fluido, induzindo o desalojamento do embrião e do endosperma. O fluido que passa através da abertura G pode ser pelo menos um gás, pelo menos um líquido ou qualquer combinação desses. O jato de fluido pode exercer força continuamente ou não continuamente, por exemplo, como em pulsos. Conforme os embriões e endospermas são desalojados pelo jato de fluido com pressão positiva da abertura G, eles caem na tela J, que retém os endospermas enquanto permite que os embriões caiam para a superfície coletora K (por exemplo, gaze esterilizada)
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54/99 abaixo. O excesso de fluido pode ser opcional mente coletado em um receptáculo para rejeito ou reciclagem L. Depois de completado o processo de remoção do embrião para cada espiga de milho, o interior do tubo pode ser lavado manualmente ou com um jato automatizado acima ou abaixo do flange F.
Exemplo 8: Métodos de processamento de preparações brutas de embrião [00156] As preparações de embrião obtidas por métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 1 a 7 podem incluir tanto embriões intactos quanto embriões parciais, que podem estar acompanhados por tecido não embrionário, tais como endosperma e glumas. Algumas aplicações podem não precisar de tratamento posterior ou etapas de separação, por exemplo, em uma transformação em massa de tal preparação bruta de embrião, onde os embriões (intactos ou parciais) não precisam ser separados do tecido não embrionário. Por exemplo, calos derivados tanto de embriões imaturos intactos ou parciais de milho podem ser usados para transformação, regeneração e produção de plantas transgênicas férteis. Portanto, ambos os embriões intacto e parcial podem servir como explantes transformáveis e não necessitam ser separados um do outro. Entretanto, em outros casos pode ser desejável purificar adicionalmente os embriões de uma preparação bruta de embriões.
[00157] Procedimentos nos quais algumas dificuldades podem ser encontradas no processamento de preparações brutas de embrião incluem: (1) remoção de tecidos não embrionários (por exemplo, restos celulares, grãos de amido, proteínas indesejáveis), (2) remoção eficiente do excesso de líquido de embriões depois da extrusão ou lavagem usando líquido, e (3) adição de líquido com turbulência mínima tal que os embriões flutuem e não se tornem submersos.
[00158] Um material poroso é útil para a separação de tecido não
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55/99 embrionário de embriões. Qualquer material poroso adequado pode ser empregado, preferivelmente tendo uma trama ou tamanho de poro pequeno o suficiente para reter os embriões mas que deixe tecidos não embrionários ou resíduos menores passar através e capaz de ser esterilizado (por exemplo, pela autoclave, calor, irradiação ou esterilização química). A adequabilidade de materiais é facilmente julgada ou testada pela simples experimentação por aquele versado na técnica. Exemplos de materiais adequados incluem gaze de algodão ou outro material têxtil e outras telas ou peneiras. Em algumas modalidades, materiais sólidos perfurados podem ser usados, incluindo cerâmicas perfuradas, polímeros, metais ou vidros (por exemplo, na forma de um funil de Buchner ou um funil de separação similar). A gaze de algodão de graduação apropriada, por exemplo, tem um tamanho de malha pequeno o suficiente para reter os embriões mas permite que resíduos menores passem através dela e é autoclavável. A gaze de algodão pode ser acoplada a uma tela ou anel (por exemplo, a tela para conter embrião da superfície coletora K na Figura 2 e descrita no Exemplo 7) para possibilitar a gaze e todos os embriões retidos serem simultaneamente submersos para fácil enxágue. Por exemplo, a gaze de algodão pode ser facilmente acoplada a uma tela por meio de uma banda elástica ou semelhante (por exemplo, tubo de silicone); tais telas são facilmente fabricadas, por exemplo, a partir e um béquer ou cilindro graduado feito de material autoclavável (por exemplo, polipropileno, polimetilpenteno, policarbonato ou vidro autoclavável) cortado em seções. A gaze de algodão tem acentuada capilaridade, permitindo que o líquido seja eficientemente extraído dos embriões, expondo assim sua epiderme cerácea ao ar antes da flutuação. Na etapa de flutuação, a gaze de algodão é simplesmente submersa em líquido aquoso, permitindo que os embriões flutuem.
Exemplo 9: Isolamento substancial de embriões usando um jato de
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56/99 fluido [00159] Esse exemplo descreve uma modalidade adicional da presente invenção. Nesse exemplo, múltiplos embriões foram desalojados das sementes por jato de fluido com pressão positiva.
[00160] No exemplo mais simples, uma ponta de pipeta de 200 microlitros foi acoplada a uma torneira de pia com Parafilm®. Quando a água foi aberta, um jato emergiu da ponta da pipeta com força considerável. A pressão da água da torneira foi estimada ser cerca de 413,7 kPa (cerca de 60 libras por polegada quadrada). Esse jato de fluido (líquido) foi formado sobre uma espiga de milho imatura (contida em um béquer) onde os grãos tinham sido decapitados como descrito no Exemplo 1. Conforme o jato golpeava cada grão, o endosperma e o embrião eram ejetados e coletados no béquer. Como o endosperma nesse estágio é um tecido relativamente macio, ele foi fragmentado em vários pedaços pequenos pelo jato, enquanto os embriões pareciam permanecer intactos.
[00161] O endosperma e o tecido do embrião desalojados pelo jato foram decantados diretamente sobre uma gaze de algodão N° 60 (outros materiais porosos adequados, tais como uma tela hidrofílica de tamanho de malha apropriado, podem ser substituídos). Classes diferentes de gaze de algodão estão disponíveis (por exemplo, classes 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90, onde as aberturas da malha diminuem com classes mais elevadas) e a classe ou o tamanho da malha apropriados para o tamanho médio e a forma de um dado tipo de embrião são facilmente selecionados por simples experimentação. Os embriões e fragmentos maiores do endosperma foram retidos na superfície superior da gaze de algodão. Antes da próxima etapa, a gaze de algodão foi deixada secar parcialmente pela drenagem do excesso de líquido. Isso retirou o líquido dos tecidos e expôs as superfícies do embrião ao ar. Quando a gaze foi mergulhada em um líquido aquoso, os embriões
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57/99 flutuaram por que suas epidermes ceráceas não se reumedeceram. [00162] Em uma configuração simples, a gaze de algodão (ou outro material poroso adequado) pode ser manualmente esticada ou mantida sobre um receptáculo ou recipiente de rejeitos conforme o líquido que contém as preparações brutas de embriões é derramado sobre a gaze de algodão. Para um trabalho estéril, a gaze de algodão pode ser amarrada a telas rígidas, que podem ser autoclavadas antes do uso. Peneiras acopladas com cabos, tais como aquelas disponíveis em lojas de artigos para cozinha, também podem ser usadas no método. Exemplo 10: Dispositivos para extração de embrião usando um jato de fluido [00163] Esse exemplo descreve várias modalidades de um aparelho para preparar mecanicamente múltiplos embriões de milho adequados para cultura de tecido.
[00164] Uma modalidade inclui um aparelho para a preparação de múltiplos embriões de milho usando um jato de fluido, similar de modo geral ao aparelho descrito na Figura 2. Um cilindro transparente aberto no fundo foi feito pelo corte das extremidades de um cilindro graduado de polimetilpenteno (PMP) de 1 litro autoclavável. Uma ponta de pipeta (por exemplo, Gilson DistriTip®, gradativamente estreitada para evitar a formação de pressão contrária) foi fixada no lado de cilindro e serviu como uma abertura para guiar uma corrente de fluido como um jato através de um orifício feito na parede do cilindro. O fluido (nesse caso, água) foi alimentado através da ponta de pipeta a partir de uma tubulação de bomba peristáltica autoclavável de alta pressão PharMed®. A água foi liberada a partir de uma torneira da pia do laboratório, mas pode ser um fluido aquoso liberado por uma bomba ou outra fonte. Usar uma bomba capaz de liberar um fluido estéril é preferível quando, por exemplo, um meio de cultura estéril ou uma solução salina estéril é descoberta ser superior a água como um líquido para isolamento subsPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 65/151
58/99 tancial de embriões. Um exemplo de uma bomba adequada é uma bomba Masterflex® com uma bomba de pressão L/S (Cole-Parmer Instrument Co., Vernon Hills, IL) que pode liberar líquido estéril até 689,5 kPa (100 psi) quando usada com uma tubulação de alta pressão. [00165] Uma espiga de milho com os grãos previamente decapitados foi manualmente posicionada dentro do cilindro. Depois que a espiga estava adequadamente posicionada dentro do cilindro, cada grão foi submetido à pressão positiva do jato de água. Isso resultou na extrusão dos embriões e tecidos não embrionários dos grãos. O exame da espiga depois do tratamento indicou a remoção eficiente dos embriões dos grãos. O material removido foi lavado do interior das paredes do cilindro para um coletor de embrião posicionado embaixo do cilindro. O coletor de embrião incluía: (1) uma tela plástica grossa (sobre a qual resíduos maiores foram capturados), fundida a quente ao topo cortado de um béquer de plástico Tri-Pour® e sobreposta acima (2) uma tela mais fina (gaze de algodão Classe 60, sobre a qual os embriões extrusados foram capturados), fixada com uma banda elástica do topo cortado de um segundo béquer de plástico Tri-Pour® e sobreposta acima (3) um béquer coletor de rejeitos ou outro recipiente (no qual os resíduos menores, tecidos não embrionários e rejeito líquido foram coletados).
[00166] Modificações a essas e a modalidades similares são facilmente feitas por aquele versado na técnica. Por exemplo, com relação ao posicionamento da espiga ou semente de milho para aplicação do jato de fluido, a espiga poderá ser mantida manualmente no lugar, ou preferivelmente montada com segurança dentro do cilindro por um porte móvel capaz de movimentar a espiga em três dimensões. Por exemplo, a espiga poderá ser montada em uma haste de metal ou polímero aparafusada, tal como uma haste de polipropileno, que poderá ser usada para mover a espiga ao longo de seu eixo longitudinal assim
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59/99 como de girar a espiga). Outro exemplo de um mecanismo de montagem está descrito na Figura 3, que ilustra um punho magnético pelo qual a espiga pode ser fixada a um braço robótico.
[00167] Em outras modalidades, entretanto, a espiga ou espigas de milho não precisam ser fixadas individualmente a um fixador, mas podem estar livremente móveis de maneira a permitir que múltiplos grãos sejam contatados pela força usada para remover os embriões dos grãos. Por exemplo, pelo menos uma espiga ou múltiplas espigas podem ser transportadas ou fixadas entre pelo menos um suporte, tal como, mas não limitados a pelo menos uma superfície plana, uma tela, uma grade, uma tela metálica, uma peneira, plataforma, rolamento, haste ou fio guia e uma esteira, roda ou esteira sobre roletes. Tal suporte pode ser móvel ou induzir a espiga ou espigas a se moverem, por exemplo, por vibração, rolamento, gravidade ou outros mecanismos. Embriões substancialmente isolados poderão passar através da própria plataforma se a plataforma for porosa (por exemplo, feita de tela). A espiga ou espigas também podem flutuar sobre um fluido de uma maneira que possibilite que cada espiga gire ou se mova livremente de outra maneira enquanto flutua. O fluido, tal como um líquido que contém os embriões substancialmente isolados, poderá ser continuamente drenado, opcionalmente através de dispositivo de filtração ou sedimentação ou coletado por centrifugação.
[00168] Dispositivos para obtenção de movimento ao longo do eixo longitudinal de uma espiga de milho incluem, mas não são limitados a lâminas direcionadas por fusos de esfera ou laminas direcionadas por esteira, tais como aquelas comercial mente disponibilizadas por vários fabricantes tais como Techno. Inc. (New Hyde Park, NY; Technoisel.com). Para se obter movimento rotatório para girar uma espiga de milho, um motor de passo pode ser usado, por exemplo, um motor de passo acoplado a uma placa deslizante. O movimento rotatório pode
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60/99 ser fornecido por dispositivos de rolamento, por exemplo, por roletes redondos ou tubulares paralelos entre os quais a espiga de milho é fixada e girada.
[00169] A forma do jato fluido pode ser vantajosamente modificada de acordo com a aplicação desejada. Por exemplo, um jato estreito em forma de coluna de diâmetro uniforme é útil para a remoção de embriões de uma semente de uma vez. Onde for desejável aumentar a taxa na qual os embriões são substancialmente isolados, múltiplos embriões podem ser simultaneamente removidos de suas sementes por um jato de fluido; isso pode ser obtido, por exemplo, pelo uso de pelo menos um único jato de fluido que cubra uma área maior, ou pelo uso de jatos múltiplos simultaneamente. Em uma modalidade, múltiplos jatos, tais como jatos múltiplos paralelos, estreitos ou em forma de coluna (por exemplo, produzidos por múltiplos injetores similares àqueles usados no Exemplo 9 e opcionalmente conectados um ao outro por uma mangueira, são usados para direcionar o jato de fluido com pressão positiva sobre múltiplas sementes para isolar substancialmente seus embriões substancialmente e simultaneamente. A automação desses e outros dispositivos pode incluir ainda sensores ópticos ou de massa para auxiliar no posicionamento da espiga e do jato de fluido em relação um ao outro.
[00170] Em outra modalidade, pelo menos um jato de fluido que cobre uma área maior (por exemplo, em que o jato de fluido impacta simultaneamente múltiplos grãos ou múltiplas fileiras de grãos sobre uma espiga de milho) pode ser usado. As dimensões de tal jato, preferivelmente, permitem que o jato entre nos grãos e enfraqueça os embriões. Tipicamente, embriões de milho usados em experimentos genéticos são imaturos e geralmente variam de tamanho entre cerca de 1,8 a cerca de 2,2 milímetros de comprimento; os grãos que abrigam esses embriões imaturos geralmente estão na faixa de tamanho entre
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61/99 cerca de 4 a cerca de 5 milímetros de largura. Para embriões desse tamanho, um jato de fluido apropriado pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,5 a cerca de 1 milímetro de largura.
[00171] Quaisquer meios adequados para a produção de tal jato de fluido mais largo podem ser usados, tais como, mas não limitados a injetores que geram jatos de fluido não colunares. Exemplos de injetores adequados incluem, mas não estão limitados a injetores que geram um padrão de spray plano e injetores que geram um padrão de spray em forma de leque ou de cone. Em um exemplo, um injetor de spray plano comercial mente disponível (número 23990-1/4-04, Spraying Systems Co., Dillburg, PA) foi usado com uma bomba Masterflex® L/S (modelo 77250-62) para bombear líquido a 1 litro por minuto e 206,84 kPa (30 psi); os embriões foram removidos de uma espiga de milho sob essas condições. Outro exemplo de um injetor preferido é um injetor que gera um jato de fluido na forma de folha plana de fluido, tal como está ilustrado na Figura 4. Tal injetor preferivelmente é capaz de gerar um jato de fluido uniforme, plano que mantém um fluxo semelhante a uma folha coerente, uniforme por pelo menos uma distância suficiente para permitir que o fluxo contate mais do que uma semente (e preferivelmente várias sementes) ao mesmo tempo. O novo injetor ilustrado na Figura 4 é desenhado para gerar um jato laminar uniforme que tem cerca de 0,5 a 1 milímetro de espessura, maior do cerca de 20 milímetros de largura e que mantém o fluxo folicular ao longo de uma distância de cerca de 15 a cerca de 30 milímetros da abertura do injetor. Essa última distância permite que o jato seja movido ao longo das fileiras de grãos com necessidade de ajustes mínimos para as diferenças na distância entre a superfície dos grãos e a abertura do injetor.
[00172] Sem levar em consideração a área ou a forma do jato ou o padrão do spray gerado pelo injetor ou pela abertura através da qual o
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62/99 líquido flui, injetores ou aberturas são preferivelmente usados com taxas de fluxo e pressões suficientes para gerar força fluida suficiente para desalojar o embrião de sua semente, sem danificar o embrião. Em algumas modalidades é preferível usar uma taxa de fluxo pequena e possivelmente uma pressão maior para minimizar o consumo de fluido (tal como um meio) assim como para minimizar o rejeito gerado. Exemplo 11: Usando um jato de gás para isolar substancialmente os embriões [00173] Esse exemplo descreve modalidades adicionais de métodos e dispositivos para preparar mecanicamente múltiplos embriões de milho adequados para transformação genética e cultura de tecido. Como descrito no Exemplo 6, jatos de gás também podem ser usados para o isolamento substancial de múltiplos embriões. Um aparelho similar àquele descrito no Exemplo 10 foi modificado para uso com gás. Uma ponta de pipeta de 1 mililitro (Marsh Bio Products-ABGene, Rochester, NY; número de catálogo TN1300RS) foi fixada ao lado de um cilindro graduado de polimetilpenteno de 1 litro e serviu como abertura para orientar uma corrente de ar como um jato através de um orifício feito na parede do cilindro. O ar foi fornecido por um compressor pressurizado entre cerca de 413,7 a cerca de 689,5 kPa (60 a cerca de 100 psi). Uma válvula de ar, por conveniência, foi posicionada em linha entre o compressor e a ponta da pipeta. O jato de ar que emerge dessa ponta de pipeta foi usado para desalojar os embriões de uma espiga de milho preparada. O exame dos grãos depois que eles foram submetidos ao jato de ar mostrou que o pericarpo espesso permaneceu no lugar e circundado por glumas semelhantes a papel e os conteúdos do pericarpo (embrião e endosperma) tinham sido removidos. O exame do tecido retido pela gaze de algodão classe 60 mostrou que esse incluía embriões desalojados assim como algumas glumas desalojadas pelo jato de ar de alta pressão. As glumas de milho têm uma suPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 70/151
63/99 perfície cerácea como os embriões e também flutuam depois do procedimento de flutuação. Usando pressões de ar menores pode-se reduzir a contaminação por gluma.
Exemplo 12: Isolamento substancial de embriões usando outras forças fluidas [00174] Esse exemplo descreve modalidades adicionais de métodos e dispositivos para preparar mecanicamente múltiplos embriões de milho adequados para transformação genética e cultura de tecido. As forças exercidas pelos fluidos, diferentes da pressão de fluido positiva de um jato de fluido, podem ser usadas para isolar substancialmente os embriões. Em um experimento, o ápice dos grãos foram removidos de uma espiga de milho, que foi colocada dentro de uma garrafa que continha água destilada estéril e agitada vigorosamente com a mão. Isso resultou no isolamento substancial de 90 dos 200 embriões da espiga. Outro experimento repetiu o procedimento precedente, exceto pela agitação que foi realizada em um misturador de tina mecânico. Nesse experimento, 56 embriões foram substancialmente isolados dos 190 embriões da espiga. Em um terceiro experimento, um procedimento similar foi realizado, exceto que a espiga de milho tinha sido présubmersa em meio 211 (1 litro: N6 Basal Salt Mixture da Duchefa: 1 pkg (isto é, 3,952 g) (Gold Biotechnology Inc., St. Louis, MO, USA); 2,4-D (1 mg/ml): 1 ml; Tiamina (0,5 mg/ml): 2 ml; Ácido Nicotínico (0,5 mg/ml): 1ml; Monoidratode L-Asparagina: 0,91g; Mio-inositol: 100 mg; MES: 0,5 g; MgCÍ26H2O: 1,6g; Hidrolisado de Caseína: 100 mg; Prolina: 0.69g; Sacarose: 20g; Ágar: 2g, pH 5.8), e a misturação foi realizada em um misturador de tinta. Nesse experimento, 109 embriões foram substancialmente isolados dos 210 embriões da espiga. Nesses casos, a força de jato não fluido a partir do movimento do líquido entorno da espiga de milho resultou no isolamento substancial dos embriões; a força fluida pode incluir fluido com fluxo turbulento,
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64/99 fluido com fluxo laminar, cisalhamento a partir do fluxo de fluido, fluido com pressão negativa (por exemplo, resultando em cavitação) ou suas combinações. As forças também incluem forças geradas por técnicas acústicas, tais como por uma onda ou ondas acústicas (pulsadas ou contínuas) tanto na fase gasosa quanto na fluida.
[00175] Os exemplos precedentes (incluindo os Exemplos 9-11) descrevem o uso de um jato de fluido para remover embriões de uma espiga imatura. Durante esses procedimentos, foi observado que o jato de fluido geralmente também induzia a liberação de pelo menos parte do endosperma do grão. O tecido do endosperma foi observado ser mais macio e mais friável do que os embriões e tendia a desintegrar em vários graus (em contraste com os embriões que tendem a permanecer intactos). É possível que os endospermas se desintegrem depois da exposição ao cisalhamento causado pelo jato de fluido. Esse cisalhamento é considerado não ser uniforme, resultando na variabilidade da desintegração observada; apesar de tudo, uma grande proporção do material do endosperma que foi suficientemente desintegrado para passar através da gaze de algodão, deixou um retentado composto de uma preparação semipura de embriões.
[00176] Quando um jato de baixa pressão de uma garrafa comum de laboratório com esguicho foi direcionado para o retentado da gaze de algodão, mais do tecido de endosperma remanescente foi desintegrado adicionalmente e lavado através da gaze, deixando para trás uma preparação de embriões relativamente mais pura. Portanto, é razoável predizer que se o retentado é uniformemente exposto a uma força de cisalhamento de intensidade correta, a todo ou substancialmente todo o endosperma remanescente pode se desintegrar e passar através da gaze. Tal força de cisalhamento pode ser gerada por qualquer meio adequado, tal como, mas não limitado a um jato único, jatos múltiplos, um jato semelhante a uma folha ou um jato semelhante a
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65/99 uma cortina, jatos que se movem rapidamente e aceleração e desaceleração dos endospermas. Além disso, se o jato usado para liberar inicialmente os conteúdos do grão é destinado a expor uma proporção maior dos endospermas ao cisalhamento durante a ejeção, pode ser obtida uma preparação inicial de embrião com maior pureza.
[00177] Segue-se modalidade não limitante para aplicação de cisalhamento para purificar adicionalmente os embriões. Uma vez que os embriões e endospermas parcialmente desintegrados são liberados de uma espiga, o restante do endosperma pode ser fragmentado rapidamente por fluxo de líquido, por exemplo, a partir de um injetor de spray, que golpeia o endosperma uniformemente e simultaneamente. Um tipo adequado de injetor é um injetor cônico total. Injetores cônicos totais geram um padrão de spray completamente preenchido com gotas. Uma lâmina interna dentro do injetor transmite turbulência controlada ao líquido antes que ele saia pelo orifício, possibilitando a formação do padrão em spray. Os injetores comercial mente disponíveis têm padrões de spray que são redondos, quadrados ou ovais. Um exemplo de um injetor de cone total é conhecido como UniJet® Spray Nozzle, Standard Spray, Small Capacity (Spraying Systems Co., Wheaton, IL; pedido número TG-SS0.3).
Exemplo 13: Dispositivos que usam uma combinação de forças [00178] Esse exemplo descreve várias modalidades adicionais do método da invenção, que usa uma combinação de forças para isolar substancialmente múltiplos embriões de sementes.
[00179] A Figura 5 ilustra um dispositivo que usa um jato de fluido mais volumoso(como descrito no Exemplo 10). Esse dispositivo inclui um injetor para a geração do fluxo de fluido tal como um jato de fluido mais volumoso (por exemplo, um jato de fluido plano) e opcionalmente um cabeçote de sucção ou componente para aplicação de fluido com pressão negativa (por exemplo, por vácuo ou sucção), para o desaloPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 73/151
66/99 jamento de embriões e/ou para coletar embriões desalojados. A Figura 5A (alto) ilustra um corte transversal de um exemplo de tal dispositivo, mostrando como o injetor, o cabeçote de sucção opcional e a espiga de milho podem ser posicionados um em relação ao outro. A espiga de milho, o injetor e o cabeçote de sucção opcional podem ser movidos um em relação ao outro; por exemplo, a espiga de milho pode estar estacionária, enquanto o injetor e o cabeçote de sucção opcional são movidos ou o injetor e o cabeçote de sucção estão estacionários, enquanto a espiga de milho é movida. A Figura 5B (embaixo) ilustra esquematicamente uma espiga de milho posicionada no dispositivo e mostra o injetor posicionado para gerar um jato de fluido plano em que o jato impacta múltiplos grãos de uma fileira.
[00180] A Figura 6 ilustra uma modalidade de um cabeçote de sucção adequado ou componente para aplicação de fluido com pressão negativa (por exemplo, por vácuo ou sucção), tal como é usado opcionalmente no dispositivo da Figura 5 e que também pode ser usado sozinho para isolar substancialmente os embriões. O cabeçote de sucção pode incluir uma ou mais aberturas através das quais pode ser aplicado o fluido com pressão negativa. O cabeçote de sucção também pode incluir um meio para distribuição de fluido (tal como gás ou líquido, por exemplo, água ou meio), por exemplo, aberturas múltiplas no cabeçote de sucção. Para uso com o milho, o cabeçote de sucção é preferivelmente formatado para acompanhar os contornos de uma espiga de milho típica e é preferivelmente capaz de capturar embriões de múltiplos grãos ou de múltiplas fileiras de grãos. É previsto que o cabeçote de sucção possa ser fabricado com um material rígido (tal como aço inoxidável ou outros metais) ou com um material flexível para permitir a conformação mais fácil do cabeçote de sucção aos contornos de uma espiga de milho ou de suas combinações. Os embriões podem ser substancialmente isolados por qualquer combinação de
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67/99 pressão mecânica positiva (exercida, por exemplo, pelo bordo de ataque do cabeçote de sucção), pressão de fluido negativa (por exemplo, sucção ou vácuo) e força fluida (tal como, mas não limitada à pressão positiva a partir de um jato de fluido, fluido com fluxo turbulento e fluido com fluxo laminar capturando o material do interior do grão).
[00181] Dispositivos para aplicação de força para substancialmente isolar embriões, tais como são descritos nos Exemplos 1,3,4, 6, 7, 9, 10 e o presente exemplo (incluindo, mas não limitado aos dispositivos ilustrados nas Figuras 5 e 6) podem ser movidos em relação à espiga de milho. A espiga pode estar parada ou o dispositivo pode estar parado ou ambos podem ser movidos. Como a semente do milho tipicamente ocorre em fileiras relativamente uniformes arranjadas em paralelo ao eixo longitudinal da espiga de milho, o dispositivo tipicamente é movido (em relação à espiga) tal que o dispositivo passa paralelamente ao eixo longitudinal da espiga de milho e acompanhando uma fileira ou múltiplas fileiras de grãos. Entretanto, o movimento de tais dispositivos em relação a espiga pode acompanhar a circunferência da espiga ou pode ser aleatório ou pode ser qualquer combinação de movimentos adequados.
[00182] As Figuras 7A a 7C ilustram planos diferentes de uma modalidade de dispositivo que usa uma combinação de forças para isolar substancialmente múltiplos embriões de semente (nesse exemplo, de milho). Esse dispositivo inclui um cabeçote com um bordo de ataque capaz de aplicar uma quantidade predefinida de pressão mecânica à base dos grãos que previamente tiveram o pericarpo aberto ou truncado, tal que os embriões são expelidos do grão de uma maneira similar àquelas descritas nos Exemplos 1, 3 e 4. O dispositivo inclui ainda um componente para aplicação de pressão de fluido negativa (por exemplo, por vácuo ou sucção) para deslocar embriões e/ou para coletar os embriões deslocados. Os embriões expelidos (e os tecidos não embriPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 75/151
68/99 onários que os acompanha) são assim separados da espiga de milho e podem ser coletados pela aplicação de pressão de fluido negativa. Os embriões coletados e tecidos não embrionários podem ser ainda separados, se desejado, por métodos adequados, tais como separação por tamanho, separação hidrofóbica ou centrifugação diferencial. Uma variação desse dispositivo pode incluir um meio para distribuição de fluido (tal como líquido, por exemplo, água ou meio), por exemplo, múltiplas aberturas no cabeçote de sucção.
[00183] Os dispositivos para extração do embrião ilustrados nas Figuras 5, 6 e 7 são descritos como exemplos ilustrativos que não pretendem ser limitantes. Esses e outros dispositivos podem incluir componentes adicionais, por exemplo, meios para separação de embriões de tecido não embrionário ou de fluidos usados no processo de isolamento substancial.
Exemplo 14: Dados de Viabilidade [00184] Os múltiplos embriões de monocotiledônea fornecidos pelo uso dos métodos e dispositivos da presente invenção são o mais preferivelmente embriões adequados para aplicação em transformação genética ou cultura de tecido, tal como transformação e regeneração de plantas. Esse exemplo ilustra adicionalmente a utilidade de métodos da invenção no fornecimento de múltiplos embriões de monocotiledônea que são viáveis e adequados para transformação genética ou cultura de tecido. Nesse exemplo, a qualidade de embriões imaturos de milho obtidos pelos diferentes métodos de excisão foi comparada na sua resposta à transformação por Agrobacterium tumefasciens. [00185] Embriões de milho excisados usando esse aparelho e método foram transformados usando métodos padronizados conhecidos na técnica da transformação de milho (por exemplo, Cai et al; Publicação de Pedido de Patente 2004/0244075). Quatro experimentos (designados A, B, C e D, respectivamente) foram realizados. Cada expePetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 76/151
69/99 rimento comparou embriões obtidos pela excisão manual com embriões obtidos por um método da presente invenção: excisão por um jato de líquido (experimentos A, B e D) ou excisão por um jato de gás (experimento C). O jato de líquido nos experimentos A e B usou água de torneira comum e um injetor feito de uma ponta de pipeta. O experimento C testou um jato de gás usando ar de uma bomba de ar comprimido e um injetor feito de uma ponta de pipeta. O jato de líquido no experimento D usou um meio MSPL % concentrado (veja Tabela 1 da Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0244075 de Cai et al) como o líquido e um injetor de corrente sólida com um diâmetro de orifício equivalente a 0,020 polegada (número de catálogo TP000050-SS, Agricultural Division of Spraying Systems Co., Wheaton, IL).
[00186] As espigas de milho foram colhidas doze dias depois da polinização e esterilizadas por imersão em uma garrafa de 1 litro de etanol 80% por 3 minutos. Os embriões foram excisados manualmente pelo corte do terço superior do grão com um bisturi e remoção do embrião do grão usando uma espátula estreita. Os embriões coletados foram excisados em 1 mililitro de meio % MSPL em um tubo único de microcentrífuga (Eppendorf). O meio foi removido e substituído por 1 mililitro de Agrobacterium tumefasciens preparada como descrito abaixo.
[00187] Os embriões foram substancialmente isolados usando um jato de fluido (líquido ou gás), seguindo os procedimentos similares àqueles descritos nos Exemplos 10 e 11. O jato de fluido foi usado para excisar os embriões remanescentes sobre as espigas depois da remoção do terço superior do grão com um bisturi. A espiga foi posicionada tal que o jato de fluido foi apontado para grãos cortados individuais em sucessão para desalojar ambos o embrião e o tecido não embrionário (endosperma). Os conteúdos do grão removido da espiga
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70/99 foram passados através de uma tela grossa para remover pedaços grandes de endosperma e os embriões foram coletados sobre gaze de algodão esterilizada. Os embriões foram transferidos usando uma pequena espátula da gaze para um tubo de microcentrífuga contendo 1 mililitro de meio % MSPL. Depois que todos os embriões foram coletados, o meio % MSPL foi removido e substituído por 1 mililitro de inoculante de Agrobacterium tumefasciens.
[00188] Os embriões preparados pelos vários métodos de excisão foram submetidos aos mesmos procedimentos de inoculação, seleção e regeneração. Procedimentos adequados, incluindo as descrições de meios e reagentes para transformação de plantas usando seleção com glifosato e GFP como repórter foram descritos na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Número 2004/0244075 de Cai et al. [00189] Os embriões foram inoculados com 1,0 mililitro de Agrobacterium por 5 minutos. Os conteúdos do tubo de microcentrífuga foram despejados sobre uma placa com meio de cocultura, o excesso de Agrobacterium foi removido com uma pipeta e os conteúdos foram cocultivados por 18 horas a 23 graus Celsius. Os embriões foram transferidos depois para um meio de indução MS e cultivados a 30 graus Celsius por 13 dias. Os calos derivados da transformação foram cultivados a 27 graus Celsius por 11 dias antes da regeneração. Nesse momento, setores positivos para GFO foram contados usando um microscópio de fluorescência. Para a regeneração, os calos derivados de cada embrião foram individualmente transferidos para o meio MS/6 BA e cultivados em um ambiente iluminado por 7 dias, depois do que cada calo amadurecido foi transferido para meio MSOD e retornado para o ambiente iluminado por 17 dias adicionais. As mudas resultantes foram transferidas para Phytatrays® contendo meio de regeneração (consistindo em 2,165 g de MS Basal Salts, 5 mililitros de 100X MS Vitamins e 20 gramas de sacarose feito com 1 litro em água e autoclaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 78/151
71/99 vado, pH ajustado com KOH para 5.8, solidificado por autoclavagem com 3 g de Phytagel® e com 0,75 mililitro de 1 miligrama por mililitro de ácido indol-3-butírico, 0,5 mililitro de 1 miligrama por mililitro de ácido 1-naftalenoacético e 0,2 mililitro de glifosato 0,5 molar). Após 3 semanas, as plantas transgênicas foram consolidadas pelo transplante de mudas enraizadas em vasos de turfa contendo mistura de solo e cultivadas a 26 graus Celsius.
[00190] Os resultados desses experimentos estão resumidos na Tabela 3. O número de embriões que foram transformados é estimado a partir do número de embriões positivos para GFP.
Tabela 3. Viabilidade e frequência de transformação de embriões excisados.
| expe- rimen- to | método de excisão | número de embriões inoculados | número de embriões positivos para GFP | frequência de transfor- mação | número de plantas no solo | frequência de trans- forma- ção/regener ação |
| A | manual | 56 | 23 | 41% | 6 | 11% |
| jato líquido | 44 | 8 | 18% | 3 | 6,8% | |
| B | manual | 22 | 11 | 50% | 6 | 27% |
| jato líquido | 23 | 4 | 17% | 1 | 4% | |
| C | manual | 33 | 27 | 82% | n/a | n/a |
| jato de gás | 61 | 19 | 31% | n/a | n/a | |
| D | manual | 36 | 17 | 47% | n/a | n/a |
| jato líquido | 166 | 51 | 31% | n/a | n/a |
n/a:dados não avaliados [00191] A frequência global de transformação e regeneração é dada como o percentual de plantas positivas para GFP, regeneradas a partir dos embriões inoculados. Esses resultados demonstraram que os vários métodos e dispositivos da presente invenção são úteis para o fornecimento de múltiplos embriões de monocotiledônea adequados para transformação genética ou cultura de tecido.
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Exemplo 15: Desenvolvimento de meios líquidos para excisar embriões de milho [00192] O aparelho de jato de fluido requereu cerca de 20 I de líquido para excisar os embriões de uma espiga, necessitando o desenvolvimento de um meio de excisão que seja simples de preparar (isto é, contendo apenas cerca de um ou dois ingredientes), que possa ser facilmente preparado, que seja esterilizado por filtração preferivelmente através de uma unidade de filtração em linha, que possa fluir através do aparelho de jato de fluido em uma pressão operacional preferida de 275,8 - 413,7 kPa (40-60 psi) e que não necessitasse de ajuste de pH antes do uso. Tal meio e sua preparação devem ser de baixo custo, reduzir o tempo de preparação do meio e permitir a automação. Esse exemplo fornece vários de tais meios.
[00193] Meios de cultura tais como Lynx 1013 (meio de inoculação) e Lynx 1902 (Lynx 1013 com meia concentração) foram usados com sucesso para a excisão de embriões de milho úteis para a transformação usando um aparelho de jato de fluido. O Lynx 1013 compreende (por litro): MS Basal Salts (Phytotech; PhytóTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS): 2,165g; MS Vitamins (100X; Phytotech): 10 ml; Glicose (Phytotech): 36 g; Sacarose (Phytotech): 68,5 g; Prolina (Fisher): 0,115 g. O meio foi ajustado para pH 5.4 com KOH e depois esterilizado por filtração. Embora esses meios funcionassem bem, eles continham vários ingredientes, alguns dos quais deviam ser esterilizados por filtração. Esses meios também requerem ajuste de pH antes do uso.
[00194] Vários outros meios líquidos (Tabela 4) foram testados para a excisão de embriões de milho transformáveis a partir de espigas de milho. Os embriões excisados foram usados depois para a transformação de acordo com os métodos descritos em outro lugar nessa descrição e a frequência de transformação (FT) foi determinada para cada
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73/99 meio de excisão testado. A FT foi definida como o número de eventos de transformação únicos regenerados em plantas dividido pelo número de embriões inoculados com Agrobacterium.
[00195] Todos os meios testados, incluindo a água, foram capazes de produzir embriões que eram transformáveis (veja a Tabela 4). Entretanto, meios que compreendem manitol produziram FT comparável com o meio de controle Lynx 1902. O meio com manitol é um meio simples com apenas dois ingredientes (manitol e água), não requer ajuste de pH antes do uso e é esterilizável por filtração, tornando-o significativamente mais barato e conveniente para usar.
[00196] A concentração de manitol no meio está entre cerca de 0,05 M a cerca de 0,5 M. Preferivelmente a concentração de manitol no meio é de cerca de 0,1 M. Mais preferivelmente, a concentração de manitol no meio é de cerca de 0,2 M. Uma concentração adequada de manitol para o meio de excisão, entretanto, pode ser determinada por aquele versado na técnica de cultura de tecido de planta, simplesmente pela variação da concentração de manitol.
[00197] Medidas osmóticas representativas em potencial dos meios selecionados são encontradas na Tabela 4. As leituras foram feitas usando Wecor 5100C Vapor Pressure Osmometer (Wecor, Logan, UT, USA), com calibração usando soluções padronizadas de 100, 290 e 1000 mOsm/kg. Um meio com um potencial osmótico (isto é, molalidade) entre cerca de 0 mOsm/kg a cerca de 500 mOsm/kg é adequado para a excisão de embriões de milho para cultura de tecido, incluindo por exemplo, cerca de 7 mOsm/kg a cerca de 300 mOsm/kg. Por exemplo, uma solução de manitol 0,2 M em água tem uma osmolalidade de cerca de 222-230 mOsm/kg, enquanto que uma solução de MES 0,05% em água tem uma osmolalidade de cerca de 7 mOsm/kg. Essa faixa de potencial osmótico é preferivelmente obtida pela adição de um ou dois compostos para fazer o meio, tal como os meios Lynx
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74/99 #1937, #1932 e #1162. Preferivelmente, tais compostos não têm efeito adverso significativo sobre a cultivabilidade e transformabilidade do tecido dos embriões excisados.
Tabela 4. Medidas de potencial osmótico de soluções exemplares para uso no isolamento de embriões
| Identificador e composição | Osmolalidade média mOsm/kg | Osmolalidade STD | % FT |
| Lynx #1118- Água destilada estéril | 7,00 | 8,89 | 3,0 |
| Lynx # 1013 - Meio de Ino- culação | 503,67 | 9,07 | 20,6 |
| Cloreto de cálcio- 10 ppm CaCb | n/a | n/a | 4,2 |
| Lynx # 1902 - Lynx #1013 meio concentrado | 262,67 | 4,04 | 9,5 |
| Lynx# 1932-0,2 M Manitol, autoclavado | 222,33 | 9,29 | 15,6 |
| Lynx # 1986 - 0,2M Manitol, esterilizado por filtração | 230,00 | 28,83 | 11 |
| Lynx # 1987 - 0,1 M Manitol, esterilizado por filtração | 117,33 | 27,15 | 9,7 |
| Lynx #1162- 5% Sacarose (p/v) | 258,33 | 4,51 | 4,5 |
| Lynx # 1953 - 5% Sacarose + Sais MS (mesma quantidade como em Lynx #1013) | 313,33 | 3,51 | 1,6 |
| Lynx # 1937 - 0,05% MES, pH 5.4, autoclavado | 7,00 | 3,61 | 0,3 |
| Lynx # 1964 - 0,05% MES, pH 5.8, esterilizado por filtração com filtro de 0,2 mi- cron | 13,33 | 11,50 | 0 |
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75/99 n/a = não realizado
Exemplo 16: Construção de um sistema de preparação de meio para excisão por jato de fluido [00198] Esse exemplo descreve um sistema de preparação de meio (MPS) para uso com um aparelho de jato de fluido. Os aparelhos de jato de fluido testados precisaram de 20 litros de meio, o que requereu tempo e esforços para fazer e usar. O MPS da presente invenção pode preparar grandes quantidades de meio rapidamente. Ele também permite a preparação de um volume específico de meio para um tamanho particular de espiga de milho.
[00199] O MPS compreendeu uma Câmara de Misturação (MC) e uma Caixa de MPS (MPSH). O MC foi desenhado para ser facilmente desengatável de MPSH para fácil esterilização por autoclavagem. Ambos, MC e MPSH, podem ser feitos de qualquer material adequado. Preferivelmente eles são feitos de um material tal como aço ou alumínio. Como mostrados nas Figuras 11 e 12, MC compreende um tanque que tem uma extremidade superior e uma extremidade inferior, um flange que está acoplado na extremidade superior do tanque e uma placa de cobertura para cobrir a extremidade superior e para vedar a câmara de misturação. Preferivelmente, o tanque é vedado com a placa de cobertura por um anel de vedação fornecido no flange. A placa de cobertura é feita, preferivelmente de alumínio aeronáutico classe 7075, resistente a corrosão para reduzir o peso da câmara de misturação. Em uma modalidade, o tanque é fornecido com três pinos na extremidade inferior, cada um sobre três lados como mostrado na Figura 12, para orientação e posicionamento do tanque sobre a placa de suporte da câmara de misturação. Em uma posição de trabalho, os três pinos se engatam com os três suportes de posicionamento fornecidos sobre a placa de suporte como mostrado nas Figuras 12 e 14. Uma placa de posicionamento (Figura 12 e 13) também é fornecida no funPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 83/151
76/99 do do tanque, no quarto lado, para segurar o tanque em uma posição de trabalho sobre a placa de suporte da câmara de misturação. Preferivelmente, a placa de posicionamento tem uma rosca de 6,35 mm (1/4) NPT para a montagem de um conector rápido para conduzir um braço de posicionamento com um punho (Figura 14) a fim de fixar a câmara de misturação sobre a placa de suporte (por exemplo, Figura 13).
[00200] A placa de cobertura é fornecida com uma abertura para inserção de um tubo para trazer um líquido, tal como água para fazer o meio, uma abertura para inserção de um tubo para levar o meio preparado que é conectado com uma aparelho de jato de fluido, uma abertura para inserção de um tubo para adição de ingredientes do meio, preferivelmente de aço inoxidável, na câmara de misturação (por exemplo, Figura 12). N aposição de trabalho, anéis de vedação separados vedam vários tubos com aberturas. A placa de cobertura também é fornecida com uma abertura para inserção de uma caixa contendo um sensor ultrassônico para monitorizar um volume específico de meio que precise ser preparado. Preferivelmente, a abertura para a caixa do sensor ultrassonico é fornecida em um lado da placa de cobertura. Na posição de trabalho, várias aberturas fornecidas sobre a placa de cobertura da câmara de misturação são conectadas aos tubos correspondentes fornecidos na superfície inferior da plataforma superior da caixa (Figura 11). Esses tubos são preferivelmente feitos de aço. As várias aberturas se conectam com a câmara de misturação como mostrado na Figura 11, por exemplo, através de tubos de conexão. A canalização é preferivelmente feita de policarbonato.
[00201] Um conjunto misturador de meio está acoplado à extremidade inferior da placa de cobertura, tal que o conjunto pende, preferivelmente, no centro do tanque. O conjunto compreende um impulsor com duas laminas dobradas, um eixo de aço inoxidável vedado com
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77/99 um anel de vedação na placa de cobertura, um rolamento de esferas para alta temperatura adequado para funcionar em alta temperatura, tal como acima de 204°C (400°F), presente durante a autoclavagem e um acoplamento do tipo aranha (por exemplo, Figura 12) para o acoplamento do conjunto com um motor no MPSH (Figura 16).
[00202] Um bloco rosqueável é montado sobre o lado inferior da câmara de misturação que suporta a placa e é conectável com um fuso de esferas montado em um rolamento de esferas fornecido na superfície superior da plataforma inferior da caixa. A placa de suporte também é deslizante através de quatro rodas para os quatro pés da caixa de MPS como mostrado na Figura 15. As rodas rolam ao longo de fendas em t das quatro pernas para facilitar o movimento para cima e para baixo da câmara de misturação quando o motor de passo fornecido na superfície inferior da plataforma inferior do MPSH é ligado. [00203] Depois da autoclavgem, a câmara de misturação é posicionada sobre a placa de suporte pelos três pinos e a placa de posicionamento. O braço de posicionamento com o punho é inserido no conector rápido. O braço é empurrado para baixo e girado 90 graus no sentido horário com a ajuda do fixador para posicionar e fixar a câmara de misturação sobre a placa de suporte. O braço de posicionamento e acoplado ao carne e montado sobre uma mola que é soldada na placa de suporte. A mola empurra o braço e o carne para cima. Quando colocado em posição, o pino posterior da câmara de misturação empurra um interruptor elétrico, que envia um sinal para um Controlador Lógico Programável (PLC). Esse sinal informa ao PLC que a câmara de misturação está posicionada sobre a placa de suporte da câmara de misturação. O motor de passo fornecido sobre a plataforma inferior da caixa empurra a câmara de misturação em direção a plataforma superior da caixa onde, na posição de trabalho, as várias aberturas fornecidas sobre a placa de cobertura da câmara de misturação se tornam
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78/99 conectadas com os tubos correspondentes fornecidos na superfície inferior da plataforma superior da caixa (Figura 16).
[00204] Depois de receber um sinal de operação, o PLC abre uma válvula eletromagnética conectada a um sistema de água para o preenchimento da câmara de misturação com água. O sensor ultrassonico monitoriza o nível de água na câmara de misturação. Quando o nível da água alcança o nível especificado na câmara de misturação, o PLC fecha a válvula de água eletromagnética e aguarda por um sinal do operador indicando que os componentes do meio de excisão estão na câmara de misturação. Quando o PLC recebe aquele sinal, ele aciona um motor fornecido sobre a superfície superior da plataforma superior do MPSH e operacionalmente ligado ao conjunto misturador. Assim, o conjunto misturador começa a misturar o meio. Uma vez que o meio está pronto, ele é bombeado usando uma bomba de engrenagem através do tubo de saída de meio para o aparelho de jato de fluido de acordo com um programa PLC.
[00205] Em uma modalidade, a saída/suprimento do meio preparado conectada ao aparelho de jato de fluido é fornecida com uma unidade de filtração em linha tal como um 0,2 Micron Absolute FiberFlo® Hollow Fiber Capsule Filter (Minntech Filtration Technologies Group, Minneapolis, MN) para esterilizar o meio antes do seu uso no aparelho de jato de fluido para a excisão dos embriões.
Exemplo 17: Isolamento de embrião por excisão gradativa [00206] Esse exemplo descreve um aparelho para a preparação de múltiplos embriões de milho adequados para cultura de tecido de grãos sobre uma espiga de milho, compreendendo pelo menos uma abertura para orientar um primeiro fluxo de fluido em um primeiro momento para extrair substancialmente os endospermas dos grãos e um segundo fluxo de fluido em um segundo momento para extrair substancialmente os embriões dos grãos, os embriões extraídos sendo
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79/99 adequados para cultura de tecido. O aparelho compreende ainda um meio para mover pelo menos uma espiga de milho em relação ao primeiro e segundo fluxos de fluido. O meio para mover pelo menos uma espiga de milho em relação ao primeiro e segundo fluxos de fluido move os fluxos de fluido ao longo do eixo longitudinal de pelo menos uma espiga de milho. Nessa modalidade particular de aparelho, cada fluxo de fluido é um fluxo líquido. O fluxo líquido pode consistir, por exemplo, essencialmente em manitol e água em uma concentração de cerca de 0,05 M a cerca de 0,5 M de manitol. O fluxo de fluido pode ser alternativamente um fluxo de gás. O aparelho pode compreender ainda um meio para detectar endosperma ou embriões excisados. O aparelho pode compreender também um meio para a canalização de endosperma ou embriões excisados de maneira a separar o endosperma do embrião. O aparelho pode compreender também um meio para ligar os meios de detecção de endosperma e embriões excisados aos meios de canalização de endosperma e embriões excisados, eletronicamente para automação. O aparelho pode compreender ainda pelo menos um separador para a separação de embriões de tecidos não embrionários, em que os embriões separados compreendem embriões de milho adequados para cultura de tecido. O separador pode compreender um dispositivo de exclusão por tamanho. Alternativamente, o separador pode separar os embriões do tecido não embrionário por hidrofobicidade diferencial ou densidade diferencial.
[00207] O presente exemplo também descreve um método para o fornecimento de embriões de monocotiledônea adequados para cultura de tecido compreendendo: (a) fornecer sementes de monocotiledôneas contendo embriões que têm uma abertura no pericarpo das sementes; e (b) aplicar uma primeira força em um primeiro ponto de tempo às sementes para extrair substancialmente os endospermas das sementes e uma segunda força em um segundo ponto de tempo
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80/99 para extrair substancialmente os embriões das sementes, os embriões extraídos sendo adequados para cultura de tecido. As forças compreendem uma ou mais forças selecionadas a partir de um jato de fluido com pressão positiva, um jato de líquido com pressão positiva, pressão mecânica positiva, pressão negativa, força centrífuga, aceleração linear, desaceleração linear, cisalhamento fluido, fluxo de fluido turbulento e fluxo de fluido laminar. O método compreende ainda separar os embriões do tecido não embrionário pelos métodos selecionados do grupo que consiste em separação por exclusão de tamanho, separação hidrofóbica e densidade diferencial. As sementes de monocotiledônea são fornecidas sobre, pelo menos, uma espiga. A monocotiledônea pode ser da família Poaceae, tal como espécies de Zea (por exemplo, Zea mays). A etapa de cultura de tecido pode incluir uma ou mais etapas de transformação e regeneração, que resultam em pelo menos uma planta transformada fértil.
[00208] Como mostrado na Figura 17, o aparelho é fornecido com um injetor de jato plano (1) para produzir um fluxo plano laminar (6), dois motores de passo controlados por um controlador lógico programável (PLC) e uma bomba de engrenagens digital. Um motor de passo gira a espiga (2), que tem os grãos de milho a partir do s quais a coroa foi removida para facilitar a excisão, montado sobre um eixo em uma câmara hermética (3) e o segundo motor avança a espiga ao longo do eixo tal que o fluxo atua sobre cada grão por substancialmente a mesma quantidade de tempo. A bomba de engrenagens digital força o meio líquido através do injetor como especificado pela taxa e pressão de PLC. O injetor (1) produz um fluxo de líquido que tem cerca de 0,0762 mm (cerca de 0,003) de largura e cerca de 25,4 mm (cerca de 1) de altura. Geralmente a largura do fluxo é menor do que a largura do grão. Na faixa de pressão testada de 206-517,1 kPa (30-75 psi), o fluxo laminar ficou estável até uma distancia de até 5 cm (2), 12,7Petição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 88/151
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7,62 cm (5-3) do injetor (1) e não se dispersou antes de atingir a espiga. A espiga (2) pode ser posicionada a 3,2 - 5 cm (1¾11 - 2) do injetor (1) tal que o fluxo de líquido aja sobre cada grão em uma fileira com substancialmente a mesma força. A quantidade e a duração da força podem ser manipuladas pela alteração da pressão do líquido no injetor, pelo ajuste da distancia da espiga ao injetor e pelo espaço entre as placas do injetor assim como outros parâmetros tais como o ângulo de entrada do fluxo de líquido no grão e a velocidade de rotação da espiga.
[00209] Na primeira fase, um PLC de acordo com um programa PLC abre um canal (4) por uma válvula (5) para coletar o endosperma e ajusta uma pressão e uma taxa de fluxo através do injetor (1) pelo envio de sinais de controle para a bomba de engrenagens digital e gira e avança a espiga (2) pelos dois motores de passo. O fluxo de líquido (6) controlado pelo PLC remove primeiro o endosperma (7) dos grãos deixando os embriões (9) acoplados aos grãos (7). A quantidade de tempo e força necessárias para remover o endosperma pode ser ajustada dependendo do tamanho do endosperma, da extensão do corte na coroa do grão e das diferenças entre os tamanhos da espiga e do grão, entre outros parâmetros. A mistura de meio líquido e endospermas coletados no canal (4) pode ser bombeada através de um sistema de filtração. Depois da filtração, o meio líquido pode ser reutilizado no processo de excisão.
[00210] Na segunda fase, a PLC de acordo com um programa de PLC fecha o canal (4) e abre um canal (10) pela válvula (5) para a coleta de embrião, ajustando uma pressão e uma taxa de fluxo através do injetor (1) e girando e avançando a espiga. O fluxo de líquido (6) remove os embriões (9) e o resto dos endospermas (8) dos grãos (7). A separação posterior dos embriões, se desejada, pode ser feita usando separadores descritos em outro lugar. A quantidade de tempo
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82/99 e força necessárias para remover o endosperma pode ser ajustada dependendo do tamanho do endosperma, da extensão do corte na coroa do grão e das diferenças entre os tamanhos da espiga e do grão, entre outros parâmetros. A mistura de meio líquido e embriões coletada no canal (10) é submetida a um dispositivo de separação (por exemplo, Exemplo 18) para isolar os embriões dos resíduos e do líquido, e o líquido pode ser bombeado através de um sistema de filtração para reutilização no processo de excisão.
[00211] A câmara (3) pode ser guarnecida com um emissor (11) e um sensor fotoelétrico preferencial (12) para detecção dos embriões no meio líquido que sai depois da excisão. Durante a primeira fase, o sinal que confirma o aparecimento dos embriões no meio que sai instrui o PLC para completar a fase um. Durante a segunda fase, o sinal que confirma o desaparecimento dos embriões no meio líquido que sai alerta o PLC para completar a fase dois e pode ainda instruir o PLC a desligar o aparelho.
[00212] Os embriões de milho excisados usando esse aparelho e método foram transformados usando métodos padronizados na técnica de transformação de milho (por exemplo, Cai et al; Publicação de Pedido de Patente U.S 2004/0244075). Todos os tratamentos usaram Lynx #1986 (Manitol 0,2 M, não esterilizado) para a excisão do embrião. As frequências de transformação (FT) representativas são mostradas na Tabela 5, indicando que os embriões produzidos por esse aparelho e método eram transformáveis e forneceram plantas transgênicas.
Tabela 5. Transformação de embriões de milho excisados pelo aparelho e método de jato de fluido gradativo
| Exp. n° | Trt n° | Descrição do Experimento | FT % |
| 6778 | 2 | FJ Fase com endosperma | 6,0% |
| 6778 | 3 | FJ Fase sem endosperma | 8,0% |
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| 6858 | 2 | FJ Fase com endosperma | 4,0% |
| 6858 | 3 | FJ Fase sem endosperma | 8,0% |
| 6858 | 5 | FJ Fase com endosperma | 2,9% |
| 6858 | 6 | FJ Fase sem endosperma | 5,7% |
| 6894 | 2 | FJ Fase com endosperma | 14,0% |
| 6894 | 3 | FJ Fase sem endosperma | 16,0% |
| 6894 | 5 | FJ Fase com endosperma | 6,7% |
| 6894 | 6 | FJ Fase sem endosperma | 6,7% |
[00213] FJ (Jato de Fluido) Fase com endosperma refere-se a embriões que, depois da coleta, foram inoculados com endosperma e deixados sobre a mesma placa (embriões e endosperma juntos). FJ Fase sem endosperma refere-se a embriões que, depois da coleta, foram removidos para uma placa com meio fresco deixando o endosperma para trás.
Exemplo 18: Processo de separação de embrião [00214] Esse exemplo descreve um processo de flutuação para separar embriões de uma mistura produzida por um processo de excisão com jato de fluido. Os parâmetros para uma separação eficiente estão aqui descritos. Nesse processo, as bolhas de um gás foram geradas em um fluido e acopladas a embriões de milho excisados presentes no fluido. As bolhas flutuaram para a superfície (isto é, interface fluido-ar), permitindo que os embriões fossem coletados preferencialmente, enquanto deixavam para trás o material de endosperma e outros resíduos.
[00215] Para reduzir o número de bolhas por unidade de volume e gerar um campo de bolhas mais uniforme tal que uma menor força de cisalhamento fosse gerada, um dispositivo foi construído contendo múltiplos pontos de fontes de bolhas. O dispositivo foi construído pela inserção de fragmentos individuais de tília em orifícios pré-perfurados no comprimento de uma tubulação de silicone (tubulação de silicone Masterflex® C-96400-16, Cole-Parmer). Depois de inserir lascas de tília
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84/99 na tubulação de silicone, uma extremidade da tubulação foi fechada com um rolamento de aço inoxidável. A tubulação é então enrolada em uma espiral e fixada com um arame de metal como mostrado na Figura 18. O dispositivo de dispersão de ar em forma de espiral combinado com o uso de PEG como tensoativo mostrou purificar 95% dos embriões de quase todo o endosperma como mostrado na Figura 19. A Figura 20 ilustra a quantidade de endosperma separado da fração de embrião pela flutuação de bolha usando o dispositivo de dispersão de ar em forma de espiral e PEG. Outros borbulhadores baseados em tília podem ser construídos ou adquiridos por exemplo, de fornecedores de aquários. A placa de Petri à esquerda da Figura 20 mostra a grande quantidade de endospermas entremeados com embriões quando o processo de flutuação não é usado. Em comparação, a placa de Petri à direita mostra a redução na quantidade de endosperma cofracionado com os embriões quando o processo de flutuação da presente invenção foi usado. As bolhas também podem ser produzidas por materiais cerâmicos que têm vários tamanhos de poro.
[00216] A fim de destacar as bolhas do material fonte que as produz, é desejável que o material da fonte seja de uma natureza oposta a das bolhas, com relação ao grau de polaridade (isto é, hidrofobicidade). Como as bolhas de ar são covalentes por natureza, elas tenderão a se destacar rapidamente de um material que é polar por natureza. Inversamente, as bolhas que emergem de uma superfície que também é covalente por natureza, como um aspersor de plástico poroso, tenderão a aderir a superfície e coalescer e crescer até um tamanho maior antes de se destacarem. Com relação a isso, o aspersor Chemglass, a tília e a cerâmica são todos escolhas desejáveis. A superfície da tília é composta de celulose, hemicelulose e lignina que são polares e, portanto, hidrofílicas, como são o aspersor de vidro sinterizado e materiais cerâmicos.
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85/99 [00217] Em um exemplo, uma vez que os embriões eram carregados para a superfície pelas bolhas e depositados na espuma, eles eram coletados da espuma com uma escumadeira e depois limpos da espuma. Em outro experimento, um dispositivo de filtração a vácuo (por exemplo, Figura 21) foi usado para coletar embriões da superfície da espuma.
[00218] Em um experimento, os embriões e endospermas foram excisados de espigas doadoras usando um aparelho de jato de fluido (FJ) e coletados sobre gaze de algodão (CC). A mistura de embriões e endosperma foi então colocada em um cilindro graduado preenchido com Lynx 1013 e 20 pi de PPG 20% (éter mono-butílico de polipropileno glicol - Peso Molecular Médio 340. Aldrich Cat. N° 438103; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e bolhas foram produzidas por ar bombeado através de um tubo de dispersão de vidro fritado com poro estreito (Chemglass) por uma bomba de aquário (borbulhador). Os embriões separados, substancialmente livres de material de endosperma e outros resíduos, foram coletados como descrito acima. Os embriões separados foram usados para transformação de milho mediada por Agrobacterium como observado acima. As frequências de transformação são mostradas na Tabela 6.
Tabela 6. Transformação de embriões de milho separados por flutuapor flutuação usando bolhas de ar estabilizadas com PPG.
| Exp. # | Trt# | Descrição do tratamento | # de embriões inoculados | # GFP + | # Eventos | FT % |
| 6376 | 2 | FJ Borbulhador CC | 120 | 32 | 9 | 7,5% |
| 6396 | 2 | FJ Borbulhador CC | 223 | 32 | 10 | 4,5% |
| 6419 | 2 | FJ Borbulhador CC | 201 | 87 | 17 | 8,5% |
[00220] Em outro experimento, um borbulhador baseado em tília foi usado para separar embriões de endospermas excisados pelo aparelho de jato de fluido. Em geral, o borbulhador baseado em tília foi colocado em um béquer em uma capela de fluxo laminar estéril. A tubulaPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 93/151
86/99 ção do borbulhador foi conectada a um filtro de ar em uma extremidade. A outra extremidade do filtro de ar foi conectada a uma bomba de aquário. O meio de separação (Manitol 0,2 M com 20 pl de PEG 20% (Peso Molecular Médio 8000, Sigma N° P21390)) foi adicionado ao béquer sobre o borbulhador. O embrião e o endosperma do jato de fluido foram coletados e transferidos para o béquer. O ar foi borbulhado através do borbulhador. Os embriões flutuantes foram transferidos para uma pequena placa de Petri e usados para a transformação usando métodos padronizados conhecidos na técnica de transformação de milho como observado acima. As frequências de transformação são mostradas na Tabela 7.
Tabela 7. Transformação de embriões de milho separados por flutuação usando bolhas de ar estabilizadas com PEG.
| Experimento | # do embrião usado | FT Média (%) | SE (%) |
| Excisão Manual | 1759 | 22,33 | 4,58 |
| Excisão Jato de fluido sem separação | 1700 | 34,85 | 5,62 |
| Excisão Jato de fluido com Separação com Bolha | 1648 | 35,50 | 5,70 |
Exemplo 19: Aparelho para separação de embriões por flutuação [00221] Figura 22 mostra um aparelho para a separação de embriões por flutuação que compreende uma coluna de flutuação (E) conectada a um tubo de entrada (A) na extremidade superior da coluna para adição de uma mistura de embriões, endosperma e outros resíduos, um duto de dispersão de ar (G) na extremidade inferior da coluna para a produção de bolhas de ar para elevar os embriões e um tubo de saída (H) também na extremidade inferior da coluna para regulação do nível líquido e remoção de resíduos do fundo da coluna. O fundo da coluna é preferivelmente inclinado para facilitar a remoção de resíduos que não flutuam. A coluna de flutuação também é fornecida com um conduto de drenagem (C) para coletar a espuma que contem os emPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 94/151
87/99 briões. O duto de dispersão de ar também é fornecido com uma válvula (F) para evitar o refluxo da coluna de líquido para o tubo de dispersão de ar.
[00222] Para operar esse aparelho, a coluna de flutuação é preenchida com um meio líquido compatível com a transformação e cultura de tecido subsequentes dos embriões até que o nível do líquido alcance o dreno de drenagem (D). O dreno de drenagem tem um tubo de sifonagem (B) aberto para o ar no rapo. Um tensoativo é adicionado ao meio líquido para prevenir a coalescência prematura das bolhas e estabilizar a espuma para o acoplamento e ascenção dos embriões até o topo da coluna de flutuação.
[00223] A próxima etapa na operação do aparelho é ligar o fornecimento de ar para o duto de dispersão de ar. Os poros no duto de dispersão são pequenos o suficiente para produzir bolhas que sobem tão lentamente que seu contato com a superfície hidrofóbica do embrião é longo o suficiente para permitir o acoplamento das bolhas aos embriões.
[00224] Depois, uma mistura de embriões, endosperma e resíduos, produzida pelo aparelho de jato de fluido contendo a concentração desejada de um tensoativo (tal como PEG em uma concentração de 20 partes por milhão) é alimentada pelo duto de entrada. Conforme a pasta entra na coluna de flutuação, as partículas suspensas encontram a coluna de bolhas do dispositivo de dispersão de ar. As bolhas se acoplam primeiro aos embriões e preferencialmente elevam os embriões para a superfície da coluna de flutuação onde eles se tornam parte da espuma. Conforme a espuma se acumula, ela sai da coluna de flutuação através do conduto de drenagem (C).
[00225] Durante a operação, a coluna pode ser inclinada em um ângulo discreto com a vertical em direção ao conduto de drenagem tal que as bolhas ascendentes são concentradas na parede posterior da
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88/99 coluna e tendem a empurrar a espuma na direção e para o conduto. [00226] Os resíduos ricos em endosperma, que não flutuam, caem para o fundo da coluna de flutuação e se acumulam no ponto mais baixo do fundo inclinado. Esses resíduos são removidos da coluna durante o nivelamento líquido automático da coluna, que ocorre quando a pasta de embriões e resíduos de endosperma é alimentada inicialmente no funil de alimentação no início do funcionamento da coluna ou podem ser removidos no final da operação da coluna de flutuação.
[00227] Em outra modalidade, o nível de líquido no tanque de flutuação é um nível mantido com um dreno de saída e a espuma que sobe para a superfície é continuamente arrastada para o dreno. Essa ação pode ser facilitada pela existência de mais bolhas que surgem no lado do tanque afastado do dreno tal que há uma circulação produzida que surge no lado longe do dreno e se dissipa no lado do dreno.
[00228] Em outra modalidade, o nível líquido no tanque de flutuação pode ser mantido abaixo do nível do dreno até que uma quanidade suficiente de espuma e embriões tenha se acumulado e então o nível líquido é elevado tal que a espuma e os embriões transbordam para o dreno.
Exemplo 20: Aparelhos alternativos para separar embriões pela flutuação [00229] Esse exemplo descreve outra modalidade de aparelho designado para separar embriões de milho do endosperma do milho por meio de um processo de flutuação que usa bolhas e tensoativos. O aparelho pode ser usado com um aparelho de excisão de embriões, tal como um aparelho de jato de fluido como descrito anteriormente no pedido.
[00230] No aparelho (Figura 23), os embriões e endospermas fluem para uma câmara guarnecida com um meio para a produção de bolhas. As bolhas podem ser geradas pelo ar forçado através de asperPetição 870170075618, de 05/10/2017, pág. 96/151
89/99 sor. Preferivelmente, o tamanho (diâmetro) da bolha é de cerca de 100 pm a 500 pm. Um agente estabilizador de bolha, tal como polietileno glicol (PEG) também é adicionado em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 100 ppm, por exemplo, 20 ppm. Os embriões, preferencialmente se acoplam a bolhas através de interação hidrofóbica e as bolhas elevam os embriões acoplados para a superfície da câmara. A adição de PEG possibilita que as bolhas transportem suas cargas de embriões para a superfície. PEG também ajuda a criar uma camada de espuma no topo da superfície e os embriões coletados no topo da camada de espuma são carregados para o conduto de drenagem. Um dispositivo de escumadeira motorizada pode ser usado para facilitar o fluxo da espuma que contém os embriões para a saída, onde eles passam por uma estação de imagem ou dispositivo de contagem para a contagem do número de embriões, e são coletados em recipientes como necessário. Um comutador operacionalmente ligado a uma estação de imagem ou ao dispositivo de contagem pode ser fornecido para dispensar os números desejados de embriões em recipientes diferentes. Os recipientes podem ser conectados a uma dispositivo coletor a vácuo para remover o líquido deixando para trás os embriões para uso posterior.
[00231] O aparelho ainda é guarnecido com um meio para trazer o liquido para dentro e para fora da câmara. O nível líquido na câmra pode ser controlado por um dispositivo de nivelamento de líquido. Os endospermas e outros resíduos que não estão seletivamente acoplados as bolhas, são descartados através de meios para retirar o líquido do fundo do recipiente, tal como um dreno para saída de rejeitos. O mesmo meio líquido que é usado para a excisão dos embriões pode ser usado para encher a câmara de separação de embriões. O meio que sai do aparelho pode ser reciclado para uso posterior durante os processos de excisão e separação.
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Exemplo 21: Combinação de dispositivo para excisão e separação de embriões de milho para cultura de tecido [00232] Esse exemplo ilustra um dispositivo de combinação ou um dispositivo integrado que compreende um extrator de embrião como mostrado nas Figuras 24-25 e um separador de embrião como mostrado na Figura 26. Preferivelmente, o extrator de embrião está em comunicação com o separador. Entretanto, o extrator de embrião ou o separador podem ser operados separadamente e a saída do extrator de embrião pode ser a entrada do separador de embrião.
[00233] Com referência à Figura 24 que é uma vista superior, o extrator de embrião é guarnecido com pelo menos um jato de fluido (C) para extração de embriões de cada espiga (B). Mais do que um jato de fluido pode ser direcionado para uma única espiga. Cada espiga da Figura 24 é mantida em posição pelos retentores guarnecidos com molas (A) em uma extremidade das espigas e um retentor mecanizado (D) na outra extremidade que pode ser dirigido por um mecanismo de esteira (E). Uma vista lateral do aparelho é mostrada na Figura 25. Normalmente, as coroas dos grãos sobre a espiga são parcialmente ou completamente removidas para facilitar a extração do embrião. [00234] Qualquer meio líquido pode ser usado para produzir o jato de fluido (C), por exemplo, como descrito no Exemplo 15. Água estéril pode ser usada para excisar os embriões desde que o período entre o contato inicial do embrião com a água e a imersão no meio de cultura no tanque de flutuação seja curto. Um filtro pode ser usado para esterilizar a água. Alternativamente, o meio líquido compreende manitol ou outro soluto de força osmótica adequada como descrito acima.
[00235] Como mostrado na Figura 26, depois da extração dos embriões dos grãos, os embriões e os resíduos caem, opcionalmente, ou são adicionados a um separador de embrião, que compreende um sistema de esteira rolante com tela dupla conectado a uma câmara de
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91/99 flutuação. A esteira rolante com tela dupla tem uma tela grosa móvel (A) que captura material grosseiro, mas deixa que os embriões e outros materiais menores passem através para uma tela mais fina (H) que retém os embriões e o material de tamanho similar, mas que permite que um material muito fino e o líquido passem através para o dreno de rejeito líquido (W). O material coletado sobre a tela grossa é removido no tanque de lavagem da tela grossa (F) e é auxiliado pelo fluxo de rejeito abaixo do dreno de rejeito líquido (W) e escoado através do conduto do tanque de lavagem da tela grossa (E) e do dreno do tanque de lavagem (G). O material coletado sobre a tela fina (H) é lavado livremente no tanque de lavagem da tela fina (N) com o auxílio de um meio fresco e preferivelmente um espumante através da entrada (M). Se os embriões não se deslocam da tela fina (H) para o tanque de lavagem da tela fina (N), pode ser usada a agitação. Por exemplo, os embriões capturados sobre a tela fina são desalojados no meio de flutuação conforme eles passam em volta de um rolete (K) e também pelo impacto da produção do meio adicionado através de (Μ). A liberação de meio fresco e do espumante é ajustada tal que os resíduos que se acumulam na câmara de flutuação são continuamente removidos através da entrada do regulador de nível líquido (U) e dos dutos de saída (V).
[00236] Telas termoplásticas moldadas, que não são tecidas, podem ser preferidas para uso nesse aparelho já que elas não se desfazem. Tais telas estão disponíveis (por exemplo, McMaster-Carr, Atlanta, GA) em várias espessuras (trançado) de tela, largura de trançado e tamanhos de abertura da tela. As telas feitas de polipropileno também são preferidas por que elas podem ser autoclavadas. As dimensões exatas da tela podem ser selecionadas empiricamente pelo operador dependendo dos tamanhos esperados dos embriões e dos resíduos que são introduzidos no separador.
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92/99 [00237] Com referência à Figura 26, a tela grossa (A) e a tela fina (H) podem ser suportadas por rolos. Preferivelmente, a tela grossa (A) é suportada por um rolo mecanizado (B), um rolo livre (C) e um rolo de limpeza (D). A tela fina (H) é suportada por um rolo mecanizado (I), um rolo livre (J), um rolo de limpeza (K) e um rolo elevador (L). Os rolos podem ser cilíndricos lineares ou diferentes de cilindrico linear, preferivelmente côncavo-cilíndrico por que eles permitem que esteiras transportadoras tipo calha sejam usadas, que tipicamente têm menos perda de produto ao longo de seus limites do que esteiras planas. Esteiras transportadoras tipo calha podem permitir maiores velocidades e inclinações da esteira. Um ou mais dos rolos podem ser mecanizados, por exemplo, o rolo (B) e podem ter suas superfícies texturizadas para se agarrarem mais firmemente a tela. Pode ser desejável mecanizar apenas um rolo diretamente e ter o outro rolo mecanizado, por exemplo, o rolo (C) a partir do primeiro por uma esteira ou engrenagem. Suportes ou guias laterais ou centrais sob as telas grossa e fina podem ser desejáveis para evitar a submersão e a perda de líquido ao longo dos limites das telas. Rolos de suporte adicionais também podem ser desejáveis.
[00238] Depois que o material coletado sobre a tela fina (H) se desloca para o tanque de lavagem da tela fina (N), ele cai para além do defletor de bolhas (O) e entra na câmara de flutuação (P) onde ele encontra bolhas de ar ascendentes (S) produzidas, por exemplo, por um duto de dispersão de ar (T). Nesse ponto, as bolhas de ar se acoplam preferencialmente as superfícies hidrofóbicas dos embriões, carregando-os para a superfície onde eles são depositados em uma espuma através da abertura lateral da câmara de flutuação (Q) e do conduto de liberação de embrião (espuma) (R). Se os embriões que afundam na câmara de flutuação (P) não são expostos adequadamente as bolhas, um dispositivo de misturação tal como um agitador magnético pode ser
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93/99 fornecido na porção inferior da câmara (P) para melhorar a exposição. [00239] O nível líquido no tanque de flutuação é regulado pela entrada de meio fresco e o espumante a partir de (M) e pelo sistema de nivelamento de líquido (por exemplo, Figura 27) que compreende um tubo de entrada em U e um tubo de saída (V) no qual o excesso de líquido junto com os resíduos entra no tubo em U e sai pelo tubo (V). Um tubo em forma de U conecta (U) e (V) com o nível mais alto no tubo atingindo o nível no qual o líquido deve ser mantido. O topo do tubo em U também é guarnecido com uma abertura antissifonagem. Outro dispositivo para nivelamento de líquido tal como aqueles baseados na flutuação, baseados em óptica, baseados na condutividade e baseados em eletricidade podem ser previstos para regular o nível de líquido nesse dispositivo.
Exemplo 22: Aparelho para isolamento de tecidos transformáveis de sementes e frutos [00240] As composições, métodos e aparelhos da presente invenção podem ser usados para isolar tecido transformável, por exemplo, embriões de sementes e frutos de outras plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo sem limtação, milho, trigo, cevada, soja, girassol, algodão, canola, pimentas, tomates, framboesa e morango entre outras.
[00241] Um fixador adequado, por exemplo, uma lamina que tem orifícios e/ou sulcos adequados para conter sementes ou frutos de várias formas e tamanhos é fornecido (por exemplo, Figura 28). O fixador pode ser feito de um material adequado tal como plástico ou metal. O fixador pode ser uma folha chata ou enrolado em um cilindro como mostrado na Figura 29 e suspenso em uma fase gasosa tal como uma fase de ar ou líquido ou pode ser parcialmente suspenso nas fases gasosa e líquida. As sementes e os frutos podem ser fixados sobre o fixador por uma força adequada, tal como uma força mecânica e/ou de
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94/99 sucção. O fixador pode ser fixado em relação a uma força fluida, por exemplo, uma corrente líquida do meio descrito no Exemplo 15 ou pode ser móvel em relação à força fluida.
[00242] Em outra modalidade mostrada na Figura 30, um Came ou Parafuso de pressão, por exemplo, um parafuso, é inserido em uma extremidade do cilindro para aplicar pressão sobre as sementes e frutos para facilitar o isolamento dos embriões. Os embriões isolados podem ser separados dos resíduos pelos vários métodos descritos em outros lugares nesse pedido.
[00243] Em outra modalidade da presente invenção, a folha ou o cilindro podem ser centrifugados em um recipiente para aplicar forças sobre as sementes ou frutos retidos para isolar os embriões.
[00244] Os embriões podem ser separados de outros tecidos como descrito nos Exemplos 18-20 e usados para transformação e regeneração de várias espécies de planta. Por exemplo, embriões de soja podem ser transformados usando os métodos descritos na Patente U.S. 7.002.058. Métodos de transformação para outras plantas são conhecidos na técnica.
Exemplo 23: Métodos para separação de embriões de algodão e soja [00245] Esse exemplo ilustra a utilidade das composições, métodos e aparelhos da presente invenção na separação de embriões de algodão e soja do tecido da semente, demonstrando assim utilidade mais ampla. As sementes de algodão e soja foram esmagadas pelo método e aparelho descritos no Pedido de Patente U.S N° de Série 12/045.502, depositado em 10 de Março de 2008 e na Publicação de Pedido de Patente U.S 20050005321, e adicionados a uma solução de manitol 0,2 M com PEG 8000 0,0012% para o isolamento de embriões de algodão e cerca de 0,003% de PEG8000 para o isolamento de embriões de soja, usando o aparelho mostrado na Figura 31. As bolhas foram produzidas, por exemplo, como descrito no Exemplo 18. A maior
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95/99 parte dos eixos embrionários de algodão foram encontrados acumulados com as bolhas como mostrado nas Figuras 32-33. Os embriões de algodão foram preparados para transformação usando os métodos descritos no Pedido de Patente U.S N° de Série 12/045.502. No caso da soja, os embriões quebrados (eixo embrionário e cotilédones) foram encontrados no fundo do recipiente, enquanto que a maioria dos revestimentos da semente flutuaram até o topo com as bolhas. Os eixos embrionários e cotilédones foram separados depois por métodos de densidade diferencial. Por exemplo, em uma solução de Ficoll em sacarose 20%, os eixos embrionários sobem para a superfície, enquanto que os cotilédones mergulham para o fundo do recipiente. Os embriões de soja podem ser transformados usando o método descrito na Patente US 7.002.058.
Exemplo 24: Desenvolvimento de um meio de cocultura para intensificar a frequência de transformação [00246] Em alguns experimentos, o uso do meio de cocultura 1233 (Publicação de Pedido de Patente U.S 2004/00244075) no processo de transformação do milho, utilizando os embriões preparados por um método com jato de fluido e separados por um método de flutuação, resultou em frequências de transformação menores (FTs). A fim de manter ou intensificar a frequência de transformação, um novo meio de cocultura, denominado 1898 foi testado e inesperadmente descoberto aumentar as FTs.
[00247] Vários grupos de experimentos foram conduzidos para comparar o meio de cocultura 1233 e o meio de cocultura 1898. Entre outras diferenças de composição (veja Tabela 9), o meio de cocultura 1898 tem um nível menor de 2,4-D e tem Carbenicilina. Embriões imaturos de espigas de milho foram excisados e separados como descrito nos Exemplos acima. Os embriões separados foram divididos em dois tratamentos. Embriões em ambos os tratamentos foram inoculados
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96/99 com o vetor de transformação de planta pMON97367 que compreende um gus e um cassete de expressão de CP4. Os embriões do tratamento 1 foram cocultivados sobre o meio 1233 e os embriões do tratamento 2 foram cocultivados sobre o meio 1898. Depois da cocultura durante a noite, os embriões foram processados pelo método descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S 2004/00244075.
[00248] A Tabela 8 mostra que o uso do meio de cocultura 1898 resultou em aperfeiçoamentos em todos os indicadores principais tais com resposta da cultura, eventos criados, eventos transferidos para Phytatrays, eventos transferidos para o solo e % de FT em comparação com o uso do meio de cocultura 1233. A Tabela 9 dá as composições dos meios usados.
Tabela 8. Aumento da frequência de transformação com o meio de cocultura 1898.
| Meio de Cocul- tura | #Total de Embriões Testados | % de Embriões com Resposta Embriogênica | # Eventos Criados | % Transferido para Phytatrays | % Transferido para o Solo | % FT |
| 1233 | 660 | 53,0 | 107 | 16,2 | 11,7 | 10,6% |
| 1898 | 628 | 79,3 | 263 | 43,5 | 31,5 | 30,9% |
Tabela 9. Composições dos meios usados na presente invenção. Os meios 1233, 1278, 1073, 1071, 1084 são de Cai et a!.\ Publicação de
Pedido de Patente U.S. 2004/00244075. Meio 1898 é da Publicação de Pedido de Patente U.S 2008/0124727.
| Componentes/l dos Meios (Fornecedores) | 1233 (cocultu- ra) | 1898 (cocultu- ra) | 1278 (MSW 50+BAP) (seletor de íon) | 1073 (MS/ 6BA) (1a regeneração) | 1071 (MSOD) (2a regeneração) | 1084 (enrai- zamen- to) |
| MS Basal Salts (Phytotech) | 2,165 g | 4,33 g | 4,33 g | 4,33 g | 4,33 g | 2,165 g |
| MS Vitamins (100X) (Phytotech) | 10 mL | 10 mL | 10 mL | 0 | 0 | 0 |
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| Componentes/l dos Meios (Fornecedores) | 1233 (cocultu- ra) | 1898 (cocultu- ra) | 1278 (MSW 50+BAP) (seletor de íon) | 1073 (MS/ 6BA) (T regeneração) | 1071 (MSOD) (2a regeneração) | 1084 (enrai- zamen- to) |
| MS Fromm Vitamins (1000X)* | 0 | 0 | 0 | 1 mL | 1 mL | 0 |
| BAP (Sigma) | 0 | 0 | 0,01 mg | 3,5 mg | 0 | 0 |
| Tiamina HCL (Sigma) | 0,5 mg | 0,5 mg | 0,5 mg | 0 | 0 | 0 |
| 2,4-D (Phytotech) | 3 mg | 0,5 mg | 0,5 mg | 0 | 0 | 0 |
| NAA (Sigma) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,5 mg |
| IBA (Sigma) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,75 mg |
| Sacarose (Phytotech) | 20 g | 30 g | 30 g | 30 g | 0 | 20 g |
| Glicose (Phytotech) | 10g | 0 | 0 | 0 | 10g | 0 |
| Maltose (Phytotech) | 0 | 0 | 0 | 0 | 20 g | 0 |
| Prolina (Sigma) | 115 mg | 1,38 g | 1,38 g | 1,38 g | 0 | 0 |
| Casamino Acids (Difco) | 0 | 0,5 g | 0,5 g | 0,05 g | 0,5 | 0 |
| Monohidrato de Asparagina (Sigma) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,15 | 0 |
| Mio-inositol (Sigma) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,1 g | 0 |
| Low EEO Agarose (Sigma) | 5,5 g | 5,5 g | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Phytagel (Sigma) | 0 | 0 | 3g | 3g | 3g | 3g |
| Acetosiringona (Aldrich) | 200 uM | 200 uM | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Carbenicilina (Phytotech) | 0 | 50 mg | 500 mg | 250 mg | 250 mg | 0 |
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| Componentes/l dos Meios (Fornecedores) | 1233 (cocultu- ra) | 1898 (cocultu- ra) | 1278 (MSW 50+BAP) (seletor de íon) | 1073 (MS/ 6BA) (T regeneração) | 1071 (MSOD) (2a regeneração) | 1084 (enrai- zamen- to) |
| Glifosato (Gateway Chemical) | 0 | 0 | 0,1 mM | 0,1 mM | 0,1 mM | 0,1 mM |
| Nitrato de Prata (Sigma) | 3,4 mg | 3,4 mg | 3,4 mg | 0 | 0 | 0 |
| PH | 5.2 | 5.8 | 5.8 | 5.8 | 5.8 | 5.8 |
*Compreendendo 1250 mg/L de ácido nicotínico (Sigma), 250 mg/L de piridoxina HCI (Sigma), 250 mg/L de tiamina HCI (Sigma), e 250 mg/L de pantotenato de cálcio (Sigma).
[00249] Todos os materiais e métodos descritos e reivindicados aqui pode ser feitos e usados, como instruídos pela descrição acima, e sem experimentação exaustiva, por uma pessoa versada na técnica. Embora os materiais e métodos dessa invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas e exemplos ilustrativos, ficará claro para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos aqui descritos sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos os substituintes similares e modificações claras para aqueles versados na técnica são considerados estar dentro do conceito, espírito e escopo da invenção como definida adicionalmente pelas reivindicações anexas.
REFERÊNCIAS [00250] As referências a seguir, à medida que elas fornecem procedimentos exemplares ou outros detalhes suplementares àqueles descritos aqui, estão especificamente incorporadas aqui por referência.
Patente U.S. 5.550.318 Patente U.S.5.780.708 Patente U.S.6.194.636 Patente U.S.6.232.526
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Patente U.S.7.002.058
Patente U.S.7.150.993
Pedido de Patente U.S. 10/710.067 Pedido de Patente U.S. 11/613.031 Pedido de Patente U.S. 12/045.502 Publicação de Patente U.S. 2003/0024014 Publicação de Patente U.S. 2004/0016030 Publicação de Patente U.S. 2004/0126845 Publicação de Patente U.S. 2004/0210958 Publicação de Patente U.S. 2004/0216189 Publicação de Patente U.S. 2004/0244075 Publicação de Patente U.S. 2005/0246786 Publicação de Patente U.S. 2008/0124727 Pedido de Patente Provisória U.S. 60/894.096 Pedido de Patente Provisória U.S. 60/915.066
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1/3
Claims (22)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para preparar um embrião de planta adequado para cultura de tecidos e/ou transformação genética, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) colocar um tecido de semente de planta que compreende tegumentos de semente e embriões de planta em um ambiente aquoso;(b) contatar o tecido com um agente que acople seletivamente aos embriões ou tegumentos de semente; e (c) isolar pelo menos um primeiro embrião baseado no acoplamento seletivo do agente ao embrião ou tegumento de semente.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente compreende bolhas de gás.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as bolhas de gás têm uma dimensão média mais larga, entre 100 pm a 1 mm.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as bolhas de gás compreendem um gás selecionado do grupo que consiste em ar, oxigênio, nitrogênio e suas combinações.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende isolar o primeiro embrião baseado na flutuabilidade do embrião.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreendendo incluir no ambiente aquosos um tensoativo que reduza a coalescência das bolhas uma com a outra.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é selecionado do grupo que consiste em um poliéter, PPG (poli(propileno glicol)) e PEG (poli(etileno glicol)).
- 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que PPG tem um peso molecular de cerca de 340 a cercaPetição 870180043763, de 24/05/2018, pág. 6/122/3 de 3500 daltons.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que PEG tem um peso molecular de 100 a 9000 daltons.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente compreende um segundo líquido que é imiscível com o ambiente aquoso.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o segundo líquido é selecionado do grupo que consiste em óleo vegetal, óleo mineral ou outro líquido hidrofóbico compatível com a sobrevivência e a transformação dos embriões.
- 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido da semente da planta compreende embriões produzidos pelo método da reivindicação 1.
- 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ambiente aquoso consiste em água e/ou um agente osmótico com uma osmolalidade de 0 mOsm/kg a 600 mOsm/kg.
- 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente osmótico é selecionado do grupo que consiste em manitol, sorbitol, glicose e sacarose.
- 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio consiste em água e manitol em uma concentração entre 0,05 M a 0,5 M.
- 16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio consiste em água e sacarose em uma concentração entre 0,05 M a 0,5 M.
- 17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreendendo colocar o tecido de semente de planta no ambiente aquoso sem separar primeiro o embrião do tecido não embrionário.
- 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadoPetição 870180043763, de 24/05/2018, pág. 7/123/3 pelo fato de que o tecido de semente de planta é tecido de semente de planta de milho, tecido de semente de planta de algodão ou tecido de semente de planta de soja.
- 19. Aparelho para preparação de tecido de embrião de planta adequado para cultura de tecido e/ou transformação genética, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) um recipiente para conter o tecido de semente de planta compreendendo uma pluralidade de embriões de planta em um ambiente aquoso; e (b) pelo menos um primeiro injetor para liberação no ambiente aquoso de um agente que se acople seletivamente aos embriões, em que o injetor produz bolhas de gás com um diâmetro médio entre 100 pm a 1 mm.
- 20. Aparelho de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o recipiente é preenchido com um meio e tecido de planta compreendendo embrião e tecido não embrionário.
- 21. Aparelho de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreendendo ainda um coletor para separar o tecido embrionário baseado na flutuabilidade dos embriões dentro do ambiente aquoso.
- 22. Aparelho de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as bolhas de gás compreendem um gás selecionado do grupo que consiste em ar, oxigênio, nitrogênio e suas combinações.Petição 870180043763, de 24/05/2018, pág. 8/121/34
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