CN101035426B - 用于大致分离植物组织的方法和装备 - Google Patents

Abstract

本发明披露和要求了用于迅速地机械分离适用于转化或组织培养的单子叶植物组织的方法和设备。本发明包括用于大致分离用作可转化的外植体和繁殖转基因植物和植物组织的目标植物组织的机械设备。

Description

用于大致分离植物组织的方法和装备

本申请为2004年8月4日提出的美国申请No.10/911,191的部分继续，其要求2003年8月5日提出的美国临时申请No.60/493,011的优先权，全部这两个申请在这里全文作为参考加入。 

技术领域

本发明一般地涉及植物繁殖和用于大致分离诸如胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标植物组织的机械的方法。 

背景技术

制备用于植物繁殖、再生和转化的组织费时且劳动密集，特别是因为其通常涉及手动分割可转化的或可培养的植物组织。例如，在玉米中(玉蜀黍(zea mays))，通常手动移除单独的不成熟的胚胎以提供可遗传转化的外植体。手动分割胚胎发生的组织费力并且存在对工人的人机工程学伤害的危险。另外，当需要较大量的可转化的植物组织用于高生产量转化和植物生产时，必须雇佣和培训更多工人以满足增加的需求。另外，根据单独的工人的技术水平、小心程度、注意力和疲劳程度，获得的植物组织的质量可能存在非常大的可变性。此组织可变性是有问题的，因为质量差的组织负面地影响随后的组织培养、遗传转化和植物繁殖的效率。从而，在本领域中需要更加迅速地，减小工人的总的人体工程学负担，减小处理植物材料所需要的工人的量，和/或出产比手动生产的组织质量更高或更一致的植物组织的制备目标植物组织的方法。 

发明内容

本发明披露了用于大致分离目标植物组织以用于植物组织培养和遗传转化的方法和装备，以简化、改进安全性、增加可靠性、减小人体工程学伤害、减小需要的人员的数量、和/或增加速度。特别是，本发明披露和要求适用于大致分离胚胎的方法和装备。在一些实施例中，该方法和设备可以用于大致分离诸如玉米胚胎的单子叶植物胚 胎。大致分离的胚胎优选地适用于遗传转化或组织培养。这里披露的方法和装备特别适用于高生产量处理(即，大致分离大量目标组织和/或处理大量种子)。 

本发明的一个方面包括用于从单子叶植物大致分离诸如胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标组织的方法。该方法包括(a)提供在果皮或种子的种皮内具有开口的包含不成熟的胚胎的单子叶植物种子；和(b)将足够大致从种子分离不成熟的胚胎的力施加到种子。在一些实施例中，从玉米种子大致分离不成熟的玉米胚胎。从而，获得的不成熟的胚胎优选地适用于遗传转化或组织培养。 

本发明的另一个方面提供了用于大致分离诸如胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标植物组织的装备。该设备包括至少一个用于引导流体流的孔口。在一个实施例中，流体流接触玉米的穗上的谷粒并且导致胚胎变得大致从谷粒分离。大致分离的胚胎优选地适用于遗传转化或组织培养。 

在一个实施例中，装备包括至少一个从以下部件中选择的部件(a)至少一个适用于将机械正压力施加到种子的外部的坚固的表面；(b)至少一个用于引导流体流的孔口；(c)至少一个用于施加负流体压力的孔口；和任何它们的组合。部件可以用于将足够大致分离诸如胚胎的目标组织的物理的力导向到种子上。从而，该装备可以用于从玉米的穗大致分离适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎。在一些实施例中，用于引导流体流的孔口导向流体流以接触玉米的穗上的玉米种子或谷粒。在一些实施例中，用于施加负流体压力的孔口导向负流体压力以接触玉米的穗上的玉米种子或谷粒。通过这样的装备大致分离的目标组织优选地适用于组织培养或遗传转化。 

本发明还提供转基因植物、植物组织、和种子。转基因植物和植物组织可以通过以下步骤生产(a)使用这里描述的方法和/或装备大致分离目标组织，(b)将异种核酸分子引入目标组织以生产转化的外植体，和(c)在适合的生长条件下培养转化的外植体以生产转基因植物组织或植物。任何转化方法适用并且为本领域中的普通技术人员已知。另外，适合的培养和再生条件已知并且是常规的。转基因植物、植物组织、或种子优选为诸如玉米的单子叶植物。本发明还包括全部从转基因的植物组织或植物生产的后代植物、植物组织、和种子。 

在接下来的详细描述中披露本发明的其它实施例。 

附图说明

图1示出了使用正机械压力来大致分离胚胎的本发明的装备的一个实施例，如在示例4中所描述的。 

图2示出了通过本发明的方法使用流体射流正压力从种子取出胚胎的本发明的装备的一个实施例，如在示例7中所描述的。图例：(A)可以在X、Y和Z维度运动的自动机，(B)旋转玉米穗的马达，(C)抓紧器，(D)保持玉米穗的把手，(E)防止材料向上飞溅的挡板，(F)防止材料向上飞溅的凸缘，(G)用于引导流体的孔口，(H)透明的管，(I)玉米穗，(J)摇动筛，(K)干酪包布或其它多孔材料，和(L)废物贮存器。 

图3示出了玉米穗可以通过其被固定到自动机臂的使用磁性“把手”的安装机构的一个实施例，如在示例7中所描述的。 

图4示出了适用于本发明的方法的喷嘴的一个实施例，如在示例7中所描述的。此喷嘴产生大致均匀的、扁平的片状流体射流。 

图5示出了适用于本发明的方法的装备的一个实施例，如在示例13中所描述的。此设备包括用于产生大致扁平的流体射流的喷嘴和可选的吸头。图5(顶部)示出了这样的设备的一个实施例的截面图，示出了喷嘴、可选的吸头、和玉米穗可以如何相对于彼此定位。图5(底部)示意性地示出了定位在设备内的玉米穗。图例：(A)基部，(B)保持器，(C)喷嘴，(D)吸头，(E)玉米穗，和(F)用于引导流体流的孔口。 

图6示出了适用于本发明的方法的适用于施加负流体压力的部件的一个实施例，如在示例13中所详细描述的。图例：(A)一个或多个用于引导流体流的孔口。 

图7示出了图7A到7C，示出了使用力的组合并且适用于本发明的方法的设备的实施例的不同视图，如在示例13中所详细描述的。此设备包括具有能够将预先确定的量的机械压力施加到之前已经打开或截顶果皮的谷粒的基部的前缘的头，和用于施加负流体压力的部件。此装置还能够包括用于分配流体或引导流体流的装置。 

图8示出了本发明的实施例，其中，筒的顶部全部地、部分地、或大致覆盖有稍微小于玉米穗的直径的膜或软的材料的片；和其接附到的把手。

图9示出了图8所示的实施例的替代的设计，其中，在膜内制造小的切口以提供附加的柔性。 

图10示出了图8或9所示的实施例的侧视图，其中，提供用于将膜固定在装备上的装置。 

图11示出了用于本发明的替代的膜接附系统。 

图12示出了对来自McMaster-Carr#9010K12的超软性10A硬度硅树脂膜防溅罩(1/32英寸厚度)的测试。在膜内制造1”直径的孔。玉米芯能够向下通过开口运动并且也能够通过该开口返回。 

图13示出了玉米芯，示出了胚胎在单独的谷粒内的位置。还示出了本发明的一个实施例，其中，将液体射流导向到谷粒的与胚胎定位的向顶的侧相反的向基的侧。 

具体实施方式

除非另外限定，当在本说明书的上下文中使用时，这里使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含意。当在本说明书和作为参考加入的材料的文字之间存在矛盾时，采用本说明书中提供的限定和意义。这里使用的名称和下面描述的制造或实验室程序对于本领域中的普通技术人员众所周知且普遍应用。 

短语“大致分离”或“析取”指的是处理存在于或形成较大的组织复合体(例如，种子)的一部分的目标组织(例如，胚胎或其它组织外植体)，使得目标组织从较大的复合体的至少一半物理地分开。在一些实施例中，可以从较大的复合体的至少大约50％、60％、70％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或者其任何百分率物理地分开大致分离的目标组织。在其它实施例中，从较大的复合体的多于大约80％到大约100％、大约90％到大约100％、或大约99％到大约100％或之间的任何百分率物理地分开目标组织。在一些实施例中，可以从较大的复合体的大约100％物理地分开目标组织。 

虽然从较大的复合体的一些百分比物理地分开大致分离的目标组织，不必要从该复合体纯化大致分离的目标组织。换句话说，大致分离的目标组织可以与较大的组织复合体保留在同一批内，只要从复合体物理地分开目标组织(如上所述)。然而，在一些实施例中，可能需要从大致分离的目标组织移除一些或全部分开的复合体。全部这样的实施例属于本发明的范围内。 

短语“目标植物组织”指的是设法大致分离的植物组织或种子的部分。在本发明中，目标植物组织指的是能够被大致分离并且用于遗传转化或组织培养的植物或植物种子的任何部分。在一些实施例中，目标植物组织为胚胎，特别是来自诸如玉米的单子叶植物的不成熟的胚胎。 

短语“适用于遗传转化”和“适用于组织培养”分别指的是有能力在适合的植物培养条件下转化或生长的植物组织。本领域中的普通技术人员能够通过使用常规的实验容易地确定特定的目标组织是否适用于遗传转化或组织培养。例如，可以在适合的植物介质(同样对于本领域中的普通技术人员已知)上培养来自一批大致分离的目标组织的样本，以确定该组织是否能够生长和再生。相似地，大致分离的目标组织的样本可以经历转化和筛选以确定是否存在异种核酸分子。这样的技术是常规的并且能够迅速地识别哪种组织有能力转化或组织培养并且识别哪种组织不可以，如果存在不可以的组织的话。 

在术语以单数形式提供时，本发明人还考虑了通过该术语的复数形式描述的本发明的方面。 

用于大致分离目标植物组织的方法 

本发明提供了大致分离适用于遗传转化或组织培养的目标植物组织的方法，包括(a)提供在果皮或种子的种皮内包含开口的种子；和(b)将足够大致从种子分离目标植物组织的力施加到种子。在一些实施例中，目标植物组织为胚胎。胚胎优选地为诸如来自玉米的单子叶植物胚胎。在一些实施例中，可以完全地或部分地分离大致分离的目标组织。例如，一批大致分离的不成熟的胚胎可以包括完整无缺的胚胎、部分的胚胎或它们的混合物。优选地，完整无缺的和/或部分的组织适用于遗传转化、组织繁殖、植物再生和其它组织培养应用。 

当使用例如水流分离组织时，可以提供收集容器。在一些实施例中，为这样的收集器皿提供盖是有用的，以便改进装备的效率、减少混乱、防止来自射流的不合需要的飞溅、和/或限制任何析取的组织在 收获期间逸出。可以使用任何适用的容器或容器盖。在本申请中在别处给出了示例并且对于本领域中的普通技术人员已知。 

适用于容器的盖可以包括那些由金属、木头、玻璃、网、织物、塑料、橡胶、乳胶、丙烯酸树脂、和功能等价的材料制造的。在一些实施例中，材料是柔性的，以便在析取过程期间在维持穗附近的大致不透水密封的同时允许玉米的穗穿入和移除。材料可以提供有适合的开口以允许玉米的穗进入和移除。在一些实施例中，材料为坚固的并且包含用于在析取期间接收和保持穗的柔性的孔。在其它实施例中，材料是柔性的。这样的柔性的材料可以在容器上方伸展以形成液体不能透过的配合，但是允许通过穿入材料插入穗或通过提供开口以接收玉米的穗。在再一个实施例中，材料为具有柔性的开口的网或筛。 

盖可以为可移除的或半永久地接附。在一些实施例中，通过弹性带或等价的固定装置保持材料。在其它实施例中，通过重量、摩擦圈环、钩、卡扣、或其它功能等价的固定装置将盖保持在适当的位置。 

盖可以由柔性的材料制造并且具有不同的厚度。这些因素可以变化，以便获得插入和析取玉米的穗的希望的效果。接下来的表格示出了一些对于硅树脂盖的硬度和厚度参数。然而，本发明决不限于这些选择。 

肖氏硬度       膜厚度(英寸) 

10A            1/32 

10A            1/16 

20A            1/32 

20A            1/16 

40A            1/32 

40A            1/16 

1. 

在一个实施例中，收集容器覆盖有稍微小于玉米穗的直径的膜或软的材料的片和其接附到的把手。在替代的实施例中，在膜内制造小的切口以提供更大的柔性。图8-11提供了上述盖和接附装置的不同的实施例。 

在一些实施例中，材料为耐高压的。耐高压的材料对于本领域中 的普通技术人员众所周知。例如可以使用诸如软的硅树脂橡胶片的软的材料。本领域中的普通技术人员知道可以在提供减小析取的组织逸出并且防止不合需要的飞溅的收集器皿的同时允许析取的可能的材料和物理设置。 

适用于植物组织培养和再生的程序在本领域中众所周知。例如，参看Adams等人的美国专利号5,550,318，Lundquist等人的美国专利号5,780,708，Duncan等人的美国专利申请公开号2004/0210958，Lowe等人的美国专利申请公开号2004/0016030，和Cai等人的美国专利申请公开号2004/0244075，它们披露了适用于玉米的转化方法，和Cheng等人的美国专利申请公开号2003/0024014，其披露了适用于小麦的转化方法，全部这些在这里全文作为参考加入。这些组织培养应用可以包括至少一个从转化，形成愈伤组织，直接胚胎形成，形成分化的植物组织，形成至少一个成熟的植物，形成至少一个能繁殖的成熟的植物，和这些过程的组合中选择的过程。可以通过例如去分化的组织(愈伤组织)的分化或通过析取的不成熟的胚胎的直接胚胎形成来再生从析取的不成熟的胚胎再生的植物。再生的植物可以优选地生长到成熟以提供成熟的植物，并且更优选地提供能繁殖的成熟的植物。析取的不成熟的胚胎和析取的非胚胎组织也可以用于其它目的，诸如但不限于，遗传或生物化学分析。 

本发明的方法和装备可以应用于任何感兴趣的单子叶植物。优选的单子叶植物包括但不限于，禾本科的成员，包括诸如草坪草的草和诸如玉米(玉米(maize))、小麦、和稻的谷类作物。特别优选的单子叶植物包括玉蜀黍(zea)种，包括玉米(zea mays)，其具有通常在玉米穗上以行保持的多个谷粒(种子)。 

总之，以任何适合的方式提供目标组织从其中大致分离的单子叶植物种子。例如，可以将种子接附到种子生长的穗或头上；在一些实施例中，可以在大致纯化目标组织之前从穗或头移除单子叶植物种子。 

在一些实施例中，在单子叶植物种子的果皮或种皮上提供开口。这可以通过任何适合的技术实现，诸如但不限于，用针、锥子、刀片、或其它适合的器具制造孔、穿孔、或切口。在方法的一些应用中，不需要移除果皮组织；在其它实施例中，打开果皮可以包括移除果皮的 至少一部分并且可能移除一些非胚胎组织(例如，胚乳)。优选地，开口足够以大致从种子分开胚胎。在一些实施例中，可能仅需要大致弱化果皮(例如，通过研磨，或通过其它物理的、化学的、或酶的处理)，使得将力施加到种子导致大致分离诸如胚胎的目标组织。 

方法包括将足够从种子大致分离诸如不成熟的胚胎的目标组织的力施加到种子的步骤，其中，大致分离的目标组织适用于遗传转化和组织培养。力可以顺序地或同时地施加到多个种子。施加的力可以是连续的或不连续的(例如，脉冲的或波状的力)，并且通常机械地施加，即，通过使用设备或机器而不是人手获得力。施加的力的量优选地足够克服目标(例如胚胎)和非目标(例如，诸如胚乳的非胚胎组织)来自彼此的粘附力，从而允许目标和非目标组织分开。任何适合的一个或多个力可以用于从其种子移除目标组织，并且多个力可以结合地、顺序地或同时地使用。适合的力包括但不限于，流体射流正压力，液体射流正压力，机械正压力，负压力，离心力，线性加速度，线性减速度，流体剪切力，流体湍流，和流体层流。流体力可以通过任何流体、气体或液体或它们的结合施加。 

因为玉米胚胎位于谷粒的向顶的侧，可以根据需要将液体射流导向到谷粒的向基的侧，以成功地排出胚胎(参看例如图13)。在这样的设置中，射流的全部的力没有直接地冲击胚胎。而是，力的相当大的量仅间接地施加到胚胎自身。从而，在没有大致增加对正在被移除的胚胎的伤害的情况下，可以在装备内施加更强的力以加速胚胎的移除。 

可以通过促使更大量的液体通过本发明的装备提供更大的冲击力。然而，在一些实施例中，可以在不使用更多液体的情况下产生更大的冲击力。例如，在一些实施例中，减小射流开口的尺寸使得可以在更高的速度使用相同体积的液体。因为运动物体的能量与速度的平方成比例，相同体积的射流可以具有高得多的能量。运动物体的动能的简单等式为等于(1/2)(m)(v²)。液体射流的实际冲击能量的计算还应该考虑本领域中的普通技术人员已知的其它因素。另外，一些实施例可以使用增加流体和改变射流开口尺寸的结合以获得希望的力或能量。 

加仑/分额定值为大约0.01到大约0.25的喷嘴可以用于本发明，或大约0.01到约0.2，或大约0.01到大约0.1，或大约0.01到大约0.09， 0.08，0.07，0.06，0.05，0.04，0.03，0.02，或0.015，或这些量之间的任何整数或分数。在一些实施例中使用加仑/分额定值低的喷嘴，如可以使用0.033或0.021加仑/分。当这样的喷嘴用于更高压力但是指向谷粒的与胚胎相反的侧时，可以在避免伤害胚胎的同时获得加速的胚胎收获。 

在一些实施例中，在本发明的装备中提供多个射流。这样的装备适用于减小从玉米的穗收获胚胎所需要的时间。在一些实施例中，装备可以具有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多个用于传送流体力的射流开口或喷嘴。在一些实施例中，存在2，3，4，5或6个射流开口或喷嘴。在一个实施例中，存在三个开口。这样的设备在图12中示出。在一些实施例中，开口提供为水平定向的小角度扁平流射流。然而，在本申请中在别处提供了射流开口的其它实施例。 

方法还可以包括从诸如胚乳、颖、和种皮或果皮组织的有关的非胚胎组织分开大致分离的诸如不成熟的胚胎的目标组织的步骤。可以通过一种或多种适合的技术实现分开，包括但不限于，通过尺寸排除(例如，通过在一个或多个过滤步骤中过滤)分开，基于疏水性、亲水性、亲油性、或其它吸引力分开，和通过质量或密度差异分开(例如，通过离心、沉淀、和倾析分开)。一个或多个分开步骤可以是可选的，例如，为了用于组织培养，不需要附加地分离完整无缺的或部分的胚胎。 

本发明的方法特别适用于必须提供大量目标组织的应用，例如，在高生产量过程或筛选中，或者在用于遗传转化或组织培养的批量处理中。例如可能通过使用机器人或机械操纵玉米穗或种子、打开果皮、将力施加到种子、或可选的分开步骤实现方法的自动化。这样的自动化可以使用光学的或机械的传感器以辅助相对于施加的一个或多个力或在分开步骤中定位玉米穗或种子。在一个优选的实施例中，方法以每个工日在大约250到100,000之间或更多胚胎的速度提供大致分离胚胎；或者每个工日在大约250到大约100,000之间、或者大约250到大约50,000之间、或者大约250到大约20,000之间、或者大约250到大约10,000之间、或者大约250到大约5,000之间、或者大约250到大约3,000之间、或者大约250到大约1,000之间的胚胎；或者每个工日在 大约800到大约100,000之间、或者大约800到大约50,000之间、或者大约800到大约20,000之间、或者大约800到大约10,000之间、或者大约800到大约5,000之间、或者大约800到大约3,000之间、或者大约800到大约1,000之间的胚胎；或者每个工日在大约2500到大约100,000之间、或者大约2500到大约50,000之间、或者大约2500到大约20,000之间、或者大约2500到大约10,000之间、或者大约2500到大约5,000之间、或者大约2500到大约3,000之间的胚胎；或者每个工日在大约5000到大约100,000之间、或者大约5000到大约50,000之间、或者大约5000到大约20,000之间、或者大约5000到大约10,000之间的胚胎，或任何上述范围之间的任何分数或整数。作为参考，工日等于本领域中的普通技术人员一天的工作量。虽然平均雇员产量可能不同，下面给出了用于比较本发明与当前的平均雇员产量的方针。为了管理人体工程学负担，当前建议工人大约每星期两次每天切除大约玉米的一个穗(大约200到300个胚胎)。从而，遵循这样的建议的平均雇员每星期能够生产大约600个胚胎。可能平均雇员每天可以生产大约500-800个切除的胚胎。然而，由于增加的人体工程学负担并且考虑到质量，不建议在数日或甚至数星期中维持这样的产量。如上所述，本发明克服这些重大的产量限制。 

用于大致分离目标植物组织的装备 

本发明还提供了用于大致分离诸如玉米胚胎的适用于遗传转化或组织培养的目标组织的装备。在用于分开玉米胚胎的实施例中，这样的装备包括至少一个用于引导流体流的孔口，其中，流体流接触玉米穗上的谷粒并且从谷粒大致分离胚胎。通常，在方便的情况下，流体流在给定的一段时间内接触尽可能多的谷粒以便更加迅速地分离胚胎是优选的。至少一个孔口可以包括单一孔口或多个孔口(例如，单一或多个喷嘴，可以包括扁平的、圆的、椭圆的、扇形的或其它图案的喷嘴，和可调节的、运动的、或静止的喷嘴)，并且能够产生任何适合的类型和介质的流体流。流体可以为气体(诸如空气、氮气、或气体混合物)、液体(诸如水、生理盐水、或不同的培养介质)，或它们的结合。适合的流体流包括但不限于，流体射流(诸如单一的或多个柱形的射流；扁平的、锥形的、或扇形的射流或喷射；和片状射流)，流体层流，和流体湍流。适合的流体流可以导致不同的力以将胚胎从 其谷粒移除，包括正压力或负压力或全部；这样的力可以为均匀的或不均匀的，连续的或不连续的(诸如脉冲的或波状的力)，或以任何它们的结合。 

本发明的装备还可以包括用于使得大致纯化的目标组织和流体流相对于彼此运动的装置。例如，可以运动包含种子的玉米的穗或流体流或全部。装备的不同实施例可以用于单个或多个完整无缺的或部分的玉米的穗。例如，可以将一个或多个玉米穗固定到相对于流体流运动的保持器或抓紧器。然而，在其它实施例中，一个或多个玉米穗不需要单独地固定到保持器，而是可以自由地运动，以便允许用于从谷粒移除胚胎的力接触多个谷粒。用于使得至少一个玉米穗相对于流体流运动的装置可以使得该至少一个玉米穗和该至少一个孔口相对于彼此旋转，或者可以沿该至少一个玉米穗的纵轴线运动流体流，或者可以提供该至少一个玉米穗和该至少一个孔口相对于彼此的任何适合的三维运动，诸如旋转和纵向运动的结合。 

本发明的装备还可以包括至少一个用于从非目标组织分开目标组织的分开器。例如，可以从非胚胎组织分开胚胎组织，其中，分开的胚胎包括至少一些适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎。分开器可以通过任何适合的机制工作，包括但不限于，通过尺寸排除分开(例如，使用网、筛、穿孔的表面、或其它能够除去某些尺寸的物体的设备)，基于疏水性或其它吸引力分开(例如，使用能够吸引或排斥胚胎的固体的或流体的材料)，和通过质量或密度差异分开(例如，使用离心机，或使用用于有差异的沉淀的溶液)。在某些实施例中，该至少一个分开器可以是可选的，例如，为了用于遗传转化或组织培养，不需要附加地分离完整无缺的或部分的胚胎。 

大致分离的(并且可选地分开的)不成熟的胚胎包括至少一些诸如不成熟的完整无缺的或部分的胚胎的适用于组织培养应用、转化、形成愈伤组织、直接胚胎形成，形成分化的植物组织，形成至少一个成熟的植物，形成至少一个能繁殖的成熟的植物，和上述这些过程的结合的胚胎。大致分离的不成熟的胚胎和非胚胎组织也可以用于其它目的，诸如但不限于，遗传或生物化学分析。 

本发明还提供用于从至少一个不成熟的玉米穗机械地大致分离多个适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎的装备，包括至少一个从以 下部件中选择的部件(a)至少一个用于将机械正压力施加到该至少一个不成熟的玉米穗上的谷粒的外部的坚固的表面；(b)至少一个用于引导流体流的孔口，其中，流体流接触该至少一个不成熟的玉米穗上的谷粒；和(c)至少一个用于施加负流体压力的孔口，其中，负流体压力接触该至少一个不成熟的玉米穗上的谷粒；并且其中，该至少一个部件将足够从谷粒大致分离胚胎的力施加到谷粒，大致分离的胚胎包括多个适用于遗传转化或组织培养的不成熟的胚胎。适合的装备施加一个或多个足够从种子大致分离不成熟的胚胎的力，其中，大致分离的不成熟的胚胎包括适用于遗传转化或组织培养的胚胎。该一个或多个力可以以连续的或不连续的方式顺序地或同时地施加到多个种子，并且通常机械地而不是手动地施加。多个力可以结合地、顺序地、或同时地使用。适合的力包括但不限于，流体射流正压力，液体射流正压力，机械正压力，负压力，离心力，线性加速度，线性减速度，流体剪切力，流体湍流，和流体层流。流体力可以通过任何流体、气体或液体或它们的结合施加。 

本发明的结合的装备可以可选地包括用于相对于一个或多个力的源(即，用于施加机械正压力的坚固的表面，用于引导流体流的孔口，或用于施加负流体压力的孔口)运动该至少一个玉米穗的装置。优选地，在方便的情况下，该一个或多个穗相对于力的源运动，使得该一个或多个力在给定的一段时间内接触尽可能多的谷粒以便更加迅速地分离胚胎。 

本发明的结合的装备还可以包括至少一个用于更进一步地分开适用于遗传转化或组织培养的大致分离的不成熟的胚胎的装置，其中，分开的胚胎包括至少一些适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎。分开器可以通过任何适合的机制工作，包括但不限于，通过尺寸排除分开、基于吸引力分开、和通过质量或密度差异分开。 

转化的植物和它们的生产方法 

本发明还提供了转化的单子叶植物，通过以下步骤生产(a)使用这里描述的方法或装备提供至少一个可转化的目标组织；(b)将异种核酸分子引入可转化的目标组织以生产转化的外植体；和(c)从转化的外植体生长转化的单子叶植物。本发明的优选的单子叶植物为转化的禾本科的成员，包括诸如草坪草的草和诸如玉米(玉米)、小麦、 和稻的谷类作物。 

特别优选的单子叶植物包括转化的Zea种，诸如Zea mays。转化的玉米优选地包含至少一种能够将希望的特性赋予转化的玉米的异种核酸分子，希望的特性诸如除草剂抵抗力、害虫抵抗力、低温发芽耐受力、缺水耐受力、增加的生产率、增加的产出、和类似的特性。例如，在披露了对玉米有用的方法的McElroy等人的美国专利号6,194,636、McElroy等人的美国专利号6,232,526、Houmard等人的美国专利申请公开号2004/0216189、Cai等人的美国专利申请公开号2004/0244075和披露了对小麦有用的方法的Cheng等人的美国专利申请公开号2003/0024014中披露了用于制造本发明的转基因单子叶植物的实用的转化方法和材料(例如，不同的介质和受体目标细胞，不成熟的胚胎的转化，和随后能繁殖的转基因植物的再生)，全部这些在这里作为参考加入。单一的或多种异种核酸分子可以用于转化本发明的单子叶植物；例如，在Van Eenennaam等人的美国专利申请公开号2004/0126854中披露了用于基因表达的同等的减少和增加的构造，其在这里作为参考加入。 

作为结果的本发明的转基因的能繁殖的植物的种子能够被收获并且用于生长后代，包括在它们的基因组中包括异种核酸分子的转化的植物的杂种世代。从而，本发明包括最初的转化的植物(通过转化通过本发明的方法提供的胚胎生产的“R0”植物)和它们的含有异种核酸分子的后代。能够通过与缺乏此构造的第二植物杂交具有异种核酸分子的本发明的转化的单子叶植物制备这样的后代转基因植物。同样，可以与具有赋予另一个特性的其它异种核酸分子的植物线杂交本发明的转化的单子叶植物，以生产具有赋予多个特性的异种核酸分子的后代植物。 

示例 

示例1：挤出多个玉米胚胎的方法 

此示例示出了使用来自挤出机设备的机械正压力来生产适用于组织培养或遗传转化的胚胎的方法。 

用普通的蔬菜去皮机从不成熟的玉米(zea mays)的穗无菌地移除谷粒的顶部。使用稍微锯切运动将去皮机从玉米穗的基部端推向顶部 端以实现迅速、急剧地截顶谷粒。虽然在此实施例中截顶单独的谷粒以露出内部组织，在其它实施例中，可以仅需要在不真正移除果皮材料的情况下确保在果皮内制造开口(诸如穿孔或切口或研磨)。在希望胚胎完整无缺的场合(例如，用于转化的完整无缺的胚胎)，任何开口的尺寸优选为足够允许在不伤害胚胎的情况下移除胚胎。可以通过使用任何适合的设备打开果皮，包括但不限于，刀片和研磨材料。例如，蔬菜去皮机设计为被相对安全并且快速地使用；其具有规定的切割深度并且与解剖刀相比需要较少的使用技能。可以使用其它具有相似的功能的工具。用于打开果皮的设备优选地为可杀菌的，例如，通过高压灭菌法或加热或通过化学杀菌。这些果皮处理过程可以是自动的；例如，一个或多个刀片或研磨器可以机动化。 

将无菌挤出机(在此情况中为4毫米直径的杆)推靠在截顶的谷粒的基部上。可以使用其它适合的挤出设备。优选地，这样的设备的尺寸和形状能够将相对局部化的力施加到截顶的谷粒的基部上，以排出胚胎和胚乳。优选地，施加的力的幅度足够并且在适合的方向施加，使得前进的挤出机不“拱上”到向前的谷粒上。挤出机的后缘还优选地提供排出的胚胎和胚乳积聚在其上的表面；例如，可以使用具有倒圆的前缘的扁平的不锈钢片。在此示例中，从果皮逐渐地压榨出胚胎，随后是胚乳。挤出的胚胎和胚乳停留在前进的挤出机杆的顶部上，并且在过程期间不被压碎。 

用含水的流体介质(水，液体介质，或盐水)将胚胎和胚乳的混合物冲洗到具有菱形开口(大约2×3毫米)的无菌的网上。观察到胚乳被大量地保留，并且较小的胚胎和一些较小的胚乳碎片被冲洗通过筛，进入收集容器。再次冲洗收集的胚胎以移除小的碎片。 

通过浮选过程更进一步地纯化冲洗过的胚胎。在浮选过程的第一个步骤，从收集容器彻底地收回含水的流体介质，允许收集容器简短地干燥(例如大约1分钟)，使得从胚胎的腊状的表面收回保留的含水的介质，使得它们直接暴露于空气。添加新的含水的介质，并且大多数胚胎漂浮，因为它们的腊状的表面没有被流体重新湿润。诸如胚乳碎片的非胚胎组织保留浸没在介质内，并且获得胚胎和非胚胎组织的清晰的分开。可以通过诸如通过使用抽吸或者通过毛细作用(例如，放置在收集容器内的无菌的吸收剂的毛细作用以从挤出的胚胎吸走流 体)更加迅速、完全、或可复现地收回含水的介质来改进挤出的胚胎的浮选。 

在此初步的实验中分离大约100个胚胎的产出，其中，仅处理了来自整个穗的胚胎-胚乳材料的一部分。这些结果证明了对于从玉米芯收获大量不成熟的胚胎，本发明的方法是实用并且方便的。 

通过本发明的方法分离的胚胎可以随后用于组织培养程序，例如，用于再生方法以产生转基因玉米植物。通过将顶端靠在一起的镊子放在漂浮的胚胎下面，用镊子将它们提升到液体外面，并且将它们放置到培养介质上，简单地实现将分离的胚胎转移到培养介质。另一个技术可以为用具有疏水表面的器械拾起分离的胚胎。附加的技术可以为通过疏水性转移胚胎，例如，通过用小喷空气或突然的机械运动，使得它们的动能超过将它们保持到器械的疏水的力，将它们转移到介质表面。 

示例2：胚胎尺寸的视觉判定 

本示例描述了对示例1中描述的本发明的方法的一个实施例的改进。使用示例1所述的方法，不成熟的玉米胚胎需要靠近谷粒的截顶部分，以便以最大的数量排出。在测定要移除的谷粒顶部的量时，考虑不成熟的玉米胚胎尺寸的变化是重要的。胚胎倾向于在穗的中间区段最大，朝向端部，胚胎稍微减小。移除较小的胚胎，例如长度小于大约1.5毫米的胚胎更加困难，除非它们靠近截顶部。 

一种确保谷粒已经在尺寸变化的胚胎上方足够地去头的方法为在去头过程期间在低放大倍率下观察芯。例如，使用低放大倍率护目镜(装备有7号透镜的提供了2.75倍放大倍率的Donegan Opti-VISOR头带双目式放大镜)辅助视觉判定胚胎尺寸和果皮的适合的截顶。如果第一次切割没有移除足够的谷粒尖端，可以进行第二次切割。可以使用具有相同的或相似的放大倍率的其它低放大倍率设备。例如，可用于Opti-VISOR的透镜提供从1.5到3.5倍的放大倍率。 

示例3：挤出胚胎和胚乳 

本示例描述了对示例1中描述的本发明的方法的一个实施例的改进。动力驱动的设备可以用于辅助挤出胚胎和胚乳。例如，与倒圆的 挤出机设备配合的诸如WeCheer320动力驱动的凿子的动力驱动的凿子可以用于减小人员需要施加以排出胚胎和胚乳的力。其它动力驱动的设备可以获得并且可以被相似地使用。优选地，这样的工具的“凿子”部分(或可以与胚胎接触的工具的任何部分)可以被方便地杀菌，例如，通过插入珠子杀菌器。 

在一个实施例中，不锈钢称重刮刀的刀片自身向后弯曲以提供具有倒圆的前缘的挤出机设备。在插入WeCheer320动力驱动的凿子之后，大约10厘米长的部分从动力驱动的凿子的卡盘延伸出来。此组件用于从去头的谷粒的单独的行排出胚胎和胚乳。当挤出机设备(修改的刮刀)向下运动一行谷粒时，观察到刮刀从中心向左或向右滑动的轻微的倾向；然而，此倾向可以通过在每个外部边缘上包括刮刀的小的龙骨状延伸部修正。 

示例4：机械化的胚胎挤出 

本示例描述了对示例1中描述的本发明的方法的一个实施例的改进。可以通过使用适合的设备实现胚胎挤出过程的机械化，诸如但不限于，在这里描述并且在图1中示意性地示出的设备。此设备包括两个马达。第一马达D为步进马达，其能够旋转玉米穗，使得谷粒的新的行暴露于两个挤出杆G，两个挤出杆G施加力以将胚胎和胚乳从它们的果皮压榨出来。 

杆G方便地定位在穗的相对的侧上，以便使得施加到穗的压力相对于穗的纵轴线平衡。然而，可以使用单一杆或多于两个杆；在使用多个杆的场合，它们定位为在穗周围均匀地分配作为结果的机械压力是优选的。杆不需要是直的杆；在本设备的一个实施例中，环绕穗的圆周的柔性的“圈环”替代刚性的杆使用。在另一个实施例中，多个短杆或辊设置为能够沿穗的纵轴线滑动的柔性的、环形的构造，同时将机械压力施加到谷粒的许多或全部行。 

第二马达连接到小齿轮E，小齿轮E连接到齿条F，使得穗可以向上和向下线性运动。通过从把手向下延伸到穗的基部内的螺钉将穗的基部牢固地保持到把手B。把手的窄的中间部分为正方形的，使得其不会旋转，除非其接附到的保持器C被步进马达D旋转。 

在插入机器之前，和示例1中一样，去头谷粒的顶部，使得可以 压榨出胚胎和胚乳。为了开始此过程，降低穗直到两个杆G正好在把手B的下方靠近穗的基部。随后将杆压靠到穗的全部两侧，并且齿条和小齿轮组件向上拉穗。与此同时，胚胎和胚乳被从几个行移除，向下落入停留在基底I上的收集盘H，并且在堆J内收集。当杆接近芯的顶部端时，芯被向上撤回到其原始开始位置并且被步进马达稍微旋转，直到谷粒的新的行进入适当的位置。 

此机器的不同程度的自动化是可能的，包括传感器以自动调节垂直开始和结束位置以及旋转开始和结束位置。齿条和小齿轮不是实现线性运动的唯一方法。气动装置或液压装置对于一些应用可以是优选的。可以通过适合的机构自动地打开杆G。当装载新的穗时，将穗升高到足够高的位置以清洗杆可以是优选的。 

示例5：胚胎的疏水的分开 

本示例描述了对示例1中描述的本发明的方法的一个实施例的改进。在分开应用中，感兴趣的材料频繁地在不同的物相的分界面处出现(例如，在含水的和亲油的溶剂之间)。从这样的分界面移除感兴趣的材料可能引起问题，并且在过去为涉及与析取剂和要析取的材料紧密接触的手动过程。通常，成功地分开成分的唯一方法为使用相同极性或疏水性/亲水性的材料。在通过本发明的方法挤出的不成熟的玉米胚胎的情况中，在含水的/空气分界面发现胚胎。玉米胚胎的表面是蜡状的，即，亲油的或疏水的，并且当胚胎表皮与相似疏水性的物质接触时，胚胎将倾向于粘到疏水的表面。胚胎的疏水性减小了其周围的水的表面张力，这帮助胚胎“漂浮”在含水的/空气分界面的表面处。 

一种利用这些物理特性的方法为用疏水的材料(诸如疏水的滤纸，例如Whatman No.1 PS纸，其为用硅树脂浸透的防水物相分离纸；参看例如www.whatman.com/repository/document/s3/tech_appli_010.html)接触漂浮的胚胎。在一个示例中，可以将一片无菌的疏水的滤纸降低到漂浮的胚胎的整个贮存器上，并且一次将它们全部拾起。在另一个示例中，可以用小片疏水的纸接连地拾起一定数量的胚胎并且将它们转移到下一个贮存器。在第三示例中，可以使用小片的疏水的纸或疏水的移液管尖端接触并且拾起单独的胚胎并且通过从移液管喷空气分配它们。也可以通过将移液管尖端插入疏水的管道(例如，硅树脂管 道)的短的长度修改普通的移液管尖端以用于这样的用途；随后可以通过疏水地吸引到疏水的管道的远端拾起胚胎，并且随后通过从移液管喷空气分配来释放。疏水的胚胎周围的减小的表面张力帮助它们漂浮在含水的表面上，并且也可以通过在含水的表面上运动漂浮的胚胎(例如，通过指向胚胎的空气射流)传送它们。可以通过修改诸如设计为用于群体拾起或用于检索染色的2-D蛋白质凝胶上的蛋白质斑点的机器的现有设备来自动化拾起和分配胚胎。 

示例6：排出或挤出胚胎的更进一步的方法 

本发明的方法包括使用不同类型的力或力的结合以从其种子分开胚胎。此示例描述了更进一步的实施例。在示例1中描述的一个基本方法中，将机械正压力施加到截顶的种子(诸如玉米谷粒)的基部以通过种子的截顶的顶部排出胚胎。 

在另一个实施例中，可以使用离心力排出胚胎。例如，玉米穗(其谷粒在之前已经被截顶)可以以足够在径向的轨迹排出胚胎和/或胚乳的速度围绕其纵轴线旋转。可以通过任何适合的技术实现旋转，诸如但不限于，用自由地旋转的锥体接触玉米穗的顶端，其中，穗的旋转保持在受限制的纵向范围内，例如，通过将穗的基部端接附到把手，把手随后插入保持器，把手可以在保持器内旋转。在一个使用离心力的示例性的实施例中，用刮刀移除玉米穗上的每个谷粒的顶部的大约三分之一，并且穗在表面上滚动以使得谷粒内的胚胎和胚乳松驰。穗折断为两块，每块的长度大约为750毫米。每块被放置在具有大约100毫升水的250毫升离心瓶内。以5000转/分钟离心分开15分钟以排出胚胎。离心之后对穗的检查显示，在穗的一些部分，全部胚胎已经通过离心被移除，而在其它区域，很少或没有胚胎被移除。排出的材料被离心并且移除上层清液以留下包含完整无缺的胚胎(估计包括胚胎总量的大约20％)的浆体。在另一个示例中，收获玉米的不成熟的穗(通常在授粉之后大约10到大约14天之间)。为穗除虫，并且在无菌条件下切去每个谷粒的顶部。将穗安装在电钻(或相似的设备)的钻头上，并且通过大的无菌的收集器皿(例如，大的玻璃烧杯)围绕穗。穗以足够排出不成熟的胚胎的旋转速度旋转，并且从无菌的贮存器收集排出的组织。例如，通过手动收集或者通过用无菌的组织培养 介质漂洗贮存器并且重新获得包含胚胎的浓缩的馏分(例如，通过筛选，通过使用液体密度梯度，或者通过其它方法从非胚胎组织分开胚胎，如在本披露物中的别处描述的)收集不成熟的胚胎。不成熟的胚胎(或源自不成熟的胚胎的愈伤组织)可以随后用于转化。可以通过常规测试确定优选的离心时间和速度来实现使用这些和其它离心方法的改进的结果。 

另一个实施例使用谷粒的大量浸软。收获玉米的不成熟的穗(通常在授粉之后大约10到大约14天之间)。为穗除虫。果皮可以在无菌的条件下打开或谷粒可以保持完整无缺。通过任何适合的程序从芯移除谷粒，包括但不限于，使用刮刀或其它有刀片的工具。谷粒一旦从芯分开，被放置在组织培养介质内。谷粒-介质混合物可以经历使用适合的切割设备的更进一步的组织分裂，切割设备诸如但不陷于共混机。例如，通过手动收集或者通过用无菌的组织培养介质漂洗贮存器并且重新获得包含胚胎的浓缩的馏分(例如，通过筛选，通过使用液体密度梯度，或者通过其它方法从非胚胎组织分开胚胎，如在本披露物中的别处描述的)收集不成熟的胚胎。不成熟的胚胎(或源自不成熟的胚胎的愈伤组织)可以随后用于转化。 

在再一个实施例中，可以使用流体射流(气体或液体或它们的结合)取出胚胎。此方法的一个示例为以步进式的或连续的(螺旋状的)方式自动地旋转玉米穗经过静止的射流，收集包含胚胎的排出的材料并且根据需要更进一步地分离胚胎，例如，通过在网或筛或类似物上按尺寸分开。在玉米穗垂直地定向(相对于其纵轴线)的场合，在向上的螺旋状的方向旋转穗可以是优选的，或者另外相对于射流运动穗，使得析取的胚胎倾向于向下洗涤。 

在再一个实施例中，可以使用线性减速度或线性加速度取出或排出胚胎。例如，可以给予玉米穗平行于穗的纵轴线的震动和足够排出胚胎和胚乳的力。玉米穗可以被封闭在适合的无菌的耐冲击能力高的保持器内，该保持器可以例如经历通过急剧冲击(例如来自大锤)造成的突然加速或减速。 

对方法的另一个改进可以为促进从截顶的种子排出或挤出胚胎。例如，可以通过将力施加到完整无缺的种子的顶部(例如，通过在去头谷粒的顶部之前，施加辊或其它施加压力的装置到完整无缺的穗内 的玉米谷粒的行的顶部，或将穗自身滚或压在表面上)使得胚胎在种子内的它们的初始位置处松驰或移动。也可以通过例如通过超声施加振动松驰种子内的胚胎。另一种方法可以为在胚胎排出或挤出之前移除附加的非胚胎组织，诸如附加的侧壁(果皮)材料。例如，可以使用V形刀或其它器械移除穗的行内的玉米谷粒的侧壁的一些。 

示例7：使用流体射流正压力的自动的胚胎分离 

此示例描述了本发明的再一个实施例。在此示例中，自动化的设备使用流体射流正压力从种子取出胚胎。参考图2，自动机的抓紧器C(优选地能够通过自动机A和马达B或通过等价的装置在三维空间运动)在自动机台上的齿条的限定的位置内拾起玉米穗I(通过具有挡板E的把手D)。自动机在凸缘F下方的开始位置处将玉米穗插入管H(为了容易视觉观测，可选地由透明材料制造)。通过孔口G引入流体射流正压力并且同时通过自动机A和自动机B升高(在Y维度)并且旋转穗，优选地导致每个谷粒被流体射流打击，导致取出胚胎和胚乳。通过孔口G的流体可以为至少一种气体、至少一种液体或任何它们的结合。流体射流可以连续地或不连续地，例如，以脉冲的形式施加力。当通过来自孔口G的流体射流正压力取出胚胎和胚乳时，它们向下落到摇动筛J上，摇动筛J在允许胚胎通过其落到下面的收集表面K(例如，无菌的干酪包布)的同时保留胚乳。多余的流体可以可选地被收集在废物或再循环容器L内。在对每个玉米穗完成胚胎移除过程之后，可以手动地或通过在凸缘F上方或下方自动的射流简单地洗涤管的内部。 

示例8：处理未加工的胚胎制备物的方法 

通过诸如那些在示例1到7中描述的方法获得的胚胎制备物可以包括完整无缺的胚胎和部分的胚胎，其伴有诸如胚乳和颖的非胚胎组织。一些应用可能不需要更进一步的处理或分开步骤，例如，在大量转化这样的“未加工的”胚胎制备物时，不需要将胚胎(完整无缺的或部分的)从非胚胎组织分开。例如，源自完整无缺的或部分的不成熟的玉米胚胎的愈伤组织可以用于转化、再生、和生产能繁殖的转基因植物。从而，完整无缺的和部分的胚胎可以用作可转化的外植体并 且不需要从彼此分开。然而，在其它情况中，可能希望从未加工的胚胎制备物更进一步地纯化胚胎。 

在处理未加工的胚胎制备物中可能遇到一些困难的程序包括：(1)漂洗去除非胚胎组织(例如，细胞碎片、淀粉粒、不合需要的蛋白质)，(2)在挤出或使用液体漂洗之后有效地从胚胎移除多余的液体，及(3)添加具有最小湍流的液体，使得胚胎漂浮并且不被淹没。 

多孔材料适用于从胚胎分开非胚胎组织。可以使用任何适合的多孔材料，适合的多孔材料优选地具有足够小以保留胚胎但是让较小的非胚胎组织或碎块通过的网眼或孔尺寸，并且能够被杀菌(例如，通过高压灭菌、加热、照射、或化学灭菌)。本领域中的普通技术人员通过简单的实验容易地判断或测试材料的适合性。适合的材料的示例包括干酪包布或其它织造材料、和其它网或筛。在一些实施例中，可以使用穿孔的固体材料，包括穿孔的陶瓷、聚合物、金属、或玻璃(例如，以Büchner或相似的分液漏斗的形式)。适合的规格的干酪包布例如具有足够小以保留胚胎但是允许较小的碎块通过的网眼尺寸，并且耐高压。干酪包布可以接附到框架或圈环(例如，保持图2所示并且在示例7中描述的胚胎收集表面K的框架)，以允许干酪包布和全部保持的胚胎同时被浸没以容易漂洗。例如，可以通过弹性带或类似物(例如，硅树脂管道)容易地将干酪包布接附到框架；这样的框架例如由切割成区段的耐高压的材料(例如，聚丙烯、聚甲基戊烯、聚碳酸酯、或耐高压的玻璃)制造的烧杯或量筒容易地制造。干酪包布具有强毛细作用，允许从胚胎有效地拉离液体，从而在漂浮之前使得胚胎的蜡状的表皮暴露于空气。在漂浮步骤中，将干酪包布简单地浸没在含水的液体内，允许胚胎浮起。 

示例9：使用流体射流大致分离胚胎 

本示例描述了本发明的再一个实施例。在此示例中，通过流体射流正压力从种子取出多个胚胎。 

在最简单的示例中，将200毫升移液管尖端接附到具有 

的垂直的水槽喷嘴。当打开自来水时，从移液管尖端形成具有相当大的力的射流。估计自来水压力为大约每平方英寸60磅。此流体(液体)射流被瞄准到谷粒已经如示例1所述被去头的不成熟的玉米穗(包含 在烧杯内)上。当射流打击每个谷粒时，胚乳和胚胎排出并且收集在烧杯内。因为胚乳在此阶段为相对软的组织，其被射流碎裂为许多较小的块，然而胚胎保持完整无缺。 

通过射流取出的胚乳和胚胎组织被直接倾倒到No.60干酪包布(其它适合的多孔材料，诸如适合的网眼尺寸的亲水的网可以为替代品)上。可以获得不同“等级”的干酪包布(例如，等级10、20、30、40、50、60、70、80、和90，随着等级升高，网开口减小)，并且通过简单的实验容易地选择适合给定类型的胚胎的平均尺寸和形状的等级或网眼尺寸。胚胎和胚乳的较大的碎片被保留在干酪包布的上表面上。在下一个步骤之前，通过依靠芯吸作用吸走多余的液体，允许干酪包布部分地干燥。这将液体从组织拉开并且使得胚胎的表面暴露于空气。当将干酪包布降低到含水的液体内时，因为胚胎的蜡状的表皮不再次湿润，胚胎漂浮。 

在简单的设置中，当将保持未加工的胚胎制备物的液体倾倒通过干酪包布时，可以将干酪包布(或其它适合的多孔材料)手动地伸展或保持在容器或废物贮存器上方。为了无菌工作，干酪包布可以被接附到可以在使用之前高压灭菌的刚性的框架。诸如那些可以在厨具供应商店内获得的与把手卡扣在一起的滤网也可以在方法中使用。 

示例10：用于使用流体射流析取胚胎的设备 

此示例描述了用于机械地制备多个适用于组织培养的玉米胚胎的装备的不同的实施例。 

一个实施例包括用于使用流体射流制备多个玉米胚胎的装备，通常与图2所示的设备相似。通过切割1升耐高压的聚甲基戊烯(PMP)量筒的端部制造透明的端部开口的筒。移液管尖端(1250微升GilsonDistritip，渐缩以避免背压形成)被固定到筒的侧并且用作用于通过在筒的壁内形成的孔引导流体流作为射流的孔口。从 高压耐高压的蠕动泵管道通过移液管尖端供给流体(在此情况中为水)；水从实验室水槽水龙头输送，但是可以为从泵或其它源输送的含水的流体。当发现例如无菌的培养介质或无菌的盐溶液作为用于大致分离胚胎的液体比水更好时，使用能够输送无菌的流体的泵是优选的。适合的泵的示例为具有高压力L/S泵头的Masterflex泵，当与高压力管道 一起使用时，其能够以高达100psi的压力输送无菌的液体。 

将具有之前去头的谷粒的玉米穗手动地定位在筒内。一旦穗在筒内适当地定位，每个谷粒经历来自水射流的正压力。这导致从谷粒挤出胚胎和非胚胎组织。在此处理之后检查穗指示从谷粒有效地移除胚胎。挤出的材料被从筒的内部壁向下冲洗到定位在筒下面的胚胎收集器。胚胎收集器包括：(1)热熔合到Tri-Pour^TM塑料烧杯的切去的顶部并且堆叠在其上的粗孔的塑料筛(较大的碎块被捕获在其上)(2)用弹性带固定到第二Tri-Pour^TM塑料烧杯的切去的顶部并且堆叠在其上的细孔筛(等级60干酪包布，挤出的胚胎被捕获在其上)(3)废物收集烧杯或其它贮存器(其中收集细微的碎块、非胚胎组织、和废液)。 

本领域中的普通技术人员容易地作出对这些和相似的实施例的修改。例如，关于对于应用流体射流定位玉米穗或种子，可以手动地将穗保持在适当的位置，或者优选地，通过能够在三维空间运动穗的可运动的支撑装置将穗固定地安装在筒内。例如，穗可以被安装到有螺纹的金属或聚合物杆，诸如聚丙烯杆，其可以用于沿纵轴线运动穗以及旋转穗。安装机构的另一个示例在图3中示出，图3示出了磁“把手”，穗可以通过其固定到自动机臂。 

然而，在其它实施例中，一个或多个玉米穗不需要被单独固定到保持器，而是能够自由地运动以便允许用于从谷粒移除胚胎的力接触多个谷粒。例如，至少一个穗，或多个穗，可以支承或保持在至少一个支撑装置之间，诸如但不限于，至少一个平面、框架、格子、筛、网、平台、辊、引导线或杆、和皮带、轮、或辊式运输机。这样的支撑装置可以是可运动的或可以导致一个或多个穗运动，例如，通过振动、滚动运动、重力、或其它机制。如果平台是多孔的(例如，由网制造)，大致分离的胚胎可以自己通过平台。一个或多个穗还可以漂浮在流体上，方式为在漂浮时允许每个穗旋转或另外自由地运动。诸如包含大致分离的胚胎的液体的流体可以被连续地排除，可选地通过过滤或沉淀设备，或被收集用于离心。 

用于实现沿玉米穗的纵轴线的运动的设备包括但不限于，滚珠螺杆驱动的滑块或带驱动的滑块，诸如那些可以从诸如Techno，Inc(technoisel.com)的不同厂商购买到的。为了实现用于旋转玉米穗的 旋转运动，可以使用步进马达，例如，接附到滑动板的步进马达。也可以通过滚动设备提供旋转运动，例如，通过平行的圆的或管状的辊，玉米穗保持在其间并且旋转。 

可以根据应用的需要有利地修改流体射流的形状。例如，直径均匀的窄柱形射流适用于一次从一个种子移除胚胎。在希望增加大致分离胚胎的速率的场合，可以通过流体射流从种子同时移除多个胚胎；这可以例如通过使用覆盖较大的区域的至少一个单一的流体射流或者通过同时使用多个射流实现。在一个实施例中，多个射流，诸如多个平行的、狭窄的、柱形射流(例如，通过与示例9中使用的相似并且可选地通过集管连接到彼此的多个喷嘴产生)用于将流体射流正压力导向到多个种子上以同时大致分离它们的胚胎。这些和其它设备的自动化还可以包括光学或质量传感器以辅助相对于彼此定位穗和流体射流。 

在另一个实施例中，可以使用至少一个覆盖较大区域的流体射流(例如，其中，流体射流同时冲击玉米穗上的多个谷粒或多行谷粒)。这样的射流的尺度优选地允许射流进入谷粒并且冲出胚胎。通常，用于遗传实验的玉米胚胎是不成熟的并且通常长度在大约1.8到大约2.2毫米的尺寸范围内；保持这些不成熟的胚胎的谷粒通常宽度在大约4到大约5毫米之间的尺寸范围内。对于此尺寸的胚胎，适当的流体射流可以为例如宽度在大约0.5到大约1毫米之间。 

可以使用用于产生这样的较大的流体射流的任何合适装置，诸如但不限于，产生非柱形流体射流的喷嘴。适合的喷嘴的示例包括但不限于，产生扁平的喷射图案的喷嘴和产生扇形或锥形喷射图案的喷嘴。在一个示例中，可以购买到的扁平的喷射喷嘴(号码23990-1/4-04，Spraying Systems Co.，Dillburg，PA)与Masterflex L/S泵(型号77250-62)一起使用，来以1升每分钟和30psi泵送液体；在这些条件下从玉米穗切除胚胎。优选的喷嘴的另一个示例为产生流体的扁平的“片”形式的流体射流的喷嘴，诸如在图4中所示的。这样的喷嘴优选地能够产生均匀的、扁平的流体射流，该流体射流对于至少足够允许流同时接触多个种子(并且优选地数个种子)的距离维持一致的、均匀的片状流。图4所示的新颖的喷嘴设计为产生厚度为大约0.5到大约1毫米、宽度大于大约20毫米、并且在距喷嘴的孔口大约20到大 约25毫米的距离内维持片状流的均匀的、扁平的片状射流。此后面的距离允许射流沿谷粒的行运动，使得谷粒的表面和喷嘴的孔口之间的距离差异所需要的调节最小。 

与通过液体通过其流动的喷嘴或孔口产生的射流的区域或形状或喷射图案无关，喷嘴或孔口优选地用于足够产生足够的流体力以在不损伤胚胎的情况下从种子取出胚胎的流速和压力。在一些实施例中，使用更低的流速并且可能地使用更高的压力是优选的，以最小化流体(诸如介质)损耗以及最小化产生的废物。 

示例11：使用气体射流以大致分离胚胎 

此示例描述了用于机械地制备多个适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎的方法和设备的更进一步的实施例。如示例6所述，气体射流也可以用于大致分离多个胚胎。修改与示例10所述的相似的装备以与气体一起使用。1毫升移液管尖端(目录号码TN1300RS，Marsh BioProducts)被固定到筒的侧并且用作用于通过在筒的壁内形成的孔引导空气流作为射流的孔口。空气从增压到大约60到大约100psi之间的压缩机供应。为方便起见，空气阀串联定位在压缩机和移液管尖端之间。从此移液管尖端发出的空气射流用于从制备的玉米穗取出胚胎。在谷粒已经经历空气射流之后对谷粒的检查显示厚的果皮保留在适当的位置并且被纸状的颖围绕，并且果皮内容物(胚胎和胚乳)已经被移除。对通过等级60的干酪包布保留的组织的检查显示其包括取出的胚胎以及一些通过高压空气射流取出的颖。与胚胎相似，玉米的颖具有蜡状的表面并且也在漂浮程序之后漂浮。使用较低的空气压力可以减小颖污染。 

示例12：使用其它流体力大致分离胚胎 

此示例描述了用于机械地制备多个适用于遗传转化或组织培养的玉米胚胎的方法和设备的更进一步的实施例。通过流体施加的力，而不是来自流体射流的正流体压力，可以用于大致分离胚胎。在一个实验中，已经从玉米穗移除谷粒的顶部，玉米穗被放置在包含无菌的蒸馏水的瓶子内并且用手有力地摇动。这导致大致分离穗的200个胚胎中的90个。另一个实验重复前面的程序，只是摇动在机械的涂料摇动 器内执行。在此实验中，大致分离穗的190个胚胎中的56个胚胎。在第三个实验中，执行相似的程序，只是玉米穗被预先浸泡在211介质内，并且摇动在涂料摇动器内执行。在此实验中，大致分离穗的210个胚胎中的109个胚胎。在这些情况中，来自围绕玉米穗的液体的运动的非射流流体力导致胚胎大致分离；流体力可以包括流体湍流、流体层流、来自流体流的剪切力、负流体压力(例如，导致涡凹)、或它们的结合。力还可以包括通过声学技术产生的力，诸如通过声波或以气体或流体物相的波(脉冲的或连续的)。 

前面的示例(包括示例9-11)描述了使用流体射流从不成熟的穗移除胚胎。在这些程序期间，观察到流体射流通常还导致从谷粒释放至少部分胚乳。观察到胚乳组织比胚胎更软并且更脆，并且倾向于不同程度地分裂(与倾向于保持完整无缺的胚胎相反)。胚乳可能在暴露于通过流体射流产生的剪切力时分裂。认为此剪切力是不均匀的，导致观察到的分裂的可变性；但是，胚乳材料的大部分充分地分裂以通过干酪包布，留下由半纯的胚胎制备物构成的保留物。 

当将来自普通的实验室喷射瓶的低压力射流对准干酪包布保留物时，更多保留的胚乳组织更进一步地分裂并且被冲洗通过干酪包布，留下相对更纯的胚胎制备物。从而，预测如果保留物均匀地暴露于正确的强度的剪切力，全部或基本上全部保留的胚乳将分裂并且通过干酪包布，是合理的。这样的剪切力可以通过任何适合的装置产生，诸如但不限于，单一射流、多个射流、片状或幕状射流、迅速运动射流、和胚乳减速或加速。另外，如果用于初始地释放谷粒内容物的射流设计为在排出期间使得更大比例的胚乳暴露于剪切力，可以获得初始更高纯度的胚胎制备物。 

接下来是施加剪切力以更进一步地纯化胚胎的一个非限制性的实施例。一旦从芯释放胚胎和部分地分裂的胚乳，可以通过例如来自喷射喷嘴的流体流迅速地碎裂胚乳的剩余物，该流体流均匀地和同时地打击胚乳。一种适合的类型的喷嘴为密实锥形喷嘴。密实锥形喷嘴产生完全由滴填充的喷射图案。在液体离开孔口之前，喷嘴内的内部叶片给予液体受控的湍流，允许形成喷射图案。可购买到的喷嘴具有圆形的、正方形的、或椭圆形的喷射图案。已知的适合的密实锥形喷嘴的示例为“UniJet Spray Nozzle，Standard Spray，Small Capacity”(零 件号TG-SS0.3)。 

示例13：结合的设备 

本示例描述了本发明的方法的数个附加的实施例，其使用力的结合从种子大致分离多个胚胎。 

图5示出了使用更大的流体射流(如示例10所述)的设备。此设备包括用于产生诸如更大的流体射流(例如，扁平的流体射流)的流体流的喷嘴，并且可选地包括用于施加负流体压力(例如，通过真空或抽吸)的吸头或部件，用于取出胚胎和/或用于收集取出的胚胎。图5(顶部)示出了这样的设备的示例的截面图，示出了喷嘴、可选的吸头、和玉米穗可以如何相对于彼此定位。玉米穗、喷嘴、和可选的吸头可以相对于彼此运动；例如，玉米穗可以为静止的，而喷嘴和可选的吸头运动，或喷嘴和吸头可以为静止的，而玉米穗运动。图5(底部)示意性地示出了定位在设备内的玉米穗，并且示出了定位为产生扁平的流体射流的喷嘴，其中射流冲击行内的多个谷粒。 

图6示出了用于施加负流体压力(例如，通过真空或抽吸)的适合的吸头或部件的实施例，诸如可选地在图5所示的设备中使用的，并且其自身也可用于大致分离胚胎。吸头可以包括一个或多个孔口，负流体压力可以通过这些孔口施加。吸头也可以包括用于分配流体(诸如气体或液体，例如，水或介质)的装置，例如，吸头内的多个孔口。为了用于玉米，吸头优选地成形为符合通常的玉米穗的轮廓，并且优选地能够从多个谷粒或从多行谷粒俘获胚胎。设想吸头可以由刚性的材料制造(诸如不锈钢或其它金属)，或由柔性的材料制造，以允许更容易使得吸头与玉米穗的轮廓一致，或者由它们的结合制造。可以通过机械的正压力(例如通过吸头的前缘施加)、负流体压力(例如抽吸或真空)、和流体力(诸如但不限于，来自从谷粒的内部俘获材料的流体射流、流体湍流、和流体层流的正压力)的任何结合大致分离胚胎。 

诸如在示例1、3、4、6、7、9、10和本示例(包括但不限于图5和6所示的设备)中所描述的用于施加用于大致分离胚胎的力的设备可以相对于玉米穗运动。穗可以是静止的，或者设备可以是静止的，或者两者都可以运动。因为玉米种子通常存在于与玉米穗的纵轴线平行地设置的相对均匀的行内，设备通常运动(相对于穗)使得设备平 行于玉米穗的纵轴线经过并且跟随谷粒的一行或多行。然而，这样的设备相对于穗的运动可以跟随穗的圆周，或者可以是随机的，或者可以为适合的运动的任何结合。 

图7A到7C示出了使用力的结合以从种子(在此示例中为玉米)大致分离多个胚胎的设备的实施例的不同视图。此设备包括具有前缘的头，能够将预先确定的量的机械压力施加到之前已经打开或截顶果皮的谷粒的基部，使得以与示例1、3、和4中描述的相似的方式从谷粒挤出胚胎。设备还包括用于施加负流体压力(例如，通过真空或抽吸)以取出胚胎和/或用于收集取出的胚胎的部件。从而，挤出的胚胎(和伴随的非胚胎组织)从玉米穗分开并且可以通过施加负流体压力收集。可以根据需要通过适合的装置更进一步地分开收集的胚胎和非胚胎组织，诸如通过尺寸分开、疏水的分开、或差速离心。此设备的变体可以包括用于分配流体(诸如液体，例如，水或介质)的装置，例如，吸头内的多个孔口。 

图5、6、和7中所示的胚胎析取设备作为非限制性的示例性的示例描述。这些和其它这样的设备可以包括附加的部件，例如，用于从非胚胎组织或从用于大致分离过程的流体分开胚胎的装置。 

示例13：生存能力数据 

通过使用本发明的方法和设备提供的多个单子叶植物胚胎是适用于诸如植物的转化和再生的遗传转化或组织培养应用的最优选的胚胎。本示例更进一步地示出了本发明的方法在提供多个能活的并且适用于遗传转化或组织培养的单子叶植物胚胎的效用。在此示例中，通过不同的切除方法获得的不成熟的玉米胚胎的质量通过它们对通过根瘤土壤杆菌转化的响应来比较。 

为了转化，使用包含左和右边界序列的质粒、用于选择的用于抵抗草甘膦的基因、和报告基因(gfp，编码绿色荧光蛋白质)。包含此质粒的土壤杆菌被从冻结的甘油储液划线到LB板上并且在28摄氏度温育器内生长3天。通过将来自LB板的三个群体接种到25毫升LB培养液内制备种子培养物，其在27摄氏度、摇动(200转每分钟)温育15个小时。此种子培养物(10毫升)用40毫升新鲜的LB培养液稀释并且在27摄氏度、200转每分钟下生长6个小时。离心土壤杆菌 10分钟，并且沉淀块在AB最小化诱导介质内以660纳米以0.2的光密度重新悬浮。这在27摄氏度、摇动(200转每分钟)下温育15个小时。离心土壤杆菌培养物10分钟，并且用10毫升Lynx1040洗涤沉淀块，并且沉淀块在5毫升接种介质内重新悬浮。光密度调节到1.0并且用于接种。 

执行四个实验(分别标明为A、B、C、和D)。每个实验比较通过手动切除获得的胚胎与通过本发明的方法获得的胚胎：通过液体射流切除(实验A、B、和D)或通过气体射流切除(实验C)。实验A和B中的液体射流使用普通的自来水和由移液管尖端制造的喷嘴。实验C测试使用来自压缩空气泵的空气的气体射流和由移液管尖端制造的喷嘴。实验D中的液体射流使用1/2MSPL介质作为液体和具有0.020”直径的等价的孔口的密集流喷嘴(目录号码TP000050-SS，Agricultural Division of Spraying Systems Co.，Dillburg，PA)。 

在授粉后12天收获玉米穗并且通过浸泡在1升瓶的80％酒精内3分钟杀菌。通过用刮刀切去谷粒的顶部三分之一，并且使用窄的刮铲从谷粒移除胚胎来手动地切除胚胎。收集的胚胎被切除到单一的微型离心机(Eppendorf)管内的1毫升1/2MSPL介质内。移除介质并且用如下所述制备的1毫升根瘤土壤杆菌替代介质。 

在与那些在示例10和11中描述的相似的程序之后，还使用流体(液体或气体)射流大致分离胚胎。流体射流用于在用刮刀移除谷粒的顶部三分之一之后切除穗上的剩余的胚胎。穗定位为使得流体射流指向单独切割谷粒，接着取出胚胎和非胚胎组织(胚乳)之后。从穗移除的谷粒内容物通过粗孔筛以移除大块的胚乳，并且在无菌的干酪包布上收集胚胎。使用小的刮铲将胚胎从干酪包布转移到包含1毫升1/2MSPL介质的微型离心机管内。在收集全部胚胎之后，移除1/2MSPL介质并且用1毫升根瘤土壤杆菌接种剂代替。 

通过不同的切除方法制备的胚胎经历相同的接种、选择、和再生程序。在作为参考全文加入这里的Cai等人的美国专利申请公开号2004/0244075中披露了用于使用草甘膦选择和GFP作为报告子的植物转化的适合的程序，包括对介质和试剂的描述。 

用1.0毫升土壤杆菌接种胚胎5分钟。将微型离心机管的内容物倾倒在共培养介质板上，并且在23摄氏度共培养18个小时。接下来将 胚胎转移到诱导MS介质，并且在30摄氏度培养13天。源自转化的愈伤组织在再生之前在27摄氏度培养11天。此时，使用荧光显微镜计数GFP阳性区段。为了再生，将源自每个胚胎的愈伤组织单独转移到MS/6BA介质并且在明亮的房间内培养7天，在那之后将每个变绿的愈伤组织转移到MSOD介质并且返回明亮的房间再17天。将作为结果的芽转移到包含再生介质的Phytatray(包括2.165克MS basal salts，5毫升100X MS维生素，和20克蔗糖用水补偿为1升并且高压灭菌，用KOH调节pH为5.8，通过用3克Phytagel高压灭菌固化，并且添加0.75毫升的1毫克每毫升吲哚-3-丁酸，0.5毫升的1毫克每毫升1-萘乙酸，和0.2毫升的0.5摩尔草甘膦)。在大约3周之后，通过将生根的芽移植到包含土壤混合物的泥炭腐殖质营养钵内并且在26摄氏度生长来健化转基因植物。 

表格1中总结了这些实验的结果。从GFP阳性的胚胎的数量估计可转化的胚胎的数量。总的转化和再生频率给出为从接种的胚胎再生的GFP阳性的植物的百分比。这些结果表明本发明的不同的方法和设备适用于提供多个适用于遗传转化或组织培养的单子叶植物胚胎。 

表格1 

n/a：数据无法得到 

本领域中的普通技术人员能够如通过上面的披露物所指示的且在 不需要过多的实验的情况下制造和使用在这里披露和要求的全部材料和方法。虽然已经用优选的实施例和说明性的示例描述了本发明的材料和方法，本领域中的普通技术人员应该明白，可以在不偏离本发明的构思、精神、和范围的情况下变化在这里描述的材料和方法。认为全部对于本领域中的普通技术人员显而易见的这样的相似的替代物和变体属于通过后附的权利要求书更进一步地限定的本发明的构思、精神、和范围。 

Claims (24)

1.一种提供适用于转化或组织培养的单子叶植物胚胎的方法，其包括：

(a)提供包含不成熟的胚胎的单子叶植物种子，在所述种子的果皮内具有开口；和

(b)将流体力施加到所述种子，以从所述种子析取不成熟的胚胎，其中，所述析取的不成熟的胚胎包括胚胎或胚胎的块，适用于遗传转化或组织培养。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括从非胚胎组织分开所述析取的不成熟的胚胎，其中，所述分开的析取的不成熟的胚胎包括适用于组织培养的胚胎。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单子叶植物属于禾本科。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单子叶植物为玉蜀黍种。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述单子叶植物种子包括在至少一个玉米穗上的多个玉米谷粒。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，适用于组织培养的所述胚胎包括完整无缺的胚胎。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，适用于组织培养的所述胚胎包括部分胚胎。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，适用于组织培养所述的胚胎被转化。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组织培养包括再生。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述再生导致形成愈伤组织。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述再生导致至少一个能繁殖的植物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体力包括从流体射流正压力、液体射流正压力、流体剪切力、流体湍流、和流体层流中选择的一个或多个力。

13.根据权利要求2所述的方法，其中，所述分开包括使用尺寸排除、疏水的分开、和密度差异中的至少一个。

14.一种用于机械地制备适用于组织培养的玉米胚胎的装备，其包括至少一个用于引导流体流的孔口，其中，所述流体流接触所述玉米穗上的谷粒并且从所述谷粒析取胚胎，析取的胚胎适用于转化或组织培养。

15.根据权利要求14所述的装备，还包括用于相对于所述流体流运动至少一个玉米穗的装置。

16.根据权利要求14所述的装备，还包括用于从非胚胎组织分开胚胎的至少一个分开器，其中，所述分开的胚胎包括至少一些适用于组织培养的玉米胚胎。

17.根据权利要求15所述的装备，其中，所述用于相对于所述流体流运动至少一个玉米穗的装置使得所述至少一个玉米穗和所述至少一个孔口相对于彼此旋转。

18.根据权利要求15所述的装备，其中，所述用于相对于所述流体流运动至少一个玉米穗的装置使所述流体流沿所述至少一个玉米穗的纵轴线运动。

19.根据权利要求14所述的装备，其中，所述流体流为液体流。

20.根据权利要求14所述的装备，其中，所述流体流为气体流。

21.根据权利要求16所述的装备，其中，所述至少一个分开器包括尺寸排除设备。

22.根据权利要求16所述的装备，其中，所述至少一个分开器通过疏水性从所述非胚胎组织分开所述胚胎。

23.根据权利要求16所述的装备，其中，所述至少一个分开器通过密度差异从所述非胚胎组织分开所述胚胎。

24.一种用于从至少一个不成熟的玉米穗机械地析取多个适用于组织培养的玉米胚胎的装备，其包括从以下部件中选择的至少一个部件：

a)至少一个用于将机械正压力施加到所述至少一个不成熟的玉米穗上的谷粒的外部的坚固的表面；

b)至少一个用于引导流体流的孔口，其中，所述流体流接触在所述至少一个不成熟的玉米穗上的谷粒；和

c)至少一个用于施加负流体压力的孔口，其中，所述负流体压力接触在所述至少一个不成熟的玉米穗上的谷粒；以及

其中，所述至少一个部件将流体力施加到所述谷粒，以从所述谷粒析取胚胎，所述析取的胚胎包括多个适用于组织培养的不成熟的胚胎。

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