CN102816829B - 用于提取植物胚的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于从种子中分离目标植物材料的快速并且有效的方法和装置以及用于提取植物胚的方法和装置。在一个实施方案中，本发明涉及用于从玉米种子中分离出胚的方法和装置。在另一个实施方案中，可以将所分离的胚进行繁殖并且再生成为植物。本发明涉及用于鉴别从玉米种子中分离出的单倍体胚的方法和用于从由玉米种子中分离出的单倍体胚开发双单倍体植物的方法。

Description

用于提取植物胚的方法和装置

此案是申请日为2009年05月22日、中国申请号为200980111685.4、发明名称为“用于提取植物胚的方法和装置”的发明申请的分案申请。

发明人：WilliamPaulBullock

424OliverAvenue

Ames,IA50010

美国公民

发明人：JoshSeverson

2305260^thStreet

Ames,Iowa50014

美国公民

用于提取植物胚的方法和装置

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年5月23日提交的美国临时申请系列号61/128,695的权益，其全部内容通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及使用流体用于从植物中提取组织的方法和装置。该流体包括但不限于液体或气体。更确切地说，该方法和装置是涉及从种核或种子中分离胚。更具体地说，该方法和装置对于从单子叶植物种子例如作物种子（像小麦、大麦、燕麦、玉米、稻、草，等）中生产分离的胚或部分完整的胚是有用的。然而更具体地说，该方法和装置对于生产分离的胚是有用的，这些胚形成植物、它们的子代，和种子。甚至更具体地说，该方法和装置对于生产分离的胚是有用的，这些胚发育成转化的植物、它们的子代，和种子。该方法和装置对于从玉米种子中提取未成熟胚是特别有用的。

发明背景

在研发玉米和其他单子叶植物中，手工提取胚仍然是最经常使用的。用于切除玉米不成熟胚的标准惯例涉及手工提取，一次一个胚。更确切地说，切开并且去除核冠从而露出胚乳组织。使用一种小型仪器例如一种金属手术刀将胚乳组织移到一边并且因此使玉米胚可见并且易于从该种核中取出。这是很慢的过程要求相当的手-眼协调性以及灵巧性从而完全切除有活力的胚。通过使用一种抽吸装置已经有了向这种胚的提取过程机械化的一些改变，该抽吸装置用于从每个种子单个地吸取胚。该过程的机械化受到玉米胚的易碎性所妨碍。自动化该胚切除过程的一次尝试描述于孟山都专利美国专利号7,150,993中，该专利披露了使用真空的方法用一台真空吸气器从每一个单独的种核切除未成熟的玉米胚。尽管这个系统适合于比用手工进行的手术刀的速度稍微增加胚切除的速度，它仍然是非常慢并且乏味的切除过程。对于以对胚完全不产生伤害的方式来切除胚的更快并且更有效的方法仍然存在着一种需要。

发明概述

本发明涉及用于取出(removing)或分离(displacing)目标植物组织的多种方法和装置。本发明的这些方法和装置可以用于任何感兴趣的单子叶植物。优选的单子叶植物包括，但不限于禾本科的成员，包括草类例如草坪草以及谷物作物，例如玉米（玉蜀黍）、小麦、和稻。特别地优选的单子叶植物包括玉蜀黍种，包括玉米(corn)（玉蜀黍），玉米具有通常在玉米穗上成排放置的多个种核（种子）。

在一个实施方案中，该目标植物组织是胚。该胚可能是成熟的，未成熟的，完整的，部分完整的胚或完整的和部分完整的胚的一种混合物。在另一个实施方案中，该方法和装置对于从玉米的穗中取出未成熟的玉米胚是有用的。在另一个实施方案中，该取出的胚可以用于植物组织培养或遗传转化。

本发明还涉及多种方法和装置，这些方法和装置可以用于大量分离单子叶植物胚，例如玉米胚。这些大量分离出的胚可以用于遗传转化或组织培养。在此披露的这些方法和装置对于高通量处理（例如大量地分离大量的目标组织和/或处理大量的种子）是有用的。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于从种子中分离胚的一种装置，包括用于种子的夹持器，用于生成流体流的装置，以及用于将该流体流导向玉米种子的喷嘴，其中该喷嘴连接到该生成流体的装置上。该流体包括但不限于液体、气体、或液体和气体的组合。可以通过任何数目的手段生成该流体流，这些装置包括但不限于泵，压缩机，气压系统和液压系统。在另一个实施方案中，该装置可以包含在外壳内。这可以有助于希望的物质的收集并且在种子物质接触该流体流之后，减少种子物质的飞溅。在又一个实施方案中，感兴趣的种子可以包含在外壳内。该流可以具有一种流体包括但不限于一种气体或空气。

在另一个实施方案中，该种子可以位于植物上，在植物中或从该植物取出。例如，如果该种子是玉米种子，该种子可以位于玉米穗上，或它可以从该玉米穗上取出。玉米穗上的种子可以在该装置中的夹持器上支撑从而使单个的种子更稳定并且使之可接触该流体流。

在又一个实施方案中，本发明的装置可以适配为从大量的种子中分离目标植物组织。该装置对于玉米穗是有用的，因为该装置的喷嘴将流体流同时导向许多玉米种子。本发明的这些方法和装置提供了去除目标植物组织（包括但不限于胚）的一种有效率的、快速的并且有效的机理。

在又一个实施方案中，该夹持器和喷嘴以及该装置的喷嘴彼此相对移动以便将流体流导向在不同位置的多个种子。在又一个实施方案中，该夹持器可以固定到位并且该喷嘴可以相对于该夹持器移动。在又一个实施方案中，该喷嘴可以固定到位并且该夹持器相对于该喷嘴移动。

在又一个实施方案中，该装置包含用于收集分离的胚的收集装置。该收集装置可以是容器，该容器可以收集未成熟的、成熟的或半成熟的胚和/或其他种子内物质。这些胚可以是单倍体或双单倍体的玉米胚。

在本发明的另一个实施方案中，包含一种方法，该方法用于从由玉米种子中分离的胚培育植物的一种方法，包括大致同时地从玉米种子分离多个玉米胚，收集这些分离出的玉米胚，鉴别所希望的胚，并且，将这些胚再生从而形成植物。这种方法可以包括用标志物或通过DNA提取或通过选择试剂测试所希望的胚的步骤。

该发明还涉及一种方法，该方法包括：提供含有目标植物材料的单子叶植物种子（该种子在该种子的果皮或种皮上具有开口），从种子中分离目标植物材料，并且收集分离出的目标植物材料。在又一个实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法包括从一种种子中分离目标植物材料，并且收集分离的目标植物材料。

该方法适合于快速分离大量的胚包括但不限于完整的胚和部分完整的胚。通过使胚早萌发从而发育成植物可以繁殖这些胚。在另一个实施方案中，该繁殖可以是用于从胚的盾片生产胚性愈伤组织，然后可以将该愈伤组织再生成植物，该植物可以是能生育的，并且用于生产下一代的植物和种子。

在另一个实施方案中，该方法允许将分离的胚用于转化胚物质例如它的细胞，盾片，或芽的顶端分生组织。在另一个实施方案中，该方法包含用一种有丝分裂停滞试剂处理一种分离的胚。在又一个实施方案中，该方法包含使胚萌发并且用一种有丝分裂停滞试剂处理该萌发的植物材料。在又另一个实施方案中，该方法包含用一种有丝分裂停滞试剂处理从胚发育的胚性愈伤组织。

在又一个实施方案中，该方法可以用于鉴别从玉米种子中分离的单倍体胚。该方法包含大致同时地从玉米种子分离多个玉米胚，收集所述分离出的玉米胚，并且通过R-nj或R1scm2或两者的盾片表型标志物鉴别单倍体胚。在又另一个实施方案中，该方法包含处理单倍体胚从而诱导双单倍体。

本发明涉及1.用于从种子中分离胚的装置(apparatus)，包括：

(a)用于种子的夹持器（holder）；

(b)产生流体流的装置；

(c)连接到该产生流体流的装置上的喷嘴，该喷嘴用于将流体流导向该种子从而从该种子中分离(displace)该胚。

2.根据项1所述的装置，其中该流体选自：液体、气体、以及液体和气体的组合。

3.根据项1所述的装置，其中该产生流体流的装置选自：泵、压缩机、气压系统、和液压系统。

4.根据项1所述的装置，进一步包括外壳（enclosure），其中至少包含所述种子。

5.根据项4所述的装置，其中所述外壳包含除空气外的流体。

6.根据项1所述的装置，其中该种子是在玉米穗上的玉米种子、并且包含未成熟胚。

7.根据项6所述的装置，其中将该玉米的穗支撑在夹持器上。

8.根据项7所述的装置，其中在该玉米穗上有多个玉米种子。

9.根据项8所述的装置，其中该喷嘴将该流体流同时导向多个玉米种子。

10.根据项8所述的装置，其中该夹持器与该喷嘴彼此相对移动以便将该流体流导向在该玉米穗上不同位置的多个玉米种子。

11.根据项10所述的装置，其中将该夹持器固定到位并且该喷嘴相对于该夹持器移动。

12.根据项10所述的装置，其中将该喷嘴固定到位并且该夹持器相对于该喷嘴移动。

13.用于从玉米穗的玉米种子中分离未成熟胚的装置，包括

(a)用于该玉米穗的夹持器；

(b)产生流体流的装置；

(c)连接到该产生流体流的装置上的喷嘴，该喷嘴用于将流体流导向玉米种子从而从种子中分离胚；以及

(d)用于收集所分离的胚的容器。

14.用于从玉米种子中分离胚的装置，包括：

(a)用于固定该玉米种子的装置；以及

(b)用于将流体流导向该玉米种子以便从该种子中分离胚的装置。

15.根据项14所述的装置，其中该胚是未成熟的或半成熟的胚。

16.用于从玉米种子中分离胚的方法，包括：从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚，并且收集所述分离出的玉米胚。

17.用于从种子中分离胚的方法，包括：

a)将流体流施加在种子上，其中该流体或者是液体、气体、或液体与气体的组合；

b)从该种子中分离出胚；并且

b)收集所述分离出的胚。

18.如项17所述的方法，其中所述胚是双单倍体的玉米未成熟胚。

19.如项17所述的方法，其中所述胚是单倍体的玉米未成熟胚。

20.如项17所述的方法，其中所述胚是二倍体玉米未成熟胚。

21.如项17所述的方法，其中从玉米穗上的多个种子中分离出多个胚。

22.如项21所述的方法，其中该多个胚是完整的和部分完整的胚的混合。

23.如项17所述的方法，进一步包括通过将该胚的早熟萌发（precociousgermination）来繁殖分离出的胚而发育成植物。

24.如项23所述的方法，其中所述繁殖包括从该胚的盾片生成胚性(embryogenic)愈伤组织。

25.如项24所述的方法，其中所述的繁殖包括从植物的所述胚性愈伤组织的再生。

26.根据项17所述的方法，其中所述分离出的胚具有以下胚物质，包括：细胞、盾片、和分生组织；并且进一步包括转化选自下组的胚物质，该组包括：细胞，盾片，或茎端分生组织(shootapicalmeristem)。

27.根据项23所述的方法，其中该植物是能生育的植物。

28.根据项26所述的方法，进一步包括从所述胚物质再生植物。

29.根据项28所述的方法，进一步包括从该能生育的植物获得种子。

30.根据项29所述的方法，进一步包括从如此获得的种子生长植物。

31.根据项23所述的方法，进一步包括从该能生育的植物获得种子、并且从如此获得的种子生长植物。

32.根据项17所述的方法，进一步包括用有丝分裂停滞剂（arrestagent）处理所述胚。

33.根据项17所述的方法，进一步包括用有丝分裂停滞剂处理所述发芽的植物材料。

34.根据项24所述的方法，进一步包括用有丝分裂停滞剂处理所述胚性愈伤组织。

35.根据项28所述的方法，进一步包括用有丝分裂停滞剂处理所述再生的植物。

36.根据项17所述的方法，其中所述胚包含对于转化有用的盾片组织。

37.用于鉴别从玉米种子中分离出的单倍体胚的方法，包括：

(a)从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚；

(b)收集所述分离出的胚；并且

(c)通过R-nj或R1SCM2盾片表型标志物鉴别单倍体胚。

38.用于从由玉米种子中分离出的单倍体胚开发双单倍体植物的方法，包括

(a)从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚；

(b)收集所述分离出的玉米胚；

(c)通过R-nj或R1SCM2盾片表型标志物鉴定单倍体胚；并且

(d)诱导该单倍体胚形成双单倍体植物。

39.根据项38所述的方法，其中该双单倍体植物可以产生种子，该种子用于植物育种。

40.用于从由玉米种子中分离的胚培育植物的方法，包括：

(a)从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚；

(b)收集所述分离出的玉米胚；

(c)通过测试鉴定出所希望的胚；和

(d)将这些胚再生以形成植物。

41.利用生命周期缩短方法将转基因渗入（introgressing）植物的方法，所述方法其特征:

A)将转基因回交入植物，和

B)在未成熟胚阶段收集种子；

C)几乎同时分离（displacing）由所述玉米种子产生的多个玉米胚;

D)收集所述分离的玉米胚;

E)通过检测鉴定所期望的胚,

F)由所述期望的胚形成植物,和

G)对植物授粉并任选地重复步骤(b)-(g)。

42.分离胚以快速育种的方法，包括穗授粉几天后筛选应用具有早期胚的种子（selectingforuseafewdaysafterpollinationoftheearaseedwithanearlyembryo）,自所述种子分离所述胚,将分离的胚置于含有筛选转基因的试剂的介质中，在单个介质筛选步骤中筛选存在至少两个和经常三个或多个转基因胚,使用自筛选的胚生长的植物育种。

43.项42的方法，其中介质包括具有草甘膦，草丁膦，和甘露糖的生长培养基。

44.项42的方法，其中没有一个或多个转基因的胚不能在介质中存活。

45.项42的方法，用筛选的含有下述至少之一的胚育种：草甘膦抗性，和PMI(甘露糖)选择标记，Pat或Bar选择标记或基因。

46.分析育种材料的方法，包括步骤：穗的早期收获，用快速胚提取装置提取胚和分析用于育种的提取材料。

47.项46的方法，包括萌发提取的胚的步骤和发育秧苗的步骤。

48.项46的方法，其中使用筛选介质在授粉后8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20天或更多天分析用于下代的筛选的秧苗。

49.项46的方法，其中早收获，胚的提取和秧苗分析导致育种生命循环相对于种子的早收获缩短一到三周，种子的早收获没有胚的去除，并且种子萌发为秧苗。

50.项46的方法，包括用于分离的胚，或沉默转基因的纯度检测。

51.项47的方法，其中将提取的胚材料置于与介质和/或植物激素接触。

52.项51的方法，其中筛选所述介质和/或植物激素以促进快速萌发，生长和所得秧苗的发育。

53.应用分离的胚的方法，包括下述步骤：授粉几天后，自分离种质收获种子，从所述材料分离胚和分析胚，基于胚的分析生长发育材料，其中胚分析减少种植的植物数。

54.项53的方法，其中胚分析减少检测的，培养的或收回的植物数。

55.项53的方法，其中分析分离的胚用于鉴定，分离或筛选胚或其它内部种子材料。

56.项53的方法，其中授粉几天后自分离的种质收获种子保护收获的种子以免丢失（harvestingseedsfromsegregatinggermplasm,afewdaysafterpollinationprotectsagainstlossofharvestedseed）。

57.项53的方法，其中授粉几天后自分离的种质收获种子导致快速发育后代（harvestingseedsfromsegregatinggermplasm,afewdaysafterpollinationresultsindevelopingprogenyquickly）。

附图简要说明

图.1A外壳以及分配器系统：种子1、喷嘴3、动力冲洗液供给软管(Power-WashSupplyHose)6、分配器喷嘴7、外壳8、穗轴/种子夹持器9、穗轴/穗10、穗轴/穗夹持器手柄11、穗/分配器进口门12、可滑动的板112。

图.1B胚捕获系统：外壳流出管13、收集容器14、洗液流出管15、可去除流体的筛网16。

图.1C.动力冲洗液压系统入口29、无菌冲洗容器31、冲洗压力泵32、紫外冲洗液灭菌器33、冲洗压力表34、出口35、歧管(manifold)36、泵出口(pumpoutlet)37、歧管阀38。

图.2A早熟胚（8D.A.P.）萌发随后进行幼苗发育（胚切除后7天）。

图.2B早熟胚（12D.A.P.）萌发随后进行幼苗发育（胚切除后48天）。

图.3A本发明的一个实施方案示出了手柄、穗、种子物质、流体2、外壳、用于旋转的装置、分配器、喷嘴、侧面对侧面并且旋转的穗的移动性、收集点。

图.3B本发明的一个实施方案示出了并联的穗分离机理，在4个穗上（可以使用任何的倍数）每个穗150个胚，喷射时间3分钟，在一个小时(anhour)中产生了12,000个分离的胚。这个实施方案还示出了自动化的手柄、穗、种子物质、流体、外壳、用于旋转的装置、分配器、喷嘴、旋转的穗的移动性、收集点。

图.3C本发明的一个实施方案示出了手柄/夹持器、穗、种子物质、流体、外壳、用于旋转的任选的装置、喷嘴、收集点。

图.4.从用本发明切除的早熟萌发的18-20D.A.P.的胚得到的年幼的玉米幼苗。P.W.I.E.E系统用于胚切除。

图.5从该动力冲洗分离系统得到假定的单倍体植物。所有植物（胚切除后约35天）先前用一种有丝分裂停滞试剂进行处理。

图.6使用从源于动力冲洗的胚拯救的植物得到的花粉在对照植物上种子的生成。

图.7在源于动力冲洗的胚拯救的植物上能生育的雄花穗的生成。

发明详细说明

定义

在本披露中数字范围是近似的，并且因此可以包括该范围之外的数值，除非另外指明。数字范围包括从最低值到最高值的所有的数值并且包括该最低值和最高值（以单位的增量），前提是在任意低值和任意高值之间有至少两个单位的差别。作为实施例，如果组合的，物理的或其他的特性像例如分子量，粘度，熔融指数，等是从100到1,000，它旨在使所有单个的值，例如100、101、102，等，以及亚范围，例如100到144、155到170、197到200，等，清楚地列举出来。对于含有小于一或含有大于一的分数（例如1.1、1.5，等）数值的范围，适当时一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。对于含有小于十（例如1到5）的一位数的范围，一个单位通常被认为是0.1。这些仅仅是确切地想要的实施例，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合将被认为是在本披露中清楚地说明了。在本披露中提供了数字范围，它们用于，除其他事物之外，混合物中组分的相对量，以及在这些方法中所述的不同的温度和其他参数范围。

术语“分离”指处理目标组织（例如胚或其他组织的外植体），该目标组织保留在更大的组织复合物（例如种子）中或形成更大的组织复合物（例如种子）的一部分，以便将该目标组织从至少一半的该更大复合物进行物理分离。在某些实施方案中，该分离的目标组织可以是从至少约50%、60%、70%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的该更大的复合物，或其任何分数进行物理分离。在其他实施方案中，从多于约80%到约100%、约90%到约100%、或约99%到约100%的该更大的复合物，或期间任何分数分离目标组织。在一些实施方案中，可以从约100%的该更大的复合物分离目标组织。

本发明涉及可以用于提高从种核切除目标植物材料的效率的多种方法和装置。本发明的这些装置和方法可以用于快速切除并且分离完整的胚或部分完整的胚。大多数这些胚能够发育成能生育的种子，从而生成植物。

使用本发明的这些方法和装置从种子快速分离大量的有活力的胚。这些方法和装置对单子叶植物（包括玉米）工作良好。本发明的这些方法和装置提供了用于快速切除并且分离大量的完整的或部分完整的，大部分有活力的成熟的或未成熟的胚的一种装置。在其他实施方案中，本发明的方法和装置提供了用于分离感兴趣的其他种子内物质的一种装置。

该目标植物材料可以是任何希望的物质包括但不限于未成熟的胚，成熟的胚，部分的胚，完整的胚，以及胚和其他植物材料的一种组合物。该方法可以用于大致同时地从种子分离多个胚。一种流体流可以用于分离胚。该流体流包括但不限于液体，气体，或液体和气体的组合。

用于提取胚的装置

本发明涉及一种装置，该装置包括压力源，和流体冲洗源。该压力源可以是泵系统，压缩机，气压或液压系统，或能够提供加压流体的任何其他装置。该流体可以是气体，液体或这两种的某种组合。在另一个实施方案中，该装置进一步包含分配器以便将该流体冲洗流出的流导向到种子上。另外，该装置可以包含种子或穗的夹持器。该流体进入未修饰的或修饰的种子中，例如裂开的种子，并且从该种核中分离胚和其他种子内物质。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于提取一种植物胚的装置，包括：一种流体的压力源，其中该流体被导向到种子上从而可以分离出种子内物质，以及用于收集所希望的种子物质的一种收集装置。一种压力源包括但不限于泵系统，压缩机，气压或液压系统，或能够提供加压流体的任何其他装置。该流体可以是气体，液体或气体和液体的组合。

在另一个实施方案中，该装置进一步包含一种分配器以便将该流体导向到种子上。该流体接触种子，该种子可以在某些方面未作修饰或者做了改变，并且从该种子分离胚和其他种子内物质。

本发明还涉及用于提取胚的一种装置，包括：用于种子的夹持器，一种生成流体流的装置，以及用于将该流体流导向种子的一种喷嘴，其中该喷嘴连接到生成该流体的装置上。该种子可以是提取胚所希望的任何种子，包括但不限于玉米、小麦、大麦、燕麦、稻、和草。

该夹持器可以由任何适合的材料制成，包括但不限于铁、钢、特氟纶(Teflon)、复合材料(composites)、钛、铝、镍、铜、锡、塑料、聚氯乙烯，以及聚烯烃。该夹持器可以配置成适合于固定种子或含有种子的植物的形状（confine）包括但不限于圆形，矩形，正方形，三角形，八角形以及五角形。

该夹持器可以用于限制该种子，在植物上包含的一种种子，或在花上包含的一种种子。例如，在将该种子放入该夹持器之前可以从该玉米穗取出玉米种子。在另一个实施方案中，可以将该玉米穗放在该夹持器中。

在另一个实施方案中，在将该种子放在该夹持器中之前可以对该种子进行改变从而暴露胚。玉米胚和胚乳包在在玉米穗上生成的玉米种子中。该种子或种核保护该种子内物质包括脆弱的胚。为了从种子中提取胚，将种冠或顶部进行手工或机械地去除或切开以将胚暴露出来。可以以不同的成熟度和大小切除胚。胚的大小（以毫米测量）是年龄，亲本基因型以及环境的函数。如果不采取足够的注意，在分离过程中可能损坏胚。授粉后（D.A.P.）5-11天范围内的小的未成熟的胚通常比12天或更多D.A.P的更老的和更大的胚更脆弱。使本发明的这些方法和装置改善到足以分离时十分有活力的成熟的或小的不成熟的玉米胚。

在另一个实施方案中，在将该穗插上该夹持器之前，准备用于提取胚/种子物质种子。可以使用手术刀切下核冠（顶部）从而在较小的阻力下动力冲洗可以穿透该种核的内部。

通过从种子去除种冠(seedcap)，流体的压力仅需要足以从种子的腔中分离胚即可。加压的流体不需要具有适配为劈开种腔的强力。强力劈开流体压力可以降低通过本发明分离的有活力的完整胚的百分比。如果该胚不是所希望的物质，可能增加流体压力并且避免去除或切下种冠。这可能要求这种压力的水平是脉冲或改变的。

用于生成一种流体流的装置包括但不限于泵，压缩机，气压系统和液压系统。该流体包括但不限于液体，气体，液体和气体的混合物，以及一种凝胶。该液体或气体可以是对植物材料不造成损害或产生负面影响的并且在室温下是气态或液体的任何液体或气体。该气体可以是两种或以上气体的一种组合或混合物。最常用的气体是空气。最常用的液体是水。

该液体或气体可能容易受适合于影响该植物材料的其他化学品、组分、流体、分散的固体或溶液所浸染。例如，单子叶植物的种子和多数植物的种子已经将胚包被在一种保护性的外壳中。由于任何数量的潜在的细菌或真菌污染，将受保护的组织暴露于外部环境可能导致胚生活力的丧失。解决这种忧虑的一个办法是使用一种抗生素或杀生物剂，例如植物防腐剂混合物或抑制细菌和/或真菌在流体中生长的化合物的某种混合物。例如，消毒剂、抗细菌或抗真菌组分和/或减少该植物材料污染的组分，或增加生活力，胁迫耐性，或生长习性或该植物材料的生长或细胞分裂速度的组分可以用于本发明的流体中。这些措施有助于减少污染的作用。

该流体至少是一种要素(element)，该要素可以用于将暴露的胚从种子或种核中分离出。在一个实施方案中，将该流体从一种或多种装置释放并且导向这些种子。该流体可以从流体分配装置强力地推进。该流体分配装置可以包括适配为将该加压流体导向到含有所希望的一个或多个胚的切开的一个或多个种核的一种固定的或定向地可旋转的一个或多个喷嘴或一个或多个喷射口。

用于这些种子的流体的量和力足以将该目标植物材料（例如一种未成熟的胚）从这些种子中分离出来。可以将流体连续地或同时施加到多个种子上。使用的流体可以是连续的或非连续的（例如，脉冲的或波形的力）使用的流体的量优选地足以克服目标物（例如胚）和非目标物（例如非胚组织例如胚乳）来自彼此的粘附力，从而允许分离该目标物和非目标组织。可以使用任何适合的一种流体或多种流体用于从它的种子中取出目标组织，并且可以组合地，顺序地或同时地使用多种流体。

通过一种流体通过单独地或组合地使用如下的任意一种可以取出胚或其他希望的物质：一种固定的，可移动的，或可旋转的分配器，穗或喷嘴。固定的意指将它固定在特定的位置。可移动的意指能够在X、Y、或Z轴上，或在这些轴的两个的一种组合上移动。可转动意指能够通过该X、Y、和Z轴移动，例如以圆形或螺旋形的方式移动。

在另一个实施方案中，用于产生一种流体流的装置是一种固定位置的分配器，从而该分配器仅指向方向但适配于环绕该穗旋转，而该穗是固定的或可移动的。在另一个实施方案中，用于产生一种流体流的装置是一种分配器，该分配器是可移动的并且环绕该穗旋转，而该穗是固定的或可移动的。在另一个实施方案中，用于产生一种流体流的装置是一种分配器，该分配器是固定的或可移动的并且环绕该旋转的穗旋转，而该分配器上的喷嘴是固定的，可旋转的或可移动的。在另一个实施方案中，用于产生一种流体流的装置是在固定位置上的一种分配器，其中穗也在固定位置上，其中该穗或分配器两者都是可移动的。许多其他的排列组合是同样有用的并且在本发明的范围内。

分配器喷嘴或喷射口的类型可以在直径和长度上改变从而适合于从种子中切除在不同的发育阶段的胚。在一个实施方案中，喷嘴可以含有小的圆形的孔口或口。该分配器可以具有锥形末端并且可以根据需要就从分配器喷嘴的顶部到种子的距离向上或向下放置。

在另一个实施方案中，该流体可以加压。该流体可以在产生流体流的装置中加压或可以将该流体引导到单独的装置中，在该装置中可以将该流体加压。来自压力源使用的压力的量可以通过该分配器改变。可以使用引起胚从种子中的分离和取出而不会产生不使希望的植物材料的任何压力。有用的动力冲洗输出量（每平方英寸的磅数（p.s.i.））可以是范围从约20-150，包括20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145以及以外的量。基于在此披露的传授的内容，本领域的普通技术人员应当知道仅仅在常规实验下改变该分配器的大小，分配器喷嘴开口的直径和形状，流体的量和形式，装载流体从而提取这些胚的管子的直径或长度以及从种子分离这些未成熟胚的压力将是有可能的。在每个这些实施方案中，该流体喷雾有效区域以及力足以适用于胚取出。多数的所希望的种子物质通过流体的力从腔中冲洗下来。这些冲洗下来的物质当从穗上脱离后随后进行收集。

在另一个实施方案中，该装置可以另外包含可以用于获得该目标植物组织的一种分离装置或一种过滤器。该冲洗流体可以含有所希望的物质，例如未成熟的胚，和其他的不希望的物质，例如胚乳，颖片，以及种皮或果皮组织。通过一种或多种适合的技术可以实现分离，包括但不限于通过大小排除的分离（例如，通过一个或多个过滤步骤的过滤），基于疏水性，亲水性，亲油性，或其他吸引力的分离，以及通过质量或密度差异的分离（例如通过离心、沉降、和倾析的分离）。该分离的一个步骤或多个步骤可以是任选的，例如当它们用于组织培养时不需要另外分离完整的或部分的胚。

在另又一个实施方案中，该装置可以另外包含一种杀菌装置。在一个实施方案中，该杀菌装置可以用于在接触种子前对该液体，气体或液体和气体的组合进行杀菌。在另一个实施方案中，该杀菌装置可以用于使细菌和真菌孢子不能存活，它们可能与该目标植物组织或该液体或气体有关。任何方案或装置可以用于对该冲洗液体进行杀菌，前提是使该细菌和真菌孢子不能存活，并且该目标植物组织不受影响。该杀菌装置包括但不限于发射紫外线辐射、X-射线、微波等离子体辐射、电子束辐照、以及辐射的装置。此外，该杀菌装置还由可去除细菌、真菌和病毒物质的一种过滤器构成。可以使用不同大小的一种或一种以上的过滤器。

在下文中，除非另外指明本发明的分配器和穗被认为是固定的，可旋转的或可移动的或在这些参数之间可切换的。在一些实施方案中该分配器和穗同时从种子中取出胚，在其他的实施方案中从该穗中同时取出至少两个或以上胚。一些实施方案可以设想从该穗中同时取出多数（即使不是所有的）的胚。

在图1A中所示的一个实施方案中，该穗轴/种子夹持器9夹住玉米穗10并且旋转该穗并且从而该种子/种核一个或多个种核1经过该冲洗分配器的一个或多个喷嘴7。另外地，该一个或多个分配器7是可移动的从而当玉米穗旋转时可以将该流体2导向到玉米穗10的不同的区域。该穗的旋转可以在任何轴上，包括长轴或短轴。可替代地，该旋转可以是该分配器的旋转。在又另一个实施方案中，该轴和分配器在X，Y和Z轴的至少一个上都可以是可移动的。分配该流体2从而取出该穗上的感兴趣的这些种子的内部物质。

更确切地说，图1A示出了一种流体供应管6，它连接到分配器7上，该分配器可以连接喷嘴3，该喷嘴被适配为用于接合到该分配器上。该分配器7可以导向到或调整外壳8内的流体2。该流体供给软管6连接到一种流体源上。该流体2可以储存在罐，圆柱体，用于储存气体的容器，用于储存液体的容器或任何其他适合的储存装置中。该流体供给软管6可以具有任何希望的长度并且可以由任何适合的材料制成，包括钢，塑料，铁，橡胶，和聚烯烃。如图1A中所示，通过该外壳8的顶部的开口将该流体供给软管6插入该外壳8中。然而，通过该外壳的一侧或通过该外壳8的底部可以将该流体供给软管6插入该外壳8中。

在图1A中所示的一个实施方案中，将该穗或穗轴10固定在穗轴/种子夹持器9上并且通过该穗轴/穗夹持器手柄11旋转。该手柄11可以适配成机械旋转或手动旋转。通过本领域中已知的任何装置可以实现机械旋转包括但不限于使用电动机，气动机，小型发动机，电的动力源，电池，气体的动力源，丙烷发动机，和由水提供动力的发动机。

如图1A中所示，在至少一个实施方案中，将该穗轴/穗夹持器9设计为插入该外壳8中，从而使该穗轴/穗夹持器9的一部分置于该外壳8的外面。在又另一个实施方案中，该穗轴/穗夹持器可以设计为使该夹持器的一部分置于该外壳的两端的外面。可以对称地设计该穗轴/穗夹持器9从而该夹持器9的类似的长度置于该外壳的两侧的外面。在另一个实施方案中，可以将该穗轴/穗夹持器9设计为该夹持器9只有一端置于该外壳8的外面。

图1A描绘了连接到该穗轴/穗夹持器9上的一种手柄11（它是可任选的）。可以将手柄11置于该穗轴/穗夹持器的两端或置于单一的一端。

图1A中所示的该具体的外壳具有进口门12用于插入该穗或这些种子。在该实施方案中的流体分配器7连接到可配合地接合到该外壳中的可滑动的板112上。该板允许该流体分配器7的移动，这保持了流体喷雾在该外壳8中。

该外壳8可以是任何尺寸的包括但不限于圆形、正方形、矩形、三角形、八角形、椭圆形、五角形、六角形、平行四边形、菱形、鸢形(kite)、和梯形。该外壳可以是任何大小包括但不限于2X2、2X3、2X4、2X6、2X8、3X3、3X4、3X6、3X8、4X4、4X6、4X8、5X5、5X6、5X8、6X6、6X8、以及8X8英尺。该外壳8由单一件材料或多件材料制成。该外壳8可以由塑料、纤维玻璃、玻璃、橡胶、聚烯烃、聚乙烯、聚苯乙烯、HDPE、和木材制成。该外壳可以能够在任何位置开口包括但不限于顶部、底部、右侧和左侧。

图1B描绘了一个实施方案包括用于分离该冲洗液体，未成熟的胚，以及其他种子部分的一个或多个筛网或过滤器。该流体从该种子1中冲洗出该种子的胚4，与许多其他残留的种子部分一起，流入该外壳8中。该外壳8具有外壳流出管13，它将该流体2以及胚4和种子部分排出至该收集容器14中。在该实施方案中，该容器14包括流体可渗透的筛网16，当流体2流过该容器14时它根据大小捕获胚4和种子部分。然后使清洁的流体2从该容器14流入该冲洗液流出管15用于或者排放或者循环再利用。

一种流体可渗透的筛网可以是任何材料或装置，它将希望的物质与不希望的物质分开，包括但不限于过滤器、膜、筛、网状物、网、滤纸、whatman滤纸、布、粗棉布、以及其他过滤或蒸馏装置。该流体可渗透的筛网可以基于大小，形状，流动强度，或上述这些特性的任意组合进行分离。该流体可渗透的筛网可以是一种过滤器包括但不限于重力过滤器、压力过滤器、侧向流过滤器、表面过滤器（在压力下操作的单途径系统）、深度过滤器、以及连续旋转过滤器。

图1B显示该外壳有助于将这些分离出的种子部分（包括未成熟的胚）引导到特定的位置。将这些种子部分引导到该外壳中的开口处，含有该未成熟的玉米胚以及其他种子部分的冲洗液可以通过它进行收集或流过。这些种子部分是从该开口或流出软管可收集的。在本发明的又另一个实施方案中，可以将这些种子部分累积到适合于收集这样的物质的收集容器中。

在图1C中所示的实施方案中，存在可以用于使细菌和真菌孢子失去活性的紫外杀菌系统，以及用于调节气体或液体或每一个的混合物的压力（20-150p.s.i.）或流量或流速的装置，以及一种分配器喷雾装置，它可以包括一种软管、分配器、和/或喷嘴。在一个实施方案中该分配器装置在特定的方向上是可移动的，或可以编程为一种特定的喷雾方式，具有或者稳定的、平稳的、脉冲的或可变的速度。

用于生产加压流体（或者液体或者气体或者混合物）的不同的方法在本领域中是已知的并且本叙述并非旨在将本发明限制于这种方法。图1C描绘了由本发明的一个实施方案中使用的该流体压力系统30。该流体2是无菌水，它储存在容器31中，邻近于该压力泵32，紫外流体灭菌器33，流体压力表34以及岐管36。

流体2流入容器31的入口29，在该容器中储存该流体2。然后该流体移动通过出口35进入泵32，并且穿过该泵流出口37进入灭菌器33中。该流体2流过该紫外灯，流出该灭菌器流出口31至岐管36。用岐管阀38将该流体2释放进入供给软管6中用于流体分配。

该泵32可以是有效地移动和/或加压该流体的任何类型的装置包括但不限于正排量泵(apositivedisplacementpump)、高压泵(ahighpressurepump)、气动泵(air-operatedpump)、波纹管泵(bellowspump)、隔膜泵(diaphragmpump)、挠性叶轮泵(flexibleimpellerpump)、旋片泵(rotaryvanepump)、挠性套泵(flexiblelinerpump)、PTFE章动盘泵(PTFEnutatingdiscpump)、螺杆泵、柱塞泵、压力冲洗泵、以及喷雾嘴泵(progressingcavitypump,plungerpump,pressureswasherpump,andaspraynozzlepump)。

该压力表34可以是任何类型的压力表包括但不限于直接读数型压力表、间接读数型压力表、传统的压力表、充填式压力表、以及商用压力表。压力表可以从多种商业来源得到包括OmegaEngineering（Stamford,Connecticut）。

图3A-C中的以下实施方案中显示了通常地不同的装置设计。图3A示出了正在移动穿过该分配器的一对旋转的玉米穗。图3B示出了在用分配器喷雾的同时适配为旋转的多个穗。图3C示出了玉米穗，与具有分配器环绕该穗的外部的外壳，该环绕是以该穗及该分配器均无须需要移动的方式。可将一穗玉米放置其中的外壳可以适配为控制任何偏转的流体喷雾。在图3C的可替代的实施方案中，该外壳与该分配器是一体的。在图3C中，该分配器或该穗或两者可以或者以相同的方向或者以相反的方向旋转。因此，如果该分配器旋转，该外壳的内部可以旋转。因此，该实施方案具有或者固定的分配器或者允许移动，和/或旋转或者该穗或者该一个或多个分配器，或该穗和该一个或多个分配器两者的装置。另外，这些实施方案中任何一个可以具有运输系统，它在自动化的系统中将多个穗移动与该流体冲洗液接触。

图3A-C示出了本发明的装置的不同的实施方案。图3A中，通过旋转的夹持器9夹持该玉米穗或穗10。这些穗10可以手动旋转或通过动力源进行机械旋转。释放流体2的这个或这些喷嘴3的方向可以适配为可移动的，可旋转的或固定的。在该实施方案中，该分配器7和/或该这些喷嘴3可以成角度。夹持器9的旋转允许该穗旋转从而所有的种子可以出现在该分配器前。在另一个实施方案中，该加压流体的力既可以用于冲洗出种子内部物质并且由于这种冲洗的向量性也可以用于沿旋转方向移动该单个穗/多个穗的这两个目的。

流体2可以是一种气体或液体或这两者的一种混合物。可任选地，可以将多个喷雾装置/分配器7引入到本实施方案中。这些喷雾装置7可以固定或是可旋转的并且定向地可移动的，其中穗10是固定的，可旋转的或可移动的。另一种任选是其中这种或这些分配器7可以环绕穗10旋转，其中该穗也是旋转的，如图3B中所示。

在图3B中，将这种或这些分配器7置于圆柱体、环、壳或外壳样装置之中，其中喷嘴3或喷射口3被适配为对该穗10上的种子1的所有侧面强力释放流体2。在操作中，该分配器环绕该穗并且从该穗的一端移动到另一端。在另一个实施方案中，该穗移动穿过分配器，其中该分配器不是必须移动的。在又另一个实施方案中，该穗和该分配器两者可以移动。因此，该装置可以具有一个或多个喷嘴3或喷射口3并且这些喷嘴可以下移到该穗10处，或该穗10可以旋转和/或移动到这些喷嘴3中或两者能够以相同的或相反的方向移动。在这个实施方案中，将喷射口3或喷嘴3可以直接地或间接地由动力源提供动力。

在另一个实施方案中，该装置可以具有环绕这个或这些穗10放置的多个分配器喷嘴3或喷射口3并且这些喷射口3以及穗10均不要求旋转。该喷射表面积足于覆盖该穗10。

图3C示出了又另一个实施方案，该实施方案具有填满喷嘴3的环绕的外壳，这些喷嘴环绕该穗同时将加压流体2导向这些种子1。该圆柱体（或可替代地盒样的外壳或外壳）可以是固定的，其中将这些穗被运输穿过这圈流体2。在另一个实施方案中，该圆柱体（或可替代地盒样的外壳或外壳）可以是旋转的，其中将这些穗被运输穿过这圈流体2。在又一个实施方案中，该穗可以是固定的，其中该圆柱体环绕该穗10旋转或沿该穗10移动。在许多实施方案中，将该喷雾稍微导向到该外壳的底部从而易于使该种子物质从该穗10脱离并且进入该收集容器14中是有用的。

在这些实施方案中，通过该流体2的力将所希望的种子物质从该种腔中冲洗入容器14中。也可以通过穗的旋转力的辅助将该种子物质冲洗下来。这些冲洗下来的种子物质40，当从穗10上脱离后随后进行收集。

然后将收集的种子物质40进行筛选或过滤，从而定位该胚物质40。在一些实施方案中，该胚物质4将是所希望的目标植物材料。

在又另一个实施方案中，所希望的目标植物材料可以是非胚物质。由于多种原因的任意一种，可以收集非胚物质。它对于分析，或测试或收集蛋白、淀粉、或其他种子物质包括位于该非胚物质中的转基因物质可能是有用的。可替代地，可以收集该非胚和胚物质两者。这些穗的位置，该外壳的形状以及该分配器喷雾装置可以适配为将该脱位的种子物质导向限定的区域从而有助于收集。通过使用适配为将所希望的物质从不希望的物质中分离出来的筛网可以在收集容器中收集这些分离的胚和其他种子物质，如图1C中所示。

图1B是图1A的侧面图，没有穗和手柄。该外壳的下部包含该种子材料捕获系统40。该种子材料捕获系统40包含允许将该种子材料漏到该收集容器14中的外壳流出管13，该收集容器包含冲洗液体流出管15用于收集使用过的分配的流体。

可以使用该外壳的底部的托盘来收集该脱位的植物种子物质。此后，如果该种子物质需要分离则可以使用筛选或重量分离系统。

用于提取胚的方法

本发明涉及用于从种子中分离胚的一种方法，包括向种子施加一种流体流，其中该流体或者是一种液体、气体或者是液体和气体的组合，从该种子中分离胚，并且收集该分离出的胚。在又一个实施方案中，本发明涉及用于从玉米种子中分离胚的一种方法，包括：从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚，并且收集所述分离出的玉米胚。使用本发明的方法可以有效地并且快速地分离任何数目的胚。本发明的方法可以用于分离一种双单倍体、一种单倍体、或一种二倍体未成熟的胚。

在此描述的方法和装置可以与使用种子中物质的多种另外的方法一起使用。这些另外的方法包括单不限于用于转化内部单倍体种子物质、二倍体种子物质或单倍体和二倍体种子物质的一种组合，形成用于植物再生的愈伤组织；再生单倍体/双单倍体植物材料；或用于分析在该内部物质中发现的遗传物质、油、蛋白、淀粉、外来数据等。这些方法的每通过由一种流体产生的力通过快速切除种子物质（包括胚）来改进。

本发明的方法包括一种玉米转化系统或一种愈伤组织生产系统或如果这些胚的一部分怀疑是单倍体胚则包括一种染色体加倍系统。该分离转化系统适配为生产转化的植物材料。该分离的愈伤组织生产系统适配为生产植物愈伤组织。用于该染色体加倍系统的分离的胚适合于生产一种双单倍体植物材料。可以将该分离的物质在用于诱导早萌发，或用于产生所希望的细胞或DNA，在体外筛选，以及生命周期缩短的过程中。

转化

本发明可以用于植物，这些植物不必诱导单倍体，由于存在或缺少颜色标志物可以对它们进行选择或丢弃。当用于转化的目的时，这些植物可以是单倍体或它可以是种质（近交的或杂交的）。植物转化是通过已知的方法例如粒子轰击、whiskers法、电穿孔或农杆菌将遗传物质引入到不同的可转化植物组织中的一种方法。一种希望的可转化的组织是在分离出的未成熟的玉米胚中可得到的未成熟的玉米盾片。该动力冲洗分离是用于快速分离大量的未成熟胚的一种方法。因此，总的实验室转化生产量可以增加，但是降低了成本和劳动。然而，由于这些胚的小的尺寸，它们可能很难在该种子内物质的碎片中被找出来，除非使用适当的分离和鉴别方法。

当在该分离出的未成熟的胚上进行转化时，可以使用遗传物质例如构建体、质粒、载体、转基因、染色体以及类似物从而提供给该胚中的植物材料以多种不同性状，例如对除草剂、昆虫、病毒、细菌、真菌、线虫、干旱、热、冷、冷冻、过分的潮湿、盐的应激、以及氧化应激的抗性或耐受性（或如果希望的易感性）、应激耐受性或增加的农业值的性状像产量、湿度、保绿性、茎强度、外观、雄性不育、干透、直立能力（standability）、或不同的产品特征（productprofiles）例如淀粉、油、蛋白、乙醇生产潜力、氨基酸组成、以及类似物。

可以从转化的植物的种子中分离未成熟的胚。可以进一步测试这些胚从而证实该遗传（合成的或另外仍然定义为遗传的）物质的稳定整合。通常，被转化的遗传物质具有事件(event)，该事件包括某些类型的标志物（该标志物可以是目标转基因或一种另外的转基因），这允许从所不希望的物质中区别出所希望的物质。可以使用不同类型的标志物包括可筛选的标志物例如编码荧光素酶、珊瑚基因或β-葡萄糖醛酸酶uidA基因（GUS）或可选择的标志物可以包括甘露糖选择（P.M.I.）、对抗生素例如卡那霉素、潮霉素B、庆大霉素的抗性或对除草剂例如草丁膦(glufosinate)（bar或pat基因）以及草甘膦(glyphosate)（EPSPS;CP4）的抗性以及对于本领域中的普通技术人员已知的其他的物质。不同的标志物示于美国专利号5,767,378、5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中，所有这些专利通过引用结合在此。

转化方法、用于胚性愈伤组织诱导的方案，以及染色体加倍方案对于本领域中的普通技术人员是已知的。虽然如此，将这些方法的以下传授的内容列出并通过引用用于由来自植物的物质制备愈伤组织的方法结合在此，这些植物包括玉米美国专利号7,067,719、6,730,824、6,143,563、5,134,074；通过将DNA引入一种植物的基因组中转化植物，包括本领域中已知的许多已知的方法例如在美国专利号5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861、6,403,865中的微粒轰击，在美国专利号5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840和6,384,301中传授的农杆菌介导的转化；在5,302,523；和5,464,765中传授的Whisker转化。

愈伤组织以及幼苗的生成

本发明分离的胚可以形成愈伤组织或提供萌发以及幼苗发育。为了实现此目标，将分离的胚物质置于与植物组织培养基例如由Murashige和Skoog（M.S培养基）、或Chu等人（N6培养基）、或Gamborg等人（B5）描述的那些或其他组织培养盐混合物或水培（Hoegland）溶液，包括碳水化合物源（例如，蔗糖、麦芽糖，等）接触。这些有助于产生的幼苗快速萌发、生长并且发育。另外地，将一种或多种细胞分裂素（例如，激动素、玉米素、6-苄基氨基嘌呤、噻苯隆(thidiazuron)）或茁长素(auxin)（例如，2,4-二氯苯氧基乙酸、α-萘乙酸、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸）或赤霉酸（例如GA3）植物激素或植物激素的不同组合包括在该植物培养基中持续给定的一段时间来1）诱导胚性愈伤组织从盾片或胚轴发育或2）在芽顶端分生组织中影响细胞分裂或3）增强得到的幼苗的生长以及发育应该是有可能的。该诱导的胚性愈伤组织可以转化和/或再生从而形成植物以及种子。可替代地，如果希望，该分离的胚的这些细胞、盾片、芽顶端分生组织或该胚本身可以进行遗传改变。可以将这样的物质进行转化、诱变、化学处理或类似的处理并且然后使用从而再生一种植物，优选地一种能够产生花粉以及种子（除非不育是希望的改变）的植物。

分析

可以直接分析动力冲洗分离的胚以及其他种子内物质。该分析可以用于胚或其他种子内物质的鉴别、分离和选择。种子的表型例如该种子物质的糯性（waxy）、高或低植酸、油、蛋白、氨基酸、或其他淀粉的质量或独特地与存在或缺少转基因相关联的表型。

培育

培育的方法包括以下步骤，即：早期收获穗，使用一种快速胚提取装置例如在图中所示的动力冲洗机提取胚并且分析所提取的物质用于选择。快速培育方法的方法实施方案包括通过将胚置于培养基中用具有对于这些转基因选择的试剂来选择胚中的转基因。已经发现在单独的培养基选择步骤中可以选择这些早期胚找到存在至少两种并且通常是三种或以上的转基因。例如如果希望的是三个转基因在该胚中并且在分离物质中的这些转基因可以具有一种草甘膦抗性基因，以及与一种疾病相关的一种PMI（甘露糖）可选择的标志物或昆虫抗性基因，以及一种Pat或Bar可选择标志物或基因，通过将该胚置于培养基上可以鉴别出所希望的三个转基因物质，该培养基包含生长培养基包括草甘膦、草丁膦、以及甘露糖。带有这三个标志物的胚将存活并且不具有一个或多个这些基因的胚将不能存活。因此具有这三个基因的培育物质或玉米系可以鉴别出来并且选择用于该穗的授粉后几天内进一步的使用。

本领域中的普通技术人员应该理解任意数量的其他可筛选或可选择标志物以及相关的试剂、除草剂、抗生素等可以用于筛选不同的转基因。如果在本发明传授的内容的范围内有用于选择或筛选该转基因的任何手段，则在该胚中可以鉴别任何类型的转基因。

在授粉后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或更久的时间内通过使用选择培养基可以鉴别幼苗的下一代。相对于没有将胚去除并且萌发成幼苗的早期收获的种子，该培育的方法可以将培育时间缩短一到三周。本领域中的普通技术人员应该理解用于同时胚提取的装置可以在培育周期内显著地减少时间和劳动。这种方法还允许种系的纯度测试的一种方法，这些种系可能不期望分离，或具有沉默的转基因。

幼苗形成

本发明分离的胚可以萌发并且经历幼苗发育。为了实现这个目标，该分离的胚物质被置于与植物组织培养基接触中或潜在地包括植物激素例如上述在转化章节中描述的那些。选择这些培养基和/或植物激素从而有助于最终幼苗的快速萌发、生长以及发育。可替代地，如果希望，再生的起始可以等待并且这些细胞、盾片、芽顶端分生组织可以进行遗传测试或遗传改变。可以将这样的物质转化、诱变、化学处理或类似的处理并且然后使用从而再生一种植物，优选地一种能够产生花粉以及种子的植物（除非不育是希望的改变）。

分析

可以直接分析动力冲洗分离出的胚以及其他种子内物质。该分析可以用于胚或其他种子内物质的鉴别、分离和选择。可以测定该种子的基因型和/或该种子的表型例如该种子物质的糯性、低或高水平的脂肪酸、淀粉酶、不育、高或低植酸、油、蛋白、氨基酸、或其他淀粉的质量或独特地与一种转基因存在或缺少相关联的一种表型。基于这些测定，可以对某些胚进行选择或舍弃。这种非常早期的种子的分析提供了基本的培育时间、工作量、生产成本、土地使用、以及总的培育速度和效率。在授粉后几天内在该培育过程中通过从分离的种质中收获种子，该培育过程花费显著地更少的时间而发育成有用的玉米物质。如果天气条件不理想，该早期收获窗口（window）可以提供需要的灵活性从而更快地发育子代并且从而保护该种子收获。一旦收获该穗，可以从该物质中提取这些胚并且非胚物质例如果皮（母本DNA）和胚乳可以鉴别并对其进行所希望的基因型或表型测试。基于该种子材料或它的DNA的这种测试或其他分析可以对培育物质进行选择。这种早期选择减少了种植、测试、培养或在随后的季节中收获的植物的数目。

双单倍体

一种非常大的改进的未成熟玉米胚提取系统在收集单倍体物质的过程中是重要的步骤。就标准的胚切除方案而言，玉米的平均大小的穗可能要求普通的实验室工作者无论怎样要花费从20分钟到40分钟的时间来从单独的穗单个地提取并且培养所有胚。然而，使用该动力冲洗分离系统将胚的分离（穗加工时间）减少到约1-3分钟/穗。

胚提取效率对于单倍体玉米染色体加倍方法（包括双单倍体培育方法）是重要的。这是尤其合理的，因为单倍体胚诱导的频率通常很低。例如，多种蛋白体诱导物例如KEMS、ZMS、WS14、K.H.I.、RWS、RWK-76、Stock6、等在单倍体诱导率上有变化，通常范围从约2%到10%。为了检测该诱导的单倍体种子，将使用花色苷基因的一种表型标志物系统结合到该单倍体诱导物父本中。要求多种调节（C1/Pl1和R1/B1）和结构基因（A1、A2、Bz1、Bz、C2）用于花色苷表达（ChenandCoe,BiochemicalGenetics.15:333-346,1977.,Procissietal.,PlantCell,9:1547-1557,1997.,TaylorandBriggs,PlantCell,2:115-127,1990.,Dooneretal.,AnnualReviewofPlantGenetics,25:173-199,1991.,Panavas,etal.,Genetics,v153.979-991.1999.,Styles,Maydica38:127-133.1993.,Piazzaetal.,PlantPhysiology,128.:1077-1086,2002.,CrossandAlexander,Euphytica33:577-582.1984.,Coeetal.1988,TheGeneticsofCorn.81-258.In:SpragueGF,DudleyJW(eds)CornandCornImprovement,3rded.Amer.Soc.Agronomy,Madison）。

总的来说，许多单倍体诱导物依赖于使用R-nj花色苷标志物单元型从而通过花色苷色素沉着的位置表达使单倍体能够在种子中被鉴别出来。单倍体种子在该种子的顶或冠部在糊粉组织中展示了花色苷色素沉着，但在该胚的盾片中没有色素沉着。可替代地，二倍体种子在两个位置上都有色素沉着。有时候，在种子的多个部分中花色苷表达的可见的差异可能是有问题的。

通常是已知的用于调节种子中花色苷表达的可计分的花色苷标志物基因的列表包括：R-nj、R1-scm122、R1-scm2、R1-scm:3、R1-scm、R1-mb（大理石糊粉）、R1-r:standard、R1-Randolph、R1-ch:Stadler、R1-d:Catspaw,A,C、R1-d:Arapaho、R1-nj、(R1-nj:Cudu)、(R1-nj:Chase)、R1-sc:124、R1-sup-R1-suppressible、R1K10-II；R1M-X1、R1-ch、R1-g、R1-1sk、R1-r、R1-sc122、R1-sc*5691、R1-sk:nc-2、R1-sk、R1-st.等以及本领域中已知的其他物质。可替代地，基于在3-5日龄幼苗的根中存在或缺少色素沉着其他的花色苷标志物提供用于在幼苗阶段单倍体的鉴别（参见TyrnovandZavalishina,DAN276:735-738,1984）。

取决于使用许多已知的用于在种子中花色苷表达的调节基因的哪一种，种子或胚中紫色着色将显示于种子以及胚成熟的不同阶段。因此在单倍体胚拯救鉴别方法中并不是所有种子花色苷标志物是有用的，因为在胚发育的早期阶段用于鉴别的颜色是不明显的。我们已经发现X26b=R1scm2（未知背景）、M242G=R1scm2（W22背景）、X17F=R1scm3、X19A=R1scm4、以及X26C=R1sc122，花色苷种子标志物单倍体在未成熟胚（12D.A.P.）的胚拯救后24小时内提供盾片色素沉着。另外，将R1scm2花色苷标志物单元型引入一种玉米单倍体诱导物允许鉴别至至少12D.A.P的单倍体胚。一些上述颜色标志物可能提供用于甚至更早的盾片色素沉着是有可能的。

不合宜的少见的诱导单倍体玉米胚使每个胚对于染色体加倍的目的是重要的。手工提取未成熟的胚用于双单倍体生产的目的是有可能的，但是由于它们小的尺寸以及要求用于双单倍体培育计划的单倍体胚的巨大的数目，这种手工提取是相当有问题的。然而，本发明积累了（以极高的数目）最适合的植物部分（未成熟胚）用于染色体加倍。该动力冲洗分离系统将该未成熟的胚与它的相应的未成熟的芽分离。这种分离的胚物质是所希望的用于有丝分裂停滞目标物质。通过暴露于培养条件，培养基，包括化学品或激素，有丝分裂停滞使染色体加倍，从而生成能生育的玉米双单倍体。使用秋水仙碱，氧化亚氮以及其他化学品的加倍的方法示于Gayen等人，"Chromosomedoublinginhaploidsthroughcolchicine,"MaizeGenet.Coop.Newslett,.68:65,(www.agron.missouri.edu/mnl/68/101gayen.html),1994,WANandWIDHOLM,PlantBreeding114(3):253–255,1995.,Kato,"Chromosomedoublingofhaploidmaizeseedlingsusingnitrousoxidegasattheflowerprimodialstage,"PlantBreeding,121:370-377,2002;WO/2007/038075；以及美国专利7135615中，将其通过引用结合在此。因此，本发明，这种动力冲洗分离系统通过增加每单位时间胚提取的效率以及通过降低胚提取的成本这两者增加了将双单倍体用于玉米培育中。此外，使用R1scm2颜色标志物单元型提供了用于鉴别未成熟单倍体胚的方法，并且因此提供了一种高度有用的颜色标志物用于未成熟单倍体胚的鉴别。这些未成熟单倍体胚可以用于染色体加倍的目的。

提供以下的实施例是用于说明本发明，并且不是用于限制。

实施例1：来自12D.A.P.胚的未成熟胚的切除并且早萌发。

该实施例展示了使用一种流体冲洗系统来从玉米的穗上切除/分离未成熟玉米胚。

该流体压力冲洗系统的灭菌

将5加仑10%Clorox（6.0%次氯酸钠）溶液通过示于图1A-C中的泵、岐管、软管、以及紫外灭菌器系统连续地反复循环，持续约30分钟。然后通过将Clorox溶液流出穿过该喷雾器软管和箱装置（图1A）并且向下进入该流出管而从该系统中排出。

将5加仑的无菌水循环直接穿过该系统并且流出进入该流出管。

将5加仑的无菌Millipore水或自来水连续地再循环穿过该装置的整个流体系统持续30分钟，然后储存在罐中直至用于该流体压力提取这些胚。最后，用70%的乙醇冲洗该外壳/喷雾箱装置（图1）并且允许其干燥。在使用前将该穗夹持器，喷头（分配器/喷嘴），以及用于拾取该穗的夹子在70%的乙醇中杀菌5-10分钟，并且允许其干燥。

未成熟的穗的制备：

授粉后12天（12D.A.P.）从温室收获51个未成熟的杂交的玉米穗并且通过将它们浸入50%Chlorox（6%次氯酸钠）溶液中20分钟进行灭菌。然后用无菌水以5分钟间隔将这些穗冲洗三次从而去除该杀菌溶液。为了准备用于在层流罩中进行胚提取的这些穗，使用一把无菌的手术刀将种核顶部去除，注意不要切到胚轴。

切除未成熟胚。

使用无菌夹子，将该穗置于该喷雾箱装置的内部并且使用烤肉架式的杆将其固定到位（穗夹持器）（图1）。通过岐管将该液压喷雾系统调节到约90p.s.i.。使用该烤肉架式装置，旋转该穗同时该分配器喷嘴将一束流体集中到该穗上。该流体来回经过这些切开的种核表面直到所有的胚和胚乳成分从该种子中被排除或分离。收集释放的二倍体胚以及胚乳组织并且然后通过10目和20目两个筛子流出。将无菌水喷雾到胚以及在10目筛子上收集的碎片上，以便将它们冲洗通过用于在20目筛子上捕获。将得到的胚快速转移到培养皿中用4ml液体Murashige和Skoog（M.S.）组织培养基饱和的滤纸上。然后在28°C下在400PPFD（光合光量子通量密度）的光亮度下每天16小时培养这些胚持续3天的时间。

结果：

在2小时的时间内提取来自51个穗的未成熟胚。尽管大多数这些胚是完整的，但是一些盾片件从一些胚上脱落。虽然对一些盾片造成损伤，在所有的穗中多数胚轴仍然保留在有活力的条件下。

表1中的数据展示了在来自25个穗的胚中观察到的萌发速率。考虑到仅在一小时内切除所有胚，这些数据证明了该系统在每单位时间切除速率以及在这些分离的未成熟玉米胚中观察到的高水平的早萌发这两个方面的效率。

表1.来自25个穗胚的胎拯救以及萌发频率。

实施例2：从9DAP（授粉后天数）胚进行切除以及胚性愈伤组织诱导

一些玉米种系的遗传工程是基于使用年轻的（约9D.A.P.）胚这些二倍体胚相当小，范围从约0.5到1mm长，并且因此比在实施例1中描述的更大的更强壮的12D.A.P.胚（约1-2mm长）更脆弱。因此，使用一种有转化能力的玉米种系以及大小适合于植物转化的未成熟胚对该动力冲洗分离系统进行评估。

该动力冲洗系统和玉米轴两者连同该动力冲洗分离的未成熟胚一起的消毒如实施例1中所述进行。然而，由于这些更不成熟胚的更脆弱的本性，对于胚：20、30、35、40、60、70、90的提取对随后的每平方英寸水平上的动力冲洗磅数进行评估。对提取的未成熟胚进行完整程度评估检测并且在28°C下在黑暗中在组织培养胚发生的诱导培养基No.1上培养6天。该动力冲洗分离的完整的/有活力表现的胚以及胚发生的应答示于表2中。

表2.评估相对于提取完整的/有活力表现的未成熟胚以及用于脆弱的胚发生的应答的能力的该动力冲洗流体的不同的压力水平（p.s.i.）。

在所有的动力冲洗水平（p.s.i.）上分离出这些完整的/有活力表现的未成熟胚。此外，在除了两个压力水平（p.s.i）的所有动力冲洗中观察到脆弱的胚生成应答。这些数据表明该动力冲洗分离系统适合于分离对于玉米转化具有适合大小级别的胚并且另外地，这些同样的胚在动力冲洗分离步骤之后是能够脆弱地胚生成应答的。

实施例3：切除推测的单倍体胚（18-20D.A.P.）。

可以使用玉米单倍体诱导物系例如K.H.I.、RWS、RWK-76、以及ZMS作为授粉亲本从而诱导母本单倍体种核的发育。上述单倍体诱导物种系带有R-nj花色苷色素基因座，它在该玉米种核中的胚以及糊粉两者中提供颜色。可以通过一种独特的花色苷色素沉着方式鉴别这些R-nj标志物单倍体种核，其中该单倍体胚基本上是无色的并且其中该种核的顶端区域中的糊粉是着色的。实际上，该胚可以具有一种稍微带颜色的胚芽鞘并且仍然是一种单倍体。该胚的盾片是应该保持无色的物质。相反，该二倍体胚在胚以及糊粉两者中都具有花色苷色素沉着。在温室以及在大田两者中的种核色素沉着的起始是可变的，部分地由于环境条件，但在我们的研究地点通常是在约18-20D.A.P才开始。

我们以前的胚提取工作已经证明了基于从18-20D.A.P种核手工切除胚后约24小时缺少胚色素沉着将单倍体从二倍体胚中区别开来是有可能的。因此，对该动力冲洗系统进行评估从而确定是否能够切除并且萌发代表时间成熟度（chronologicalmaturity）的这种程度的胚并且连同是否可以在提取后鉴别单倍体胚。

该动力冲洗系统以及玉米穗两者连同该动力冲洗分离的半未成熟胚的消毒如实施例1中所述进行。

将几种不同的单倍体诱导物用作授粉的亲本从而杂交到不同玉米种系的穗上。这些玉米种系已知在种核中不能展示任何花色苷色素沉着。将18到20D.A.P的穗置于该动力冲洗装置中并且使用90p.s.i.的压力从而从这些种核中切除大的胚（约2-4mm）)。将来自每穗的胚分别培养在用5.5ml（包括100μM脱落酸）的液体M.S.组织培养基饱和的滤纸上，并且在28°C下在受控的生长箱中孵育。荧光照明（16小时/天，400μmolm^-2s^-1）置于该培养的胚之上以及之下。在过夜的期间的过程中，将这些胚保持在黑暗中。第二天早上，对色素沉着了的和无色素沉着的推测的单倍体胚进行鉴别，并且将这些结果汇总于表3中。可以处理经鉴别的单倍体胚从而诱导双单倍体产生，种植并且发育幼苗。

表3中的数据表明18-20D.A.P种核包括大致成熟的胚，将它们植入相当坚硬的胚乳组织中，它们仍然能够使用该动力冲洗分离系统从种核中提取出来。此外，这些数据还证明通过这些推测的单倍体胚（如通过它们缺少盾片色素沉着所鉴别的）也可以使用该动力冲洗方案有效地切除。在体外观测到的推测的诱导速率与预测的体内诱导速率匹配。在大致所有的从该推测的单倍体胚获得的植物上观察到了单倍体植物表型，表明在鉴别单倍体18-20D.A.P胚中使用了R-nj盾片表型标志物。图4和5展示了用动力冲洗方法提取的18-20D.A.P胚分别地可以容易地萌发并且发育成正常的幼苗和植物。

表3.动力冲洗分离18-20D.A.P胚以及推测的单倍体诱导结果

实施例4：从动力冲洗切除的未成熟胚获得的植物的生育能力

从该动力冲洗未成熟胚切除过程得到的植物的种子生产能力在胚拯救中是重要的因素。使用如上实施例1中所述的用于将该动力冲洗系统以及该玉米穗进行杀菌的方案连同用于动力冲洗分离未成熟胚的方法，将未成熟二倍体胚切除并且置于用5.5ml的M.S.液体组织培养基饱和的滤纸上并且在荧光灯下在28°C下培养。切除后4到6天，将这些幼苗移植到土壤中并且生长至成熟用于评估生育能力。

结果

从上述的动力冲洗胚拯救过程得到的植物具有生育能力。在穗上种核生成以及从雄花穗花药挤出的实施例分别在图6和7中提供。

实施例5：该未成熟玉米盾片的R-基因座色素沉着标志物基因以及早色素沉着

将代表以下玉米R-基因座色素沉着标志物基因/单元型R1scm2（X26B）、R1xcm2（M242G）、R1scm3（X17F）、以及R1sc122（X26C）}的种子种植到大田中并且将得到的植物进行自授粉。授粉后12天（12D.A.P.）从大田收获产生的穗，并且如实施例1中所述进行灭菌。然后使用一把金属手术刀用手工将未成熟的二倍体胚切除并且置于用滤纸衬里的培养皿中，该滤纸用2ml的M.S液体组织培养基饱和。然后将未成熟胚的培养皿置于在28°C下受控的生长室中，其中在该培养胚之上和之下放置荧光照明（16小时/天，400μmolm^-2s^-1）。

结果

在胚切除的时候，或者使用肉眼或者通过使用解剖显微镜在代表这四个玉米R基因座单元型的每的任何未成熟胚上都未观测到花色苷色素沉着。然而，约24小时后，在每个培养的胚的盾片组织中容易观察到非常深的花色苷早期色素沉着。所有R-基因座单元型标志物种系证明了非常强的盾片色素沉着。

实施例6：未成熟胚提取方法对幼苗生长的影响

从温室收获代表不同玉米种系的玉米穗（约12D.A.P.）并且如实施例1中所述灭菌。或者通过（1）如实施例5中所述手动切除，或（2）实施例1中展示的通过动力冲洗切除方法分离并且收集从种核中随机地切除未成熟的二倍体胚。每一种情况下，将来自每个穗的切除的二倍体胚置于用滤纸衬里的培养皿中，该滤纸用2ml的M.S.液体组织培养基饱和。然后将这些未成熟的胚的培养皿置于在28°C下受控的生长室中。在动力冲洗分离胚的情况下，随机地选择20个胚并且移到无任何胚乳碎片的，但是再次包含滤纸的第二种培养皿中，该滤纸用2ml的M.S.液体组织培养基饱和。在这些胚的板之上设置荧光光照（16hr/天,70μmolm^-2s^-1）。培养几天后，对于各处理组中每个胚测量胚芽鞘的长度。

结果

表4和5中呈现的这些胚芽鞘长度的数据展示该动力冲洗得到的幼苗以比得上对手工切除的胚所观测到的速率来生长。

表4.胚芽鞘长度作为胚切除/培养方法的函数

提取方法	胚数目	平均胚芽鞘长度
穗#1
			手工提取	22	8.4
动力冲洗提取	54	9.3
穗#2
			手工提取	20	6.4
动力冲洗提取	44	9.4
穗#3
			手工提取	20	16.2
动力冲洗提取	46	13.4
穗#4
			手工提取	20	7.9
动力冲洗提取	28	10.6

表5：胚芽鞘长度的统计分析（最小二乘法平均值差学生T测试）（LSMeansDifferencesStudent’sTtest)）

方法		最小二乘法平均胚芽鞘长度（mm）
			动力冲洗提取	B	10.7
手工提取	B	9.8

实施例7：使用R1scm2单元型颜色标志物来鉴别未成熟单倍体玉米胚

将已知在未成熟的胚中不产生早期花色苷色素沉着的（nottoconditionprecociousanthocyaninpigmentation）玉米种系种植于温室中并且用来自含有该R1scm2单元型颜色标志物的玉米单倍体诱导物的花粉来授粉。如实施例1中所述对穗（约12D.A.P（授粉后天数））进行灭菌并且如实施例5中所述手工切除。然后将所有的未成熟胚的培养皿置于在28°C受控的生长箱中。在这些胚的板之上安置荧光照明（16hr/天，70μmolm^-2s^-1）。未成熟胚切除后约24小时，对这些胚进行花色苷色素沉着评分。这些胚可以在相同的培养皿和培养条件下萌发并且最终移植到温室中。

结果

切除后约24小时，大多数的胚在它们盾片区强烈地色素沉着，如R1scm2色素沉着标志物的存在所产生的。然而，如表6中所报告的还观测到了相当数量的未色素沉着的推测的单倍体胚。

表6：在每个穗基础上推测的未成熟单倍体（无色素沉着）鉴别率

这些推测的单倍体胚在上述条件下容易地萌发。约200株推测的单倍体幼苗在温室生长并且对其观察了植物的身高和雄性不育以便将单倍体和二倍体倍性状态区别开。使用这些标准，200株植物中194株被鉴别为是真的单倍体。这些观察表明在玉米单倍体诱导物中使用R1scm2单元型颜色标志物在从种核中的切除后24小时内在鉴别未成熟单倍体胚（12D.A.P.）中可以是高度有效的。

实施例8：动力冲洗分离，R1scm2-衍生的盾片色素沉着，以及未成熟单倍体胚的鉴别

将已知不在其未成熟的胚中产生早期色素沉着的玉米种系种植于温室中并且用来自含有该R1scm2单元型的玉米单倍体诱导物的花粉授粉。约12D.A.P.收获穗并且如实施例1中所述灭菌。从种核或者通过（1）如实施例5中所述的手动提取或者（2）如实施例1中展示通过该动力冲洗切除方法分离并且收集而随机地切除未成熟的胚。将该手工切除的未成熟胚培养在层叠有滤纸的小的培养皿中，该滤纸用1ml的M.S.液体组织培养基饱和。可替代地，将来自每个穗的动力冲洗切除的胚置于用滤纸衬里的培养皿中，该滤纸用5ml的M.S.液体组织培养基饱和。从含有来自动力冲洗得到的未成熟胚的这些培养皿并且紧接着该分离过程之后，将每穗10个胚于用滤纸衬里的新的培养皿中进行传代培养，该滤纸用5ml或2.5ml的M.S.液体培养基饱和。然后将所有这些未成熟胚的培养皿置于在28°C下控制的生长室中。在这些胚的板上面安置荧光照明（16小时/天，70μmolm^-2s^-1）。未成熟胚切除后约24小时，对这些胚花色苷色素沉着进行评分。

结果

观察二倍体胚上R1scm2盾片花色苷表达（该胚在用5ml的液体M.S.培养基饱和的滤纸上并且在胚乳碎片存在下进行培养）表明了这些未成熟胚已减弱到温和的盾片花色苷色素沉着。可替代地，从该动力冲洗得到的二倍体胚传代培养于用5ml的M.S.液体培养基饱和的滤纸上，并且在缺少胚乳的碎片下，更强地进行着色。传代培养于含有2.5ml的M.S.液体培养基的滤纸上的从该动力冲洗得到的胚被相当强地色素沉着并且颜色可以比得上强烈色素沉着的手工提取的胚，该手工提取的胚用作参比对照。在该手工和动力冲洗提取组（2.5mlM.S.）两个组中，在从种核切除这些胚后24小时内可以容易地观察到推测的单倍体未成熟胚（无色素沉着）。

实施例9：动力冲洗分离，R1scm2-衍生的盾片色素沉着，以及未成熟单倍体胚的鉴别

将已知不在其未成熟的胚中产生早期色素沉着的玉米种系种植于温室中并且用来自含有该R1scm2单元型的玉米单倍体诱导物的花粉授粉。约12D.A.P.收获穗并且如实施例1中所述灭菌。从种核或者通过1）如实施例5中所述的手动提取或者2）如实施例1中展示通过动力冲洗切除方法分离并且收集而随机地切除未成熟的胚。将该手工切除的对照未成熟胚在层叠有滤纸的小的培养皿中培养，该滤纸用1ml的M.S.液体组织培养基饱和。可替代地，将来自每个穗的动力冲洗切除的胚置于用滤纸衬里的培养皿中，该滤纸用5ml的M.S.液体组织培养基饱和。从含有来自动力冲洗得到的未成熟胚的这些培养皿并且紧接着该分离过程之后，将每穗10个胚于层叠有滤纸的新的培养皿中传代培养，该滤纸用5ml或2.5ml的M.S.液体培养基饱和。然后将所有这些未成熟胚的培养皿置于在28°C下受控制的生长室中。在这些胚的板之上安置荧光照明（16小时/天，70μmolm^-2s^-1）。未成熟胚切除后约24小时，对这些胚的花色苷色素沉着进行评分。

结果

观察二倍体胚上R1scm2盾片花色苷表达（该胚在用5ml的液体M.S.培养基饱和的滤纸上并且在胚乳碎片存在下进行培养）表明了这些未成熟胚已减弱到温和的盾片花色苷色素沉着。可替代地，从这些动力冲洗得到的二倍体胚于用5ml的M.S.液体培养基饱和的滤纸上传代培养，但是在缺少胚乳的碎片下，更强地进行着色。传代培养于含有2.5ml的M.S.液体培养基的滤纸上的那些动力冲洗得到的胚被相当强地色素沉着并且色泽可以比得上强烈色素沉着的对照手工提取的胚。在该手工和动力冲洗提取组（2.5mlM.S.）两个组中，在从种核切除胚后24小时内可以容易地观察到推测的单倍体未成熟胚（无色素沉着）。

色素沉着的评估：自染色。

目的：进行该实验用于观察在不同背景的玉米种系，以及另外，一种甜玉米系和一些其他R基因组单元型中盾片（R-nj、R1scm2、以及其他）表达中色素沉着。这些种系中的一些已知含有一个或多个花色苷抑制的基因，这些基因敲除了（knockout）R-nj表达。本实验的主要目的是评估使用R1scm2超过Syngenta种质的深度和宽度。

材料和方法：提供用于色素评估的种质。还对Seneca60，一种甜玉米系，以及不同的自身带颜色的种系进行评估，包括具有不同程度的颜色抑制的种系。使美国和加拿大适合的种质，Seneca60以及自身带颜色的（M242G=R1scm2在W22中，X17F=R1scm3、X19A=R1sc124、X26C=R1sc122）种系在大田中生长并且用来自或者X26B或者RWKBC1（对于R-nj/R1scm2分离比1:1）的花粉手工授粉或在R基因座单元型的情况下，自授粉。美国种系生长在威斯康辛的简斯维尔，并且还与来自相同的RWK杂合种系的花粉杂交。授粉后12-13天收获所有的穗。将这些穗连夜（在冷的袋中）运送到另地方。将这些穗在50%Clorox50%自来水中灭菌20分钟并且然后进行3次无菌水冲洗每次5分钟。然后用一把消毒的手术刀将穗的种核顶部去除并且在层流罩中用无菌的刮铲手工取出胚。将所有Z.E.置于包含滤纸的100mm培养皿上（该滤纸用3ml液体M.S.+3%蔗糖培养基饱和）并且置于低光照的Percival仪中每天照明16小时，温度为28°C。在一些情况下，使用100uMABA+M.S.培养基从而试图增强色素沉着。

强度的评分如下：

1=易于评分：切除后过夜或在24小时时盾片强烈地色素沉着。

2=可评分：与上面相比盾片色素沉着减少，但还可以进行评分

3=不易于评分：盾片颜色很弱或部分色素沉着，-->从而难以与无色素沉着相区别。

盾片表型的混合物：1+2，2+3

结果

美国种质：AA2359、AF3050、AF3448、AF4543、AF5108、AD1108、AX5290、GJ7031、DC4015、DD4153、DI4214、FA4211、FA4734、FF6096、FX6022、FX6305、HI4630、HI5723、IC3423、ID2072、ID2568、ID3260、ID3374、ID3461、ID5016、ID5199、IJ7010、LD7214、LL6011、LL6622、XA5489、XO5744。在所有情况下，R1scm2单元型基因座提供适合的盾片色素沉着。出现孟德尔式分离。

如前述，这些种系在它们颜色抑制的程度上不同。无颜色抑制的种系例如GENU530、GENU632、GENU635、GENU539、GENU012、Z12945用R1scm2看上去具有良好的未成熟盾片的色素沉着。颜色抑制种系：在未成熟盾片中GENU625&GENU624色素沉着提高一点（高于R-nj）并且用ABA增强了（至少625）表达，在较老的胚中GENU108具有差的糊粉色素沉着并且用R-nj具有尚可的盾片色素沉着并且用R1scm2具有良好的胚和糊粉色素沉着，FSNU929没有发挥作用良好（不使用ABA），但较老的R-nj胚看起来色素沉着良好，FPWR284没有发挥作用良好。结论：对于一些但不是在所有颜色抑制种系中R1scm2确实提供了一些可能的优化。在一些例子中ABA可以有助于在颜色抑制种质中的色素沉着。Seneca60：观察到了良好的盾片色素沉着。

加拿大种质：使用以下种系作为雌性，其中RWKBC1种质源对于R1scm2：500160、500065、500160、500115、500234、500129、500143以1:1分离。

在色素沉着的外显率和表达性方面500143显然是有问题的。

其他R单元型：在M242G=R1scm2（W22中）、X17F=R1scm3、X19A=R1sc124、X26C=R1sc122观察到良好的盾片色素沉着。注意R1sc122具有非常未成熟胚的非常好的色素沉着。

尽管在此已经展示并且描述了具体的实施方案，本领域中普通技术人员应该理解计划实现相同目的的任何安排可以取代所示的具体的实施方案。该申请旨在涵盖根据如所述的本发明的原则操作的任何改变或变体。因此，本发明旨在仅仅受权利要求以及其等同物所限制。本申请中引用的这些专利，参考文献以及公开物的披露通过引用结合在此。

实验10.TIDRACE

目的：

在转基因渗入到各种近交的背景中，回交的方法花费相当大量的时间。如果可以将世代的时限缩短并且在一年的基础上多获得一代，则可以显著地提高。因此本实验的目的是测定是否可以节省任何时间，这可以从如下实验方案来实现，即对未成熟的胚以及早期收获的种子使用胚拯救。这采取用胚拯救的植物和使植物抽穗/花药开花的快速种子之间品种的形式。

材料和方法：

在9月3日将10个品种的玉米植物种在盆中。种植后约30天一半的植物抽穗并且进行自授粉（对于确切的日期参见excel表）。一些种系没有使之抽穗并且另外的种系没有切口（nick）（参见execl表）。在11月18日并且对于自授粉的植物，将穗的一半锯开并且带到实验室并且将一些未成熟的胚进行手工提取。将12-14DAP的胚以标准方式进行手工提取并且放在用3ml的MS+3%蔗糖饱和的100mmx25mm培养皿中。将这些培养皿放在在83F下运行的光照的Percival（400umol）中并且一天16小时，直到被移植到平板（flats）中。在12月9日，将来自各存活基因型的10个胚拯救的幼苗种植到该铺有土壤的温室地板上（soildirtgreenhousefloor）。

从留在这些植物上的穗的另一半，在12月4日收获这些穗。在那时，将该穗放在生长室中干燥（drieddown）（参见以下的干燥表）。在12月9日，这些穗完成干燥并且将来自每个存活的穗的10个玉米粒紧邻它们相应的胚挽救幼苗种植在覆有土壤的温室地板上。

对从种子衍生的这些植物和胚拯救衍生的植物进行非常仔细地观察从而看到什么时候这些雄花穗开始脱落（请参见excel表的数据）花粉。

有大量的种系没有杂交或不能在本实验的第一部分制备它，因为这个原因，在12月4日将没有缺口的玉米植物的品种再种植到盆中。这次仅使种系抽穗。其他的没有缺口（参见exel表）。将该新种系保持在盆中，将其他的砍倒并扔掉。在授粉的植物上，将一半的穗锯开并且带到实验室中并且手工提取这些未成熟的胚。将12-14DAP的胚以标准方式进行提取并且放在用3ml的MS+3%蔗糖饱和的100mmx25mm培养皿中。将这些培养皿放在在83F下以一天16小时运行的光照的Percival（400umol）中，直到被移植到平板中。在3月3日，将存活的基因型的10个胚衍生的幼苗移植到覆土地板的温室中。

将该另一半的穗留在该植物上至成熟如第一段中上所述。在授粉后第28天，如前收获穗并且将其放在生长室中干燥（参见干燥表）。干燥期后，于3月3日将来自该穗的20个玉米粒种子紧邻它的胚衍生的幼苗种植在覆有土壤的温室地板上。

对这些植物种子和胚衍生的植物进行非常仔细的观察从而看到在什么时候这些雄花穗开始脱落。

结果

总之，来自植物的胚小于来自对应物的它们的快速(fast-track)的种子。但是，来自这些植物的种子产量是非常好的。

到开花的时间（天数）

就到开花的时间而言，这些数据表明在本实验中使用的条件下，该胚拯救方法可能导致在植物中从授粉到那些同样的植物达到开花的时间的节省。这些观察表明在基因渗入过程其间，我们在一些玉米种系中每年得到多出一代。因此，通过将胚提取的动力清洗方法的简易性与实用性与减少到开花的世代时间的观察组合，一种方法学提供了一种装置(means)，该装置有助于大规模的转基因渗入方案。将这些观察与我们的就对未成熟胚的体外选择的观察相结合，形成了用于渗入转基因性状的改进的方法。

Claims (3)

1.用于鉴别从玉米种子中分离出的单倍体胚的方法，包括：

(a)从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚；

(b)收集所述分离出的玉米胚；并且

(c)通过R1SCM2、R1SCM3、R1SC124或R1SC122盾片表型标志物鉴别单倍体胚，其中所述标志物在授粉后12天的未成熟胚的胚拯救后24小时内提供盾片色素沉着。

2.用于从由玉米种子中分离出的单倍体胚开发双单倍体植物的方法，包括

(a)从玉米种子中大致同时地分离多个玉米胚；

(b)收集所述分离出的玉米胚；

(c)通过R1SCM2、R1SCM3、R1SC124或R1SC122盾片表型标志物鉴别单倍体胚，其中所述标志物在授粉后12天的未成熟胚的胚拯救后24小时内提供盾片色素沉着；并且

(d)诱导该单倍体胚形成双单倍体植物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中该双单倍体植物可以产生种子，该种子用于植物育种。