BR122018017045B1 - método para identificar embriões haplóides - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se a métodos e aparelhos rápidos e eficientes para retirar material-alvo de planta a partir das sementes. em uma modalidade, a invenção refere-se a métodos e aparelhos para retirar embriões de sementes de milho. em ainda outra modalidade, os embriões retirados podem ser propagados e regenerados em plantas.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR EMBRIÕES HAPLÓIDES (Dividido do PI 0908242-5, depositado em 22/05/2009) REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de N^o US 61/128.695 depositado em 23 de maio de 2008, o qual é aqui incorporado na íntegra por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [002]A invenção refere-se a um método e aparelho para extrair tecido de plantas com um fluido. O fluido inclui, mas não está limitado a líquido ou gás. Mais especificamente, o método e aparelho são direcionados para isolar embriões do núcleo ou da semente. Mais particularmente, o método e aparelho são úteis para a produção de embriões retirados ou embriões parcialmente intactos a partir de sementes de monocotiledóneas tais como sementes colhidas de plantas como trigo, cevada, aveia, milho, arroz, gramíneas e semelhantes. Ainda mais particularmente, o método e aparelho são úteis para a produção de embriões isolados que produzem plantas, sua progênie, e sementes. Ainda mais particularmente, o método e aparelho são úteis para a produção de embriões isolados que germinam em plantas transformadas, sua progênie, e sementes. O método e aparelho são particularmente úteis para extrair embriões imaturos a partir de sementes de milho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003]Na pesquisa e desenvolvimento de milho e outras monocotiledôneas, a extração manual de embriões na maioria das vezes ainda é empregada. Prática padrão para a extração de embriões imaturos de milho envolve extração manual, um embrião de cada vez. Mais especificamente, a capa do núcleo é cortada e removida para expor o tecido endosperma. Um pequeno instrumento tal como um bisturi é empregado para mover para o lado o tecido endosperma e assim tornar o embrião de milho visível e acessível para remoção do núcleo. Este é um processo lento que requer considerável coor

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2/104 denação mão-olho e destreza a fim de extrair embriões completamente viáveis. Tem havido alguns movimentos em direção à mecanização deste processo de extração de embriões através do uso de um dispositivo de sucção, o qual é usado para sucção individual do embrião de cada semente. A mecanização do processo tem sido impedida pela fragilidade dos embriões de milho. Uma tentativa de automatizar o processo de extração de embriões é descrito na Patente N^o 7.150.993 cujo cessionário é a Monsanto, que revela o uso de um vácuo para extrair embriões de milho imaturos de cada um dos núcleos individuais com um aspirador a vácuo. Embora este sistema seja adaptado para aumentar ligeiramente a velocidade da extração de embriões além da velocidade trabalho manual conduzido por bisturi, o mesmo ainda é um processo excessivamente lento e tedioso. Continua a existir uma necessidade por um método mais rápido e mais eficiente de extrair embriões de uma maneira que produza poucos danos aos embriões.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004]A invenção refere-se a métodos e aparelhos para remover ou retirar tecidos-alvos da planta. Os métodos e aparelhos da invenção podem ser aplicados a quaisquer plantas monocotiledóneas de interesse. As monocotiledôneas preferenciais incluem, mas não estão limitadas a, membros da família Poaceae, que incluem gramíneas tais como gramados e plantas de grãos tais como milho, trigo e arroz. Monocotiledóneas particularmente preferidas incluem espécies Zea, que incluem cereais (Zea mays), as quais têm múltiplos núcleos (sementes) tipicamente presos em fileiras em uma espiga de milho.

[005]Em uma modalidade, o tecido-alvo da planta é um embrião. O embrião pode ser um embrião maduro, imaturo, intacto, parcialmente intacto ou uma mistura de intacto e parcialmente intacto. Em ainda outra modalidade, o método e aparelho são úteis para remover embriões de milho imaturos a partir de espigas de milho. Em outra modalidade, o embrião removido pode

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3/104 ser usado para cultura do tecido da planta ou transformação genética.

[006]A invenção também refere-se a métodos e aparelhos que podem ser usados para isolar substancialmente embriões de monocotiledônea, tais como embriões de milho. Os embriões substancialmente isolados podem ser usados para transformação genética ou cultura do tecido. Os métodos e aparelhos revelados aqui são úteis para processamento de alto desempenho (ou seja, isolar substancialmente grandes quantidades de tecidos-alvos e/ou processamento de grandes quantidades de sementes).

[007]Em outra modalidade, a invenção refere-se a um aparelho para retirar um embrião de dentro de uma semente, que compreende um suporte para a semente, um dispositivo para gerar uma corrente de fluido, e um bico para direcionar a corrente do fluido para uma semente de milho, em que o bico é acoplado ao dispositivo de geração de fluido. O fluido inclui, mas não está limitado a um líquido, um gás, ou uma combinação de líquido e gás. A corrente de fluido pode ser gerada por qualquer quantidade de meios que incluem, mas não estão limitados a uma bomba, um compressor, um sistema pneumático e um sistema hidráulico. Em outra modalidade, o aparelho pode ser acomodado dentro de um invólucro. Isto pode facilitar a coleta do material desejado e reduzir agitação do material da semente depois de o mesmo estar em contato com a corrente do fluido. Em ainda outra modalidade, uma semente de interesse pode ser acomodada dentro de um invólucro. Esta corrente pode ter um fluido que inclui, mas não está limitado a um gás ou ar.

[008]Em ainda outra modalidade, a semente pode estar localizada em uma planta, dentro de uma planta ou removida da planta. Por exemplo, se a semente é uma semente de milho, a semente pode estar localizada em uma espiga de milho ou a mesma pode ser removida da espiga de milho. A semente na espiga de milho pode ser mantida no suporte dentro do aparelho para tornar as sementes individuais mais estáveis e acessíveis para a corPetição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 13/116

4/104 rente do fluido.

[009]Em ainda outra modalidade, o aparelho da invenção pode ser adaptado para retirar tecido-alvo da planta de uma pluralidade de sementes. O aparelho é útil para uma espiga de milho, porque o bico do aparelho direciona a corrente do fluido para uma pluralidade de sementes de milho simultaneamente. Os métodos e aparelhos da invenção fornecem um mecanismo eficiente, rápido e eficaz para remover tecido-alvo da planta, que inclui, mas não está limitado a embriões.

[0010]Em ainda outra modalidade, o suporte e o bico do aparelho se movem um relativo ao outro para direcionar a corrente de fluido para uma pluralidade de sementes em localizações distintas. Em ainda outra modalidade, o suporte pode ser fixo em uma posição e o bico se move relativo ao suporte. Em ainda outra modalidade, o bico pode ser fixo em uma posição e o suporte se move relativo ao bico.

[0011]Em ainda outra modalidade, o aparelho compreende um dispositivo de coleta para coletar o embrião retirado. O dispositivo de coleta pode ser um recipiente que pode coletar embriões imaturos, maduros ou semimaduros e ou outros materiais internos da semente. Os embriões podem ser embriões de milho haploide ou duplo haploide.

[0012]Em outra modalidade a invenção compreende um método para reprodução de plantas a partir de embriões retirados de dentro de sementes de milho que compreende retirar múltiplos embriões de milho a partir de sementes de milho quase simultaneamente, coletar os embriões de milho retirados, identificar os embriões desejados, e, regenerar os embriões para formar plantas. Este método pode incluir a etapa de teste para os embriões desejados com marcadores ou através de extração de DNA ou através de agentes de seleção.

[0013]A invenção também refere-se a um método que compreende fornecer sementes de monocotiledônea que contém material-alvo da planta

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5/104 que tem uma abertura no pericarpo ou tegumento das sementes, retirar o material-alvo da planta de dentro de uma semente, e coletar o material-alvo retirado da planta. Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a um método que compreende retirar material-alvo da planta de dentro da semente, e coletar o material-alvo retirado da planta.

[0014]O método é adaptado para rapidamente retirar uma pluralidade de embriões que inclui, mas não está limitada a embriões intactos e embriões parcialmente intactos. Os embriões podem ser propagados através de germinação precoce do embrião para se desenvolverem em uma planta. Em outra modalidade, a propagação pode ser para a produção de calo de tecido embriogênico a partir do escutelo do embrião, o qual então pode ser regenerado em uma planta que pode ser fértil e usada para produzir plantas e sementes adicionais.

[0015]Em outra modalidade, o método permite que o embrião retirado seja usado em material de transformação de embrião tal como suas células, o escutelo, ou gomo do meristema apical. Em outra modalidade, o método compreende tratar um embrião retirado com um agente de controle mitótico. Em ainda outra modalidade, o método compreende germinar o embrião e tratar o material da planta germinada com agente de controle mitótico. Em ainda outra modalidade, o método compreende tratar calos embriogênicos desenvolvidos a partir do embrião com um agente de controle mitótico.

[0016]Em ainda outra modalidade, o método pode ser para identificar embriões haploides retirados de dentro de sementes de milho. O método compreende retirar múltiplos embriões de milho a partir de sementes de milho de forma aproximadamente simultânea, coletar os ditos embriões de milho retirados, e, identificar os embriões haploides através do R-nj ou R1scm2 ou ambos marcadores de fenótipo escutelar. Em ainda outra modalidade, o método compreende tratar embriões haploides para induzir duplo haploidismo.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0017]Figura 1A. Sistema de Invólucro e Distribuidor: Semente (1), Bico (3) Mangueira de Abastecimento do Lavador Pressurizado (6), Bico Distribuidor (7), Invólucro (8), Suporte do Sabugo/Semente (9), Sabugo/Espiga (10), Manivela do Suporte do Sabugo/Espiga (11), Porta de Entrada do Distribuidor/Espiga (12), Placa Deslizante (112).

[0018]Figura 1B. Sistema de Captura de Embrião: Dreno do Invólucro (13), Receptáculo de Coleta (14), Dreno do Líquido de Carregamento (15), Telas de Fluido Removíveis (16).

[0019]Figura 1C. Sistema de Pressão do Líquido do Lavador Pressurizado; Entrada (29), Recipiente de Lavagem Estéril (31), Bomba de Pressão do Lavador (32), Esterilizador U.V do Lavador (33), Manômetro de Pressão do Lavador (34), Saída (35), Tubo de Distribuição (36), Saída da Bomba (37), Válvula do Tubo de Distribuição (38).

[0020]Figura 2A. Embrião Precoce (8 D.A.P.) germinação seguida por desenvolvimento da plântula (7 dias após a extração do embrião).

[0021]Figura 2B. Embrião Precoce (12 D.A.P.) germinação seguida por desenvolvimento da plântula (48 dias após a extração do embrião).

[0022]Figura 3A. Uma modalidade da presente invenção que mostra a manivela, a espiga, material da semente, fluido (2), invólucro, meios para rotação, distribuidor, bico, mobilidade de lado a lado e rotacional, ponto de coleta.

[0023]Figura 3B. Uma modalidade da presente invenção que mostra mecanismo de distribuição de múltiplas espigas, 150 embriões por espiga em quatro espigas (pode ser empregado qualquer múltiplo) tempo de pulverização de 3 minutos, resulta em 12.000 embriões retirados em uma hora. Esta modalidade também mostra a manivela automatizada, a espiga, material de semente, fluido, invólucro, meios para rotação, distribuidor, bicos, mobilidade rotacional da espiga, ponto de coleta.

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7/104 [0024]Figura 3C. Uma modalidade da presente invenção que mostra o suporte/manivela, a espiga, o material de semente, fluido, invólucro, meios opcionais para rotação, bicos, ponto de coleta.

[0025]Figura 4. Sementes de milho novo derivadas a partir de germinação precoce de embriões 18 a 20 D.A.P extraídos com a presente invenção. O sistema P.W.I.E.E foi usado para a extração de embriões.

[0026]Figura 5. Supostas plantas haploides derivadas a partir de sistema de transferência por lavagem pressurizada. Todas as plantas (aproximadamente 35 dias de idade após a extração do embrião) foram submetidas previamente a um tratamento com um agente de controle mitótico.

[0027]Figura 6. Produção de semente em uma planta de controle que usa pólen obtido de uma planta resgatada de embrião derivado de lavagem pressurizada.

[0028]Figura 7. Produção de pendão fértil em uma planta resgatada de embrião derivado de lavagem pressurizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES [0029]As séries numéricas nesta revelação são aproximadas, e desta forma podem incluir valores fora das séries a menos que indicado em contrário. As séries numéricas incluem todos os valores a partir dos e incluindo os valores inferior e superior em incrementos de uma unidade, visto que existe uma separação de pelo menos duas unidades entre qualquer valor inferior e qualquer valor superior. Como exemplo, se uma propriedade de composição, física ou outra, tal como, por exemplo, peso molecular, viscosidade, índice de fusão, etc., é de 100 a 1.000, entende-se que todos os valores individuais, tais como 100, 101, 102, etc., e subséries, tais como 100 a 144, 155 a 170, 197 a 200, etc., são expressamente enumeradas. Para séries que contém valores que são menores do que um ou contém números fracionários maiores do que um (por exemplo, 1,1, 1,5, etc.), um unidade é considerada

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8/104 ser 0,00001, 0,001, 0,001 ou 0,1, conforme apropriado. Para séries que contêm números de digito único menores do que dez (por exemplo, 1 a 5), 0,1 é tipicamente considerado ser uma unidade. Estes são apenas exemplos de o que é especificamente pretendido, e de que todas as possíveis combinações de valores numéricos entre o menor valor e o maior valor enumerados, devem ser consideradas como sendo expressamente referidas nesta revelação. São fornecidas séries numéricas dentro desta revelação para, dentre outras coisas, quantidades relativas de componentes em uma mistura, e várias temperaturas e outras séries de parâmetros enumeradas nos métodos.

[0030]A expressão retirado refere-se ao processamento de um tecido-alvo (por exemplo, um embrião ou outro explante de tecido) que reside em ou faz parte de um complexo de tecido maior (por exemplo, uma semente) de modo que o tecido-alvo é fisicamente separado de pelo menos metade do complexo maior. Em algumas modalidades, um tecido-alvo retirado pode ser fisicamente separado de pelo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% do complexo maior, ou qualquer fração deste. Em outras modalidades o tecido-alvo é retirado de mais do que aproximadamente 80% até aproximadamente 100%, ou aproximadamente 99% até aproximadamente 100% do complexo maior, ou qualquer fração intermediária. Em algumas modalidades, o tecido-alvo pode ser retirado de aproximadamente 100% do complexo maior.

[0031]A invenção refere-se a métodos e aparelhos que podem ser usados para aumentar a eficiência da extração do material-alvo da planta dos núcleos de semente. Os aparelhos e métodos da invenção podem ser usados para extrair e isolar rapidamente embriões intactos ou parcialmente intactos. A maior parte dos embriões é capaz de se desenvolver em plantas que produzem sementes férteis.

[0032]Vários embriões viáveis são rapidamente retirados das sementes com os métodos e aparelhos da invenção. Os métodos e aparelhos da

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9/104 invenção fornecem um meio para extrair e isolar rapidamente grandes quantidades de embriões intactos ou parcialmente intactos, a maior parte viável maduros ou imaturos. Em outras modalidades, os métodos e aparelhos da invenção fornecem um meio para isolar outro material de interesse interno da semente.

[0033]O material-alvo da planta pode ser qualquer material desejado que inclui, mas não está limitado a um embrião imaturo, um embrião maduro, um embrião parcial, um embrião intacto, e uma composição de embrião e outro material da planta. O método pode ser usado para retirar múltiplos embriões de semente quase simultaneamente. Uma corrente de fluido pode ser usada para retirar embriões. A corrente de fluido inclui, mas não está limitada a um líquido, um gás ou uma combinação de líquido e gás.

Aparelhos para Extração de um Embrião [0034]A invenção refere-se a um parelho que compreende uma fonte de pressão, e uma fonte de fluido de carregamento. A fonte de pressão pode ser um sistema de bombeamento, um sistema compressor, pneumático ou hidráulico ou qualquer outro meio que seja capaz de fornecer fluido pressurizado. O fluido pode ser um gás, um líquido, ou alguma combinação dos dois. Em outra modalidade, o aparelho adicionalmente compreende um distribuidor para direcionar a corrente de saída do fluido de carregamento em direção a uma semente. Adicionalmente, o aparelho pode compreender um suporte de semente ou espiga. O fluido entra em uma semente modificada ou não modificada, tal como uma semente fendida, e transfere a partir do núcleo o embrião e outros materiais do interior da semente.

[0035]Em outra modalidade, a invenção refere-se a aparelhos para a extração de um embrião de planta que compreende: uma fonte pressurizada de fluido, em que o fluido é direcionado a uma semente de modo que o material do interior da semente pode ser retirado, e um dispositivo de coleta para coletar o material desejado da semente. A fonte de pressão inclui, mas

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10/104 não está limitada a um sistema de bombeamento, um sistema compressor, pneumático ou hidráulico ou quaisquer outros meios que sejam capazes de fornecer fluido pressurizado. O fluido pode ser um gás, um líquido ou uma combinação de gás e líquido.

[0036]Em outra modalidade, o aparelho adicionalmente compreende um distribuidor para direcionar o fluido em direção a uma semente. O fluido contata uma semente, que pode ser tanto modificada como alterada de alguma forma, e transfere o embrião e outros materiais do interior da semente.

[0037]A invenção também refere-se a um aparelho para a extração de um embrião que compreende: um suporte para uma semente, um aparelho para gerar uma corrente de fluido, e um bico para direcionar a corrente do fluido para uma semente, em que o bico é acoplado ao dispositivo de geração de fluido. A semente pode ser qualquer semente para a qual seja desejada a extração de um embrião que inclui, mas não esta limitada a milho, cevada, aveia, arroz, e gramíneas.

[0038]O suporte pode ser feito de qualquer material que inclui, mas não está limitado a ferro, aço, Teflon, compósitos, titânio, alumínio, níquel, cobre, estanho, plástico, cloreto de polivinila, e poliolefinas. O suporte pode ser configurado em uma forma apropriada para prender uma semente ou uma planta que contém uma semente que inclui, mas não está limitado a um círculo, um retângulo, um quadrado, um triângulo, um octógono, e um pentágono.

[0039]O suporte pode ser usado para prender a semente, uma semente contida em uma planta, ou uma semente contida em uma flor. Por exemplo, uma semente de milho pode ser removida da espiga do milho antes de colocar a semente no suporte. Em outra modalidade, a espiga de milho pode ser posicionada no suporte.

[0040]Em outra modalidade, a semente pode ser alterada para expor o embrião antes de colocar a semente no suporte. Um embrião e endosper

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11/104 ma do milho são encerrados dentro de uma semente de milho, que é produzida em uma espiga de milho. A semente ou núcleo protege o material do interior da semente que inclui o frágil embrião. Para extrair o embrião da semente, a capa ou topo da semente é removido ou fatiado manual ou mecanicamente para expor o embrião. O embrião pode ser extraído em uma variedade de maturidades e tamanhos. O tamanho do embrião (medido em milímetros) é uma função da idade, do genótipo parental, e do ambiente. Se não for tomado cuidado suficiente, o embrião pode ser danificado durante o processo de transferência. Pequenos embriões imaturos na faixa de 5 a 11 dias após a polinização (D.A.P.) são geralmente mais frágeis do que embriões maiores e mais velhos, 12 dias ou mais D.A.P. Os métodos e aparelhos da invenção são suficientemente refinados para retirar embriões de milho maduros ou imaturos pequenos, que são totalmente viáveis.

[0041]Em outra modalidade, antes de inserir a espiga no suporte, a semente é preparada para a extração do embrião/material da semente. Pode ser usado um bisturi para destacar as coroas (topos) dos núcleos de modo que a lavagem pressurizada pode penetrar o interior do núcleo com menos resistência.

[0042]Pela remoção da capa da semente, a pressão do fluido precisa apenas ser suficiente para retirar o embrião a partir da cavidade da semente. O fluido pressurizado não tem que ter uma força intensa que seja adaptada para fender a cavidade da semente. Uma pressão de fluido com força maior para fender pode reduzir a porcentagem de embriões viáveis intactos retirados pela presente invenção. Se o embrião não é o material desejado, pode ser possível aumentar a pressão do fluido e evitar a remoção ou fatiamento da capa da semente. Isto pode exigir que o nível de pressão seja pulsado ou variado.

[0043]O dispositivo para gerar uma corrente de fluido inclui, mas não está limitado a uma bomba, um compressor, um sistema pneumático e um

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12/104 sistema hidráulico. O fluido inclui, mas não está limitado a um líquido, gás, uma mistura de líquido e gás, e um gel. O líquido ou gás pode ser qualquer líquido ou gás que não danifique ou afete negativamente o material da planta e seja gasoso ou líquido à temperatura ambiente. O gás pode ser uma combinação ou uma mistura de dois ou mais gases. O gás mais comum é o ar, O líquido mais comum é a água.

[0044]O líquido ou gás pode ser prontamente impregnados com outros produtos químicos, componentes, fluidos, sólidos dispersados ou soluções que sejam adaptadas para afetar o material da planta. Por exemplo, a semente de uma monocotiledônea e da maior parte das plantas tem o embrião encapsulado dentro de uma casca protetora externa. A exposição do tecido protegido ao ambiente externo pode resultar em perda de viabilidade do embrião devido a qualquer quantidade de potenciais contaminações de bactéria ou fungos. Uma forma de endereçar esta questão é usar um antibiótico ou biocida, por exemplo, Mistura Preservativa de Planta ou alguma mistura de compostos inibidores de crescimento de bactéria e/ou fungos no fluido. Por exemplo, desinfetantes, componentes antibacterianos e/ou antifúngicos e/ou componentes que reduzem a contaminação do material da planta, ou componentes para aumentar a viabilidade, tolerância a estresse, ou hábito de crescimento ou crescimento ou taxa de divisão de células do material da planta pode ser usado no fluido da presente invenção. Estas medidas ajudam a reduzir os efeitos da contaminação.

[0045]O fluido é pelo menos um elemento que pode ser usado para retirar o embrião exposto da semente ou núcleo. Em uma modalidade, o fluido é liberado a partir de um ou mais dispositivos e direcionado para as sementes. O fluido pode ser vigorosamente impulsionado a partir do dispositivo de distribuição do fluido. O dispositivo de distribuição do fluido pode incluir um bico(s) ou jato(s) estacionário ou rotativo direcionalmente adaptado para direcionar o fluido pressurizado para o(s) núcleo(s) cortado(s) que contém o

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13/104 (s) embrião(ões) desejado(s).

[0046]A quantidade e força do fluido aplicado às sementes são suficientes para isolar o material-alvo da planta, tal como um embrião imaturo, das sementes. O fluido pode ser aplicado a múltiplas sementes consecutiva ou simultaneamente. O fluido aplicado pode ser contínuo ou não contínuo (por exemplo, pulsado ou força semelhante à onda), A quantidade de fluido aplicada é preferencialmente suficiente para suplantar a adesão do alvo (por exemplo, embrião) e não alvo (por exemplo, tecido não embrião tal como endosperma) um do outro, em que desta forma permite a separação dos tecidos-alvo e não alvo. Qualquer fluido ou fluidos apropriados podem ser empregados para a remoção do tecido-alvo de sua semente, e podem ser usados múltiplos fluidos em combinação, sequencial ou simultaneamente.

[0047]Um embrião ou outro material desejado pode ser removido por um fluido através do uso de qualquer um dos seguintes individualmente ou em combinação: um distribuidor, espiga ou bico fixo, móvel ou rotativo. Fixo deve significar que o mesmo é instalado em uma posição particular. Móvel deve significar capaz de se mover nos eixos geométricos X, Y ou Z ou em uma combinação de dois destes eixos. Rotativo deve significar capaz de se mover através dos eixos geométricos X, Y, e Z, por exemplo, movimento em padrão circular ou espiral.

[0048]Em outra modalidade, o dispositivo para gerar uma corrente de fluido é um distribuidor de posição fixa, de modo que o distribuidor aponta em apenas uma direção, mas é adaptado para ser rodado em volta da espiga, enquanto a espiga é fixa ou móvel. Em ainda outra modalidade, o dispositivo para gerar uma corrente de fluido é um distribuidor que é móvel e roda em volta da espiga, enquanto a espiga é fixa ou móvel. Em ainda outra modalidade, o dispositivo para gerar uma corrente de fluido é um distribuidor que é fixo ou móvel e roda em volta da espiga que roda, enquanto o bico no distribuidor é fixo, rotativo ou móvel. Em outra modalidade, o dispositivo para

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14/104 gerar uma corrente de fluido é um distribuidor que em uma posição fixa com uma espiga também em uma posição fixa, em que tanto a espiga como o distribuidor são móveis. Uma quantidade de outras trocas é igualmente útil e dentro do escopo desta invenção.

[0049]O tipo de bico ou jato distribuidor pode variar em diâmetro e comprimento para acomodar a extração de um embrião em vários estágios de desenvolvimento de uma semente. Em uma modalidade, um bico pode conter um pequeno orifício ou abertura circular. O distribuidor pode ter uma extremidade afunilada e pode ser posicionado acima ou abaixo com respeito à distância do cume do bico distribuidor para a semente de acordo com a necessidade.

[0050]Em outra modalidade, o fluido pode ser pressurizado. O fluido pode ser pressurizado dentro do dispositivo que gera uma corrente de fluido ou o fluido pode ser canalizado dentro de um dispositivo separado onde o fluido pode ser pressurizado. A quantidade de pressão aplicada a partir de uma fonte de pressão através do distribuidor pode variar. Pode ser usada qualquer pressão que provoque a transferência e remoção do embrião da semente sem tornar o material desejado da planta inutilizável. Saídas úteis de lavagens pressurizadas kPa (psi) podem variar de aproximadamente 137,8 a 1033,5KPa (20 a 150 psi) incluindo 137,8(20), 172,25(25), 206,7(30), 241,15(35), 275,6(40), 310,05(45), 344,5(50), 378,95(55), 413,4(60),

447,85(65), 482,3(70), 516,75(75), 551,2(80), 585,65(85), 620,1(90),

654,55(90), 689(95), 723,45(95), 757,9(100), 792,35(105), 826,8(110), 861,25(115), 895,7(120), 930,15(125), 964,6(130), 999,05(135), 1033,5(140) e além. Baseado nos ensinamentos revelados aqui, alguém versado na técnica deve saber que é possível com não mais do que experimentação de rotina mudar o tamanho do distribuidor, o diâmetro e forma da abertura do bico do distribuidor, a quantidade e forma do fluido, o diâmetro ou comprimento da tubulação para levar o fluido para extrair os embriões, e a pressão

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15/104 para isolar os embriões imaturos da semente. Em cada uma destas modalidades a cobertura e força de pulverização de fluido se acomodam adequadamente à remoção do embrião. A maior parte do material de semente desejado é carregado da cavidade através da força do fluido. Este material carregado quando expelido da espiga é posteriormente coletado.

[0051]Em ainda outra modalidade, o aparelho pode adicionalmente compreender um dispositivo de separação ou um filtro que pode ser usado para obter o tecido-alvo da planta. O fluido de carregamento pode conter o material desejado, tal como embriões imaturos, e outros materiais indesejados, tais como endosperma, gluma e tegumento ou tecidos do pericarpo. A separação pode ser obtida por uma ou muitas técnicas apropriadas, que incluem, mas não estão limitadas a, separação por exclusão de tamanho (por exemplo, por filtração em uma ou mais etapas de filtragem), separação baseada em hidrofobicidade, hidrofilicidade, lipofilicidade, ou outras forças atrativas, e separação por diferenciais de massa ou densidade (por exemplo, separação por centrifugação, sedimentação, e decantação). A etapa ou etapas de separação podem ser opcionais, por exemplo, onde não é necessário isolamento adicional dos embriões intactos ou parciais para seu uso na cultura de tecido.

[0052]Em ainda outra modalidade, o aparelho pode adicionalmente compreender um dispositivo de esterilização. Em uma modalidade, o dispositivo de esterilização pode ser usado para esterilizar o líquido, gás ou combinação de líquido e gás antes do contato com a semente. Em outra modalidade, o dispositivo de esterilização pode ser usado para tornar esporos de bactéria e fungos inviáveis, o qual pode ser associado com o tecido-alvo da planta ou o líquido ou gás. Qualquer protocolo ou dispositivo pode ser usado para esterilizar o fluido de carregamento uma vez que os esporos de bactéria e fungos sejam tornados inviáveis, e o tecido-alvo da planta não seja afetado. O dispositivo de esterilização inclui, mas não está limitado a dispositi

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16/104 vos que emitem radiação ultravioleta, raios x, radiação de plasma de microondas, irradiação de feixe de elétrons, e radiação. Adicionalmente, o dispositivo de esterilização pode consistir em um filtro que pode remover matéria bacteriana, fúngica, e viral. Podem ser usados um ou mais do que um filtro de tamanhos variados.

[0053]Daqui em diante, a menos que indicado em contrário o distribuidor e a espiga da presente invenção são considerados fixos, rotativos ou móveis ou comutáveis entre estes parâmetros. O distribuidor e espiga em algumas modalidades removem o embrião de uma semente por vez, em outras modalidades pelo menos dois ou mais embriões são removidos simultaneamente da espiga. Algumas modalidades visam remoção simultânea da maior parte se não de todos os embriões da espiga.

[0054]Em uma modalidade mostrada na Figura 1A, o suporte de sabugo/semente 9 prende uma espiga de milho 10 e roda a espiga e assim a semente/núcleo 1 ou núcleos 1 passam no(s) bico(s) do distribuidor de lavagem. Adicionalmente, o(s) distribuidor(es) 7 é(são) móvel(is) de modo que o fluido 2 pode ser direcionado para áreas diferentes da espiga de milho 10, enquanto o mesmo está rodando. A rotação da espiga pode ser através de um eixo que inclui o eixo longo ou curto. Alternativamente, a rotação pode ser do distribuidor. m ainda ouras modalidades, tanto a espiga como o distribuidor podem ser móveis em pelo menos um dos eixos geométricos X, Y, e Z. O fluido 2 é disperso para assim remover o interior das sementes de interesse na espiga.

[0055]Mais especificamente, A Figura 1A mostra uma mangueira de abastecimento de fluido 6, a qual é acoplada a um distribuidor 7, o qual pode ser acoplado a um bico 3 que é adaptado para engatar no distribuidor. O distribuidor 7 pode direcionar ou regular o fluido 2 para dentro de um invólucro 8. A mangueira de abastecimento de fluido 6 é acoplada a uma fonte do fluido. O fluido 2 pode ser armazenado em um tanque, um cilindro, um reci

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17/104 piente para armazenar gás, um recipiente para armazenar líquido ou qualquer outro dispositivo de armazenamento apropriado. A mangueira de abastecimento de fluido 6 pode ser de qualquer tamanho desejado e pode ser feita de qualquer material apropriado que inclui aço, plástico, ferro, borracha, e uma poliolefina. Como mostrado na Figura 1A, a mangueira de abastecimento de fluido 6 é inserida dentro do invólucro 8 através de uma abertura no topo do invólucro 8. Entretanto, a mangueira de abastecimento de fluido (6) pode ser inserida dentro do invólucro 8 através de um lado do invólucro ou através do fundo do invólucro 8.

[0056]Em uma modalidade mostrada na Figura 1A, a espiga ou sabugo 10 é estabilizado em um suporte de sabugo/semente 9 e rodada pela manivela do suporte de sabugo/semente 11. Esta manivela 11 pode ser adaptada para ser rodada mecanicamente ou rodada manualmente. Rotação mecânica pode ser obtida por qualquer meio conhecido na técnica que inclui, mas não está limitado ao uso de um motor elétrico, um motor a gás, um motor pequeno, uma fonte de energia elétrica, uma bateria, uma fonte de energia a gás, um motor a propano, e um motor propulsionado por água.

[0057]Como mostrado na Figura 1A, em pelo menos uma modalidade, o suporte de sabugo/semente 9 é projetado para ser inserido dentro de um invólucro 8 de modo que uma parte do suporte de sabugo/semente 9 seja localizada fora do invólucro 8. Em ainda outra modalidade, o suporte de sabugo/semente pode ser projetado de modo que uma parte do suporte seja localizada fora de ambas as extremidades do invólucro. O suporte de sabugo/semente 9 pode ser projetado simetricamente de modo que um comprimento similar do suporte 9 seja localizado fora de ambos os lados do invólucro. Em outra modalidade, o suporte de sabugo/semente 9 pode ser projetado de modo que apenas uma extremidade do suporte 9 seja localizada fora do invólucro 8.

[0058]A Figura 1A retrata uma manivela 11 (que é opcional) acoplada

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18/104 ao suporte de sabugo/semente 9. Uma manivela 11 pode ser instalada em ambas as extremidades do suporte de sabugo/semente ou em uma única extremidade.

[0059]Este invólucro particular mostrado na Figura 1A tem uma porta de entrada 12 para a inserção da espiga ou das sementes. O distribuidor de fluido 7 nesta modalidade é acoplado a uma placa deslizante 112 encaixados conjugadamente dentro do invólucro. Esta placa permite o movimento do distribuidor de fluido 7, que mantém a pulverização do fluido dentro do invólucro 8.

[0060]O invólucro 8 pode ser de qualquer formato que inclui, mas não está limitado a círculo, um quadrado, um retângulo, um triângulo, um octógono, oval, hexágono, paralelogramo, losango, pipa e trapézio. O invólucro pode ser de qualquer tamanho que inclui, mas não está limitado a 60,96x60,96, 60,96x91,44, 60,96x121,92, 60,96x182,88, 60,96x243,84, 91,44x91,44, 91,44x121,92, 91,44x182,88, 91,44x243,84, 121,92x121,92, 121,92x182,88, 121,92x243,84, 152,4x152,4, 152,4x182,88, 152,4x243,84, 182,88x182,88, 182,88x243,84, e 243,84x243,84 centímetros. O invólucro 8 pode ser fabricado de uma única peça de material ou de múltiplas peças de material. O invólucro 8 pode ser fabricado de plástico, fibra de vidro, vidro, borracha, poliolefina, polietileno, poliestrireno, HDPE, e madeira. O invólucro 8 pode ser capaz de abrir em qualquer local que inclui, mas não está limitado ao topo, o fundo, o lado esquerdo, e o lado direito.

[0061]A Figura 1B retrata uma modalidade que compreende uma ou mais peneiras ou filtros que são usados para separar o líquido de carregamento, embriões imaturos, e outras partes da semente. O fluido arrasta o embrião da semente 4 de dentro da semente 1, juntamente com uma grande quantidade de outras partes residuais da semente, para dentro do invólucro 8. O invólucro 8 tem um dreno do invólucro 13, que drena o fluido 2 e embrião 4 e partes da semente para dentro de um receptáculo de coleta 14.

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Nesta modalidade, o receptáculo 14 inclui telas permeáveis a fluido 16, as quais capturam os embriões 4 e partes da semente de acordo com o tamanho conforme o fluido 2 passa através do receptáculo 14. O fluido de limpeza 2 então flui do receptáculo 14 para dentro do dreno de líquido de carregamento 15 para ou descarte ou reaproveitamento.

[0062]Uma tela permeável a fluido pode ser qualquer material ou aparelho que separe o material desejado do material indesejado que inclui, mas não está limitado a um filtro, uma membrana, uma peneira, uma malha, uma rede, filtro de papel, papel Whatman, pano, gaze, e outros aparelhos de filtração ou destilação. A tela permeável a fluido pode separar baseada no tamanho, forma, intensidade de fluxo, ou qualquer combinação das propriedades enumeradas acima. A tela permeável a fluido pode ser um filtro que inclui, mas não está limitado a um filtro de gravidade, um filtro de pressão, um filtro de fluxo lateral, uma filtração de superfície (sistema de passagem única que opera sob pressão), um filtro de profundidade, e um filtro de rotação contínua.

[0063]A Figura 1B mostra que o invólucro ajuda na canalização das partes retiradas da semente, inclusive de embriões imaturos para dentro de um local específico. As partes da semente são canalizadas em direção a abertura no invólucro, através da qual a lavagem que contém os embriões de milho imaturos e outras partes da semente podem ser coletadas ou fluir. As partes da semente são coletáveis a partir desta abertura ou dreno. Em ainda outra modalidade da invenção, as partes da semente podem ser acumuladas em um receptáculo de coleta adaptado para receber tal material.

[0064]Na modalidade mostrada na Figura 1C, existe um sistema de esterilização U.V., que pode ser usado para tornar inviáveis os esporos bacterianos e fúngicos, e meios para regular a pressão 137,9 a 1034,2 kPa(20150psi) ou taxa de fluxo ou velocidade do gás ou líquido ou uma mistura de cada um, e um aparelho de distribuição de pulverização, que pode compre

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20/104 ender uma mangueira, distribuidor, e/ou bico. O dispositivo distribuidor em uma modalidade é móvel em uma direção específica, ou pode ser programado em um padrão de pulverização específico, com qualquer uma de velocidade estável, fixa, pulsante ou variável.

[0065]Vários métodos para produzir fluidos pressurizados, sejam líquidos, gases ou misturas, são bem conhecidos na técnica e sua representação não tem a intenção de limitar a invenção a este método. A Figura 1C retrata o sistema de pressurização do fluido 30 empregado por uma modalidade da invenção. Este fluido 2 é água esterilizada, a qual é armazenada no recipiente(31, próxima à bomba de pressão 32. O esterilizador de fluido ultra violeta 33, o manômetro de pressão do fluido 34 e o tubo de distribuição 36.

[0066]O fluido 2 flui para dentro de uma entrada 29 no recipiente 31 onde o fluido 2 é armazenado. Em seguida o fluido de move através da saída 35, para dentro da bomba 32, e através do fluxo de saída da bomba 37 para dentro do esterilizador 33. O fluido 2 passa através da luz ultravioleta, sai pelo fluxo de saída do esterilizador 31 para o tubo de distribuição 26. O fluido 2 é liberado com as válvulas do tubo de distribuição 38 para dentro das mangueiras de abastecimento 6 para distribuição do fluido.

[0067]A bomba 32 pode ser qualquer tipo de aparelho que mova de maneira eficaz e/ou pressurize o fluido que inclui, mas não está limitado a uma bomba de deslocamento positivo, uma bomba de alta pressão, bomba operada a ar, bomba de fole, bomba de diafragma, bomba de rotor flexível, bomba de pistão, bomba de lavadora pressurizada, e uma bomba de bico pulverizador.

[0068]O manômetro de pressão 34 pode ser qualquer tipo de manômetro de pressão que inclui, mas não está limitado a manômetro de pressão de leitura direta, manômetro de pressão tradicional, manômetro de pressão preenchido, manômetro de pressão comercial. Manômetros de pressão são disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais que inclui a

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Omega Engineering (Stamford em Connecticut).

[0069]As Modalidades seguintes nas Figuras 3A a C mostram de maneira geral, diferentes desenhos de aparelhos. A Figura 3A mostra um par de espigas de milho rotativas que são movidas e passam pelo distribuidor. A Figura 3B mostra uma quantidade de espigas adaptadas para rodar enquanto são pulverizadas pelos distribuidores. A Figura 3C mostra tanto uma espiga como o invólucro que tem os distribuidores circundando o exterior da espiga de tal forma que nem a espiga nem os distribuidores precisam se mover. O invólucro dentro do qual uma espiga de milho pode ser colocada pode ser adaptado para controlar qualquer pulverização de fluido desviada. Em uma modalidade alternativa da Figura 3C, o invólucro é integral com os distribuidores. Na Figura 3C, os distribuidores ou espigas ou ambos podem rodar, em direções iguais ou opostas. Assim, se os distribuidores rodam, o interior do invólucro pode rodar. Portanto, a modalidade tem ou um distribuidor fixo ou um dispositivo que permite movimento, e ou rotação ou da espiga ou do(s) distribuidor(es). Adicionalmente, qualquer das modalidades pode ter um sistema de transporte que move uma quantidade de espigas em contato com fluido de carregamento em um sistema automatizado.

[0070]As Figuras 3A a C mostram modalidades diferentes do aparelho da presente invenção. Na Figura 3A as espigas de milho ou espigas 10 são presas pelos suportes 9 que rodam. As espigas 10 podem ser rodadas manualmente ou rodadas mecanicamente por uma fonte de energia. A direção do(s) bico(s) distribuidor(es) 3 liberando o fluido 2 pode ser adaptada para ser móvel, rotativa ou fixa. Nesta modalidade, o distribuidor 7 e/ou bicos 3 pode ser angulado. A rotação do suporte 9 permite que a espiga seja rodada de modo que todas as sementes possam ser apresentadas para o distribuidor. Em outra modalidade, a força do fluido pressurizado pode servir ao duplo propósito de expulsar o material do interior da semente e mover a espiga/espigas em uma direção rotacional devido ao vetor de carregamento.

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22/104 [0071]O fluido 2 pode ser um gás ou líquido ou uma mistura dos dois. Opcionalmente, mais dispositivos/distribuidores de pulverização 7 podem ser incluídos dentro desta modalidade. Estes dispositivos de pulverização 7 podem ser fixos ou rotativos e móveis direcionalmente com a espiga 10 sendo fixa, rotativa ou móvel. Uma opção adicional é onde o(s) distribuidor(es) 7 pode(m) rodar em volta de uma espiga 10, que também é rotativa como mostrado na Figura 3B.

[0072]Na Figura 3B, o(s) distribuidor(es) 7 é(são) posicionado(s) dentro de um dispositivo cilíndrico, circular, casca ou semelhante a invólucro com bicos 3 ou jatos 3 adaptados para liberar energicamente o fluido 2 contra todos os lados das sementes 1 na espiga 10. Em operação, os distribuidores circundam a espiga e se movem de uma extremidade a outra da espiga. Em outra modalidade, a espiga se move através de um distribuidor, em que o distribuidor não tem que se mover. Em ainda outra modalidade, a espiga e o distribuidor podem ambos se mover. Assim, o dispositivo pode ter um ou mais bicos 3 ou jatos 3 e os bicos podem se mover para baixo a espiga 10 ou a espiga 10 pode rodar e/ou se mover dentro dos bicos 3 ou ambos podem ficar em movimento em direções iguais ou opostas. Nesta modalidade, o jato 3 ou bicos 3 podem ser acionados direta ou indiretamente com uma fonte de energia.

[0073]Em outra modalidade, o dispositivo pode ter vários bicos 3 ou jatos 3 distribuidores posicionados para circundar a(s) espiga(s) 10 e nem os jatos 3 nem as espigas necessitarem de rotação. Em que área de superfície do pulverizador é suficiente para cobrir a espiga 10.

[0074]A Figura 3C mostra ainda outra modalidade que tem um invólucro envolvente preenchido com bicos 3 que circundam a espiga ao mesmo tempo em que direcionam o fluido pressurizado 2 para as sementes 1. Este cilindro (ou alternativamente um invólucro semelhante a uma caixa ou invólucro) pode ser estacionário com as espigas sendo transportadas através do

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23/104 círculo de fluido 2. Em outra modalidade, este cilindro (ou alternativamente um invólucro semelhante a uma caixa ou invólucro) pode ser rotativo com o cilindro girando em torno ou se movendo ao longo da espiga 10. Em uma quantidade de modalidades, é útil direcionar a pulverização levemente em direção ao fundo do invólucro para expulsar com facilidade o material da semente da espiga 10 para dentro do receptáculo de coleta 14.

[0075]Nestas modalidades, o material desejado da semente é carregado da cavidade do núcleo através da força do fluido 2 para dentro do receptáculo 14. O carregamento do material da semente também pode ser auxiliado pela força de rotação da espiga. O material carregado da semente 40, quando expulso da espiga 10, é posteriormente coletado.

[0076]O material coletado da semente 40 em seguida é peneirado ou filtrado, de modo que o material do embrião 4 é localizado. Em algumas modalidades, o material do embrião 4 será o material-alvo da planta desejado.

[0077]Em ainda outras modalidades, o material-alvo da planta desejado pode ser o material não do embrião. O material não do embrião pode ser coletado por qualquer uma de uma quantidade de razões. Pode ser útil para análise, ou teste ou coleta de proteína, amido, ou outros materiais da semente que incluem materiais transgênicos que são localizados dentro deste material não de embrião. Alternativamente, tanto o material não de embrião como o material de embrião podem ser coletados. A posição das espigas, a forma do invólucro e o dispositivo de distribuição de pulverização podem ser adaptados para direcionar o material deslocado da semente para uma área confinada para facilitar a coleta. Os embriões deslocados e outro material da semente podem ser coletados com o uso de telas adaptadas para separar o material desejado do material indesejado nos recipientes de coleta como mostrado na Figura 1C.

[0078]A Figura 1B é uma vista lateral da Figura 1A sem a espiga e a manivela. Esta seção inferior do invólucro compreende o sistema de captura

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24/104 do material da semente 40. O sistema de captura de material da semente 40 compreende um dreno do invólucro 13 que permite que o material da semente seja canalizado para o receptáculo de coleta 14, o qual inclui um dreno de líquido de carregamento 15 para coletar o fluido distribuído.

[0079]Pode ser empregada uma bandeja no fundo do invólucro para coletar o material de semente deslocado da planta. Depois disso, se o material da semente tem que ser separado, então sistemas de seleção ou separação gravitacional podem ser usados.

Métodos Para a Extração de um Embrião [0080]A invenção refere-se a um método para retirar um embrião de uma semente que compreende aplicar uma corrente de fluido à semente, em que o fluido é qualquer um de líquido, gás ou combinação de líquido e gás, retirar um embrião da semente, e coletar o embrião retirado. Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a um método para retirar embriões de dentro de sementes de milho que compreende: retirar múltiplos embriões de milho a partir de sementes de milho quase simultaneamente, e coletar os ditos embriões de milho retirados. Qualquer quantidade de embriões pode ser retirada eficiente e rapidamente com o uso dos métodos da invenção. Os métodos da invenção podem ser usados para remover um embrião imaturo duplo haploide, haploide ou diploide.

[0081]O método e aparelho descritos aqui podem ser usados com uma quantidade de métodos adicionais que empregam material dentro de uma semente. Estes métodos adicionais incluem, mas não estão limitados a métodos para transformar material interno de semente haploide, diploide ou uma combinação de haploide e diploide, formando calos para a regeneração da planta, regenerar materiais de planta haploide/duplo haploide, ou análise de material genético, óleo, proteínas, amido, dados externos e semelhantes encontrados dentro deste material interno. Cada um destes métodos é melhorado através da extração rápida de material de semente que inclui embriPetição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 34/116

25/104 ões através da força produzida com um fluido.

[0082]Os métodos da invenção incluem um sistema de transformação de milho ou um sistema de formação de calos ou se uma parte dos embriões é suspeita de serem embriões haploides então um sistema de duplicação de cromossomos. O sistema de transformação e retirada é adaptado para produzir material de planta transformado. O sistema de produção de calos retirados é adaptado para produzir calos de plantas. Os embriões retirados para o sistema de duplicação de cromossomos são adaptados para produzir um material de planta duplo haploide. O material retirado pode ser empregado para induzir germinação precoce, ou para a geração de células ou DNA desejados, seleção in vitro, e processos de diminuição de vida útil.

TRANSFORMAÇÃO [0083]A presente invenção pode ser usada em plantas que não são necessariamente haploides induzidas, que são selecionadas ou descartadas devido à presença ou ausência de um marcador de cor. Quando usadas para fins de transformação as plantas podem ser haploides ou podem ser germoplasmas, naturais ou híbridas. A transformação da planta é um método de introduzir material genético através de métodos conhecidos tais como bombardeamento de partículas, bigode, eletroporação ou agrobactérias dentro de vários tecidos transformáveis de plantas. Um tecido transformável desejável é o escutelo de milho imaturo disponível em embriões de milho imaturos retirados. A retirada por lavagem pressurizada é um método para retirar rapidamente uma grande quantidade de embriões imaturos. Desta forma, a produção geral de transformação de laboratório pode ser aumentada, mas com custo e mão de obra reduzidos. Entretanto, devido ao pequeno tamanho destes embriões, eles podem ser difíceis de localizar dentro dos restos do material interno de semente, a menos que sejam empregados procedimentos de identificação e separação apropriados.

[0084]Quando a transformação é executada no embrião imaturo reti

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26/104 rado, o material genético tal como uma construção, plasmídeo, vetor, transgenia, cromossomo e semelhantes podem ser empregados para fornecer o material da planta dentro do embrião com uma quantidade de características diferentes tais como resistência ou tolerância (ou se desejado, suscetibilidade) a herbicida, inseto, vírus, bactéria, fungo, nematoide, aridez, calor, frio, congelamento, umidade excessiva, estresse salino e estresse oxidativo, tolerância a estresse ou características de valor agronômico aumentadas como produção, umidade, permanência verde, força do pedúnculo, aparência, esterilidade do macho, redução da secagem, sustentabilidade, ou diferentes perfis de produto tais como amido, proteína, potencial de produção de etanol, composição de aminoácidos, e outros semelhantes.

[0085]Embriões imaturos podem ser retirados das sementes de plantas transformadas. Estes embriões podem ser testados adicionalmente para confirmar a integração estável do material genético (sintético ou de outra forma ainda é definido como genético). Geralmente, o material genético que é transformado tem um evento que inclui algum tipo de marcador (o qual pode ser a transgenia-alvo ou uma transgenia adicional) que permite que o material desejado seja distinguido do material não desejado. Podem ser empregados tipos diferentes de marcadores que incluem marcadores detectáveis tais como codificação luciferase, genes de coral ou gene betaglucuronidase uidA (GUS) ou marcadores selecionáveis podem incluir seleção de manose (P.M.I.), resistência a antibióticos tais como canamicina, higromicina B, gentamicina ou resistência a herbicidas tais como glufosinato (genes bar ou pat) e glifosato (EPSPS; CP4) e outros conhecidos dos que são versados na técnica. Vários marcadores são mostrados nas Patentes americanas de Nos US 5.767.378, 5.550.318, 5.633.435, 5.780.708 e 6.118.047, todas aqui incorporadas por referência.

[0086]Métodos de transformação, protocolos para indução de calos embriogênicos, e protocolos de duplicação de cromossomos são bem co

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27/104 nhecidos por aqueles com conhecimentos comuns na técnica. Apesar disso, os seguintes ensinamentos destes processos são listados e incorporados por métodos de referência para preparar calos com materiais de plantas que incluem milho Patentes Americanas de Nos US 7.067.719, 6.730.824, 6.143.563, 5.134.074, transformar plantas através da introdução de DNA no genoma da planta inclui muitos métodos bem conhecidos na técnica tais como bombeamento de micro projéteis nas Patentes Americanas de Nos. US 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861,6.403.865, transformação mediada por agrobactéria que é ensinada nas Patentes Americanas de Nos US 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616, 5.981.840 e 6.384.301, transformação de bigode que é ensinada nas Patentes 5.302.523 e 5.464.765.

FORMAÇÃO DE CALOS E PLÂNTULA [0087]Os embriões retirados da invenção podem formar calos produzir calos ou proporcionar germinação e desenvolvimento de plântulas. Para alcançar isto, o material de embrião retirado é colocado em contato com mídia de cultura de tecido de planta tais como aquelas descritas por Murashige e Skoog (M.S medium), ou Chu e outros (N6 medium), ou Gamborg e outros (B5) ou outras misturas salinas de cultura de tecidos ou soluções hidropônicas (Hoegland), inclusive de fontes de carbohidrato (por exemplo, sacarose, maltose, etc.). Estes facilitam a germinação, crescimento e desenvolvimento rápidos das plântulas resultantes. Adicionalmente pode ser possível incluir uma ou mais citocininas hormônios de plantas (por exemplo, cinetina, zeatina, 6- benzilaminopurina, thiodiazuron) ou auxinas (por exemplo, 1,4- ácido diclorofenoxiacético, ácido acético alfa-naftaleno, indol-3-ácido butírico, indol-3-ácido acético) ou ácidos giberélicos (por exemplo, GA3) ou várias combinações de hormônios de plantas no meio de cultura de planta por dados períodos de tempo para 1) induzir desenvolvimento de calos embriogênicos a partir de escutelo ou eixo de embrião ou 2) para impactar a divisão

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28/104 de células dentro do gomo do meristema apical ou 3) aumentar o crescimento e desenvolvimento das plântulas resultantes. O calo embriogênico induzido pode ser transformado e/ou gerado para formar plantas e sementes. Alternativamente, as células, escutelo, gomo de meristema apical do embrião retirado ou o próprio embrião podem ser geneticamente modificados de desejado. Tal material pode ser transformado, mutagenizado, tratado quimicamente ou semelhante e depois disso empregado para regenerar uma planta, preferencialmente uma capaz de produzir pólen e sementes (a menos que a mudança desejada fosse esterilização).

ANÁLISE [0088]Embriões e outros materiais do interior da semente retirados por lavagem pressurizada podem ser analisados diretamente. A análise pode ser para a identificação, separação e seleção de: embriões ou outro material interno da semente. O fenótipo da semente tal como ceroso, ácido fítico alto ou baixo, óleo, proteína, aminoácidos, ou outras qualidades de amido do material da semente, ou um fenótipo associado unicamente com a presença ou ausência de uma transgenia.

REPRODUÇÃO [0089]O método de reprodução inclui as etapas de colheita precoce de espigas, extração dos embriões com um aparelho de extração rápida de embriões tal como a lavadora pressurizada mostrada nas figuras e análise do material extraído para seleção. Uma modalidade de método de processo de reprodução rápida compreende a seleção de transgenias no embrião através da colocação do embrião em mídia com agentes que selecionam transgenias. Verificou-se que estes embriões precoces podem ser selecionados para a presença de pelo menos dois e frequentemente três ou mais transgenias em uma única etapa de seleção mídia. Por exemplo, se são desejadas três transgenias no embrião e as transgenias no material de segregação podem ter um gene resistente a glifosato, e um marcador selecionável

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PMI (manose) associado com uma doença ou gene resistente a inseto, e um marcador ou gene selecionável Pat ou Bar, o material transgênico triplo desejado pode ser identificado através da colocação do embrião em mídia que compreende crescimento médio inclusive de glifosato, glufosinato, e manose. Os embriões que levam estes três marcadores irão sobreviver e os embriões sem um ou mais destes genes não irão sobreviver. Assim o material de reprodução ou linhagens de milho com estes três genes podem ser identificadas e selecionadas para uso adicional em bem poucos dias após a polinização da espiga.

[0090]Aquelas pessoas de conhecimento comum na técnica entenderão que qualquer quantidade de outros marcadores detectáveis ou selecionáveis e agentes, herbicidas, antibióticos, etc. associados podem ser empregados para detectar diferentes transgenias. Qualquer tipo de transgenia pode ser identificada dentro do embrião se existirem meios para selecionar ou detectar a transgenia dentro do escopo dos ensinamentos desta invenção.

[0091]A próxima geração de plântulas pode ser identificada com o uso de mídia de seleção dentro de 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 dias ou mais após a polinização. Este método de reprodução pode encurtar o tempo de reprodução de uma a três semanas relativo à colheita precoce da semente que não tem o embrião removido e germinação em uma plântula. Como será entendido por aqueles versados na técnica o aparelho para extração simultânea de embriões permite uma redução substancial em tempo e esforço dentro do ciclo de reprodução. Este processo também permite um método de teste de pureza de linhagens que não podem ser antecipadas para serem segregadas, ou que têm transgenias silenciadas.

FORMAÇÃO DA PLÂNTULA [0092]Os embriões retirados da invenção podem germinar e passar por desenvolvimento da plântula. Para alcançar isto, o material de embrião

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30/104 retirado é colocado em contato com a mídia de cultura de tecido de planta ou potencialmente inclusivo de hormônios de plantas tal como aqueles descritos acima na seção de Transformação. Estas mídias e/ou hormônios de plantas são selecionados para facilitar a germinação, crescimento e desenvolvimento rápidos das plântulas resultantes. Alternativamente o início da regeneração pode esperar e as células, escutelo, gomo de meristema apical podem ser geneticamente testados ou geneticamente mudados se desejado. Tal material pode ser transformado, mutagenizado, tratado quimicamente ou algo semelhante e depois disso empregado para regenerar uma planta, preferencialmente uma capaz de produzir pólen e sementes (a menos que esterilidade seja a mudança desejada).

ANÁLISE [0093]Os embriões retirados por lavagem pressurizada e outros materiais do interior da semente podem ser analisados diretamente. A análise pode ser para a identificação, separação e seleção de embriões ou outra material interno da semente. Pode ser determinado o genótipo da semente e/ou o fenótipo da semente tal como ceroso, níveis altos ou baixos de ácido graxo, amilase, esterilidade, baixo ou alto ácido fítico, óleo, proteína, aminoácidos, ou outras qualidades do amido do material da semente, ou um fenótipo associado unicamente com a presença ou ausência de uma transgenia. Baseado nestas determinações, certos embriões podem ser selecionados ou descartados. Esta análise da semente muito precoce proporciona substancial velocidade e eficiência de tempo de reprodução, esforço, custo de produção, uso de solo, e reprodução em geral. Através da colheita das sementes a partir do germoplasma de segregação no processo de reprodução dentro de poucos dias após a polinização o processo de reprodução leva substancialmente menos tempo para desenvolver material de milho útil. Esta janela de colheita precoce pode proporcionar a flexibilidade necessária para desenvolver a progênie mais rapidamente e proteger a colheita da semente se

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31/104 as condições climáticas não forem as desejadas. Uma vez que a espiga e colhida os embriões podem ser extraídos a partir do material e o material não do embrião tal como o pericarpo (DNA materno) e o endosperma podem ser identificados e testados para genótipos e fenótipos desejados. Baseado nestes testes ou outra análise do material da semente ou suas seleções de DNA podem ser feitas seleções a partir do material de reprodução. Esta seleção precoce reduz a quantidade de plantas plantadas, testadas, cultivadas ou colhidas na próxima estação.

HAPLOIDES DUPLICADOS [0094]Um sistema de extração de embriões de milho imaturo muito aperfeiçoado é uma etapa importante no processo de coleta de material haploide. Em termos de protocolo padrão de extração de embrião, uma espiga de milho de tamanho médio pode exigir que o típico trabalhador de laboratório gaste algo entre 20 minutos a 40 minutos para extrair e cultivar individualmente todos os embriões de uma única espiga. Entretanto, o uso do sistema de retirada com lavagem pressurizada reduz o tempo de retirada de embrião (tempo de processamento da espiga) para abaixo de aproximadamente 1 a 3 minutos por espiga.

[0095]A eficiência da extração de embrião é importante para os métodos de duplicação de cromossomo de milho haploide que incluem processos de reprodução haploide. Isto é particularmente verdade porque a frequência da indução de embrião haploide frequentemente é baixa. Por exemplo, uma variedade de indutores haploides tal como KEMS, ZMS, WS14, K.H.I., RWS, RWK-76, STOCK-6, etc. variam em taxas de indução de haploides, geralmente variando de aproximadamente 2% a 10%. Para detectar a semente haploide induzida, um sistema marcador fenotípico que emprega genes antocianina é incorporado dentro do pai macho indutor haploide. Uma quantidade de genes regulatórios (C1/P11 e R1/B1) e estruturais (A1, A2, Bz1, Bz, C2) são exigidos para expressão antocianina (Chen e Coe, Biochemical Ge

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32/104 netics 15:333 a 346, 1977, Procisi e outros, Plant Cell, 9:1547 a 1557, 1997, Taylor e Briggs, Plant Cell, 2:115 a 127, 1990, Dooner e outros, Annual Review os Plant Genetics, 25:173 a 199, 1991, Panavas e outros, Genetics, v153. 979 a 991, 1999, Styles, Maydica 38:127 a 133, Piazza e outros, Plant Physiplogy, 128:1077 a 1086, 2002, Cross e Alexander, Euphytica 33:577 a 582, 1984, Coe e outros 1988, The Genetics of Corn. 81 a 258, In: Sprague GF, Dudley JW (eds) Corn and Corn Improvement, 3^rd ed. Amer. Soc. Agronomy, Madison).

[0096]Geralmente, muitos indutores haploides se apoiam no uso de haplótipo marcador antocianina R-nj para permitir que haploides sejam identificados na semente através de expressão posicional da pigmentação antocianina. A semente haploide exibe pigmentação antocianina na no tecido de aleurona na capa ou coroa da semente, mas falta de pigmentação do escutelo do embrião. Alternativamente, as sementes diploides são pigmentadas em ambos os locais. Algumas vezes, a discriminação visual da expressão antocianina nas partes da semente pode ser problemática.

[0097]Uma lista de genes marcadores antocianina na semente incluem R-nj, R1-scm122, R1-scm2, R1-scm:3, R1-scm, R1- mb (aleurona marmorizada), R1-r:padrão, R1 -Randolph, R1-ch:Stadler, R1- d:Catspaw, A, C, R1-d:Arapaho, R1-nj, (R1-nj:Cudu), (R1-nj:Chase), R1- sc:124, R1-sup-R1supressível, R1 K10-II; R1 M-X1 , R1-ch, R1-g, R1-1sk, R1-r, R1-sc122, R1sc*5691, R1-sk:nc-2, R1-sk, R1-st. etc. e outros conhecidos na técnica. Alternativamente, outros marcadores antocianina fornecem identificação haploide no estágio de plântula baseados na presença ou falta de pigmentação nas raízes de plântulas de 3 a 5 dias de idade (ver Tyrnov e Zavalishina, DAN 276:735 a 738, 1984).

[0098]Dependendo da quantidade empregada de genes regulatórios conhecidos para expressão antocianina na semente, a coloração roxa na semente ou embrião aparecerá em diferentes estágios de maturidade da

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33/104 semente e embrião. Assim, nem todos os marcadores antocianina são úteis em um método de identificação de resgate de embriões haploides porque a cor de identificação não é evidente nos estágios iniciais do desenvolvimento do embrião. Foi descoberto que X26b - R1scm2 (base desconhecida), M242G = R1cm2 (base W22), X17F = R1 scm3, X19A = R1scm4, e X26C = R1 sc122 haplótipos marcadores de semente antocianina fornecem pigmentação escutelar dentro de 24 horas a pós o resgate do embrião imaturo (12 D.A.P). Adicionalmente, introgressão de haplótipo marcador antocianina R1scm2 dentro de um indutor haploide de milho permite a identificação de embriões haploides pelo menos através de 12 D.A.P. É possível que alguns dos marcadores de cor acima possam fornecer pigmentação escutelar até mesmo mais cedo.

[0099]A raridade desfavorável na indução de embriões de milho haploide torna cada embrião importante para fins de duplicação de cromossomos. A extração manual de embriões imaturos para o fim de produção de haploide duplicado é possível, mas devido a seu tamanho pequeno e grande quantidade de embriões haploides exigidos para programas de reprodução de duplo haploide, esta extração manual é muito problemática. Entretanto, a presente invenção acumula (em quantidades extremamente altas) a parte da planta mais adequada (o embrião imaturo) para uso na duplicação de cromossomos. O sistema de retirada de lavagem pressurizada retira o embrião imaturo com seu correspondente gomo imaturo. Este material de embrião retirado é material-alvo desejado para controle mitótico. O controle mitótico permite a duplicação dos cromossomos através da exposição a condições de cultura, a mídia, inclusão de produtos químicos ou hormônios para produzir haploides férteis duplicados de milho. Métodos de duplicação que empregam colchinina, óxido nitroso e outros produtos químicos são mostrados em Gayen e outros, Chromosome doubling in haploids through colchicine, Maize Genet. Coop. Newslett., 68 a 65,

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34/104 (www.agron.missouri.edu/mnl/68/101gayen.html), 1994, WAN and WIDHOLM, Plant Breeding 114 (3):253 a 255, 1995, Kato, Chromosome doubling of haploid maize seedlings using nitrous oxide gas at the flower primodial stage, Plant Breeding, 121:370 a 377, 2002, WO/2007/038075, e patente norte-americana de N^o US 7.135.615 incorporados aqui por referência. Desta forma, a presente invenção, o sistema de retirada por lavagem pressurizada aumenta o uso de haploides duplicados na reprodução de milho tanto pelo aumento da eficiência na extração do embrião por unidade de tempo como pela redução do custo da extração do embrião. Adicionalmente, o uso do haplótipo marcador de cor R1scm2 fornece a identificação de embriões haploides imaturos e, desta forma, fornece um marcador de cor altamente útil para identificação de embrião haploide imaturo. Estes embriões haploides imaturos podem ser usados para fins de duplicação de cromossomos.

[00100]Os exemplos seguintes que são fornecidos para ilustrar a invenção, e não tem a intenção de ser limitantes:

Exemplo 1: Extração e Germinação Precoce de Embriões Imaturos a partir de Embriões 12 D.A.P.

[00101]Este exemplo ilustra o uso de um sistema de carregamento de fluido para extrair/retirar embriões de milho imaturos de uma espiga de milho.

Esterilização do sistema de carregamento com fluido pressurizado:

[00102]Dezenove litros de solução de Clorox 10% (6,0% Hipoclorito de Sódio) foram recirculados continuamente através da bomba, tubo de distribuição, mangueiras, e sistema esterilizador UV mostrados nas Figuras 1A a C por aproximadamente 30 minutos. A solução de Clorox em seguida foi evacuada do sistema esgotando-a através da mangueira de pulverização e aparelho caixa (Figura 1A) e para dentro do dreno.

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35/104 [00103]Dezenove litros de água esterilizada foram circulados diretamente através do sistema e para fora pelo dreno.

[00104]Dezenove litros de água Millipore estéril ou água de torneira foram continuamente recirculados através do sistema de fluido inteiro do aparelho por 30 minutos e em seguida armazenados em um tanque até serem usado para a extração com fluido pressurizado dos embriões. Finalmente, o invólucro/aparelho de caixa de pulverização (Figura 1) foi lavado com 70% de etanol e deixado secar. O suporte de espiga, ponta de pulverização (distribuidor/bicos), e torquês usada para pegar a espiga forma esterilizados em etanol 70% por 5 a 10 minutos antes do uso e deixados secar.

Preparação da Espiga Imatura:

[00105]Cinquenta e uma espigas de milho imaturas foram colhidas da estufa 12 dias após a polinização (12 D.A.P.) e esterilizadas através da imersão das mesmas em solução de Chlorox 50% (Hipoclorito de Sódio 6%) durante 20 minutos. As espigas em seguida foram lavadas três vezes com água esterilizada em intervalos de cinco minutos para remover a solução de esterilização. Para preparar as espigas para e extração de embriões em uma capa de fluxo laminar, as capas de núcleo foram removidas com o uso de um bisturi esterilizado, tomando cuidado para não cortar dentro do eixo do embrião.

Extração de Embriões Imaturos [00106]Com o uso de torqueses esterilizadas, a espiga foi colocada dentro do aparelho de caixa de pulverização e mantida no lugar com o uso do suporte de espiga (Figura 1). O sistema de pulverização de líquido pressurizado foi ajustado através do tubo de distribuição para aproximadamente 6,33 kgf/cm² Com o uso do aparelho de suporte, a espiga foi girada ao mesmo tempo em que o bico distribuidor fez convergir uma pulverização de fluido na espiga. O fluido foi passado para trás e para frente sobre as superfícies cortadas do núcleo até que todos os embriões e conteúdo de endos

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36/104 perma fossem evacuados ou retirados da semente. Os embriões diploides e tecidos de endosperma foram coletados e em seguida drenados através de peneiras tanto de malha 10 como 20. Foi pulverizada água esterilizada sobre os embriões e restos coletados na peneira de malha 10, a fim de carregá-los através desta para captura na peneira de malha 20. Os embriões resultantes foram rapidamente transferidos para um filtro de papel saturado com 4 ml de líquido Murashige and Skoog (M.S.) de meio de cultura de tecido dentro de uma placa de Petri. Os embriões em seguida foram cultivados a 28°C em um nível de luz de 400 PPFD (densidade de Fluxo de Fótons Fotossintética) com um dia de 16 horas por um período de 3 dias.

Resultados:

[00107]Foram extraídos embriões de 51 espigas ao longo de um período de duas horas. Ao mesmo tempo em que a maior parte dos embriões ficou intacta, algumas peças escutelares foram rompidas de alguns embriões. A despeito do dano a alguma escutela, a maior parte das linhas centrais dos embriões permaneceram em uma condição viável em todas as espigas.

[00108]Os dados na Tabela 1 ilustram as taxas de germinação observadas entre os embriões de 25 espigas. Dado que todos os embriões foram extraídos em apenas uma hora, estes dados demonstram a eficiência do sistema tanto em termos de taxa de extração por unidade de tempo como de alto nível de germinação precoce observada entre os embriões de milho imaturos retirados.

Tabela 1. Resgate de Embriões e frequência de germinação a partir de 25 espigas

Número	Quantidade	Quantidade de Embri-	Percentual de Embri-
da Es-	de Embriões	ões Brotados 72 Horas	ões Brotados 72 Horas
piga	Extraídos	após a Extração	após a Extração
1	104	96	92,31%
2	209	200	95.69%

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Número	Quantidade	Quantidade de Embri-	Percentual de Embri-
da Es-	de Embriões	ões Brotados 72 Horas	ões Brotados 72 Horas
piga	Extraídos	após a Extração	após a Extração
3	89	89	100%
4	115	109	94,78%
5	142	138	97,18%
6	221	209	94,57%
7	112	105	93,75%
8	129	129	100%
9	109	108	99,08%
10	82	78	95,12%
11	99	97	97,98%
12	114	108	94,74%
13	153	152	99,35%
14	139	135	97,12%
15	116	112	96,55%
16	120	115	95,83%
17	92	91	98,91%
18	105	94	89,52%
19	123	122	99,19%
20	83	82	98,80%
21	203	202	99,51%
22	83	81	97.59%
23	124	123	99,19%
24	93	93	100%
25	112	111	99,11%
Totais	3071	2979	97,00%

Exemplo 2: Extração e Indução de Calos Embriogênicos a partir

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38/104 de embriões 9 DAP (dias após a polinização) [00109]A engenharia genética de algumas linhagens de milho foi baseada na utilização de embriões jovens (aproximadamente 9 D.A.P.). Estes embriões haploides eram muito pequenos, variando entre 0,5 a 1 mm de tamanho, e assim, eram mais frágeis do que os embriões 12 D.A.P. maiores e mais robustos (aproximadamente 1 a 2 mm de tamanho) descritos no Exemplo 1. Desta forma, o sistema de retirada por lavagem pressurizada foi avaliado no uso de uma linhagem de milho apropriada para a transformação e embriões imaturos de um tamanho adequado para a transformação em planta.

[00110]Tanto a desinfecção do sistema de lavagem pressurizada como das espigas de milho bem como a retirada por lavagem pressurizada de embriões imaturos foi conduzida como descrito no Exemplo 1. Entretanto devido à natureza mais frágil destes embriões menos maduros, foram avaliados os seguintes níveis de kgf/cm² da lavagem pressurizada com respeito à extração de embriões: 1,41, 2,11, 2,46, 2,81, 4,22, 4,92, 6,33. Os embriões imaturos extraídos foram avaliados para o grau de integridade e cultivo em meio de indução embriogênico de cultura de tecido No. 1 por 6 dias no escuro a 28°C. O isolamento da lavagem pressurizada de embriões que aparecem intactos/viáveis e resposta de embriogênicos são mostrados na Tabela

2.

Tabela 2. avaliação de vários níveis de pressão do fluido de lavagem pressurizada (kgf/cm²) com respeito a extração de embriões imaturos que aparecem intactos/viáveis e competência para resposta de embriogênicos friáveis

Nível da Lavagem pressurizada (kgf/cm2)	Retirada de Embriões Imaturos Aparecendo Intactos/Viáveis	Resposta de Embriogênicos Friáveis
1,41(20)	Sim	Sim
2,11(30)	Sim	Sim

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2,46(35)	Sim	Sim
2,81(40)	Sim	Sim
4,22(60)	Sim	Não
4,92(70)	Sim	Não
6,33(90)	Sim	Sim

[00111]Os embriões imaturos que aparecem intactos/viáveis foram isolados em todos os níveis de lavagem pressurizada (kgf/cm²). Adicionalmente, as respostas de embriogênicos friáveis foram observadas em todos exceto dois níveis de pressão (kgf/cm²) da lavagem pressurizada. Estes dados indicaram que o sistema de lavagem pressurizada foi adequado para o isolamento de embriões de classe de tamanho apropriado para transformação de milho e adicionalmente, que estes mesmos embriões são capazes de resposta de embriogênicos friáveis após o processo de retirada por lavagem pressurizada.

Exemplo 3: Extração de supostos embriões haploides (18 a 20 D.A.P.) [00112]Linhagens de milho de indutores haploides tais como K.H.I., RWS, RWK-76, e ZMS podem ser utilizadas como pais de polens para induzir o desenvolvimento de núcleos haploides maternos. As linhagens de indutores haploides acima mencionadas carregam o local de pigmento antocianina R-nj que confere coloração em ambos o embrião e aleurona dentro do núcleo do milho. Os núcleos haploides marcadores R-nj podem ser identificados através de um padrão de pigmentação antocianina único em que o embrião haploide era substancialmente sem cor e em que a aleurona na região da casca do núcleo era pigmentada. De fato o embrião pode ter um coleóptilo levemente colorido e ainda ser um haploide. O escutelo do embrião é o material que deve permanecer sem cor. Ao contrário, os embriões diploides têm pigmentação antocianina tanto nos embriões como na aleurona. O início da pigmentação do núcleo tanto na estufa bem como no campo foi va

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40/104 riável, em parte devido a condições ambientais, mas em geral começa aproximadamente 18 a 20 D.A.P. em nosso local de pesquisa.

[00113]Os esforços prévios de extração de embriões têm demonstrado que é possível diferenciar embriões haploides de diploides baseado na falta de pigmentação do embrião aproximadamente 24 horas após a extração manual de embriões a partir de núcleos de 18 a 20 D.A.P. Portanto, o sistema de lavagem pressurizada foi avaliado para determinar se embriões que representam este grau de maturidade cronológica podem ser extraídos e germinados, e igualmente se embriões haploides podem ser identificados após a extração.

[00114]Tanto a desinfecção do sistema de lavagem pressurizada como as espigas de milho bem como a retirada por lavagem pressurizada de embriões semi-imaturos foi conduzida como descrito no Exemplo 1.

[00115]Foram usados alguns indutores haploides como pais de pólen para cruzar sobre as espigas de diferentes linhagens de milho. Sabia-se que estas linhagens de milho não exibem qualquer pigmentação antocianina no núcleo. Foram colocadas espigas de 18 a 20 D.A.P. dentro do aparelho de lavagem pressurizada e foi usada uma pressão de 6,33 kgf/cm² para extrair embriões grandes (aproximadamente de 2 a 4 mm) dos núcleos. Os embriões de cada espiga foram cultivados separadamente em filtros de papel saturados com 5,5 ml de meio de cultura de tecido M.S. líquido, inclusive 100μΜ de ácido abscísico, e incubados em uma câmara de crescimento controlada a 28°C. Iluminação fluorescente (16 hr/dia, 400 pmol m^-2 s^-1) foi colocada tanto acima como abaixo dos embriões cultivados. Durante o período noturno, os embriões foram mantidos no escuro. Na manhã seguinte, embriões supostamente haploides pigmentados e não pigmentados foram identificados, e os resultados estão sumarizados na Tabela 3. Os embriões haploides identificados podem ser tratados para induzir produção de haploide duplo, plantado e desenvolvidas plântulas.

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41/104 [00116]Os dados na Tabela 3 indicam que núcleos de 18 a 20 D.A.P. compostos de embriões quase maduros, os quais estavam embutidos em tecido endosperma relativamente firme, ainda foram capazes de serem extraídos do núcleo como sistema de lavagem pressurizada. Além disso, estes dados também demonstram que embriões supostamente haploides como identificados pela sua falta de pigmentação escutelar também podem ser extraídos eficientemente com o protocolo de lavagem pressurizada. A taxa indução presumida observada in vitro corresponde à taxa de indução in vivo predita. Um fenótipo de planta haploide foi observado em quase todas as plantas derivadas de embriões supostamente haploides, o que indica a utilidade do marcador de fenótipo escutelar R-nj na identificação de embriões haploides de 18 a 20 D.A.P. As Figuras 4 e 5 ilustram que embriões de 18 a 20 D.A.P. extraídos com o processo de lavagem pressurizada foram prontamente capazes de germinar e se desenvolver em plântulas e plantas normais, respectivamente.

Tabela 3. Isolamento por lavagem pressurizada de embriões de 18 a 20

D.A.P. e resultados de indução de supostos haploides

Identificação	Idade DAP	Quantidade de	Quantidade de Embriões
da Espiga Fê-	do Embrião	Embriões Ex-	Supostamente Haploides
mea	Extraído	traídos	Não Pigmentados
1	19	111	20
2	20	107	11
3	19	42	10
4	20	22	2
5	19	94	13
6	19	118	14
7	20	56	6
8	20	72	0
9	20	47	2

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Identificação	Idade DAP	Quantidade de	Quantidade de Embriões
da Espiga Fê-	do Embrião	Embriões Ex-	Supostamente Haploides
mea	Extraído	traídos	Não Pigmentados
10	20	122	2
11	18	52	6
12	18	40	2
13	18	20	3
		Total 903	Total 91

Exemplo 4: Fertilidade de Plantas derivadas de Embriões Imaturos extraídos por Lavagem pressurizada [00117]A capacidade de produção de sementes de plantas derivadas do processo de extração de embriões imaturos por lavagem pressurizada é um fator importante no resgate de embriões. Com a utilização protocolos para a desinfecção do sistema de lavagem pressurizada e das espigas de milho bem como o método para retirada de embriões imaturos por lavagem pressurizada como descrito no Exemplo 1 acima, foram extraídos embriões diploides imaturos e colocados em um filtro de papel saturado com 5,5 ml de meio de cultura de tecido líquido M.S. e cultivados a 28°C sob luz fluorescente. De quatro a seis dias após a extração, as plântulas foram transplantadas para o solo e cresceram até a maturidade pesquisa de fertilidade.

Resultados:

[00118]As plantas derivadas do processo, de resgate de embriões por lavagem pressurizada, descrito acima foram férteis. Exemplos de produção de núcleo na extrusão de espiga e antera de um pendão são fornecidos nas Figuras 6 e 7, respectivamente.

Exemplo 5: Genes Marcadores de Pigmentação R-Locus e Pigmentação Precoce do Escutelo de Milho Imaturo [00119]Foram plantadas sementes representativas dos genes/haplótipos de milho marcadores de pigmentação R-locus R1scm2

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43/104 (X26B), R1xcm2 (M242G), R1scm3 (X17F), e R1sc122 (X26C) no campo e as plantas resultantes foram autopolinizadas. As espigas resultantes foram colhidas do campo 12 dias após a polinização (12 D.A.P.) e esterilizadas como descrito no exemplo 1. Embriões diploides imaturos foram extraídos em seguida a mão com o uso de um bisturi metálico e colocados em uma placa Petri revestida com um filtro de papel saturado com 2 ml do meio de cultura de tecido líquido M.S. As placas de embriões imaturos foram em seguida colocadas dentro de uma câmara de crescimento controlada a 28 °C com iluminação fluorescente (16 horas/dia, 400 pmols m^-2 s^-1) situada tanto acima como abaixo dos embriões cultivados.

Resultados:

[00120]No momento da extração dos embriões, não era observável nenhuma pigmentação antocianina tanto a olho nu como com o uso de microscópio de dissecar em qualquer dos embriões imaturos que representam cada um dos quatro haplótipos R-locus de milho. Entretanto, aproximadamente 24 horas depois, foi prontamente observada pigmentação precoce antocianina muito escura no tecido escutelar de cada embrião cultivado. Todas as linhagens de haplótipos R-locus demonstraram pigmentação escutelar muito forte.

Exemplo 6: Impacto da metodologia de Extração de Embriões Imaturos no Crescimento das Plântulas [00121]Espigas de milho (aproximadamente 12 D.A.P.) representando uma variedade de linhagens de milho foram colhidas da estufa e esterilizadas como descrito no Exemplo 1. Embriões diploides imaturos foram extraídos randomicamente dos núcleos ou através de (1) extração manual como descrito no Exemplo 5 ou (2), retirados e coletados pelo processo de extração por lavagem pressurizada ilustrado no Exemplo 1. Em cada caso, os embriões extraídos de cada espiga foram colocados em placas Petri revestidas com um filtro de papel saturado com 2 ml do meio de cultura de tecido

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44/104 líquido M.S. As placas de embriões imaturos foram em seguida colocadas dentro de uma câmara de crescimento controlada a 28 °C. No caso dos embriões retirados por lavagem pressurizada, 20 embriões foram selecionados randomicamente e foram movidos para uma segunda placa sem qualquer resto de endosperma, mas novamente contendo um filtro de papel saturado com 2 ml do meio de cultura de tecido líquido M.S. Foi situada iluminação fluorescente (16 horas/dia, 70 pmol m^-2 s^-1) acima das placas de embriões. Depois de alguns dias de cultura, o comprimento dos coleóptilos foi medido para cada embrião em cada grupo de tratamento.

Resultados:

[00122]Os dados de comprimento de coleóptilos apresentado nas Tabelas 4 e 5 ilustram que as plântulas derivadas de lavagem pressurizada crescem a uma taxa que é comparável àquela observada dos embriões extraídos manualmente.

Tabela 4. Comprimento do coleóptilos como função do método de extração/cultura do embrião

Método de Extração	Quantidade de Embriões	Comprimento Médio do Coleóptilo
Espiga #1
Extração Manual	22	8,4
Extração por Lavagem pressurizada	54	9,3
Espiga #2
Extração Manual	20	6,4
Extração por Lavagem pressurizada	44	9,4

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45/104

Espiga #3
Extração Manual	20	16,.2
Extração por Lavagem pressurizada	46	13,4
Espiga #4
Extração Manual	20	7,9
Extração por Lavagem pressurizada	28	10,6

Tabela 5. Análise estatística do comprimento do coleóptilo (teste de Estudantes T das Diferenças de Meios LS)

Método		Tamanho do Coleóptilo (mm) Método dos Mínimos Quadrados
Extração por Lavagem pressu- rizada	B	10,7
Extração Manual	B	9,8

Exemplo 7: Utilidade do Marcador Haplótipo R1scm2 para Identificar Embriões de Milho Haploide Imaturos [00123]Uma linhagem de milho conhecida por não condicionar pigmentação antocianina precoce em embriões imaturos foi plantada na estufa e polinizada com pólen de um indutor haploide que contém o marcador de cor haplótipo R1scm2. Espigas (aproximadamente 12 D.A.P. (dias após polinização) foram esterilizadas como descrito no Exemplo 1 e extraídas a mão como descrito no Exemplo 5. Todas as placas de embriões imaturos foram em seguida colocadas dentro de uma câmara de crescimento controlada a 28°C. Foi situada iluminação fluorescente (16 horas/dia, 70 pmol m^-2 s^-1) sobre as placas de embriões> aproximadamente 24 horas após a extração dos embriões imaturos, os embriões foram registrados em relação a pigmentação antocianina. Os embriões foram deixados brotar nas mesmas placas e

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46/104 condições de cultura e eventualmente foram transplantados para a estufa. Resultados:

[00124]Aproximadamente 24 horas após a extração, a maior parte dos embriões estava intensamente pigmentada em sua região escutelar como condicionado pela presença do marcador de pigmentação R1scm2. Entretanto, uma quantidade significativa de embriões haploides supostamente haploides não pigmentados também foi observada e relatada na Tabela 6.

Tabela 6. Taxas de identificação de supostos haploides imaturos (não pigmentados) em uma base por espiga

Número da Espiga	Quantidade Total de Embriões Extraídos	Quantidade de Embriões Não Coloridos (Supostos Haploides)	Frequência de Embriões Não Coloridos (Indução de Supostos Haploides)
1	81	13	16,0%
2	54	4	7,4%
3	81	13	16,0%
4	57	11	19,3%
5	93	22	23,6%
6	99	10	10,1%
7	89	11	12,3%
8	46	17	36,9%
9	51	11	21,5%
10	83	10	12,0%
11	56	4	7,1%
12	82	2	2,4%
13	63	14	22,2%
14	29	7	24,1%
15	69	17	24,6%

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47/104

16	87	16	18,3%
17	69	25	36,2%
18	71	21	29,5%
19	38	8	21,0%
Total / Média.	1298	236	18,18%

[00125]Os embriões supostamente haploides germinados prontamente sob as condições descritas acima. Aproximadamente 200 plântulas supostamente haploides foram avançadas para a estufa e observadas em relação à estatura e esterilidade do macho a fim de discriminar entre as condições de ploidia haploide e diploide. Como uso deste critério, 294 de 200 plantas foram identificadas como sendo verdadeiras haploides. Estas observações indicaram que o uso do marcador de cor haplótipo R1scm2 em um indutor haploide de milho pode ser altamente efetivo na identificação de embriões haploides imaturos (12 D.A.P.) dentro de 24 horas após a extração do núcleo.

Exemplo 8: Retirada por Lavagem pressurizada, Pigmentação Escutelar Derivada de R1scm2, e Identificação de Embrião Haploide Imaturo [00126]Uma linhagem de milho conhecida por não condicionar pigmentação precoce em seus embriões imaturos foi plantada na estufa e polinizada com pólen de um indutor haploide de milho que contém o haplótipo R1scm2. Espigas foram colhidas aproximadamente 12 D.A.P. e esterilizadas como descrito no Exemplo 1. Embriões imaturos foram randomicamente extraídos do núcleo ou por (1) extração manual como descrito no Exemplo 5 ou (2), retirados e coletados através do processo de extração por lavagem pressurizada ilustrado no Exemplo 1. Os embriões imaturos extraídos manualmente foram cultivados em uma pequena placa Petri em camadas com filtro de papel saturado com 1 ml de meio de cultura de tecido líquido M.S. Alternativamente, os embriões extraídos por lavagem pressurizada de cada

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48/104 espiga foram colocados em placas Petri revestidas com filtro de papel saturado com 5 ml de meio de cultura de tecido líquido M.S. A partir das placas que contém embriões imaturos derivados de lavagem pressurizada e imediatamente depois do processo de retirada, 10 embriões por espiga foram subcultivados para novas placas em camadas com um filtro de papel ou com 5 ml ou com 2,5 ml de meio líquido M.S. Todas as placas de embriões imaturos foram em seguida colocadas dentro de uma câmara de crescimento controlado a 28^OC. Foi situada iluminação fluorescente (16 horas/dia, 70 pmol m² s^-1) sobre as placas de embriões. Aproximadamente 24 horas após a extração dos embriões imaturos, os embriões foram registrados em relação a pigmentação antocianina.

Resultados:

[00127]A observação da expressão antocianina escutelar R1scm2 em embriões diploides cultivados em um filtro de papel com 5 ml de meio M.S. líquido e na presença de restos de endosperma indicou que aqueles embriões imaturos tiveram pigmentação antocianina escutelar de fraca a moderada. Alternativamente, os embriões diploides derivados da lavagem pressurizada subcultivados em um filtro de papel saturado com 5 ml de meio líquido M.S. e na ausência de restos de endosperma, ficaram coloridos mais intensamente. Os embriões derivados de lavagem pressurizada subcultivados em um filtro de papel contendo 2,5 ml de meio líquido M.S. ficaram pigmentados muito intensamente e comparáveis em coloração aos embriões extraídos a mão pigmentados intensamente, o que serviu como um controle de referência. Em ambos os grupos de extração manual e lavagem pressurizada (2,5 ml M.S.), embriões imaturos supostamente haploides (não pigmentados) puderam ser prontamente observados dentro de 24 horas após a extração dos embriões dos núcleos.

Exemplo 9: Retirada por Lavagem pressurizada, Pigmentação Escutelar Derivada de R1scm2, e Identificação de Embrião Haploide Imaturo

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49/104 [00128]Uma linhagem de milho conhecida por não condicionar pigmentação precoce em seus embriões imaturos foi plantada na estufa e polinizada com pólen de um indutor haploide de milho que contém o haplótipo R1scm2. Espigas foram colhidas aproximadamente 12 D.A.P. e esterilizadas como descrito no Exemplo 1. Embriões imaturos foram randomicamente extraídos do núcleo ou por (1) extração manual como descrito no Exemplo 5 ou (2), retirados e coletados através do processo de extração por lavagem pressurizada ilustrado no Exemplo 1. Os embriões imaturos de controle extraídos manualmente foram cultivados em uma pequena placa Petri em camadas com filtro de papel saturado com 1 ml de meio de cultura de tecido líquido M.S. Alternativamente, os embriões extraídos por lavagem pressurizada de cada espiga foram colocados em placas Petri revestidas com filtro de papel saturado com 5 ml de meio de cultura de tecido líquido M.S. A partir das placas que contém embriões imaturos derivados de lavagem pressurizada e imediatamente depois do processo de retirada, 10 embriões por espiga foram subcultivados para novas placas em camadas com um filtro de papel ou com 5 ml ou com 2,5 ml de meio líquido M.S. Todas as placas de embriões imaturos foram em seguida colocadas dentro de uma câmara de crescimento controlado a 28°C. Foi situada iluminação fluorescente (16 horas/dia, 70 pmols m^-2 s^-1) sobre as placas de embriões. Aproximadamente 24 horas após a extração dos embriões imaturos, os embriões foram registrados em relação à pigmentação antocianina.

Resultados:

[00129]A observação da expressão antocianina escutelar R1scm2 em embriões diploides cultivados em um filtro de papel com 5 ml de meio M.S. líquido e na presença de restos de endosperma indicou que aqueles embriões imaturos tiveram pigmentação antocianina escutelar de fraca a moderada. Alternativamente, aqueles embriões diploides derivados da lavagem pressurizada subcultivados em um filtro de papel saturado com 5 ml de meio

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50/104 líquido M.S., mas na ausência de restos de endosperma, ficaram coloridos mais intensamente. Os embriões derivados de lavagem pressurizada subcultivados em um filtro de papel contendo 2,5 ml de meio líquido M.S. ficaram pigmentados muito intensamente e comparáveis em coloração aos embriões extraídos a mão pigmentados intensamente. Em ambos os grupos de extração manual e lavagem pressurizada (2,5 ml M.S.), embriões imaturos supostamente haploides (não pigmentados) puderam ser prontamente observados dentro de 24 horas após a extração dos embriões dos núcleos.

[00130]Avaliação da Pigmentação: Cor uniforme.

Propósito:

[00131]A experimentação foi feita para observar a pigmentação na expressão escutelar (R-nj, R1scm2, e outras) em linhagens de milho de bases diferentes e adicionalmente, uma linhagem de milho doce e outros haplótipos R locus. Algumas das linhas são conhecidas por conter um gene(s) de inibição de antocianina que vence a expressão R-nj. O propósito primário deste experimento foi avaliar a utilidade de R1scm2 da profundidade e largura do germoplasma Syngenta.

M&M:

[00132]O germoplasma para avaliação de pigmento foi fornecido. Seneca 60, uma linhagem de milho doce, e várias linhagens de cor uniforme também foram avaliadas, incluindo linhagens que tinham vários graus de inibição de cor. O germoplasma adaptado aos EUA e Canadá, Seneca 60 e linhagens de cor uniforme (M242G= R1scm2 in W22, X17F =R1scm3, X19A = R1sc124, X26C = R1sc122) foram amadurecidas no campo e polinizadas com pólen ou de X26B ou RWK BC1 (separando 1:1 para R-nj/R1scm2) ou no caso de haplótipos R locus, foram autofecundadas. As linhagens dos EUA foram amadurecidas em Janesville Wisconsin e também foram cruzadas com pólen da mesma linhagem heterozigoto RWK. Toas as espigas foram colhidas 12 a 13 dias depois da polinização. As espigas foram enviadas

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51/104 de um dia para o outro (em embalagens resfriadas) para outro local. As espigas foram esterilizadas em Clorox 50% água de torneira 50% por 20 minutos e em seguida passaram por 3 lavagens de água de 5 minutos cada. As espigas tiveram suas capas do núcleo removidas com um bisturi esterilizado e os embriões foram extraídos a mão com o uso de uma espátula esterilizada em uma capa de fluxo laminar. Todo o Z.E. foi colocado em placas Petri de 100 mm contendo um filtro de papel saturado com 3 ml de líquido M.S. + 3% de mídia de sacarose e colocada em um conjunto Percival com luz fraca com 16 horas/dia e 28°C. Em alguns casos, foi usado meio M.S. + 100 uM ABA para tentar aumentar a pigmentação.

[00133]Pontuação da intensidade com a seguir:

= Fácil de pontuar: escutelo intensamente pigmentado de um dia para o outro ou em 24 horas após e extração.

= Pontuável : Pigmentação escutelar reduzida comparada a acima, mas OK.

= Não fácil de pontuar: Pigmentação fraca ou parcial do escutelo -> difícil de distinguir da ausência de pigmentação.

[00134]Mistura dos fenótipos escutelares: 1+2, 2+3

Resultados:

[001351Germoplasma dos EUA: AA2359, AF3050, AF3448, AF4543, AF5108, AD1108, AX5290, GJ7031, DC4015, DD4153, DI4214, FA4211, FA4734, FF6096, FX6022, FX6305, HI4630, HI5723, IC3423, ID2072, ID2568, ID3260, ID3374, ID3461, ID5016, ID5199, IJ7010, LD7214, LL6011, LL6622, XA5489, XO5744. Em todos os casos, o haplótipo R1scm2 locus forneceu pigmentação escutelar razoável. Surgiu separação Mendeliana.

[001361Como observado previamente, as linhagens variaram em seus graus de inibição de cor. Linhagens de cor não inibida tais como GENU 530, GENU632, GENU635, GENU 539, GENU012, Z12945 pareceram ter boa pigmentação escutelar com R1scm2. Linhagens de cor inibida: GENU625 e

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GENU624 pigmentadas um pouco acima (mais do que R-nj) em escutelar imaturo e foi aumentada a expressão (pelo menos o 625) com ABA, o GENU108 teve pigmentação aleurona inferior e pigmentação escutelar OK com R-nj em embriões mais velhos e boa pigmentação do embrião e aleurona com R1scm2, O FSNU929 não funcionou bem (não foi usado ABA), mas embriões R-nj mais velhos pareceram pigmentar bem, o FPWR284 não funcionou bem. Conclusão: o R1scm2 fornece algum possível otimismo com algumas, mas não em todas as linhagens de cor inibida. Em alguns casos ABA pode facilitar a pigmentação em germoplasma de cor inibida. Seneca 60: foi observada boa pigmentação escutelar.

Germoplasma Canadense: As seguintes linhagens foram usadas como fêmeas com a fonte de germoplasma RWK BC1 que foi separada 1:1

para R1scm2, 500160, 500065, 500160, 500115,500234, 500129, 500143.
Separação em geral através de uma quantidade de espigas por genótipo fêmea. Genótipo	No. de Embriões Roxos	Total de Embriões Cultivados
500129	67	150
500161	21	60
500165	46	90
500143	9	70
500060	20	60
500160	45	90
500115	33	120
500234	90	180
500065	63	160

[00137]O 500143 pareceu ser problemático com respeito à penetrância e expressividade da pigmentação.

Outros haplótipos R: Foi observada boa pigmentação escutelar em M242G= R1scm2 em W22, X17F =R1scm3, X19A = R1sc124, X26C =

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R1sc122. Note-se que R1sc122 teve pigmentação muito bonita de embriões muito imaturos.

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Dados Completos:

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	Boa expressão R- nj	Boa expressão R- nj	Boa expressão R- nj
CN				X-
30.10%	O	O	O	39.60%
CO	o	o	o	y— CN
Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Muito brilhante
26	20	20	20	53
30	20	20	20	50
	SIB	SIB	SIB
BC1 (P) #2	PBJ (W)	PBJ (W)	PBJ (W)	BC1 (P) #7
X	X	X	X	X
GENU530	PBJ (W)	PBJ (W)	PBJ (W)	Z21
13DAP		Avaliado 5/7

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Notas
Intensidade	CM +	CX1	X-	CM + T-
% Roxo	46.60%	36.60%	30%	26.70%
# Escutela Roxa	y—		σ>	OO
Aleurona (cor da capa)	c i Q C (D O '5 2 E °· jò > =ξ o ra ω ω	rà Á ro . t ω -S o ra ra o O o E Q	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	Ο CO	O CO	O CO	O CO
o > < LU N	ο CO	o CO	o CO	o CO
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #7	BC1 (P) #7	BC1 (P) #7	BC1 (P) #7
	X	X	X	X
Fêmea	500129	500129	500115	500115
Data

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Não está pronto	z E E Φ ™
TODO	O CO
BC1 (P) #7	BC1 (P) #7
X	X
RWK	GENU632
23-Jun

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Notas			R1scm2 Bloqueado	R1scm2 Bloqueado
Intensidade	y-	y-			y-	CN +
% Roxo	50%	56.60%	O	O	40%	50%
# Escutela Roxa		y-	o	o	CM	LO
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	22	30	30	30	30	30	Não está pronto
o > < LU N	30	30	30	30	30	30	30
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #7	BC1 (P) #7	BC1 (P) #3	BC1 (P) #3	BC1 (P) #3	BC1 (P) #3	BC1 (P) #4
	X	X	X	X	X	X	X
Fêmea	GENU632	GENU539	FSNU929	FSNU929	Z12945	500160	500065
Data	Colheita	5 de julho	quinta feira	12 DAP		Avaliado 6/7

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		CM +
		40%	16.60%
		CXl	m
		Sem Cor	Sem Cor
Não está pronto	ζ E E Φ ™	O co	O co
O co	O co	o co	o co
BC1 (P) #4	BC1 (P) #4	BC1 (P) #2	BC1 (P) #2
X	X	X	X
500165	500165	500160	500115

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Notas	Embriões pequenos		Boa expressão R- nj	Boa expressão R____________nj____________	MUITO Boa expressão R-nj	MUITO Boa expressão R-nj	Boa expressão R- nj
Intensidade	CM +
% Roxo	36.60%		O	O	O	O	O
# Escutela Roxa			o	o	o	o	o
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	30		30	30	30	30	30
o > < LU N	30		30	30	30	30	30
SIB, uniforme			UNI- FORME	UNI- FORME	UNI- FORME	UNI- FORME	UNI- FORME
Macho	BC1 (P) #2		PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (W)
	X		X	X	X	X	X
Fêmea	500115		PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (W)
Data			24-Jun		Colheita	6 de julho	sexta feira

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	Boa expressão R- nj
					CM +
	O			26.70%	36.70%	30%
	o			CO		O)
Sem Cor	Sem Cor			Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
	O CO	Não está pronto	Não está pronto	O CO	O CO	O CO
	o CO	TODO	_1 _1 <	o CO	o CO	o CO
	UNIFORME
	PBJ (W)	RWK	RWK	BC1 (P) #2	BC1 (P) #2	BC1 (P) #2
	X	X	X	X	X	X
	PBJ (W)	BC1 (P) #2	BC1 (P) #1	GENU632	500234	500065
13DAP		Avaliado 7/7

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Notas
Intensidade	CN +		CN +
% Roxo	60%	53.30%	40%	35.90%	40%	40%
# Escutela Roxa	CO	CD	CM	28	CM	CM
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	rá A c? ui ω £ f , — c ç o ra 2 § O o E Q	Sem Cor	Muito brilhante	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	O co	O co	O co	00	O co	O co
o > < LU N	o co	o co	o co	TODO	o co	o co
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #2	BC1 (P) #8	BC1 (P) #3	BC1 (P) #7	BC1 (P) #4	BC1 (P) #4
	X	X	X	X	X	X
Fêmea	500160	500129	500161	RWK	500065	500165
Data				De 5/7	De 5/7	De 5/7

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	Ou bom R-nj ou mau R1scm2 em 2 ZE
X-	CN + T-		X-
48.30%	6.60%		50%
42	CXI		LO
Muito brilhante	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
OO	30	Não está pronto	30
TODO	30	TODO	30
	UNI- FORME
RWK	PBJ (Y)	BC1 (P) #1	BC1 (P) #1
X	X	X	X
BC1 (P) #7	PBJ (Y)	KHI B	GENU012
25-Jun		Colheita	7 de julho

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Notas
Intensidade				2+3
% Roxo	42%			30%	30%	30%
# Escutela Roxa	00			03	03	03
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	rò A ro c; £ ω £ o ra J) 2 O o E Q
ZE Extraído	CD		Não está pronto	O CO	O CO	O CO	Não está pronto
o > < LU N	O CO		O CO	o CO	o CO	o CO	O CO
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #1		BC1 (P) #1	BC1 (P) #1	BC1 (P) #1	BC1 (P)#1	BC1 (P)#1
	X		X	X	X	X	X
Fêmea	GENU012		GENU530	500143	500060	500065	CO o o IO
Data	Sábado	12DAP		Avaliado 9/7

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 74/116

65/104

	36.85%	37.50%
	LO CO	CO co
	Muito brilhante	Muito brilhante
i 8 £ | 5 E E φ <= Ό	LO 03	00 00
O CO	TODO	TODO
BC1 (P) #1	RWK	RWK
X	X	X
NRWS	BC1 (P) #2	BC1 (P) #1
	De 6/7	De 6/7

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 75/116

66/104

Notas
Intensidade						CO			CO
% Roxo	38.50%		36.70%	50%	50%	20%	O		33.30%
# Escutela Roxa	40			LO	LO	CD	o		O
Aleurona (cor da capa)	Muito brilhante		Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	104		30	30	30	30	30		30
o > < LU N	TODO		30	30	30	30	30		30
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #2		BC1 (P) #8	BC1 (P) #8	BC1 (P) #8	BC1 (P) #8	BC1 (P) #8		BC1 (P) #8
	X		X	X	X	X	X		X
Fêmea	RWK		500060	Z12945	Z12945	FSNU929	FSNU929		FSNU929
Data			26-Jun		Colheita	8 de julho	ob -UILUOQ	12DAP

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 76/116

67/104

CN +	y~	CN +
46.70%	46.70%	30%
y—		Oi
Sem Cor	2 A ro <= lE ω ~ . c ç o ro 2 2 ü o E Q	rà A ra lE ω £ f o ra 2 2 Q o E Q
O CO	O CO	O CO
o CO	o CO	o CO
BC1 (P) #8	BC1 (P) #7	BC1 (P) #1
X	X	X
GENU632	500065	500161
Avaliado 9/7		<υ Q

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 77/116

68/104

Notas
Intensidade	X-			X-		X-	X-
% Roxo	46.20%	42.90%		40.70%		CO	43.90%
# Escutela Roxa	CO	CN				X-	O CD
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor		Muito brilhante	Muito brilhante	Muito brilhante	Muito brilhante
ZE Extraído	CO	CD LD		CN		aa	205
o > < LU N	o CO	TODO	TODO	TODO	TODO	TODO	TODO
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #1	BC1 (P) #1		BC1 (P) #6		BC1 (P) #3	K13
	X	X		X		X	X
Fêmea	GENU530	KHI B		RWK		RWK	BC1 (P) #8
Data	(D Q	De 7/7		27-Jun		Colheita	9 de julho	segunda feira

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 78/116

69/104

12DAP		Avaliado 10/7

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 79/116

70/104

Notas
Intensidade
% Roxo	40%	52.80%
# Escutela Roxa	40	00 CO
Aleurona (cor da capa)	rò A ra -o í ω £ f O o E “	rà A ro t ω S o ro ® S O ° E
ZE Extraído	100	CN	1 8 * Ι E E aí <=
o > < LU N	TODO	TODO	O CO
SIB, uniforme			UNI- FORME
Macho	BC1 (P) #8	BC1 (P) #4	PBJ (Y)
	X	X	X
Fêmea	RWK	RWK	PBJ (Y)
Data	28-Jun		Colheita

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 80/116

71/104

X-	X-
40%	51.10%
CM	23
rá ό ra o lE ω £ -S o ra ra o O u E	rà Á ra . lE ω £ f o ra ra o O o E a
O CO	ΙΛ
o in	O m
BC1 (P) #8	BC1 (P) #3
X	X
Z21	Z21
10 de julho	terça feira

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 81/116

72/104

Notas			Cor em apenas uma auréola em volta do perímetro
Intensidade			2+3
% Roxo	63.60%		36.60%
# Escutela Roxa
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor
ZE Extraído		1 M G E E ®	o co
o > < LU N	o co	O CO	o co
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #3	BC1 (P) #3	BC1 (P) #3
	X	X	X
Fêmea	GENU108	GENU108	GENU625
Data	13DAP		Avaliado 11/7

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 82/116

73/104

		CM + T-	CM + T-
	40%	63.30%	50%
	O OI	CD	LO
	rá o lE ω £ £ o ra 9 O u E
i Μ 1 s E E φ <= Ό	O LO	O CO	O CO
O CO	o 10	o CO	o CO
BC1 (P) #3	K13	BC1 (P) #6	BC1 (P) #6
X	X	X	X
GENU625	BC1 (P) #1	500165	500165

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 83/116

74/104

Notas	Teve roxo em todos os embriões em volta da linha central como r-nj
Intensidade	CN
% Roxo	40%		53%
# Escutela Roxa	CN		CN
Aleurona (cor da capa)			jn A ra <= t ω £ f o ro ® 2 O o E “
ZE Extraído	O CO		LO
o > < LU N	o CO		20
SIB, uniforme
Macho	BC1 (P) #6		BC1 (P) #6
	X		X
Fêmea	500234		KHI B
Data			29-Jun

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 84/116

75/104

30%
CM
rá ό ra o lE ω £ -S o ro 2 2 O u E
40
20
BC1 (P) #3
X
KHI A
	Colheita	11 de julho	quarta feira	12DAP

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 85/116

76/104

Notas				Pigmentação parcial	Pigmentação parcial	Pigmentação parcial	Pigmentação parcial
Intensidade				CN +	CN	CN	2+3
% Roxo				6.67%	26.70%	10%	40%
# Escutela Roxa				CN	CO	CO	CN
Aleurona (cor da capa)				Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído				30	30	30	30
o > < LU N				30	30	30	30
SIB, uniforme				UNIFORME	UNI- FORME	UNI- FORME	UNI- FORME
Macho				PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (W)
				X	X	X	X
Fêmea				PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (Y)	PBJ (W)
Data	Avaliado 12/7			2-Jul		Colheita	15 de julho

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 86/116

77/104

			Roxo semelhante a expressão R-nj	Roxo semelhante a expressão R-nj
		CM +	CXJ	CXI
53.30%	30%	41%	43.30%	53.30%
CD	LO	D)	CO	CD
Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
30	50	22	30	30
30	50	30	30	30
BC1 (P) #5	K13	BC1 (P) #5	Z21	Z21
X	X	X	X	X
K13	BC1 (P) #3	500165	Birchler 05698	Birchler 0545
segunda feira	12DAP		Avaliado 20/7

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 87/116

78/104

Notas		Roxo semelhante a expressão R-nj		Embriões eram relativamente pequenos (10 DAP) biologicamente	Absolutamente sem cor
Intensidade		2+3		CN +	NA
% Roxo		16.60%		42%	O
# Escutela Roxa	O	m		T CM	o
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor		Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	30	30		50	50
o > < LU N	30	30		M.S.	M.S.
SIB, uniforme
Macho	Z21	Z21		BC1 (P)	BC1 (P)
	X	X		X	X
Fêmea	Birchler 0695	Birchler 05698		GENU012	FPWP284
Data				13-Jul

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 88/116

79/104

X-	y~	y~	y~	NA
100%	100%	100%	100%	0%
m	m	m	m	O
Cor carregada	Cor carregada	Cor carregada	Cor carregada	Sem Cor
m	ΙΩ	m	m	-O
M.S.	M.S. Seco	ABA	ABA Seco	M.S.
X26B				X26B
X				X
GENU635				GENU635
Colheita	25 de julho	quarta feira	12DAP

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 89/116

80/104

Notas						Sem cor em qualquer dos embriões	Sem cor em qualquer dos embriões
Intensidade	X-	NA	NA			NA	NA
% Roxo	25%	0%	0%			O	O
# Escutela Roxa	X-	O	O			o	o
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	sr					20	20
o > < LU N	M.S. Seco	ABA	ABA DRY			M.S.	M.S.
SIB, uniforme
Macho						BC1	BC1
						X	X
Fêmea						500143	500143
Data	Avaliado 27/7					3 “3

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 90/116

81/104

Colheita	29 de julho	ob -UIIUOQ	12DAP

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 91/116

82/104

Notas			Notas
Intensidade			Intensidade
% Roxo			% Roxo		55%	40%	60%	75%
# Escutela Roxa			# Escutela Roxa			00	CN	LO
Aleurona (cor da capa)			Aleurona (cor da capa)		Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído			ZE Extraído		O CN	O CN	O CN	O CN
o > < LU N			o > < LU N		M.S.	M.S.	M.S.	M.S.
SIB, uniforme			SIB, uniforme
Macho			Macho		BC1	BC1	BC1	BC1
					X	X	X	X
Fêmea			Fêmea		500065	500065	500234	500234
Data	Avaliado 1/8		Data		18-Jul		Colheita	30 de julho

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83/104

							2+3
65%	60%	35%	40%	35%	40%	55%	15%
CO	CM	l·-	CO	r^·	CO		CO
Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
O CM	O CM	O CN	O CN	O CM	O CM	O CM	LO
M.S.	M.S.	M.S.	M.S.	M.S.	M.S.	M.S.	M.S.
BC1	BC1	BC1	BC1	BC1	BC1	BC1	BC1
X	X	X	X	X	X	X	X
500234	500234	500234	500234	500129	500129	500129	GENU625
segunda feira	12DAP		Avaliado 1/8

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84/104

Notas
Intensidade	CXJ	CM +
% Roxo	35%	30%	20%	25%	40%	35%	25%	20%	35%
# Escutela Roxa	1^-	CO		IO	CXJ	r^·	LO	Sl-	r--
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	LO	LO	LO	20	LO	20	20	20	20
o > < LU N	M.S. Seco	ABA	ABA Seco	M.S	M.S.	M.S.	M.S. Seco	ABA	ABA Seco
SIB, uniforme
Macho				BC1	BC1	BC1
				X	X	X
Fêmea				GENU632	GENU539	FSNU929
Data

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85/104

Embriões eram relativamente pequenos (10 DAP) biologicamente
		CO	CO
44%	55%	20%	50%
Ν'		CN	LO
Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor	Sem Cor
03	20	O	O
M.S.	M.S.	M.S.	M.S. Seco
BC1	BC1	BC1
X	X	X
GENU012	Z12945	GENU624

Petição 870190063903, de 08/07/2019, pág. 95/116

86/104

Notas
Intensidade	CO	2+3
% Roxo	30%	60%
# Escutela Roxa	CO	CO
Aleurona (cor da capa)	Sem Cor	Sem Cor
ZE Extraído	O	O
o > < LU N	ABA	ABA Seco
SIB, uniforme
Macho
Fêmea
Data

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87/104 [00138]Embora aqui tenham sido ilustradas e descritas modalidades específicas será avaliado pelas pessoas com conhecimento comum na técnica que qualquer arranjo que seja calculado para alcançar o mesmo objetivo pode ser substituído para a modalidade específica mostrada. Este pedido tem a intenção de cobrir quaisquer adaptações ou variações que operam de acordo com os princípios da invenção como descrita. Portanto, entende-se que esta invenção é limitada apenas pelas reivindicações e equivalentes destas. As descrições de patentes, referências e publicações citados no pedido são incorporadas aqui por referência.

Experimento 10: Raça TID

Propósito:

[00139]Na introgressão de transgenias dentro de várias bases de endogamia, o processo de retrocruzamentos toma uma quantidade de tempo considerável. Se o cronograma geracional pudesse ser encurtado e uma geração adicional ganha em uma base anual, então aí existe uma melhoria significativa. Assim o propósito deste experimento foi determinar se existem quaisquer economias em tempo que possam ser alcançadas a partir dos protocolos que empregam resgate de embriões de embriões imaturos e colheita precoce de sementes. Isto toma a forma de uma raça entre plantas de resgate de embrião e plantas derivadas de sementes de processamento acelerado para antese de pendão/antera.

M&M:

[00140]Dez variedades de plantas de milho foram plantadas em potes em 3 de setembro. Aproximadamente, 30 dias depois do plantio uma metade das plantas floresceu e foi autopolinizada (ver tabelas para as datas exatas). Algumas linhagens não apresentaram pendão e outras não acasalaram (ver tabelas). Em 18 de novembro e com respeito às plantas que foram autopolinizadas, uma metade de uma espiga foi serrada e trazida para o laboratório, e alguns embriões imaturos foram extraídos a mão. De 12 a 14 embriões

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88/104

DAP, foram extraídos a mão da maneira padrão e colocados em placas Petri de 100 mm x 25 mm saturadas com 3 ml a 28°C e com 16 horas de dia até serem transplantadas para campinas. Em 9 de dezembro, dez plântulas de embriões resgatados de cada genótipo sobrevivente foram plantadas no piso de barro da estufa.

[00141]Da outra metade da espiga que foi deixada nas plantas, estas espigas foram colhidas em 4 de dezembro. Naquele momento as espigas foram colocadas em uma câmara de crescimento para serem secas (ver tabela de secagem abaixo). Em 9 de dezembro, as espigas tinham acabado de secar e dez núcleos de cada uma das espigas sobreviventes foram plantados próximos de suas plântulas de embriões resgatados correspondentes no piso de barro da estufa.

[00142]As plantas derivadas de sementes e as plantas derivadas de embriões resgatados foram vigiadas com muito cuidado para ver quando os pendões começaram a largar (por favor, ver dados nas tabelas) pólen.

[00143]Houve uma grande quantidade de linhagens que não acasalou ou fez isto na primeira parte do experimento, devido a isto as variedades de plantas de milho que não acasalaram foram replantadas em potes em 4 de dezembro. Apenas uma linhagem floresceu desta vez. As outras não acasalaram (ver tabelas). A nova linhagem foi mantida em potes, as outras foram derrubadas e descartadas. Na planta que foi polinizada, metade da espiga foi serrada e trazida para o laboratório e colocada em placas Petri de 100 mm x 25 mm saturada com 3 ml de MS + 3% de Sacarose. As placas foram colocadas dentro de um Percival iluminado (400 pmols) ficando a 28°C e com 16 horas de dia até serem transplantadas no piso de barro da estufa.

[00144]A outra metade da espiga que foi deixada na planta para amadurecer como descrito acima com o primeiro conjunto. Há 28 dias após a polinização, a espiga foi colhida e colocada dentro de uma câmara de crescimento para ser seca (ver tabela de secagem) como anteriormente. Depois

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89/104 do período de secagem, 20 núcleos daquela espiga foram plantados próximos as suas plântulas derivadas de embriões no piso de barro da estufa em 3 de março.

[00145]As plantas de sementes e plantas derivadas de embriões foram vigiadas muito cuidadosamente para ver quando os pendões começaram a largar.

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92/104

<υ =tt <0 o Φ o

CN c

0) O <D ra •<d « ra ra ra ω ra ra ra c <D O ra CD <0 ra tD ro o a>

o ira

0) ra o ra o >ra <n o ra

0) O) <υ ra ω m ra <υ <0

0) ra

E

0) o

Dí LU ra

0)

0)

0) E

0) <0

0)

0)

E o ra

E

0) o ra

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100/104

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101/104 ιι m ~~~.. CN co CN

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102/104

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Resultados:

[00146]Em geral, as plantas derivadas de embriões foram menores do que suas contrapartidas derivadas de sementes de processamento acelerado. Todavia, a produção de sementes a partir das plantas foi muito boa.

DURAÇÃO (DIAS) PARA ANTESE

ENDOGAMIA	RESGATE DE EMBRIÃO Data média da Antese/Produção da Semente	EXTRAÇÃO RÁ- PIDA DE MATERIAL: Data Média de Antese	RESGATE DE EMBRIÃO: ECONOMIAS DE TEMPO
NP2372 (DD5908) Data Polinização 4/11/08	21/1/2009 182 se- mentes/ano, n=7	09/02	19 dias
NP2582 (LL7621) Data Polinização 5/11/08	25/1/2009 264 se- mentes/ano, n=8	14/02	20dias
NPAA2359 (AA2359) Data Polinização 5/11/08	27/1/2009 173 se- mentes/ano, n=7	17/02 Não se adaptou a colheita precoce. Somente 2 plantas sobreviveram e tiveram crescimento lento	21 dias
NP2482 (AF3050) Data Polinização 6/11/08	28/1/2009 162 se- mentes/ano, n=7	11/02	14 dias

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104/104

NP2222 (AX5707) Data Polinização 5/11/08	30/1/2009 157 se- mentes/ano, n=3	18/02	19 dias
NP2529 Data Polinização 30/01/08	23/4/2009 n=9 Não foi gerada semente porque era óbvio que a produção de semente era possível.	28/04/09	5 dias

[00147]Com respeito à duração do período para antese, estes dados indicam que sob as condições empregadas neste experimento, o método de resgate de embriões pode resultar em economias de tempo a partir da polinização até aquelas mesmas plantas alcançarem a antese. Estas observações sugerem que ao longo do curso do processo de introgressão, ganhouse uma geração adicional por ano com algumas linhagens. Assim, pela combinação da facilidade e utilidade do método de lavagem pressurizada para extração de embriões e a observação de tempo geracional reduzido para a antese, uma metodologia fornece um meio para facilitar programas de introgressão de transgenia em larga escala. Ligando estas observações com as observações feitas com respeito à seleção in vitro em embriões imaturos, se forma o método aprimorado para introgressão de marca de transgenia.

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Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para identificar embriões haplóides retirados de dentro de sementes de milho, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) retirar múltiplos embriões imaturos de milho de sementes de milho quase simultaneamente, (b) coletar os ditos embriões de milho retirados; e (c) identificar embriões haplóides através dos marcadores de fenótipo escutelar R-nj ou R1SCM2.
2. 2. Método para desenvolver plantas duplas haplóides a partir de embriões retirados de dentro de sementes de milho, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) retirar múltiplos embriões imaturos de milho de sementes de milho quase simultaneamente, (b) coletar os ditos embriões de milho retirados;

   (c) identificar embriões haplóides através dos marcadores de fenótipo escutelar R-nj ou R1SCM2; e (d) induzir os embriões haplóides para formar plantas duplo haplóides.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta dupla haplóide pode produzir semente que é usada na reprodução de plantas.