CN106688881A - 一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，属于植物倍性育种技术领域。本发明利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽利用流式细胞仪进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。本发明方法解决了木本植物体细胞染色体加倍获得嵌合体的纯化问题，并可快速、高效地构建全同胞或异同胞二倍体、四倍体或其他倍性纯合体的异细胞型植株群体，为开展多倍体育种和倍性效应遗传分析奠定了基础。

Description

一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，具体地，涉及一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体以及建立全同胞或异同胞细胞型群体的方法。

背景技术

多倍体育种是植物遗传改良的重要手段，尤其对于异花授粉的木本植物而言，多倍体育种综合了倍性优势和杂合优势，改良效果显著(康向阳.关于杨树多倍体育种的几点认识.北京林业大学学报,2010,32(5):149-153)。三倍体毛白杨、四倍体刺槐等多倍体品种在生长量、木材品质、代谢产物含量等方面均表现出了显著的优势，已在我国林业生产中广泛应用。

四倍体植株通常通过对种子、茎尖等分生组织区施加处理诱导体细胞染色体加倍的途径获取。然而，由于植物分生组织区细胞有丝分裂的不同步性，不同细胞的加倍效果存在差异，往往导致倍性嵌合体的存在，纯四倍体的诱导率较低，影响倍性效应的发挥和育种效率。尽管Wang等通过单细胞合子染色体加倍的方式获得了杨树纯四倍体植株，并避免了嵌合体的产生，但是由于合子休眠期的存在，难以准确把握合子休眠后第一次有丝分裂的时机，因此，合子染色体加倍的四倍体诱导率也仅为3.13％(Wang J,Shi L,Song SY,TianJ,Kang XY.Tetraploid production through zygotic chromosome doubling inPopulus.Silva Fennica,2013,47(2):id932)，而且无法同时获取相同基因型的二倍体细胞型材料。此外，Cai等利用秋水仙碱处理离体培养的叶片，诱导不定芽染色体加倍也获得了杨树四倍体植株(Cai X,Kang X Y.In vitro tetraploid induction from leafexplants of Populus pseudo-simonii Kitag.Plant Cell Reports,2011,30(9):1771-1778)，但是，该方法需将材料进行同步化预培养并掌握合适的处理时机，而且不可避免的也会产生倍性嵌合体植株，同时，大量的工作量仅能完成单个基因型的四倍体诱导，试验操作步骤繁杂，试验周期长，四倍体诱导效率较低，不利于大群体四倍体植株的获得。刘孟军等在田间利用秋水仙碱处理枝条愈伤组织可获得高比率纯四倍体，但是也不能完全避免嵌合体的发生，同时还观察到了八倍体、六倍体、五倍体和三倍体的存在，而且需要经历后期发育过程的形态学鉴定(刘孟军，刘平，王玖瑞，石庆华，徐娟，宁强.枣田间愈伤组织途径免嵌合体纯化快速诱导同源多倍体.园艺学报，2013，40(S):2610)。

如能充分利用容易诱导获得的倍性嵌合体为材料，将倍性嵌合体中的四倍体细胞纯化并再生为完整植株，必将极大地提高植物四倍体育种的效率和效果，并且在可能同时纯化出相同基因型的二倍体植株，构建全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体，满足深入开展林木倍性效应遗传分析的需要，推动林木遗传改良理论发展。Chen等对黄芪倍性嵌合体材料利用愈伤组织分化并再生的方式，实现了四倍体的纯化，但是由于愈伤组织再生过程非单细胞再生，导致同时产生了嵌合体的植株(Chen LL,Gao SL.In vitro tetraploidinduction and generation of tetraploids from mixoploids in Astragalusmembranaceus.Scientia Horticulturae,2007,112:339-344)。多次继代培养被认为可以实现嵌合体的分离纯化(向素琼，梁国鲁，郭启高，李晓林，何桥.辣木组织培养与四倍体植株诱导.热带亚热带植物学报,2007,15(2):141-146)，但是时间周期很长，而且由于不同倍性细胞发育的竞争性因素，可能导致最终仅能获得二倍体植株，因此，研发更加高效、适宜的嵌合体纯化技术十分必要。

发明内容

本发明的目的是针对目前林木四倍体诱导效率低，体细胞染色体加倍易产生倍性嵌合体，难以建立四倍体大群体的问题，提供一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法。

本发明提供的一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，根据植物不定芽是单细胞起源(Broertjes C,van Harten AM.Single cell origin of adventitious buds[J].Euphytica,1985,34:93-95.)的原理，是利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。

所述不定芽诱导培养基是经过筛选得到，筛选方法为：将倍性嵌合体植物子代植株的组培苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。

本发明的方法中，当同一个体植株叶片再生的不定芽长出3-4片真叶后，对单个不定芽采集其不同叶片混合后，使用流式细胞仪对其进行倍性检测，以判断整个不定芽的倍性水平。

本发明提供了上述方法在植物育种中的应用。

本发明还提供一种植物全同胞异细胞型群体的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工控制两种不同植物的雌株和雄株进行杂交；或人工控制两种不同植物的雌株和雄株进行杂交；

(2)采集杂交种子进行加倍处理，获得倍性嵌合体植株；

(3)以步骤(1)所获得未经加倍处理的种子无菌播种苗为材料，筛选适合步骤(2)的倍性嵌合体植株子代多基因型叶片的不定芽诱导培养基；

(4)利用筛选得到的不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植株子代的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同基因型的不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体，进而构建全同胞异细胞型群体。

上述构建方法中，步骤(1)控制雌花(或雌株)仅接受目标雄花(或雄株)的花粉，防止外源花粉污染。

上述构建方法中，步骤(2)杂交种子进行加倍处理的方法为将授粉后获得的杂交种子无菌处理后，采用0.1-0.3％的秋水仙碱处理1-3天。

上述构建方法中，不定芽诱导培养基的筛选方法为：未经加倍处理的种子无菌播种苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。

本发明进一步提供了上述构建方法在植物加倍育种中的应用，该方法能快速、高效地创建林木全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体，为林木多倍体遗传改良和倍性效应遗传分析等研究提供材料。

在本发明的一个实施例中，使用小青杨雌株和钻天杨雄株进行授粉杂交，分别于授粉后37、40、43天采集杂交种子，分别用0.1％、0.2％、0.3％的秋水仙碱处理获得的杂交种子1、2、3天，用流式细胞仪检测后确定诱变植株的倍性，发现在授粉后第43天，用0.1％秋水仙碱处理24小时，小青杨×钻天杨种子存活率83.33％，获得的嵌合体数量最多，达15株。选择未经秋水仙碱加倍处理的种子无菌播种生长40天的组培苗第2-4片成熟叶片，过叶片主脉将其剪成1cm左右长，叶面向下接种于含细胞分裂素6-BA(0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L)和生长素NAA(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)的MS固体培养基上，30天后统计叶片分化情况。发现适合小青杨×钻天杨的多基因型叶片不定芽再生培养基为MS+0.4mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA，在此条件下叶片分化率为83.33±6.80％，不定芽再生系数为6.80±7.05个/片。以该培养基作为不定芽诱导培养基。将生根培养40d的青杨倍性嵌合体组培苗叶片接种至筛选得到的叶片不定芽诱导培养基中，40d后将再生的不定芽转接至MS+0.1mg/L NAA培养基中进行壮苗培养，待长出3-4片真叶后使用流式细胞仪进行倍性检测。共检测26个基因型的嵌合体的72株再生苗，其中7个基因型获得四倍体再生苗，14个基因型获得二倍体再生苗，5个基因型同时得到了二倍体和四倍体再生苗，证明了从倍性嵌合体中纯化四倍体植株的可行性，通过进一步扩展基因型数量，可建立起全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体。

本发明的有益效果在于：

1、本发明方法充分利用了常规体细胞染色体加倍所获得的大量倍性嵌合体材料，建立了林木倍性嵌合体纯化技术体系，纯化效率达100％。

2、本发明方法通过对倍性嵌合体材料的纯化，可同步获得相同基因型的二倍体和四倍体、以及其他倍性的细胞型材料，为开展倍性效应的遗传分析提供理想的研究材料。

3、本发明方法操作简单、工作量少、周期短、效率高，在半年内可获得多个基因型二倍体和四倍体异细胞型材料，从而实现全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体的构建，为从群体层面探讨多倍体植物的遗传效应奠定了基础。

附图说明

图1为种子加倍得到的倍性嵌合体组培苗及其流式细胞分析图，图1A，在培养皿中用固体培养基进行种子加倍得到的倍性嵌合体组培苗图；图1B，倍性嵌合体组培苗；图1C，倍性嵌合体流式细胞分析图。

图2为生长于多基因型叶片不定芽诱导培养基上的嵌合体叶片。

图3为倍性嵌合体纯化获得的二倍体和四倍体组培苗图，图3A，纯化的二倍体组培苗；图3B，纯化的二倍体流式细胞分析图；图3C，纯化的四倍体组培苗；图3D，纯化的四倍体流式细胞分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、植株均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本发明具体实施方式的试验材料选择小青杨雌株和钻天杨雄株，分别采集花枝水培于温室内促花。

1、控制授粉杂交

与温室内收集雄株钻天杨的花粉，待雌株小青杨雌蕊进入可授期时，利用毛笔蘸取花粉进行授粉。整个过程注意对雌蕊进行套袋隔离，防止外源花粉的污染。雌蕊柱头萎蔫后，取下套袋让雌花序继续正常发育。

2、种子加倍处理

分别于授粉后37、40、43天，采集成熟但未飞絮的雌花序，在超净工作台中用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，1.0％次氯酸钠浸泡10min后用无菌水浸泡冲洗3次。用镊子剥开蒴果，取出种子并除去杨絮，将种子接种于分别含0.1％、0.2％、0.3％秋水仙碱的空白MS固体培养基中处理1-3d，每处理种子数为30粒，共处理1350粒种子。避光培养1-3天后将其转接至不含秋水仙碱的MS+0.1mg/l IBA固体培养基中进行见光培养，待长出3-4片真叶后，在超净工作台内取其幼嫩的对生两片叶子，置于含空白MS培养基的6×6格细胞板上，一株组培苗叶片占用一格，并在原株组培瓶和取样培养皿上做好标记。在细胞核裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用30μm尼龙网过滤后加入荧光染色液DAPI染色后上样。用流式细胞仪进行检测，以确定诱变植株的倍性，结果分别见图1A、图1B、图1C。

通过处理共获得嵌合体212株，四倍体14株。其中，在授粉后第43d，用0.1％秋水仙碱处理24h，小青杨×钻天杨种子存活率83.33％，获得的嵌合体数量最多，达15株(表1)。

表1授粉后时间、秋水仙碱浓度和处理时间对加倍效果的影响

3、多基因型叶片不定芽诱导培养基筛选

随机选取80个未经秋水仙碱处理的杂交后获得的子代植株的生长40d的组培苗第2-4片成熟叶片，过叶片主脉将其剪成1cm左右长，叶面向下接种于含细胞分裂素6-BA(0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L)和生长素NAA(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)的MS固体培养基上，30天后统计叶片分化情况，见图2。

由表2可知，适合小青杨×钻天杨的多基因型叶片不定芽再生培养基为MS+0.4mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，在此条件下叶片分化率为83.33±6.80％，不定芽再生系数为6.80±7.05个/片。

表2 6-BA和NAA对青杨杂种多基因型不定芽诱导的影响

编号	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)	分化率(％)	再生系数(个)
					1	0.3	0.05	76.67±2.97	2.97±1.19
2	0.3	0.1	76.67±3.47	3.47±1.99
					3	0.3	0.2	70.00±4.00	4.00±0.92
4	0.4	0.05	76.67±3.97	3.97±3.50
					5	0.4	0.1	83.33±6.80	6.80±7.05
6	0.4	0.2	83.33±6.07	6.07±3.54
					7	0.5	0.05	66.67±1.87	1.87±1.03
8	0.5	0.1	83.33±4.00	4.00±2.21
					9	0.5	0.2	66.67±2.30	2.30±0.96

4、倍性嵌合体纯化

从步骤2中随机选择了26个青杨杂种倍性嵌合体组培苗，取叶片接种至叶片不定芽诱导培养基(MS+0.4mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)中，40d后将再生的不定芽转接至MS+0.1mg/L NAA培养基中进行壮苗培养，待长出3-4片真叶后使用流式细胞仪进行倍性检测。

通过不定芽再生共获得72个再生苗(表3)，利用流式细胞仪对这72个再生苗进行倍性检测，发现表3中Q1-Q7这7个基因型的全部14个再生苗都为四倍体，Q8-Q21的14个基因型的全部29个再生苗均为二倍体，Q22-Q26的5个基因型的29再生苗中，既有二倍体又有四倍体。

纯化的二倍体组培苗见图3A，纯化的二倍体流式细胞分析图见图3B，纯化的四倍体组培苗见图3C，纯化的四倍体流式细胞分析图见图3D。证明了采用本发明的方法从倍性嵌合体中纯化四倍体植株是可以实现的，通过进一步扩展基因型数量，可建立起全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体。

表3小青杨×钻天杨嵌合体纯化检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，其特征在于，利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基是经过筛选得到，筛选方法为：将倍性嵌合体植物子代植株的组培苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。

3.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，当同一个体植株叶片再生的不定芽长出3-4片真叶后，对单个不定芽采集其不同叶片混合后，使用流式细胞仪对其进行倍性检测，以判断整个不定芽的倍性水平。

4.权利要求1-3任一所述的方法在植物育种中的应用。

5.一种植物全同胞异细胞型群体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人工控制两种不同植物的雌花和雄花进行杂交，或人工控制两种不同植物的雌株和雄株进行杂交；

(2)采集杂交种子进行加倍处理，获得倍性嵌合体植株；

(3)以步骤(1)所获得未经加倍处理的种子无菌播种苗为材料，筛选适合步骤(2)的倍性嵌合体植株子代多基因型叶片的不定芽诱导培养基；

(4)利用筛选得到的不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植株子代的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同基因型的不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株，进而构建全同胞异细胞型群体。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)控制雌花或雌株仅接受目标雄花或雄株的花粉，防止外源花粉污染。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)杂交种子进行加倍处理的方法为将授粉后获得的杂交种子无菌处理后，采用0.1-0.3％的秋水仙碱处理1-3天。

8.如权利要求6-7任一所述的构建方法，其特征在于，不定芽诱导培养基的筛选方法为：未经加倍处理的种子无菌播种苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。

9.权利要求6-8任一所述的构建方法在植物加倍育种中的应用。

10.权利要求6-8任一所述的构建方法在植物多倍体遗传改良和倍性效应遗传分析中的应用。