CN102524056A - 一种利用秋水仙碱选育杨树四倍体植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秋水仙碱处理诱导杨树合子染色体加倍选育四倍体的方法，属于植物遗传育种领域。本发明方法包括：用杨树父本的花粉对杨树母本的雌花序进行授粉，以子房内絮状纤维发育状态作为参照判别合子发育时期，适时对授粉后雌花序施加重量百分比浓度为0.3-0.5％的秋水仙碱溶液注射处理子房，注射3-5次，每次间隔3-4小时，每子房注射30-40微升秋水仙碱溶液，处理结束后继续水培雌花枝，待种子成熟后，收集种子，播种育苗，检测子代倍性水平，获得四倍体植株。该发明与传统秋水仙碱浸泡处理相比，可显著提高杨树四倍体诱导效率，提高四倍体诱导稳定性，增强施加诱导剂的时效性，同时减少秋水仙碱使用量，降低生产成本。

Description

一种利用秋水仙碱选育杨树四倍体植株的方法

技术领域

本发明涉及一种植物四倍体植株的诱导方法，尤其涉及一种利用秋水仙碱诱导杨树合子染色体加倍选育四倍体的方法，属于植物遗传育种领域。

背景技术

植物四倍体植株可采取异倍体杂交或者理化处理诱导种子、芽、幼胚或合子等体细胞染色体加倍途径获得。

与传统利用种子、芽、幼胚、愈伤组织等体细胞染色体加倍获得植物四倍体相比，合子染色体加倍是植物四倍体选育最为理想的途径。主要表现在：(1)合子作为一个单一细胞，合子染色体加倍后形成纯合四倍体，而不易形成混倍体或嵌合体植株；(2)植物合子的形成基于有性杂交过程，配子形成过程中所经历的染色体重组使得雌雄配子融合后产生的每个合子均具有不同的基因型，进而由合子染色体加倍所获得的每株四倍体都具有不同基因型，从而通过一次加倍试验即可完成多基因型四倍体选育，为品种选育提供丰富的候选种质。

秋水仙碱被公认为诱导植物多倍体最好的诱变剂。目前，利用秋水仙碱处理诱导杨树合子染色体加倍已经在银白杨(Populus alba)和青杨派树种中成功获得四倍体植株(Mashkina OS，Burdaeva LM，V’yunova LN.Experimentalmutagenesis and polyploidy in breeding forest trees.Lesnaya Genetika，1989，136-137；王君，康向阳，石乐，等.理化处理诱导合子染色体加倍选育青杨派杂种四倍体.北京林业大学学报，2010，32(5)：63-66)。然而，这些研究均是通过秋水仙碱浸泡处理，由于杨树授粉后的雌花序较为巨大，需要将其置于一个较大的容器类实施浸泡，导致秋水仙碱溶液耗费巨大，并且造成大量浪费，加重了生产成本。此外，包被合子的胚珠位于子房内，施加秋水仙碱进行浸泡处理，需要等待秋水仙碱渗透子房壁的过程，往往导致处理时机延迟，不能准确地杨树受精后合子的第一次有丝分裂时期进行诱导处理，使得诱导处理的时机不精确、诱导处理时间延长，导致诱导效率低，四倍体诱导效果不稳定。因此，解决秋水仙碱诱导杨树合子染色体加倍，选育四倍体的第一次有丝分裂处理时期以及相关技术问题，形成合子染色体加倍选育四倍体诱导技术的重点，对于实现秋水仙碱诱导杨树合子染色体加倍选育四倍体的稳定性和高效率，以及将该方法引入其它植物的四倍体诱导等具有重要的实际价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是确定秋水仙碱诱导杨树合子染色体加倍选育四倍体植株的有效处理时期以及处理条件，并且提供一种系统而高效的秋水仙碱诱导杨树合子染色体加倍选育杨树四倍体植株的方法，该方法处理诱导杨树四倍体方法具有相对准确性、稳定性、高效性，显著减少秋水仙碱使用量，降低实验成本，并且克服药剂作用延迟问题，提高四倍体诱导效果。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种选育杨树四倍体植株的方法，包括：用杨树父本的花粉对杨树母本的雌花序进行授粉，形成果序；用秋水仙碱溶液处理授粉后雌花序的果序，诱导合子染色体加倍；待种子成熟后，收集种子，播种育苗，检测子代倍性水平，获得四倍体植株；其中，用秋水仙碱溶液处理果序诱导合子染色体加倍的方式是：将秋水仙碱溶液注射到果序的子房中。

所述的杨树母本优选为小叶杨(Populus simonii)、小青杨(P.pseudo-simonii)、欧洲黑杨(P.nigra)、美洲黑杨(P.deltoides)或哲引3号杨(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)等子房较大的杨属树种，更优选为哲引3号杨；所述的父本优选为小青杨、小叶杨、欧洲黑杨、美洲黑杨或北京杨(P.×beijingensis)等与相应母本杂交亲和的树种，更优选是北京杨。

优选地，所述的注射处理方式为：采用秋水仙碱溶液注射杨树子房3-5次，相邻两次注射间隔时间为3-4小时；每子房注射30-40微升，以溶液渗出子房为限。

所述的秋水仙碱溶液的重量百分比浓度优选为0.3-0.5％，更优选为0.3％。

本发明人结合石蜡切片等技术手段最终发现，当杨树授粉后第7-8天，此时杨树果序子房内合子进入第一次有丝分裂过程，此时为注射秋水仙碱诱导剂诱导合子染色体加倍的最佳时机，秋水仙碱溶液直接注射入杨树授粉后的子房内，使药剂直接进入到子房内与胚珠接触，而无需经过渗透子房壁的缓慢过程，提高了诱导处理的时效性和四倍体诱导效果；同时显著减少秋水仙碱使用量，降低生产成本。尤其是授粉后第8天时进行注射处理获得了较高的四倍体得率，有效扩展了获得四倍体的处理材料范围，延长了可施加处理的时间范围，使得施加处理效果更加稳定，易于掌握。

至于确定子房内部絮状纤维发育至何种状况或形态，本领域技术人员可通过肉眼观察进行确定，也可借助放大镜等工具进行观察并确认，这些方式均为本领域技术人员所熟练掌握。

所述的以子房内絮状纤维发育状态作为参照判别合子发育时期，按照中国发明专利(专利号：ZL 200910086773.5；发明名称：一种杨树四倍体植株的诱导方法；授权公告号：CN101595841B；授权公告日：2010.09.29)中公开的方法进行判别。

所述的收集种子、播种育苗主要包括土壤灭菌、种子点播、苗木管理与移栽等环节，这些技术手段都为本领域技术人员所熟知。

所述的子代倍性水平检测可以采用体细胞染色体镜检、流式细胞分析等技术，这些技术手段都为本领域技术人员所通晓。

本发明在杨树合子染色体加倍有效处理时期内，将秋水仙碱注射到果序子房内诱导合子染色体加倍，与传统秋水仙碱浸泡处理相比，本发明方法可显著提高杨树四倍体诱导效率，提高四倍体诱导稳定性，增强施加诱导剂的时效性，同时减少秋水仙碱使用量，降低生产成本，能有效克服药剂作用延迟问题，四倍体诱导效果好。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

本发明方法中杨树合子染色体加倍处理时期按照中国发明专利(专利号：ZL 200910086773.5；发明名称：一种杨树四倍体植株的诱导方法；授权公告号：CN101595841B；授权公告日：2010.09.29)中公开的方法进行判别。具体如下：

以‘哲引3号杨’ב北京杨’为例，采用‘北京杨’花粉对‘哲引3号杨’授粉，对授粉后一定时期的果序用FAA(V(70％乙醇)∶V(乙酸)∶V(38％甲醛)＝90∶5∶5)进行固定，并观察子房内部絮状纤维发育状态，通过常规石蜡切片观察合子发育进程，由于其发育存在一定的不同步性，对大量胚珠内合子发育进行统计，表明‘哲引3号’杨子房内絮状纤维的发生、发育与其双受精及合子发育进程存在密切关系。当子房内絮状纤维开始包裹胚珠，但尚未充满整个子房室时，多数合子进入第一有丝分裂过程。

以子房内絮状纤维发育状态为参照，‘哲引3号杨’ב北京杨’合子处于有效处理时期，即当授粉后‘哲引3号杨’雌花序子房内的絮状纤维开始包裹胚珠基部(此时为授粉后的第7天)和子房内的絮状纤维进一步包裹胚珠的中部但尚未完全覆盖胚珠(此时为授粉后的第8天)时，对雌花序上各子房施加秋水仙碱进行注射处理，具体的处理方法是：利用微量注射器向雌花序上各子房注射重量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液，共注射3次，每次注射间隔3-4小时，每子房注射30-40微升，以溶液渗出子房为限，平均每处理1个花序耗费秋水仙碱溶液约2mL；处理结果：在上述时期对雌花序上子房进行秋水仙碱溶液注射处理，总共诱导获得了6株杨树四倍体植株(表1)。

此外，为证明注射法处理技术的优越性，同时进行了秋水仙碱浸泡处理试验，具体处理方法是：采用重量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液浸泡授粉后7天、8天的果序24小时，平均每处理1个花序耗费秋水仙碱溶液30-40mL；处理结果：仅在授粉后7天的进行秋水仙碱浸泡处理的获得2株四倍体；对授粉后8天的雌花序上子房的果序进行浸泡诱导，没有获得四倍体植株(表1)。

对试验结果采用方差分析，表明注射法处理诱导杨树四倍体的效果显著优于浸泡法处理(F＝14.556，P＝0.032)。

当果序子房内的絮状纤维完全覆盖株柄并开始伸长至胚珠时(此时为授粉后的第6天)；或者是当子房内的絮状纤维包裹大部分胚珠，但尚未完全覆盖时(此时为授粉后的第9天)，在上述时期内对子房施加秋水仙碱注射处理，处理结果：未获得一株杨树四倍体植株。

表1秋水仙碱注射处理授粉后哲引3号杨子房诱导合子染色体加倍

说明：表1中对照指未进行处理而正常培养的雌花序，目的是为排除合子不经处理而发生自发加倍以及天然未减数配子融合形成多倍性合子的可能性。

上述试验结果说明，在杨树合子染色体加倍有效处理时期内，采用秋水仙碱注射处理诱导合子染色体加倍，可显著提高杨树四倍体诱导效率，提高四倍体诱导稳定性，同时减少秋水仙碱使用量，降低生产成本。

Claims (9)

1.一种利用秋水仙碱选育杨树四倍体植株的方法，包括如下步骤：用杨树父本的花粉对杨树母本的雌花序进行授粉，形成果序；用秋水仙碱溶液处理授粉后雌花序的果序诱导合子染色体加倍；待种子成熟后，收集种子，播种育苗，检测子代倍性水平，获得四倍体植株；其特征在于，所述用秋水仙碱溶液处理果序诱导合子染色体加倍的方式是：将秋水仙碱溶液注射到果序的子房内。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：授粉后第7-8天，将秋水仙碱溶液注射到果序的子房内。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：授粉后第8天，将秋水仙碱溶液注射到果序的子房内。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的注射是对授粉后的杨树子房注射秋水仙碱3-5次，相邻两次注射间隔时间为3-4小时。

5.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述的注射为每子房注射30-40微升秋水仙碱溶液。

6.按照权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于：所述的秋水仙碱溶液的重量百分比浓度为0.3-0.5％。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的秋水仙碱溶液的重量百分比浓度为0.3％。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的杨树母本选自小叶杨(Populussimonii)、小青杨(P.pseudo-simonii)、欧洲黑杨(P.nigra)、美洲黑杨(P.deltoides)或哲引3号杨(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)；所述的杨树父本选自小青杨、小叶杨、欧洲黑杨、美洲黑杨或北京杨(P.×beijingensis)。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的杨树父本是北京杨(P.×beijingensis)；所述的杨树母本是哲引3号杨(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)。