CN101322474B - 离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体毛泡桐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了以胎座为外植体的离体培养和秋水仙素处理结合选育四倍体毛泡桐的方法。它包括：a.选择亲本；b.以胎座为最佳外植体；c.胎座愈伤组织诱导；d.胎座愈伤组织加倍处理；e.处理后愈伤组织恢复培养；f.愈伤组织分化培养；g.芽苗生根培养；h.组培苗的移栽；i.毛泡桐植株多倍性的形态学鉴定；j.毛泡桐植株多倍性的染色体数鉴定；k.毛泡桐植株多倍性的流式细胞仪分析鉴定；l.开花期毛泡桐植株多倍性鉴定等十二个步骤。与其他多倍体毛泡桐的成年植株比较，四倍体毛泡桐具有花大、叶厚、不结实等与二倍体毛泡桐明显不同的特点，具有很好的观赏价值和生长优势。该技术不仅可直接应用于选育毛泡桐新品种，也为其它树木多倍体育种打下良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体毛泡桐，属于多倍体树木育种的技术领域。
背景技术
从植物进化的趋势看，70％以上的被子植物是多倍体(Masterson J.Stomatal size in fossilplants：evidence for polyploidy in majority of angiosperms.Science，1994，264：421-424)。多倍体植物具有的巨大性、强优势性、抗逆性和低结实性特别有利于树木新品种选育(康向阳.林木多倍体育种研究进展.北京林业大学学报，2003，25(4)：70-74；李云，冯大领.木本植物多倍体育种研究进展.植物学通报，2005，22(3)：375-382)。泡桐既是著名的速生用材树种，又具有先花后叶，繁花如云的特点，而成为重要的城市行道树和园地景观树种。但是泡桐尚存在易发生丛枝病(任国兰.泡桐丛枝病的研究现状与进展.河南农业大学学报，1996，30(4)：358-364；张春立，林木兰，胡勤学，黄文晋.泡桐丛枝病类菌原体DNA的分子克隆与序列分析.植物学报，1994，36(4)：278-282)和过早结实消耗过多营养的问题。为了解决这两个问题，本申请专利之前，国内外对泡桐的组织培养研究主要在组织培养植株再生(施士争，倪善庆.泡桐组织培养系统性研究初报.江苏林业科技，1995，22(3)：20-22；范国强，翟晓巧，蒋建平，刘心诚.不同种泡桐叶片愈伤组织诱导及其植株再生.林业科学，2002，38(1)：29-35)、体细胞胚胎发生与人工种子生产(Ipekci Z，Gozukirmizi N.Direct somaticembryogenesis and synthetic seed production from Paulownia elongata.Plant Cell Reports，2003，22：16-24)和原生质体培养(卫志明，镰田博，原田宏.从白花泡桐叶片原生质体再生植株.植物组织培养，1991，8(2)：111-113)等方面，而在树木多倍体品种选育方面主要采用自然变异利用，如毛白杨天然三倍体(朱之悌，康向阳，张志毅.毛白杨天然三倍体选种研究.林业科学，1998，34(4)：22-31)、银白杨三倍体(Seitz F W.The occurrence of triploid after selfpollination of anomalous androgenous flowers of a Grey Poplar.Z.forstgenet，1954，3(1)：1-6)等，以及在活体(in vivo)情况下通过物理和化学因素处理诱导种子、萌芽形成多倍体(赵彦华，吴国良，药文生.果树多倍体育种研究进展.山西果树，2004，(4)：35-36；李云，朱之悌，田砚亭，张志毅，康向阳.极端温度处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究.北京林业大学学报，2000，22(5)：7-12；杨新华，杨今后，骆承军.桑树多倍体育种的回顾与展望.浙江农业科学，2000，(6)：304-308)。但是，利用自然突变体的几率是很低的，利用物理或化学因素活体处理树木种子或萌芽，由于发生加倍变化的细胞和未发生变化的二倍体细胞共同生长在一起，两者竞争发育会产生嵌合体，更多情况下二倍体细胞常常将已加倍细胞排挤掉，加上物理、化学处理导致的伤害，使加倍处理材料难以成活，从而导致活体诱导加倍形成多倍体树木的频率很低(＜5％)。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用组织培养细胞的无菌性好、离散性强和再生力高的特点，结合秋水仙素处理选育多倍体毛泡桐的方法。解决多倍体树木成活难频率很低的问题，从而高效地培育多倍体树木。
本发明的技术方案为：a.选择亲本；b.以胎座为最佳外植体；c.胎座愈伤组织诱导；d.胎座愈伤组织加倍处理；e.处理后愈伤组织恢复培养；f.愈伤组织分化培养；g.芽苗生根培养；h.组培苗的移栽；i.毛泡桐植株多倍性的形态学鉴定；j.毛泡桐植株多倍性的染色体数鉴定；k.毛泡桐植株多倍性的流式细胞仪分析鉴定；l.开花期毛泡桐植株多倍性鉴定。
本发明的具体过程为：
a.选择亲本
选择优良的生长健壮、无丛枝病已开花的毛泡桐(Paulownia tomentosa)植株为组织培养取材的毛泡桐株。
b.以胎座为最佳外植体
从毛泡桐植株中取枝条茎段、叶片和开花后30～35天果实中的胎座为外植体进行培养。污染率、愈伤组织诱导率和愈伤组织分化出芽率比较，发现胎座是最佳外植体。
c.胎座愈伤组织诱导
采取开花后30～35天无胚珠的胎座在MS+2，4-D0.5-2.0mg/l(或NAA0.7-1.2mg/l)+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培养基中，25℃±1℃黑暗条件下培养30～35天，胎座上诱导出浅黄色、较松散的愈伤组织。
d.胎座愈伤组织加倍处理
将胎座愈伤组织转入到MS+2，4-D0.5-2.0mg/l(或NAA0.7-1.2mg/l)+6BA0.1mg/l+sucrose3％+秋水仙素0.05％-0.075％的液体培养基中置于105～110rpm的恒温摇床上在22～25℃旋转培养48～72hr。
e.处理后愈伤组织恢复培养
在无菌工作台上取出处理培养的愈伤组织，经无菌水冲洗3次后接种于MS+2，4-D0.5-2.0mg/l(或NAA0.7-1.2mg/l)+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培养基中，25℃±1℃黑暗条件下恢复培养7～10天，处理后浅黄褐色的愈伤组织生长出浅黄色愈伤组织。
f.愈伤组织分化培养
将恢复后的愈伤组织转到MS+NAA0.3-0.5mg/l+6BA2.0-3.0mg/l+sucrose2％+agar0.75％的培养基中，光强1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃分化培养，此后20～45天愈伤组织陆续分化出芽苗。
g.芽苗生根培养
待芽苗生长到3.0～6.0cm高，具有3.5～7.0片叶时，将它们分株转移至2/3MS+IBA0.5-1.0mg/l+NAA0.1-0.5mg/l+活性炭0.03％-0.05％+sucrose2％+agar0.75％的培养基中，光强1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃条件下生根培养，10～35天后芽苗陆续分化出根。
h.组培苗的移栽
当生根的组培苗具有7.0～10.0片叶，株高5.0～10.0cm时，将培养它们的玻瓶盖打开，加入刚盖住培养基表面的无菌水，放置到靠近窗台能接收散射光的试验台上炼苗1～2天，然后用镊子取出组培苗在自来水中清洗干净根部的培养基，再将它们移栽到已灭菌的装有2/3细砂+1/3园土为基质的泥缽中，用小喷雾器向小苗和基质喷水，再罩上薄膜保持相对湿度90％左右，上盖遮阳网，连续3天后，逐渐揭开薄膜，适时喷水保湿，在移栽后的第3天、第7天、第15天分别喷施1/10MS大量元素促进试管苗的成活，移栽15天后揭去遮阳网，30天后将缽中生长的毛泡桐小苗移栽到田间。
i.毛泡桐植株多倍性的形态学鉴定
从外部形态上观察，多倍体毛泡桐的叶片为卵圆形、叶片边缘有小锯齿状缺刻，二倍体毛泡桐的叶片为五角形、叶片全缘；取试管苗或幼小毛泡桐的叶片下表皮在显微镜下观察气孔数目，多倍体毛泡桐为314.30±15.57/mm2，二倍体毛泡桐为576.70±28.25/mm2；气孔长度，多倍体毛泡桐为35.82±3.63μm，二倍体毛泡桐为19.11±2.42μm；气孔宽度，多倍体毛泡桐为24.87±2.44μm，二倍体毛泡桐为15.78±1.95μm；气孔保卫细胞中的叶绿体数，多倍体毛泡桐为21.19±3.61个/气孔保卫细胞，二倍体毛泡桐为11.41±1.44个/气孔保卫细胞。
j.毛泡桐植株多倍性的染色体数鉴定
在显微镜下观察毛泡桐组培苗根尖染色体。四倍体毛泡桐的染色体数是2n＝80，二倍体毛泡桐为2n＝40。
k.毛泡桐植株多倍性的流式细胞仪分析鉴定
采取毛泡桐试管苗或者幼小植株的新鲜叶片50mg进行流式细胞仪分析。将叶片制取细胞核悬浮液后，取出0.5ml用含有1μl RNase(10mg/ml)的碘化丙啶(2mg/ml)50μl染色，然后在37℃±0.5℃下温育30min，然后将悬浮液置于流式细胞仪下分析，每个叶片最少有8000个核被测定分析。所获的分析结果是四倍体毛泡桐的DNA荧光值在213.0～228.0，而二倍体毛泡桐为114.0。
l.开花期毛泡桐植株多倍性鉴定
取开花期毛泡桐的花朵各5朵，分别测定花朵长度、花萼长、花萼宽、花丝长度、花药长、花药宽、花柱长及子房长度和直径。四倍体毛泡桐的花器明显比二倍体毛泡桐的花器大。花朵长度四倍体为9.73±0.55cm，二倍体为7.13±0.12cm；花萼长度四倍体为2.24±0.21cm，二倍体为2.01±0.11cm；花萼宽度四倍体为1.16±0.03cm，二倍体为0.85±0.01cm；花丝长度四倍体为3.37±0.48cm，二倍体为1.80±0.02cm；花药长度四倍体为0.51±0.02cm，二倍体为0.36±0.05cm；花药宽度四倍体为0.22±0.01cm，二倍体为0.11±0.01cm；花柱长度四倍体为3.10±0.05cm，二倍体为2.61±0.01cm；子房长度四倍体为1.10±0.08cm，二倍体为0.62±0.01cm；子房直径四倍体为0.82±0.02cm，二倍体为0.41±0.02cm。四倍体毛泡桐的结实率为0，二倍体毛泡桐的结实率为27.5％～62.3％。
本发明就是利用组织培养中胚性细胞的无菌性、离散性和强再生性特点，在适当时间适当浓度秋水仙素处理下使毛泡桐的愈伤组织细胞染色体加倍，加倍后的细胞经恢复培养、分化出芽、再生出根后，能够独立形成完整的多倍体毛泡桐。而那些经处理而未加倍的毛泡桐细胞也独立分化出芽、再生出根形成完整植株，两者各自来源于单个或少数细胞，彼此独立发育形成植株，因此很少形成嵌合体，而且这种离体诱导情况下，经过恢复培养减轻了秋水仙素处理的毒害作用，已加倍的毛泡桐细胞能正常分化出芽直至形成完整植株，从而获得较高的诱导多倍体频率。解决现有技术中多倍体树木成活难频率很低的问题，从而能够迅速高效地培育多倍体树木。
本发明所产生的四倍体毛泡桐具有花大、叶厚为卵圆形、不结实等具有更好观赏性和节约营养的特点。
附图及说明
图1是本发明的愈伤组织分化出芽；
图2是本发明的生根的芽苗；
图3是本发明田间生长的毛泡桐植株，其中A为二倍体，B为四倍体；
图4是本发明的毛泡桐叶片形态，其中A为二倍体，B为四倍体；
图5是本发明毛泡桐染色体数的鉴定，其中A为二倍体(2n＝40)，B为四倍体(2n＝80)；
图6是本发明毛泡桐的流式细胞仪分析鉴定，其中A为二倍体，B、C、D为四倍体；
图7是本发明的毛泡桐花朵多倍性鉴定，其中A为花朵，B为花萼，C为花药，D为子房
具体实施方式
下面以实施例对本发明进一步说明
实施例1.四倍体毛泡桐新品系“毛泡桐108”的选育
a.选择亲本
以优良的无丛枝病、已开花的毛泡桐植株洪山008为组织培养取材的亲本。
b.以胎座为最佳外植体
从洪山008毛泡桐植株上取枝条茎段、叶片和开花后30～35天的果实中的胎座为外植体进组织培养。经培养污染率(污染外植体数/接种外植体总数×100％)、愈伤组织诱导率(愈伤组织块数/接种外植体数×100％)和愈伤组织分化出芽率(分化出芽愈伤组织数/愈伤组织总数×100％)比较发现，胎座为外植体的污染率为0，愈伤组织诱导率为100％，愈伤组织分化出芽率90.0％，是最佳外植体。
c.胎座愈伤组织诱导
采取开花后30～35天无胚珠的胎座在MS+2，4-D0.5mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培养基中，25℃±1℃黑暗条件下培养30～35天后，100％的胎座上诱导出浅黄色较松散的愈伤组织。
d.胎座愈伤组织加倍处理
将愈伤组织转入到MS+2，4-D0.5mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+秋水仙素0.05％的液体培养基中置于105rpm的恒温摇床上在22℃±1℃旋转培养48hr。
e.处理后愈伤组织恢复培养
按无菌操作要求，取出处理培养的愈伤组织，经无菌水冲洗3次后接种于MS+2，4-D0.5mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培养基中，25℃±1℃黑暗条件下恢复培养7天，处理后的愈伤组织从浅黄褐色逐渐有部分生长出浅黄色的愈伤组织。
f.愈伤组织分化出芽(见附图1)
将恢复后的愈伤组织转到MS+NAA0.3mg/l+6BA2.0mg/l+sucrose2％+agar0.75％的培养基中，光强1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃分化培养，此后20～45天后愈伤组织陆续分化出芽苗，分化率30.7％。
g.芽苗生根培养(见附图2)
待芽苗生长到3.0～6.0cm高，具有3.5～7.0片叶时，将它们分株转移至2/3MS+IBA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+活性炭0.03％+sucrose2％+agar0.75％的培养基中，光强1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃条件下生根培养，10～35天后100％的芽苗分化出根。
h.组培苗的移栽
当生根的组培苗具有7.0～10.0片叶，株高5.0～10.0cm时，将培养它们的三角瓶瓶塞打开，加入无菌水，放置到靠近窗台的实验台上炼苗2天；然后用镊子取出组培苗在自来水中清洗干净试管苗根部的培养基，再将它们移栽到已灭菌的装有2/3细砂+1/3园土为基质的泥缽中，用小喷雾器向小苗和基质喷水，再罩上薄膜保持相对湿度90％左右，上盖遮阳网，连续3天后，逐渐揭开薄膜，适时喷水保湿，在移栽后的第3天、第7天、第15天分别喷施1/10MS大量元素促进试管苗的成活。移栽15天后揭去遮阳网，30天后将缽中生长的毛泡桐小苗移栽到田间(见附图3)。
i.毛泡桐植株多倍性的形态学鉴定(见附图4)
从叶形、下表皮气孔数目、气孔大小和叶绿体数目上比较多倍体和二倍体毛泡桐。多倍体毛泡桐的叶片为卵圆形、叶片边缘有小锯齿状缺刻，二倍体毛泡桐的叶片为五角形、叶片全缘；取试管苗或幼小毛泡桐的叶片下表皮在显微镜下观察气孔数目，多倍体毛泡桐为314.30±15.57/mm2，二倍体毛泡桐为576.70±28.25/mm2；气孔长度，多倍体毛泡桐为35.82±3.63μm，二倍体毛泡桐为19.11±2.42μm；气孔保卫细胞中的叶绿体数，多倍体毛泡桐为21.19±3.61个/气孔保卫细胞，二倍体毛泡桐为11.41±1.44个/气孔保卫细胞。
j.毛泡桐植株多倍性的染色体数鉴定
在显微镜下观察毛泡桐组培苗根尖染色体。四倍体毛泡桐的染色体数是2n＝80，二倍体毛泡桐为2n＝40(见附图5)。
k.毛泡桐植株多倍性的流式细胞仪分析鉴定(见附图6)
采取毛泡桐移栽试管苗幼小植株的新鲜叶片50mg进行流式细胞仪分析。将叶片制取细胞核悬浮液后，取出0.5ml用含有1μl RNase(10mg/ml)的碘化丙啶(2mg/ml)50μl染色，然后在37℃±0.5℃下温育30min，然后将悬浮液置于流式细胞仪下分析，每个叶片最少有8000个核被测定分析。所获的分析结果是3株四倍体毛泡桐的DNA荧光值分别为228.0、213.0、218.0，而二倍体毛泡桐为114.0，四倍体毛泡桐基本上是二倍体的2倍。
l.开花期毛泡桐植株多倍性鉴定(见附图7)
取开花期毛泡桐的花朵各5朵，分别测定花朵长度及花器官部分值，四倍体毛泡桐的花器明显比二倍体毛泡桐的大。花朵长度四倍体为9.73±0.55cm，二倍体为7.13±0.12cm；花萼长度四倍体为2.24±0.21cm，二倍体为2.01±0.11cm；花萼宽度四倍体为1.16±0.03cm，二倍体为0.85±0.01cm；花丝长度四倍体为3.37±0.48cm，二倍体为1.80±0.02cm；花药长度四倍体为0.51±0.02cm，二倍体为0.36±0.05cm；花药宽度四倍体为0.22±0.01cm，二倍体为0.11±0.01cm；花柱长度四倍体为3.10±0.05cm，二倍体为2.61±0.01cm；子房长度四倍体为1.10±0.08cm，二倍体为0.62±0.01cm；子房直径四倍体为0.82±0.02cm，二倍体为0.41±0.02cm。此外，106株四倍体毛泡桐的结实率为0，二倍体毛泡桐的结实率为27.5％～62.3％。
本发明产生的四倍体毛泡桐新品系“毛泡桐108”具有花大、叶厚卵圆形、不结实等更好的观赏性和节约营养的特点。
Claims (1)
1.一种以胎座为外植体的离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体毛泡桐的方法，其特征在于过程为：
a.选择亲本
以优良的无丛枝病已开花的毛泡桐植株为取材的亲本；
b.以胎座为最佳外植体
以开花后30～35天果实中的胎座为最佳外植体进行组织培养；
c.胎座愈伤组织诱导
采取开花后30～35天无胚珠的胎座在MS+2，4-D0.5-2.0mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培养基中，25℃±1℃黑暗条件下培养30～35天，诱导形成愈伤组织；
d.胎座愈伤组织加倍处理
将旺盛生长、浅黄色较松散的愈伤组织转到MS+2，4-D0.5-2.0mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+秋水仙素0.05％-0.075％的液体培养基中，置于105～110rpm的恒温摇床上在22～25℃旋转培养48～72hr；
e.处理后愈伤组织恢复培养
无菌取出处理后的愈伤组织，经无菌水冲洗3次后接种于MS+2，4-D0.5-2.0mg/l+6BA0.1mg/l+sucrose3％+agar0.75％的培养基中，25℃±1℃黑暗条件下恢复培养7～10天，处理后浅黄褐色愈伤组织生长出浅黄色愈伤组织；
f.愈伤组织分化培养
将恢复后的愈伤组织转到MS+NAA0.3-0.5mg/l+6BA2.0-3.0mg/l+sucrose2％+agar0.75％的培养基中，光强1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃分化培养，直至分化出芽苗；
g.芽苗生根培养
待芽苗生长到3.0～6.0cm高，具有3.5～7.0片叶时，将它们分株转移至2/3MS+IBA0.5-1.0mg/l+NAA0.1-0.5mg/l+活性炭0.03％-0.05％+sucrose2％+agar0.75％的培养基中，光强1500～2000Lux、12hr/d，25℃±1℃条件下生根培养，10～35天后芽苗陆续分化出根；
h.组培苗的移栽
当生根的组培苗具有7.0～10.0片叶，株高5.0～10.0cm时，放置在散射光下炼苗1～2天，然后洗净组培苗根部的培养基，移栽到已灭菌的装有2/3细砂+1/3园土为基质的泥缽中，喷水罩薄膜，保持相对湿度90％左右，上盖遮阳网，连续3天后，逐渐揭开薄膜，适时喷水保湿，在移栽后的第3天、第7天、第15天分别喷施1/10MS大量元素促进试管苗的成活，移栽15天后揭去遮阳网，30天后将小苗移至田间；
i.毛泡桐植株多倍性的形态学鉴定
多倍体毛泡桐的叶片为卵圆形、叶片边缘有小锯齿状缺刻，二倍体毛泡桐的叶片为五角形、叶片全缘；多倍体毛泡桐的叶片下表皮的气孔密度比二倍体小，气孔长宽比二倍体大，气孔保卫细胞中的叶绿体数比二倍体毛泡桐多近一倍；
j.毛泡桐植株多倍性的染色体数鉴定
四倍体毛泡桐的根尖染色体数是2n＝80，二倍体毛泡桐的根尖染色体数是2n＝40；
k.毛泡桐植株多倍性的流式细胞仪分析鉴定
将叶片制取细胞核悬浮液后，经含有RNase的碘化丙啶染色处理和温育30min后，置于流式细胞仪下分析，四倍体毛泡桐的DNA荧光值在213.0～228.0，是二倍体毛泡桐114.0的近2倍；
l.开花期毛泡桐植株多倍性鉴定
取开花期毛泡桐的花朵，测定花朵长度、花萼宽度、花丝长度、花药宽度、花柱长及子房长度和直径，四倍体毛泡桐的花器明显比二倍体毛泡桐的大，其中四倍体毛泡桐的花丝长度、花药宽度、子房长度和直径的值接近二倍体毛泡桐的2倍；四倍体毛泡桐的结实率为0，二倍体毛泡桐的结实率为27.5％～62.3％。
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