CN108719046A - 一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法,包括对杂种枫香离体无菌植株的叶片、叶柄分别进行芽原基预分化培养处理,然后再对预分化培养处理后的叶片、叶柄分别进行秋水仙碱诱导培养。本发明方法的杂种枫香四倍体诱导率高,获得杂种枫香四倍体的比率高,而且采用本发明方法首次诱导获得杂种枫香人工异源四倍体,异源的两份染色体数量被复制,兼具杂交效应和倍性效应,能在更大程度上产生变异,这为进一步提高枫香遗传增益和良种选育提供可能。

Description

一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法
技术领域
本发明涉及一种植株多倍体的诱导培育方法,特别涉及一种杂种枫香植株的四倍体的诱导培育方法,属于林业行业中的细胞工程诱变育种技术领域。
背景技术
枫香(Liquidambar spp)适应性强,生长快,成林早,树体高大,树干通直,树冠宽阔,叶色优美,是名符其实的多目标用途树种。枫香树属共约4种,产于北美和亚洲,应用最为广泛的是北美枫香(Liquidambar styraciflua)和中国枫香(L.formosana)。北美枫香广泛地分布于美国南部以及墨西哥、中美洲至洪都拉斯的高海拔山区,是美国最为重要的商业化阔叶树种之一,可用作木材、造纸、做成胶合板、燃料棒等;为美国林业生产做出突出贡献。
北美枫香在我国南方多个地区引种取得成功,特别是在华中地区生长良好。中国枫香天然林广泛地分布于我国南方地区,北至秦岭大别山,南至海南,西至四川、贵州川藏边界,东至台湾。木材纹理通直细致,易加工,抗压耐腐,是建筑业的上好用材,枫香还有重要的医用价值,全株均可药用,有祛风湿、行气、解毒之功效;它抗风、耐贫瘠、抗SO2耐火烧,具有较高的生态价值;因其秋叶鲜红,树体优美,自古以来被众多文人墨客所歌颂,同时中国枫香在我国栽培历史悠久,特别是在园林和寺院中,它的自然美与其散发的人文之美为众多古迹增添了浓墨重彩的一笔。
杂交育种是林木改良中应用最为广泛的育种途径,是新品种选育基础,在众多树种中取得成功。Santamour(1972)和Vendrame等(2001)研究认为,枫香种间(L.formosana与L.styraciflua)的杂交可配性强,能生产高产量的优质杂交种子。美国乔治亚大学((University of Georgia,UGA)的Merkle教授用北美枫香(L.styraciflua)与中国枫香(L.formosana)杂交,已选出了明显优于亲本的优良杂种,使得枫香的遗传育种工作又有了新的突破。但在我国尚未开展枫香种间杂交工作。
倍性育种在林木育种中同样取得成功,因多倍体普遍具有生物量大、抗性强、木材品质高等特点,倍性育种已成为林木改良的重要手段。
异源四倍体的基因组来自于两个基因型不同的两个亲本,并且两份染色体数量被复制。兼具杂交效应和倍性效应,能在更大程度上产生变异,这为进一步提高枫香遗传增益和良种选育提供可能。与同源多倍体相比,人们更加青睐于进行异源多倍体的工作。目前,未见有关于枫香多倍体诱导成功的报道,同时尚未发现天然枫香多倍体。
人工多倍体诱导可分为减数分裂多倍化和有丝分裂多倍化,也称作有性多倍化和无性多倍化,有性加倍是利用植物小孢子、大孢子、胚囊、合子等为材料,在特定时期对其进行物理和化学诱导;天然多倍体多是由于有性加倍产生的。无性加倍的方法有,以种子、茎尖为材料经处理后直接长成多倍体植株、原生质体融合、嫁接后培养接口愈伤、器官离体再生加倍。无性加倍更多地使用化学试剂进行诱导。
离体染色体加倍是利植物器官如子叶、下胚轴、茎段、叶片、叶柄、愈伤和胚性愈伤为诱导材料进行离体加倍,之后再生成多倍体的方法,具有加倍效率高、混倍体获得率低、条件可控性高等特点。相比有性加倍途径,离体再生加倍途径不受季节影响,这为木本植物染色体加倍提供极大的方便。但是,离体再生加倍能够实现的前提是该物种拥有一整套高效离体再生体系,随着人们的不断努力,木本植物离体再生技术得到飞速发展,越来越多的树种可通过离体染色体加倍的方法获得多倍体,如柑橘(Wu和Mooney,2002)、毛泡桐(Tang等2010)、杨树(Cai和Kang,2011;Xu等,2015)等。
离体染色体加倍技术不仅需要拥有一整套高效离体再生体系,同时在加倍过程中涉及诸多技术环节,外植体类型和基因型及年龄,预培养时间、有丝分裂抑制剂的浓度及种类、处理条件等。
1.外植体类型、基因型及年龄。目前利用子叶和下胚轴(de Carvalho等,2005)、芽(Zhang等,2010)、叶片(Xu等,2015)、叶柄(Wu等,2011)、愈伤(Yang等,2006)等材料都已成功地获得多倍体。不同外植体的再生能力、抗有丝分裂抑制剂和渗透能力和细胞分裂速度的差异,造成多倍体诱导率存在显著差异。de Carvalho等2005年报道子叶节的多倍体诱导率显著高于下胚轴,证明同一物种不同器官的多倍体诱导率存在差异。Xu等,2015和Wu等,2011报道杨树和猕猴桃的不同基因型四倍体诱导率不存在显著差异。而在郁金香(Chauvin等,2005)玫瑰(Khosravi等,2008);Stanys等,2006发现日本木瓜的基因型对诱导率存在显著差异。因此,在对某植物进行离体加倍时,选择合适的外植体十分重要。
2.预培养时间对加倍效率影响也十分显著,预培养可以使再生细胞发育成特定状态并且使细胞发育更加同步化。不同物种的预处理时间也不尽相同,Dhooghe等,2009和Chen等,2006年报道,松果菊和剪秋萝需要进行1周的预培养,而Wu等,2011报道,猕猴桃需要进行4周的预培养。预培养时间的选择与材料发育特性以及培养基配方有很大关系。
3.处理试剂种类多样,但主要功能都是抑制有丝分裂时纺锤丝的形成。秋水仙碱被应用的最为广泛,但效果也不尽相同,不同处理试剂对同一材料的加倍效率也有显著不同,如氨磺乐灵在木瓜(stanys等,2006)多倍体诱导的效率比秋水仙碱高,柑橘则相反(wu和Mooney,2002),Dhooghe等,2009报道,黄草消和氟乐灵对花毛茛的多倍体诱导率存在显著差异。而再生过程中所使用的细胞分裂素也会导致细胞染色体加倍。因此,选择合适的处理试剂也十分重要。不同材料的处理时间也存在一定差异,而处理时间与试剂浓度存在交互作用,往往被一同考虑。孙洪雁等,2009年报道,梨用0.4%的秋水仙碱处理2天诱导率最高,而Nilanthi等,2009报道,松果菊加倍最优条件为,用120mg/L秋水仙碱处理28天。在一定范围内使用高浓度的试剂和延长处理时间可以提高诱导率,但超出这个范围,外植体存活率极具减少,致使诱导率降低。
4.处理条件。Chakraborti等,1998认为,在处理时合理地控制温度和光周期,可以提高分生区细胞分裂的同步性,适当添加BA可加速细胞分裂的进程。适当地添加二甲基亚砜DMSO可增加植物组织对渗透剂的吸收能力,提高加倍效率。Dhooghe等,2009报道用固体培养获得多倍体,而液体培养应用地更为广泛。且固体培养所用时间明显多于液体培养。
目前,尚未见有关枫香属异源四倍体诱导育种的技术的报道。
发明内容
针对目前尚无杂种枫香四倍体植株存在,本发明提供一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法,本发明方法诱导枫香芽原基组织染色体加倍,杂种枫香异源四倍体诱导率高,获得杂种枫香四倍体的比率高,采用本发明方法获得了遗传稳定性高的杂种枫香异源四倍体,对杂种枫香的遗传性状做了进一步改良,可以用于将来作为亲本与二倍体杂交,获得异源三倍体,为最终目的是获得杂种枫香良种提高科学依据。
为实现本发明的目的,本发明通过以下技术方案实现:
一方面,本发明提供一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法,包括对杂种枫香无菌植株的叶片或叶柄进行芽原基预分化培养处理后再对预分化培养处理的叶片、叶柄分别进行秋水仙碱诱导培养。
其中,所述芽原基预分化培养处理是将枫香无菌植株的叶片、叶柄分别接种于预处理分化培养基中,进行芽原基预分化培养处理,形成芽原基,其中所述预处理分化培养基为WPM培养基+TDZ 0.1‐0.2mg/L+6‐BA 0.7‐0.9mg/L+NAA 0.1‐0.2mg/L+蔗糖20‐40g/L+琼脂1‐3g/L+倍力凝4‐5g/L。
特别是,所述预处理分化培养基优选为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6‐BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L。
其中,所述秋水仙碱诱导培养是将芽原基预分化培养处理后的杂种枫香植株的叶片、叶柄分别转入到诱导培养基中,进行芽原基的诱导培养,其中所述诱导培养基为WPM培养基+TDZ 0.1‐0.2mg/L+6‐BA 0.7‐0.9mg/L+NAA 0.1‐0.2mg/L+秋水仙碱120‐210mg/L+蔗糖20‐40g/L。
特别是,所述诱导培养基优选为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6‐BA 0.8mg/L+NAA0.1mg/L+秋水仙碱200mg/L+蔗糖30g/L。
另一方面,本发明提供一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法,包括如下步骤:
1)采集并剥开杂种枫香球果,对枫香球果内的种子进行表面灭菌,获得无菌杂种枫香种子;
2)将无菌杂种枫香种子接种于萌发培养基上,进行萌发培养,获得杂种枫香无菌苗;
3)将枫香无菌苗剪切成枫香苗段后接种于生根培养基中,进行生根培养,获得枫香无菌植株;
4)首先将枫香无菌植株顶端的第2、3片叶的叶片和叶柄分别剪切成叶片片段、叶柄段后分别接种于预处理分化培养基上,进行芽原基预分化培养处理;接着将预分化培养处理后的叶片片段、叶柄段分别接种于诱导处理培养基中,进行芽原基诱导培养处理;
5)将诱导培养处理后的叶片片段、叶柄段分别接种于不定芽分化培养基中,进行不定芽分化培养;
6)将不定芽分化培养后的外植体接种于不定芽伸长培养基中,进行不定芽伸长培养;
7)将不定芽伸长培养后的长度超过1cm的不定芽剪切后接种于不定芽生根培养基中,进行不定芽生根培养,获得杂种枫香四倍体植株。
其中,步骤1)中所述杂种枫香球果的父本为枫香(Liquidambar formosana),母本为北美枫香(Liquidambar styraciflua)。
特别是,所述所述杂种枫香球果按照如下方法制备:
A)于每年3月中旬收集父本枫香的花粉;
B)于每年3月下旬去除母本北美枫香的雄花序,然后将父本枫香的花粉授粉于北美枫香的雌花序上;
C)在授粉后的雌花序上套装硫酸纸袋25-35天后,改用纱网袋套于雌花序上,杂种枫香球果生长发育;
D)采集授粉6-7个月后的北美枫香上杂交球果,即得。
尤其是,在母本北美枫香生长至混合芽开放,雌花序和雄花序可以完全分开,雄花散粉前3-5天去除北美枫香的雄花序;然后于北美枫香的雌花柱头发亮,有稍许粘液时将父本枫香花粉授粉于北美枫香的柱头上,进行授粉处理。
其中,步骤1)中所述杂种枫香种子的表面灭菌处理包括如下顺序进行的步骤:首先将杂种枫香种子用酒精浸泡;接着用无菌水进行第一次清洗;然后用次氯酸钠溶液浸泡;再用无菌水进行第二次清洗;最后吸干表面水分,即得。
特别是,所述酒精浸泡所使用的酒精的体积百分比浓度为75%(v/v);浸泡时间为30-60s,优选为45s(秒));所述无菌水第一次清洗1-2次;所述次氯酸钠溶液的质量百分比浓度为1-3%(w/w),优选为2%;浸泡时间为6-10min,优选为8min;所述无菌水第二次冲洗3-5次。
其中,步骤2)中所述萌发培养基为WPM基本培养基中+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L,pH5.8-5.9;优选为WPM基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8-5.9。
特别是,步骤2)中所述萌发培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
尤其是,所述萌发培养时间为15-20天,优选为15天。
特别是,还包括步骤2A):将萌发的杂种枫香无菌苗移植至含有萌发培养基的培养容器中,进行继续培养。
尤其是,继续培养时间为45-50天。
其中,步骤3)中所述生根培养基为1/2WPM培基+IBA 1-2mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L,pH5.8-5.9;优选为1/2WPM培基+IBA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH 5.8-5.9。
特别是,步骤3)中所述生根培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
尤其是,步骤3)中所述生根培养时间为60-80天。
特别是,在进行芽原基预分化培养处理前,还包括步骤3A),枫香无菌植株继代扩繁培养,即将步骤3)制备的枫香无菌植株剪成2-3个具有1.5-2cm的茎段;接着将每个茎段分别接种于生根培养基中,进行继代扩繁培养,获得扩繁培养的枫香无菌植株。
尤其是,枫香无菌植株继代扩繁培养过程中,所述每个茎段上留有2片叶片,且顶部的2片叶片剪去一半。
尤其是,所述继代扩繁培养过程中每60-80天继代培养一次,继代培养次数为3-5次。
特别是,步骤3)中所述枫香苗段为将杂种枫香无菌苗修剪成顶部留有2片叶片,且顶部的2片叶片剪去一半,长1.5-2.5cm(优选为2cm)的枫香苗段。
其中,步骤4)中所述预处理分化培养基为WPM培养基+TDZ 0.1-0.2mg/L+6-BA0.7-0.9mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L,pH5.8-5.9;优选为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8-5.9。
特别是,步骤4)中所述芽原基预分化培养处理的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
尤其是,步骤4)中所述芽原基预分化培养处理时间为4-8天。
其中,步骤4)中所述诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1-0.2mg/L+6-BA 0.7-0.9mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+秋水仙碱120-210mg/L+蔗糖20-40g/L,pH5.8-5.9;优选为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱200mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9。
特别是,步骤4)中所述诱导培养处理的培养条件如下:培养温度为25±2℃,黑暗条件下培养。
尤其是,步骤4)中所述芽原基组织诱导培养处理时间为3-5天,优选为3天。
特别是,还包括步骤4A),将诱导处理后的离体叶片、叶柄从诱导处理培养基中取出后用无菌水中清洗3次(通常为3-6次),然后放在滤纸上吸干水分,获得诱导培养处理叶片、叶柄。
其中,步骤5)中所述不定芽分化培养基为WPM培养基+TDZ 0.1-0.2mg/L+6-BA0.7-0.9mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L,pH5.8-5.9;优选为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8-5.9。
特别是,步骤5)中所述不定芽分化培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
尤其是,步骤5)中所述不定芽分化培养时间为45-60天。
其中,步骤6)中所述不定芽伸长培养基为WPM培养基+6-BA 0.3-0.5mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝2-3g/L,pH5.8-5.9;优选为WPM培养基+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝2g/L,pH5.8-5.9。
特别是,步骤6)中所述不定芽伸长培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
尤其是,步骤6)中所述不定芽伸长培养时间≥15天。
其中,步骤7)中所述不定芽生根培养基为1/2WPM培基+IBA 1-2mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L,pH5.8-5.9;优选为1/2WPM培基+IBA2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8-5.9。
特别是,步骤7)中所述不定芽生根培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
尤其是,步骤7)中所述不定芽生根培养时间为60-65天。
特别是,步骤4)中所述叶片片段按照如下方法制成:将所述枫香无菌植株顶端的第2、3片叶的叶片从叶片的一侧垂直于叶片的主脉进行剪切,将叶片剪断2/3,剩余1/3保留,叶片剪成叶片主脉方向长度为0.8-1cm的叶片片段;所述叶柄段按照如下方法制成:将所述枫香无菌植株顶端的第2、3片叶的叶柄剪切成长度为0.8-1cm的叶柄段。
尤其是,步骤4)中叶片片段的近轴面贴于预处理分化培养基上,进行芽原基预分化培养处理。
本发明的诱导培育杂种枫香四倍体的方法具有如下优点和好处:
1、本发明方法重复性强,四倍体诱导率较高,混倍体获得率低,经过多次重复实验,四倍体得率相近,且不受季节影响,采用本发明方法可稳定地获得杂种枫香异源四倍体,为枫香遗传改良提供优良的变异资源,并且采用本发明方法可同时获得同一基因型的二倍体和四倍体,这为研究植物多倍体的遗传机制和倍性效应提供宝贵的遗传材料。
2、本发明方法中采用的萌发培养基种子萌发率高(萌发率在60%以上),为种子萌发提供充足的营养。
3、本发明方法中采用的不定芽分化培养基的不定芽诱导率高(60%以上),平均不定芽个数多(5个以上)并且营养供给持久,培养过程中不需要更换新的培养基。
4、本发明方法中采用的不定芽生根培养基促进生根率高(95%以上),植株生长良好。
5、本发明方法中诱导处理培养基能在化学诱导染色体加倍的过程中提供充足的营养,并且可以让材料的正在分化细胞维持较高的分裂速度,提高四倍体诱导率。
6、本发明方法的杂种枫香四倍体诱导率高,获得杂种枫香四倍体的比率高,而且获得的杂种枫香异源四倍体的遗传稳定性高;采用本发明方法首次诱导获得的杂种枫香人工异源四倍体,异源的两份染色体数量被复制,兼具杂交效应和倍性效应,能在更大程度上产生变异,这为进一步提高枫香遗传增益和良种选育提供可能。
7、采用本发明方法可同时获得同一基因型的二倍体和四倍体,这为研究植物多倍体的遗传机制和倍性效应提供宝贵的遗传材料。
采用本发明方法所用的离体再生系统可实现杂种枫香的高效离体快繁,为今后杂种枫香的良种快繁提供良好的技术支持,并且该系统可为今后杂种枫香的遗传转化提供良好的再生平台。
附图说明
图1为枫香叶片片段剪切示意图。
图2为杂种枫香叶片芽原基预分化培养处理过程中切口发育形态。
图3为杂种枫香叶柄芽原基预分化培养处理过程中切口发育形态。
图4为杂种枫香诱导培养的二倍体再生植株早期生长状况。
图5为杂种枫香诱导培育的四倍体再生植株早期生长状况,其中a为叶片诱导培育的四倍体再生植株;b为叶柄诱导培育的四倍体再生植株。
图6为不同倍性的流式细胞图(a为二倍体,b为四倍体,c为混倍体)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一、试验材料
1.杂种枫香种子获得
本发明以上海辰山植物园(上海市松江区,经度:121.22,纬度:31.03)生长良好、成熟,健康,无虫害的枫香树、北美枫香树为取材资源。
于2016年3月中旬(10‐15日)采集枫香(Liquidambar formosana)的花芽未开封的花枝,接着对花枝进行水培,3‐5天后,雄花华药含水量下降后开裂,散出金黄色花粉,收集枫香树的花粉,然后置于含有干燥剂的试管中低温保存;
于2016年3月末(20-30日)将雌花序和雄花序可以完全分开,且雄花序上还有苞片未脱落,雄花散粉前3-5天,去除北美枫香的雄花序(即对北美枫香进行去雄处理);在雌花序的雌花柱头发亮,有稍许粘液时将父本枫香的花粉授予雌花(即对北美枫香雌花序进行授粉);
授粉后的花序套上硫酸纸袋,然后于2016年4月末(20-30日)将硫酸纸袋换成纱网袋;于2016年9月中旬(10-20日)人工采摘并剥开球果,获得杂种枫香种子;
获得的杂种枫香种子于4℃下干燥贮存,备用;如果人工采摘的球果不立即剥开,则在4℃下进行低温干燥贮藏,待使用时在剥开,获得杂种枫香种子。
2.植物生长调节剂
本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、噻苯隆(TDZ)。
3.培养基
(1)WPM培养基(Woody Plant medium)标准配方
(2)1/2WPM培养基:将WPM培养基中大量元素成分减半。
上述1/2WPM培养基母液、WPM培养基母液配好后,分别进行标记,然后分别储存于温度为4℃的冰箱中,待用。根据配制培养基的量,加入琼脂、蔗糖、倍力凝,充分搅拌,最后加水定容至培养基最终体积,用pH计测试培养基酸碱度,用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将pH调整至5.8-5.9。在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
本发明培养基中添加的倍力凝透明度高,琼脂凝固能力强,二者成比例混合,既能提高培养基透光度,促使外植体接收更多的光照,提高光合效率,又在保证培养基凝固的基础上增加培养基含水量。
(3)种子萌发培养基:WPM基本培养基中添加蔗糖30g/L、琼脂2g/L、倍力凝4g/L,调节pH值为5.8-5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
(4)生根培养基:1/2WPM培基添加IBA 2.0mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂2g/L、倍力凝4g/L,调节pH值为5.8-5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
(5)预处理分化培养基:WPM培养基添加TDZ 0.1mg/L、6-BA 0.8mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂2g/L、倍力凝4g/L,调节pH值为5.8-5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
(6)诱导处理培养基:WPM培养基添加TDZ 0.1mg/L、6-BA 0.8mg/L、NAA 0.1mg/L、秋水仙碱120‐200mg/L、蔗糖30g/L,调节pH值为5.8-5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
(7)不定芽分化培养基:WPM培养基添加TDZ 0.1mg/L、6-BA 0.8mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂2g/L、倍力凝4g/L,调节pH值为5.8-5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
(8)不定芽伸长培养基:WPM培养基添加6-BA 0.4mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂2g/L、倍力凝2g/L,调节pH值为5.8-5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
(9)不定芽生根培养基:1/2WPM培基添加IBA 2mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂2g/L、倍力凝4g/L,pH5.8‐5.9,在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
本发明实施例中使用的各培养基为优选条件的培养基。
4.培养条件
4-1)种子萌发阶段:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
4-2)离体植株生根培养、继代扩繁培养阶段:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
4-3)外植体预处理分化阶段:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
4-4)诱导培养阶段:培养温度为25±2℃,黑暗处理3‐5天。
4-5)不定芽分化培养阶段、不定芽伸长培养阶段、不定芽生根培养阶段的培养条件均为:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
5、裂解液modified Galbraith’s buffer标准配方
实施例2制备枫香无菌苗
1、杂种枫香种子灭菌
挑选于4℃下干燥贮存的饱满、健康的种子,在超净工作台下进行消毒,即首先将种子放入75%的酒精(v/v)中处理30-60s(优选为45s(秒)),用无菌水清洗1-2次,之后将种子放入2%的次氯酸钠溶液(w/w)中浸泡6-10min(优选为8min),再用无菌水清洗数次(优选为3-5次);然后将杂种枫香种子放在无菌干燥的滤纸上吸干种子表面水分,获得灭菌的杂种枫香种子(350粒);
2、种子萌发处理
将灭菌的杂种枫香种子放置于种子萌发培养基(WPM基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8-5.9)中,进行种子的萌发培养,4-8天后,种子开始萌发,15天后将枫香幼苗转入装有种子萌发培养基的培养瓶中,每瓶放3-4株,继续培养,获得枫香无菌苗,其中种子萌发培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
实施例3制备无菌外植体
1、将种子萌发培养约2个月(60-65天)后,选择其中3株生长茁壮的杂种枫香无菌苗(即3个基因型杂种枫香无菌苗,命名为Z1、Z2、Z3基因型杂种枫香无菌苗),并将3株杂种枫香无菌苗分别修剪成顶部留有2片叶片,且顶部的2片叶片剪去一半,长1.5-2.5cm(优选为2cm)的枫香苗段,然后分别接种于生根培养基(WPM培基+IBA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH 5.8‐5.9)中,进行生根培养,其中,枫香苗段生根培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗;枫香苗段生根培养约10天(通常为10-15天)后,植株开始生根,分别获得3个基因型的生根的枫香苗段(即Z1、Z2、Z3基因型杂种枫香苗段);
2、3个基因型的枫香苗段生根培养70天(通常为60-80天)后,将每株枫香无菌苗外植体植株剪成2‐3个1.5‐2cm的茎段,每个茎段上留有2片叶片,且顶部的2片叶片剪去一半;接着将每个茎段接种于生根培养基中,进行继代扩繁培养,对植株进行扩繁,分别获得3个基因型的扩繁培养无菌植株(即Z1、Z2、Z3基因型植株);
继代扩繁培养过程中每60-80天将每株枫香无菌苗植株剪成2‐3个1.5‐2cm的茎段,接着将每个茎段接种于生根培养基中,进行扩繁培养,共继代扩繁培养5次(通常为4-6次),扩繁培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗。
本发明下述实施例采用L9(3)4正交试验设计,共考虑4个因素:A(基因型)、B(秋水仙碱浓度)、C(预培养时间)、D处理时间(天),每个因素各3个水平,分别是:基因型(1:Z1,2:Z2,3:Z3),秋水仙碱浓度(1:120、2:160,3:200mg/L),预培养时间(1:4,2:6,3:8天),处理时间(1:3,2:4,3:5天),共组成9个处理组合,分别是(c1-c9),每组条件以数字1-3表示,其中实施例4对应组别c1;实施例5对应组别c2;实施例6对应组别c3;实施例7对应组别c4;实施例8对应组别c5;实施例9对应组别c6;实施例10对应组别c17;实施例11对应组别c8;实施例12对应组别c9。
实施例4
1、选择Z1基因型的最后一次继代扩繁培养45天(通常为40-50天)的杂种枫香无菌植株为材料,选择植株顶端的第2、3片叶的叶片和叶柄,其中,从叶片的一侧垂直于叶片的主脉进行剪切,即横穿叶片主脉进行剪切,将叶片剪成沿着叶片主脉方向长度为0.8-1cm的叶片片段,其中叶片剪切2/3,剩余1/3保留,不剪断,如图1所示;将叶柄沿着主脉剪成长度为0.8-1cm的叶柄段;叶片片段20片;叶柄20个。每个实验设置3个重复。
芽原基预分化培养处理的叶片通过横穿叶片主脉剪切且又不剪短,即叶片仍然在叶片的一边相连接,可使叶片获得更多的分化位点,同时完整的叶片拥有更大的接触培养基面积,可在早期提供更多的营养。
2、将剪切后的外植体杂种枫香叶片片段、叶柄段分别接种于预处理分化培养基(WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6‐BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8‐5.9)上,其中叶片近轴面贴于培养基上,分别进行芽原基预分化培养处理,培养至叶片切口边缘的叶肉细胞膨大,表皮细胞开始分化;叶柄切口开始膨大,分别获得杂种枫香的预分化培养处理的叶片、叶柄;其中,枫香叶片片段、叶柄段的预处理分化培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗;叶片、叶柄预分化培养处理4天;
通常,叶片片段预分化培养处理4-10天(优选为7-9天,进一步优选为8天);叶柄段预分化培养处理4-10天(优选为5-7天,进一步优选为6天)。叶片片段预分化培养处理天的发育状态(如图2);叶柄预分化培养处理的发育状态(如图3)。
3、将预分化培养处理的杂种枫香的叶片、叶柄分别接种于诱导处理培养基(WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6‐BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱120mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8‐5.9)中,在黑暗条件下浸泡于诱导处理培养基中,分别进行芽原基组织秋水仙碱诱导培养,其中叶片、叶柄芽原基组织秋水仙碱诱导培养条件如下:培养温度为25±2℃,黑暗处理3天;
通常芽原基组织秋水仙碱诱导培养过程中培养时间为3‐5天(优选为3天)即在黑暗条件下浸泡3‐5天(优选为3天)。
将诱导处理后的离体叶片、叶柄从诱导处理培养基中取出后用无菌水中清洗3次(通常为3-6次),然后放在滤纸上吸干水分,获得诱导培养处理叶片、叶柄。
4、将诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基(WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6‐BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8‐5.9)中,分别进行不定芽分化培养;其中,诱导培养处理叶片、叶柄的不定芽分化培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗;
不定芽分化培养过程中,在将诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化生长状况,统计死亡外植体数和存活外植体数,其中外植体叶片、叶柄完全褐化,伤口处无不定芽产生,记为死亡外植体;其他外植体记为存活外植体(包括正常生长外植体、未完全褐化外植体)。计算存活率(CHL%),存活率(CHL%)计算公式如式(Ⅰ)所示:
CHL(%)=﹝1-(叶片为完全褐化的外植体数/总外植体数)﹞×100 (Ⅰ)
统计结果如表1所示。
5、将在不定芽分化培养基上培养45-60天后的杂种枫香的外植体分别移入不定芽伸长培养基(WPM培养基+6‐BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝2g/L,pH5.8‐5.9)中,分别进行不定芽伸长培养,培养至不定芽长度超过1cm;其中不定芽伸长培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为16h光/8h暗;
6、不定芽伸长培养15-30天)后,一半以上的不定芽超过1cm时,将长度超过1cm的杂种枫香的不定芽剪下,分别接种于生根培养基(1/2WPM培基+IBA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂2g/L+倍力凝4g/L,pH5.8-5.9)中,分别进行不定芽生根培养,不定芽生根培养的培养条件如下:培养温度为25±2℃,光照为2000lx,光照周期为14h光/10h暗。
不定芽生根培养30天之后,获得杂种枫香再生植株,如图4、5;其中,图4为杂种枫香二倍体再生植株早期生长状况;图5a为叶片诱导培育的杂种枫香四倍体再生植株;5b为叶柄诱导培育的杂种枫香再生四倍体植株。
剪切了长度超过1cm的不定芽后的分化的外植体再放入伸长培养基里继续进行不定芽伸长培养。
分别选择叶片、叶片再生培养的再生植株各50株,采用流式细胞仪进行倍性检测,倍性检测结果如表2、3所示。
实施例5
除了步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为6天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为4天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱160mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例6
除了步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为8天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为5天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱200mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例7
除了步骤1)中选择Z2基因型的杂种枫香无菌植株为材料;步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为6天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为5天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱120mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例8
除了步骤1)中选择Z2基因型的杂种枫香无菌植株为材料;步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为8天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为3天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱160mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例9
除了步骤1)中选择Z2基因型的杂种枫香无菌植株为材料;步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为4天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为4天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱200mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例10
除了步骤1)中选择Z3基因型的杂种枫香无菌植株为材料;步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为8天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为4天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱120mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例11
除了步骤1)中选择Z3基因型的杂种枫香无菌植株为材料;步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为4天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为5天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱160mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
实施例12
除了步骤1)中选择Z3基因型的杂种枫香无菌植株为材料;步骤2)中芽原基预分化培养处理时间为6天;步骤3)中秋水仙碱诱导培养处理时间为3天,诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+秋水仙碱200mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8-5.9之外,其余与实施例4相同。
其中,在步骤4)中不定芽分化培养过程中,在将秋水仙碱诱导培养处理的杂种枫香叶片、叶柄分别接种于不定芽分化培养基上培养14天后,分别统计不定芽分化状况,计算存活率(CHL%),存活率的统计结果如表1所示。
表1 不定芽分化培养存活率统计表
试验例1倍性检测
实施例4、5、8-12诱导培育获得的杂种枫香再生植株中分别各自选择叶片、叶片再生培养的再生植株各50株,实施例6中诱导培育获得的杂种枫香再生植株中选择叶片、叶片再生培养的再生植株各30株;实施例7中诱导培育获得的杂种枫香再生植株中选择叶片、叶片再生培养的再生植株各15株,采用流式细胞仪进行倍性检测,具体操作步骤如下:在无菌操作台里分别剪取幼嫩的叶片,接着分别放入直径5mm的培养皿里,再放入1.25ml裂解液,用刀片将叶片切碎,尽量不出现浑浊的液体;用50μm的尼龙布过滤,滤液分别收集到2ml的上样管中,再分别加入100μL DAPI(10μg/mL)溶液,染色后,放入流式细胞仪【Ploidy analyser(Patec)】中进行染色体倍性检测,检测结果如表2、3、图6所示。流式细胞仪染色体倍性检测图如图6所示:二倍体的峰值在50处,四倍体的峰值在100处,混倍体的峰值在50和100处都有出现。
实施例2萌发培养获得的杂种枫香无菌苗(二倍体植株)采用流式细胞仪进行倍性检测,检测结果如图6a所示。
表2 叶片诱导再生植株倍性检测结果
处理组 检测植株(株) 四倍体(株) 混倍体(株) 四倍体诱导率(%)
实施例4(c1) 50 1 1 2.00
实施例5(c2) 50 0 1 0.00
实施例6(c3) 30 1 2 3.33
实施例7(c4) 15 0 0 0.00
实施例8(c5) 50 1 1 2.00
实施例9(c6) 50 0 1 0.00
实施例10(c7) 50 0 1 0.00
实施例11(c8) 50 0 0 0.00
实施例12(c9) 50 1 2 2.00
表3 叶柄诱导再生植株倍性检测结果
检测植株(株) 四倍体(株) 混倍体(株) 四倍体诱导率(%)
实施例4(c1) 50 1 0 2.00
实施例5(c2) 50 2 1 4.00
实施例6(c3) 30 1 0 3.33
实施例7(c4) 15 0 0 0.00
实施例8(c5) 50 3 2 6.00
实施例9(c6) 50 0 0 0.00
实施例10(c7) 50 0 0 0.00
实施例11(c8) 50 0 0 0.00
实施例12(c9) 50 4 2 8.00
对倍性检测四倍体诱导率的数据进行极差分析,分析结果如表4所示。
表4 杂种枫香四倍体诱导率极差分析
其中:A(基因型)、B(秋水仙碱浓度)、C(预培养时间)、D处理时间(天)。基因型(1:Z1,2:Z2,3:Z3),秋水仙碱浓度(1:120、2:160,3:200mg/L),预培养时间(1:4,2:6,3:8天),处理时间(1:3,2:4,3:5天)。
K1(A)=c1+c2+c3 k1(A)=(c1+c2+c3)/3
K2(A)=c4+c5+c6 k2(A)=(c4+c5+c6)/3
K3(A)=c7+c8+c9 k3(A)=(c7+c8+c9)/3
K1(B)=c1+c4+c7 k1(B)=(c1+c4+c7)/3
K2(B)=c2+c5+c8 k2(B)=(c2+c5+c8)/3
K3(B)=c3+c6+c9 k3(B)=(c3+c6+c9)/3
K1(C)=c1+c6+c8 k1(C)=(c1+c6+c8)/3
K2(C)=c2+c4+c9 k2(C)=(c2+c4+c9)/3
K3(C)=c3+c5+c7 k3(C)=(c3+c5+c7)/3
K1(D)=c1+c5+c9 k1(D)=(c1+c5+c9)/3
K2(D)=c2+c6+c7 k2(D)=(c2+c6+c7)/3
K3(D)=c3+c4+c8 k3(D)=(c3+c4+c8)/3
由极差分析结果可知:本发明方法中叶片诱导再生植株培养中芽原基预分化培养处理8天,在200mg/L的秋水仙碱下诱导处理3天,获得再生四倍体的诱导率最优;叶柄诱导再生植株培养中芽原基预分化培养处理6天,在200mg/L的秋水仙碱下诱导处理3天,获得再生四倍体的诱导率最优。
采用本发明提供的技术,经重复试验三次,每次的四倍体得率相近,因此可认为采用本实验技术可稳定地获得杂种枫香异源四倍体,为不同倍性间杂交提供材料,丰富枫香诱变途径,为枫香的遗传改良提供一种新方法。

Claims (10)

1.一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法,其特征在于,包括对杂种枫香离体无菌植株的叶片、叶柄分别进行芽原基预分化培养处理,然后再对预分化培养处理后的叶片、叶柄分别进行秋水仙碱诱导培养。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述芽原基预分化培养处理是将杂种枫香离体无菌植株叶片、叶柄分别接种于预处理分化培养基中,进行芽原基预分化培养处理,形成芽原基,其中所述预处理分化培养基为WPM培养基+TDZ 0.1-0.2mg/L+6-BA 0.7-0.9mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述秋水仙碱诱导培养是将芽原基预分化培养处理后的杂种枫香外植体的叶片、叶柄分别转入到诱导培养基中,进行芽原基的诱导培养,其中所述诱导培养基为WPM培养基+TDZ 0.1-0.2mg/L+6-BA 0.7-0.9mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+秋水仙碱120-210mg/L+蔗糖20-40g/L。
4.一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)采集并剥开杂种枫香球果,对枫香球果内的种子进行表面灭菌,获得无菌杂种枫香种子;
2)将无菌杂种枫香种子接种于萌发培养基上,进行萌发培养,获得杂种枫香无菌苗;
3)将枫香无菌苗剪切成枫香苗段后接种于生根培养基中,进行生根培养,获得枫香无菌植株;
4)首先将枫香无菌植株顶端的第2、3片叶的叶片和叶柄分别剪切成叶片片段、叶柄段后分别接种于预处理分化培养基上,进行芽原基预分化培养处理;接着将预分化培养处理后的叶片片段、叶柄段分别接种于诱导处理培养基中,进行芽原基组织诱导培养处理;
5)将诱导培养处理后的叶片片段、叶柄段分别接种于不定芽分化培养基中,进行不定芽分化培养;
6)将不定芽分化培养后的外植体接种于不定芽伸长培养基中,进行不定芽伸长培养;
7)将不定芽伸长培养后的长度超过1cm的不定芽剪切后接种于不定芽生根培养基中,进行不定芽生根培养,获得杂种枫香四倍体植株。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述杂种枫香球果的父本为枫香(Liquidambar formosana),母本为北美枫香(Liquidambar styraciflua)。
6.如权利要求4或5所述的方法,其特征在于,步骤2)中所述萌发培养基为WPM基本培养基中+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L;步骤3)中所述生根培养基为1/2WPM培基+IBA 1-2mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂1-3g/L+倍力凝4-5g/L。
7.如权利要求4或5所述的方法,其特征在于,步骤4)中所述叶片片段按照如下方法制成:将所述枫香无菌植株顶端的第2、3片叶的叶片从叶片的一侧垂直于叶片的主脉进行剪切,将叶片剪断2/3,剩余1/3保留,叶片剪成叶片主脉方向长度为0.8-1cm的叶片片段;所述叶柄段按照如下方法制成:将所述枫香无菌植株顶端的第2、3片叶的叶柄剪切成长度为0.8-1cm的叶柄段。
8.如权利要求4或5所述的方法,其特征在于,步骤4)中所述诱导处理培养基为WPM培养基+TDZ 0.1-0.2mg/L+6-BA 0.7-0.9mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+秋水仙碱120-210mg/L+蔗糖20-40g/L。
9.如权利要求4或5所述的方法,其特征在于,还包括步骤3A),在进行芽原基预分化培养处理之前,进行枫香无菌植株继代扩繁培养,将枫香无菌植株剪成2-3个具有1.5-2cm的茎段,接着将每个茎段分别接种于生根培养基中,进行继代扩繁培养。
10.如权利要求4或5所述的方法,其特征在于,步骤4)中所述芽原基组织诱导培养处理在以下条件下进行:黑暗条件下,于25±2℃的培养温度下浸泡3-5天,优选为3天。
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