CN101248753B - 利用小孢子培养和ssr标记辅助选育低芥酸、低硫甙甘蓝型油菜自交不亲和系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种利用小孢子培养和SSR标记辅助选育低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。其特征是，以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，保持系04P63外-52为父本杂交得到F1，对F1作小孢子培养得到双单倍体(DH)自交不亲和系；进一步筛选得到低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系材料；利用SSR标记分析自交不亲和DH系的变异，考察自交不亲和DH系的株高、一次分枝数、一次分枝角果数、主花序长度、主花序角果数和单株产量等6个主选性状，筛选出产量、相关性状和一般配合力优于S-1300的双低甘蓝型油菜自交不亲和DH系。本发明为选育双低甘蓝型油菜自交不亲和系提供了一种简单、快速、有效的方法。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种利用小孢子培养和SSR标记辅助选育低芥酸、低硫甙甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。
背景技术
杂种优势利用是提高油菜产量的主要途径，优势杂交组合的选配是利用杂种优势的前提之一。实践证明杂交种的表现主要由杂交亲本的性状决定，杂交亲本的选育是配制杂交组合的关键，选育优良自交不亲和系对提高自交不亲和系杂交种的产量和抗逆性具有重要意义。虽然自交不亲和杂种具有选育周期短、制种产量高等优点，但改良自交不亲和系(母本)很困难，一方面自交不亲和性的遗传机制复杂，因而选育自交不亲和性稳定的母本所需周期长；另一方面，没有直观、快速鉴定亲和性的方法限制了改良自交不亲和系的效率和规模。在改良母本时首先要鉴定亲和性，再依据亲和性选择不亲和单株采用剥蕾自交进行繁殖。亲和指数法(华中农学院农学系作物育种组油菜科研组，甘蓝型油菜自交不亲和系的选育简报，中国油料，1975(4)：77-85)是鉴定亲和性的常用方法，具有简单、方便、可大量操作等特点，但该方法周期长、繁琐。首先要套袋自交，10～15天以后才能根据角果的发育情况初步判断是否具有亲和性特征，其次要收获成熟的角果、考察结籽情况、计算亲和指数才能最终确定亲和性。由于亲和性的鉴定需要较长的时间(初步判断也要10～15天)，往往在不明确亲和性的情况下就盲目地进行剥蕾自交，一方面做了很多无用功，另一方面，从自交不亲和植株上却不能得到足够的剥蕾自交种子。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种利用小孢子培养和SSR标记辅助选育低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。以解决甘蓝型油菜自交不亲和系选育周期长、效率低等问题，为甘蓝型油菜自交不亲和系的选育提供一种简单、快速、有效的选育方法。
本发明是这样实现的：
一种低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系的选育方法，其步骤包括，利用小孢子培养和分子标记辅助选择，具体步骤如下：
1)用甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本与保持系04P63外-52进行杂交，得到F1种子，播种F1种子得到自交不亲和的甘蓝型油菜F1植株；
2)从步骤1)的自交不亲和甘蓝型油菜F1植株上取花蕾进行小孢子培养，获得双单倍体(DH)分离群体，调查自交不亲和的表型，选择得到甘蓝型油菜自交不亲和DH系；
3)对步骤2)获得的DH系种子的含油量、芥酸含量和硫甙含量进行品质鉴定，结合SSR标记辅助选择，得到低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系；
4)种植步骤3)获得的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系，考察其后代与主选性状密切相关的株高、一次分枝数、一次分枝角果数、主花序长度、主花序角果数和单株产量6个性状，选择得到单株产量高于S-1300的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系；
5)利用步骤4)筛选出的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系为母本分别与四个甘蓝型油菜品种06-育9、华双5号、恢6178和恢5200杂交配制F1组合，种植F1组合，考察F1单株的全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个性状；筛选得到一般配合力高于S-1300的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系。
更详细的步骤如《具体实施方式》所示。
本发明的有益效果是：
1、本发明获得的甘蓝型油菜自交不亲和系所需年限短，从小孢子辅助培养到自交不亲和DH系的繁殖、品质分析和农艺性状考察等只需2年，比常规方法缩短了4～5年。
2、本发明的甘蓝型油菜自交不亲和系基因型完全纯合，不再出现亲和性分离。只需一次鉴定亲和性，不仅节省了人力、物力，而且避免连续多代自交导致的自交衰退。
附图说明
图1：本发明中小孢子培养得到的甘蓝型油菜的胚状体和再生苗，图中：a：小孢子培养得到的胚状体；b：小孢子培养得到的再生苗。
图2：本发明中小孢子培养得到的单倍体植株、双单倍体自交不亲和DH植株和双单倍体自交亲和DH植株的花器或角果形态，图中：a，双单倍体花序；b，单倍体花序；c，自交不亲和DH单株；d，自交亲和DH单株。
图3：本发明中SSR引物Na14-F11在甘蓝型油菜自交不亲和DH系以及亲本中的扩增结果，图中：箭头所指为多态性条带。
图4：本发明选育的甘蓝型油菜自交不亲和DH系与S-1300以及父本的聚类树。
具体实施方式
实施例1
1、甘蓝型油菜杂交F1的获得
以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300(马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17(3)：211-213)为母本，与父本即甘蓝型油菜品种04P63外-52(该品系于2007年9月20日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称：CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P200704，该品种的分类命名为：Brassica napus)杂交得到F1种子。
2、甘蓝型油菜杂交F1的小孢子培养
将F1种子在自然条件下种植(田间株系编号为05-9-1515)，得到F1植株。小孢子培养方法参见余凤群等(余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)：165-168)报道的方法。具体是：当F1植株开第3朵花时，选取三个单株分别编号为05-9-1515-1，05-9-1515-2和05-9-1515-3。分别在三个单株的主茎上取长度为2.8～3.5mm左右的花蕾，放入已灭菌的小烧杯中(操作工具及消毒液按常规方法灭菌，即121℃蒸汽灭菌20分钟，操作均在无菌条件下进行)。加入75％的酒精消毒1min，用0.1％HgCl2消毒10min，然后用无菌水冲洗3次，每次5min。取消毒好的甘蓝型油菜花蕾放入试管中，该试管预先加有1ml灭过菌的B5-13提取液(配方见表8的B5培养基，蔗糖浓度为13％，pH＝5.8)，用玻璃棒碾成匀浆，倒入装有孔径0.44μm双层尼龙膜的漏斗中过滤，用10ml的离心管收集滤液。加B5-13提取液至所需刻度，室温(20-25℃)，转速800rpm离心5min，弃上清液，取沉淀，即包含所需要的小孢子，加B5-13提取液重新悬浮小孢子，在转速800rpm下再离心5min。弃上清液，加入NLN-16培养基(见表8，NLN培养基，含50mg/L秋水仙碱，蔗糖浓度为16％，pH＝5.8)重新悬浮小孢子，悬浮液转移至150ml的三角瓶中，在32℃恒温培养箱中暗培养48～72h。之后将三角瓶中的液体转移至10ml的离心管中，在转速600rpm下离心5min，弃上清液，加入NLN-13培养基(见表8，NLN培养基，不含秋水仙碱，蔗糖浓度为13％，抽滤除菌，pH＝5.8)重新悬浮，分装到直径为7.5cm的培养皿中，培养密度为2蕾/皿，每皿2ml，以封口膜封口。培养皿放入25℃暗培养14～21d；待肉眼可看见胚时，置于25℃恒温摇床上震荡培养7～14d(转速为55rpm/min)。当胚状体达子叶期时，将胚转入B5固体培养基(见表8，B5培养基，蔗糖浓度2％，琼脂7.5g，pH＝5.8)，置于16h光照/8h黑暗、25℃培养室培养。一部分胚分化愈伤组织，另一部分直接分化再生苗。本发明通过小孢子培养很容易获得了胚状体(见图1a)。
取上述步骤中获得的再生苗3株，均取上部组织(含生长点)接种在B5固体培养基，每隔20d继代培养一次，继代两次后用含多效唑(0.325mg/L)的B5固体培养基继代，然后统计再生苗数，按以下公式计算胚状体成苗率：胚状体成苗率(％)＝成苗的胚状体个数/接种的胚状体个数×100％。本发明的成苗率为85.1％(见表1)。
3、甘蓝型油菜小孢子培养获得DH系
将上述步骤中得到的再生苗练苗(去掉三角瓶上的牛皮纸帽子)3天，然后移栽至大田(见图1b)，用遮阳网覆盖，每天傍晚揭网浇水，次日上午盖网。移栽苗成活(约1周)后，移去遮阳网。于盛花期(油菜植株75％开花时)观察各个单株的长势和花粉量，与正常品种相比。加倍成功的DH系(混双二倍体，染色体组成为AACC)花粉正常(见图2a)，植株、叶子和花蕾等同正常品种。未加倍成功的植株表现无花粉或微量花粉(见图2b)，植株弱小，花蕾偏小。本发明共得到283个甘蓝型油菜DH系，按照以下公式：加倍率(％)＝加倍的DH植株数/总株数×100％，计算加倍率为63.5％。
表1甘蓝型油菜株系05-9-1515小孢子培养结果
4、甘蓝型油菜DH系的亲和性鉴定
调查上述步骤中得到的283个甘蓝性型油菜DH系的自交不亲和性，具体方法如下：当主枝上有3～5朵花开放时，摘除主枝已开的花朵和花序中心的小蕾以限制主枝无限生长，然后用硫酸钠纸袋套住主枝和2～3个侧枝，每隔一天把纸袋向上抽提，在抽提的过程中用手轻拍纸袋使花粉散落有利于自交授粉，起到辅助授粉的作用。大约10天后，依结籽情况对甘蓝型油菜DH系的亲和性做出初步判断。对初步判断为自交不亲和的单株要对尽可能多的侧枝剥蕾自交繁殖种子。在终花期，再次判断甘蓝型油菜DH系的亲和性。油菜成熟收获后，脱粒、考察套袋自交结实情况，按照公式计算亲和指数：亲和指数＝籽粒数/花朵数，参见文献(马朝芝等，甘蓝型油菜低芥酸、低硫甙的自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17(3)：211-213)以1为标准，即亲和指数＜1的单株为自交不亲和，亲和指数≥1为自交亲和。
本发明调查的283个甘蓝型油菜DH系中，包括94个自交不亲和DH系(见图2c)和189个自交亲和DH系(见图2d)。选取亲和指数＜1的94个自交不亲和DH系为进一步的育种材料。
5、甘蓝型油菜自交不亲和DH系的品质分析
用近红外分析仪(Vector 22/N，Bruker，Germany，OPUS/QUANT4.0software)分析上述步骤中获得的94个自交不亲和DH系的种子的含油量、芥酸含量和硫甙含量三个品质性状，以低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜品种华双3号和高芥酸、高硫甙的甘蓝型油菜品种中油821为对照，以硫甙含量＜30μmol/g、芥酸含量＜5％作为低芥酸、低硫甙的材料的标准(见表2)。分析的甘蓝型油菜自交不亲和DH系的含油量均比甘蓝型油菜品种华双3号低，含油量最高的单株是05-9-1515-3-2，为35.96％，其次是05-9-1515-2-12，为35.80％。而株号为05-9-1515-1-100和株号为05-9-1515-1-226的含油量最低，分别为24.49％和24.59％。株号为05-9-1515-1-226的芥酸含量最高达到10.53％，属于低芥酸标准的甘蓝型油菜DH系的单株有64个，其中36个单株的芥酸含量为0。在硫甙含量方面，株号为05-9-1515-1-146的总硫甙含量为最高达到104μmol/g。检测到低硫甙指标的甘蓝型油菜DH系有56个，其中17个单株硫甙含量为0。共有56个单株为低芥酸、低硫甙的的甘蓝型油菜自交不亲和DH系，其中15个甘蓝型油菜DH系单株的总硫甙和芥酸含量均为0。这些数据说明本发明的育种方法很容易改良甘蓝型油菜自交不亲和DH系的芥酸含量和硫甙含量等品质性状。选取72个甘蓝型油菜自交不亲和DH系进行SSR标记分析。
表2本发明的甘蓝型油菜DH系的品质分析结果
| DH系株号和对照 | 含油量(％) | 总硫甙(umol/g) | 芥酸(％) |
| 华双3号 | 41.72 | 30.30 | 1.21 |
| 中油821 | 35.66 | 153.13 | 40.50 |
| 05-9-1515-1-1 | 32.17 | 3.40 | 1.24 |
| 05-9-1515-1-2 | 23.51 | 77.20 | 8.65 |
| 05-9-1515-1-8 | 27.31 | 23.50 | 0.49 |
| 05-9-1515-1-9 | 30.42 | 8.92 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-11 | 30.14 | 28.36 | 0.00 |
| DH系株号和对照 | 含油量(％) | 总硫甙(umol/g) | 芥酸(％) |
| 05-9-1515-1-25 | 30.22 | 0.26 | 0.11 |
| 05-9-1515-1-36 | 30.23 | 10.88 | 1.00 |
| 05-9-1515-1-39 | 27.08 | 43.70 | 3.79 |
| 05-9-1515-1-40 | 28.63 | 31.18 | 7.38 |
| 05-9-1515-1-46 | 26.23 | 60.84 | 3.98 |
| 05-9-1515-1-53 | 31.14 | 18.31 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-54 | 31.83 | 7.70 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-60 | 29.48 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-61 | 27.90 | 17.46 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-65 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-66 | 28.57 | 20.50 | 3.92 |
| 05-9-1515-1-67 | 33.32 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-68 | 33.34 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-69 | 33.30 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-70 | 31.11 | 0.00 | 0.08 |
| 05-9-1515-1-71 | 28.09 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-72 | 31.72 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-73 | 30.72 | 37.73 | 6.09 |
| 05-9-1515-1-74 | 34.22 | 1.19 | 3.06 |
| 05-9-1515-1-79 | N | N | N |
| DH系株号和对照 | 含油量(％) | 总硫甙(umol/g) | 芥酸(％) |
| 05-9-1515-1-80 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-81 | 34.47 | 4.41 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-85 | 32.82 | 17.51 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-93 | 28.15 | 37.29 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-96 | 23.94 | 68.98 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-97 | 31.33 | 25.39 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-100 | 24.49 | 28.14 | 2.09 |
| 05-9-1515-1-101 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-102 | 30.10 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-105 | 30.79 | 16.56 | 0.50 |
| 05-9-1515-1-106 | 30.38 | 13.63 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-109 | 32.11 | 12.01 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-111 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-118 | 27.01 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-121 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-127 | 28.84 | 35.61 | 0.29 |
| 05-9-1515-1-140 | 32.21 | 38.14 | 2.05 |
| 05-9-1515-1-141 | 28.90 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-142 | 25.63 | 30.7 | 5.44 |
| 05-9-1515-1-145 | 27.52 | 32.4 | 8.05 |
| DH系株号和对照 | 含油量(％) | 总硫甙(umol/g) | 芥酸(％) |
| 05-9-1515-1-146 | 28.13 | 104.3 | 5.65 |
| 05-9-1515-1-147 | 29.08 | 4.67 | 7.95 |
| 05-9-1515-1-148 | 30.47 | 13.56 | 0.06 |
| 05-9-1515-1-151 | 24.97 | 88.87 | 9.19 |
| 05-9-1515-1-160 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-167 | 28.96 | 38.18 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-173 | 27.13 | 63.67 | 2.37 |
| 05-9-1515-1-175 | 27.30 | 21.63 | 8.30 |
| 05-9-1515-1-181 | 31.33 | 11.63 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-190 | 32.27 | 15.93 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-194 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-195 | 30.09 | 13.40 | 1.09 |
| 05-9-1515-1-202 | 29.55 | 38.19 | 3.53 |
| 05-9-1515-1-204 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-210 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-215 | 30.81 | 2.73 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-218 | 26.13 | 32.81 | 7.91 |
| 05-9-1515-1-220 | 32.05 | 14.15 | 2.67 |
| 05-9-1515-1-226 | 24.59 | 97.00 | 10.53 |
| 05-9-1515-1-233 | 30.99 | 26.71 | 0.00 |
| DH系株号和对照 | 含油量(％) | 总硫甙(umol/g) | 芥酸(％) |
| 05-9-1515-1-234 | 33.35 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-236 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-240 | 28.72 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-245 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-248 | 29.06 | 66.85 | 1.40 |
| 05-9-1515-1-250 | 29.96 | 72.44 | 8.83 |
| 05-9-1515-1-253 | 35.15 | 17.48 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-255 | 24.68 | 41.62 | 3.54 |
| 05-9-1515-1-257 | 33.70 | 0.00 | 5.68 |
| 05-9-1515-1-263 | 30.61 | 39.68 | 6.80 |
| 05-9-1515-1-264 | 35.46 | 4.81 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-265 | N | N | N |
| 05-9-1515-1-267 | 35.55 | 0.74 | 0.44 |
| 05-9-1515-1-270 | 32.71 | 13.37 | 0.75 |
| 05-9-1515-1-277 | 25.92 | 16.45 | 0.00 |
| 05-9-1515-1-281 | 29.40 | 11.75 | 5.70 |
| 05-9-1515-2-12 | 35.80 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-2-19 | 31.85 | 0.00 | 0.00 |
| 05-9-1515-3-2 | 35.96 | 13.15 | 0.96 |
| 05-9-1515-3-8 | 35.01 | 0.00 | 0.00 |
| DH系株号和对照 | 含油量(％) | 总硫甙(umol/g) | 芥酸(％) |
| 05-9-1515-3-10 | 33.44 | 10.49 | 0.00 |
| 05-9-1515-3-34 | 32.94 | 29.11 | 4.55 |
| 05-9-1515-3-49 | 29.04 | 5.61 | 0.39 |
| 05-9-1515-3-75 | N | N | N |
| 05-9-1515-3-77 | 35.51 | 4.04 | 0.00 |
| 05-9-1515-3-80 | 33.31 | 15.20 | 2.35 |
| 05-9-1515-3-83 | 27.64 | 44.97 | 1.26 |
| 05-9-1515-3-89 | N | N | N |
| 05-9-1515-3-126 | 33.20 | 0.00 | 0.00 |
| 华双3号 | 41.93 | 39.81 | 0.06 |
| 中油821 | 34.23 | 163.85 | 38.49 |
注：N表示由于种子数量不足，尚未进行品质分析。
6、甘蓝型油菜自交不亲和DH系的SSR标记分析
将上述步骤获得的72个甘蓝型油菜自交不亲和DH系的种子，以及亲本S-1300和04P63外-52和4个甘蓝型油菜品种06-育9(该品系于2007年9月20日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：P200703，该品种的分类命名为：Brassica napus)、华双5号(审定编号：国审油2004006，一个中国大面积推广的品种)、恢6178(马朝芝等，RAPDs和RFLPs分析甘蓝型杂交油菜亲本的遗传多样性，作物学报，2003，29(5)：701-707)和恢5200(马朝芝等，RAPDs和RFLPs分析甘蓝型杂交油菜亲本的遗传多样性，作物学报，2003，29(5)：701-707)的种子在自然条件下播种。在幼苗期，取植株的鲜嫩叶片，参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法提取叶片总DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计(Pharmacia Biotech，GeneQuant II)检测DNA浓度。
选取24对SSR引物(SSR引物来源见表3)分析获得的甘蓝型油菜自交不亲和DH系的遗传多样性。PCR反应程序和银染程序均参照陆光远等(陆光远等，一个简便的适合于分析油菜中SSR位点的检测体系，中国油料作物学报，2003，25：79-81)的方法进行。SSR产物电泳银染后有带记为1，无带记为0。24对引物共产生95条多态性带(参见图3)。
利用报道的POPGene软件对SSR标记结果进行聚类分析(见图4)。聚类树可分为两大簇，3个甘蓝型油菜品种华双5号、恢6178和恢5200单独形成一簇，与甘蓝型油菜06-育9、S-1300、04P63外-52和72个甘蓝型油菜自交不亲和DH系形成的簇(称为I簇)亲缘关系较远。I簇内又可分为两个亚簇，其中S-1300和4个甘蓝型油菜自交不亲和DH系单独形成一簇，说明这5个甘蓝型油菜材料亲缘关系较近，而04P63外-52和06-育9与其余68个DH系聚成一簇(称为I-I簇)。I-I簇内又可分为两个亚簇，36个自交不亲和DH系与04P63外-52和06-育9形成一簇，其中31个DH系与04P63外-52亲缘关系较近，另外5个DH系与06-育9亲缘关系较近。其余的32个DH系聚成一簇。SSR标记分析结果说明本发明得到了与S-1300具有遗传差异的甘蓝型油菜自交不亲和系。
表3本发明使用的SSR引物名称及序列
| 引物编号 | 引物名称 | 上游引物(5’-3’) | 下游引物(5’-3’) |
| 1 | Na14-F11 | CTATGGTTCATCTTTCGCCG | CATGCTCCAACCACAGTTTG |
| 2 | Na12-E03 | TTCGCTTTCCCTTACTTTCG | CTCAGTTTCTGCAATCCACG |
| 3 | Na12-E02 | TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG | CAGCAGCCACAACCTTACG |
| 4 | Na10-C06 | TGGATGAAAGCATCAACGAG | ATCAATCAACACAAGCTGCG |
| 5 | Na10-A09 | TCTTGAGCAAAGAAACTTGG | CAAACTGAGCCATACACAAAGG |
| 6 | Na10-C01 | TTTTGTCCCACTGGGTTTTC | GGAAACTAGGGTTTTCCCTTC |
| 7 | O110-B04 | ATCTTCCTCCACGTTCATGC | CGAATCTTGAAGTTCTGACCC |
| 8 | O113-G05 | GTGTGCAGGAAACGATGTTC | GGGAGTTTGAAGAGAAAGCG |
| 9 | O112-F02 | GGCCCATTGATATGGAGATG | CATTTCTCAATGATGAATAGT |
| 10 | BRAS002A | CACTCACAGCCCTCTTCTTCT | CCTCCAGCTTCCTTTACCA |
| 11 | BRAS050 | CTTTGTGGTGGGTAGTGG | ACTTAGCCTCAATACGGTCTT |
| 12 | BRAS063 | GACGCTCATTTCACTTC | TCCTAACTAACATCATTTTGC |
| 13 | BRAS069 | CTCGATCTTCCCCTGCTTTC | GTTGAGCCAATCTACGGTTCC |
| 14 | CB10006 | GAGGCGGAGGGATAAAG | CCCGTTCTCTCCTAACTCTA |
| 15 | CB10045 | CGATCATATTACAAGCCGAGA | CCTATTGCAGATATTTCGATA |
| 引物编号 | 引物名称 | 上游引物(5’-3’) | 下游引物(5’-3’) |
| 16 | CB10093 | GACTTGGGAGAGATTAAACA | GGCGATGGTGATTTCCTAGA |
| 17 | CB10097 | ACTTCGGTGGTTCTATTTCT | CGACGGTTAATCAAGTTTCT |
| 18 | CB10139 | TCTCAAAAGGATATGCGTGAA | CAAAACTCATCAGGGTTGTAG |
| 19 | CB10364 | GAGACGATGCAAAGATCG | TGCAGACACATTCGAACA |
| 20 | CB10587 | TTGTGTTTTGCCTTCTGA | TTTGCGCACAAACAATAA |
| 21 | MR013 | CGCTACTTCCGCTGATACTTT | TCAGAATCGCGACTGTAGTCT |
| 22 | MR156 | CAACTACGCAGGAACATACAG | ACGCGGAACATGATACC |
| 23 | MR036 | TGAAGACCCGCAACTATAATC | ATCGGCGAACATCTAAGG |
| 24 | MR049 | AATGGGAAGCTCGTCGAA | AATTATGCCAACATCCTACGG |
7、甘蓝型油菜自交不亲和DH系的农艺性状调查
选取上述步骤中获得的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系36个，在自然条件下单行区播种，2次重复，行距为0.27m，株距为0.15m(每行10株)，以油菜品种S-1300为对照。花期自由授粉，成熟期考察株高、一次分枝数、一次分枝角果数、主花序长度、主花序角果数和单株产量等6个性状，用间比法(南京农业大学主编，田间试验和统计分析方法，中国农业出版社，1985，第二版，P134)分析考种结果。
在考察的6个性状中，都有表现优于对照S-1300的DH系(表4，表5)。共有22个DH系的株高超过S-1300，其中8个DH单株的株高超过10％以上，最高的DH系05-9-1515-3-2达到17.35％。共26个DH系的一次分枝数超过S-1300，其中6个DH系的一次分枝数比S-1300多10％以上，最多的DH系05-9-1515-1-146达到64.40％。一次分枝角果数优势最强，共23个DH系超过对照，其中比S-1300增加幅度最高超过200％的有1个DH系05-9-1515-1-146，超过100％的有2个DH系，05-9-1515-1-141和05-9-1515-1-142。共28个DH系的主花序长度大于S-1300，其中10个DH系超对照20％以上，5个增幅超过30％，超过S-1300最高的DH系是05-9-1515-2-19，变幅为47.14％。共12个DH系的主花序角果数多于S-1300，4个DH系的优势大于10％，最多的DH系05-9-1515-3-34比S-1300多19.93％。共21个DH系的单株产量比对照增加，其中16个DH系比S-1300高10％以上，2个系05-9-1515-1-97和05-9-1515-1-146超过S-1300分别达到154.32％和138.26％。综合6个性状的表现，2个DH系，05-9-1515-1-97和05-9-1515-3-34，在6个农艺性状上均优于S-1300。这些数据说明与现有方法相比，本发明的育种方法可以同时改良自交不亲和系的多个农艺性状。
表436个低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系的6个农艺性状表现
表5低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系在各农艺性状上超对照的个数
说明：表5的对照品种为S-1300。
8、甘蓝型油菜自交不亲和DH系的一般配合力测定
综合上述步骤中的品质分析结果和农艺性状考察结果，选取5个低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系：05-9-1515-1-72(编号为P2)、05-9-1515-1-102(编号为P3)、05-9-1515-1-270(编号为P4)、05-9-1515-1-281(编号为P5)和05-9-1515-3-126(编号为P6)，与甘蓝型油菜品种S-1300(编号为P1)一起作为母本，分别与4个甘蓝型油菜品种：06-育9(编号为P7)、华双5号(编号为P8)、恢6178(编号为P9)和恢5200(编号为P10)进行杂交，获得24个杂交组合的F1种子。
播种24个杂交组合的F1种子和上述的10个杂交亲本，按照随机区组排列，重复2次，每小区种植3行，行距为0.27m，株距为0.15m(每行10株)，田间管理同常规大田生产。油菜成熟后，收获株型一致的10个单株，考察全株角果数、角果粒数、千粒重和单株产量4个产量相关性状，计算平均值(表6)，以甘蓝型油菜品种中油杂2号为对照。结果表明：全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个产量相关性状上均出现了超对照的组合，有20个组合的千粒重、15个组合的全株角果数、12个组合的角果粒数、15个组合的单株产量高于对照中油杂2号，其中14个组合的千粒重、10个组合的全株角果数、7个组合的角果粒数、7个组合的单株产量比对照显著增加。选育的自交不亲和DH系与S-1300比较，P2、P5和P6在千粒重上优于S-1300，P6在单株产量上优于S-1300，而5个DH系的全株角果数、角果粒数均未表现出优势。这些数据说明利用本发明的育种方法选育得到了产量相关性状表现优势的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系。
表6杂交亲本和F1的全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量的相关分析
| 亲本和组合 | 千粒重(g) | 全株角果数(个) | 角果粒数(个) | 单株产量(g) |
| P<sub>1</sub> | 3.3 | 237.5 | 17.0 | 13.3 |
| P<sub>2</sub> | 3.8 | 237.3 | 12.0 | 10.0 |
| P<sub>3</sub> | 3.4 | 221.8 | 13.8 | 10.9 |
| P<sub>4</sub> | 3.0 | 238.5 | 10.6 | 5.4 |
| 亲本和组合 | 千粒重(g) | 全株角果数(个) | 角果粒数(个) | 单株产量(g) |
| P<sub>5</sub> | 3.7 | 160.4 | 10.7 | 7.7 |
| P<sub>6</sub> | 4.0 | 198.5 | 15.7 | 16.2 |
| P<sub>7</sub> | 3.5 | 166.6 | 17.4 | 10.1 |
| P<sub>8</sub> | 4.4 | 181.3 | 17.9 | 14.1 |
| P<sub>9</sub> | 3.6 | 274.7 | 19.2 | 19.0 |
| P<sub>10</sub> | 4.1 | 126.0 | 17.0 | 11.3 |
| P<sub>1</sub>×P<sub>7</sub> | 4.0<sup>*</sup> | 360.9<sup>*</sup> | 15.4 | 25.9 |
| P<sub>1</sub>×P<sub>8</sub> | 3.7 | 439.9<sup>*</sup> | 19.2 | 29.6<sup>*</sup> |
| P<sub>1</sub>×P<sub>9</sub> | 3.3 | 402.7<sup>*</sup> | 16.0 | 14.6 |
| P<sub>1</sub>×P<sub>10</sub> | 3.8<sup>*</sup> | 272.5 | 13.2 | 14.5 |
| P<sub>2</sub>×P<sub>7</sub> | 4.0<sup>*</sup> | 290.2 | 16.9 | 22.1 |
| P<sub>2</sub>×P<sub>8</sub> | 3.6 | 326.6 | 21.8<sup>*</sup> | 34.7<sup>*</sup> |
| P<sub>2</sub>×P<sub>9</sub> | 3.8<sup>*</sup> | 464.6<sup>*</sup> | 21.1<sup>*</sup> | 23.4 |
| P<sub>2</sub>×P<sub>10</sub> | 4.0<sup>*</sup> | 288.4 | 15.1 | 21.6 |
| P<sub>3</sub>×P<sub>7</sub> | 4.3<sup>*</sup> | 361.4<sup>*</sup> | 18.3 | 30.1<sup>*</sup> |
| P<sub>3</sub>×P<sub>8</sub> | 3.6 | 384.9<sup>*</sup> | 22.7<sup>*</sup> | 30.4<sup>*</sup> |
| P<sub>3</sub>×P<sub>9</sub> | 3.5 | 371.0<sup>*</sup> | 20.4 | 16.4 |
| P<sub>3</sub>×P<sub>10</sub> | 3.9<sup>*</sup> | 233.3 | 15.0 | 20.5 |
| P<sub>4</sub>×P<sub>7</sub> | 4.0<sup>*</sup> | 351.1<sup>*</sup> | 27.7<sup>*</sup> | 42.4<sup>*</sup> |
| P<sub>4</sub>×P<sub>8</sub> | 3.6 | 382.1<sup>*</sup> | 23.2<sup>*</sup> | 23.8 |
| P<sub>4</sub>×P<sub>9</sub> | 3.7 | 264.5 | 19.8 | 24.5<sup>*</sup> |
| P<sub>4</sub>×P<sub>10</sub> | 4.5<sup>*</sup> | 334.4 | 15.3 | 18.8 |
| 亲本和组合 | 千粒重(g) | 全株角果数(个) | 角果粒数(个) | 单株产量(g) |
| P<sub>5</sub>×P<sub>7</sub> | 4.2<sup>*</sup> | 273.8 | 19.0 | 23.3 |
| P<sub>5</sub>×P<sub>8</sub> | 4.3<sup>*</sup> | 291.6 | 14.7 | 24.9<sup>*</sup> |
| P<sub>5</sub>×P<sub>9</sub> | 4.0<sup>*</sup> | 409.9<sup>*</sup> | 20.1 | 19.4 |
| P<sub>5</sub>×P<sub>10</sub> | 4.5<sup>*</sup> | 245.9 | 15.4 | 21.9 |
| P<sub>6</sub>×P<sub>7</sub> | 3.5 | 318.9 | 17.1 | 20.5 |
| P<sub>6</sub>×P<sub>8</sub> | 3.5 | 345.8 | 21.8<sup>*</sup> | 23.3 |
| P<sub>6</sub>×P<sub>9</sub> | 3.6 | 308.7 | 23.5<sup>*</sup> | 20.0 |
| P<sub>6</sub>×P<sub>10</sub> | 3.8<sup>*</sup> | 239.8 | 13.2 | 11.7 |
| 中油杂2号 | 3.5 | 299.3 | 18.8 | 20.8 |
(注：*表示比对照显著增加)
甘蓝型油菜自交不亲和系各性状的一般配合力见表7。每角果粒数的一般配合力效应表现为正值的是P1和P5，其余四个(P2，P3，P4和P6)的一般配合力表现为负效应。全株角果数的一般配合力效应表现正值的是P2、P3、P4和P5，P1和P6的全株角果数的一般配合力效应表现为负值。千粒重的一般配合力效应表现正值的是P1、P2和P6，其余三个母本P3、P4和P5的千粒重的一般配合力效应表现为负值。单株产量的一般配合力效应表现正值的为P1、P2、P4和P5，其余两个母本P3和P6表现负效应。在分析的4个性状中，P1的每角果粒数、千粒重和单株产量3个性状的一般配合力效应表现正值，全株角果数的一般配合力表现负效应。P2在全株角果数、千粒重和单株产量3个性状的一般配合力效应表现为正值，每角果粒数的一般配合力表现为负效应。P5在每角果粒数、全株角果数和单株产量的一般配合力表现为正效应，千粒重的一般配合力表现负效应。综合看来，母本中一般配合力效应值高的是P1、P2和P5，对育种目标有利。这些数据说明利用本发明选育得到产量相关性状的一般配合力高于S-1300的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系。
表7母本的全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量的一般配合力
| 性状 | P<sub>1</sub>(S-1300) | P<sub>2</sub> | P<sub>3</sub> | P<sub>4</sub> | P<sub>5</sub> | P<sub>6</sub> |
| 每角果粒数 | 3.25 | -2.13 | -1.06 | -0.20 | 2.10 | -2.06 |
| 全株角果数 | -40.9 | 42.1 | 17.3 | 15.0 | 7.9 | -18.8 |
| 千粒重 | 0.21 | 0.07 | -0.10 | -0.11 | -0.16 | 0.28 |
| 性状 | P<sub>1</sub>(S-1300) | P<sub>2</sub> | P<sub>3</sub> | P<sub>4</sub> | P<sub>5</sub> | P<sub>6</sub> |
| 单株产量 | 1.33 | 0.79 | -0.14 | 0.53 | 3.49 | -2.80 |
表8 本发明使用的培养基成分
说明：表8的培养基，灭菌前应调pH至6.6-7.0，应用时补充蒸馏水至1升。
名词解释：
低芥酸：专业术语，以芥酸含量＜5％作为低芥酸材料的标准。
低硫甙：专业术语，以硫甙含量＜30μmol/g作为低硫甙材料的标准。
一般配合力：专业术语，是指一个自交系或品种(纯合体)在一系列的杂交组合中的平均产量(或其它经济性状)的表现。
双低：专业术语，即本发明所述的专业术语即低芥酸，低硫甙的简称。
Claims (1)
1.一种低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系的选育方法，其步骤包括，利用小孢子培养和分子标记辅助选择，其特征在于采用如下步骤：
1)用甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本与保持系04P63外-52进行杂交，得到F1种子，播种F1种子得到自交不亲和的甘蓝型油菜F1植株；
2)从步骤1)的自交不亲和甘蓝型油菜F1植株上取花蕾进行小孢子培养，获得双单倍体(DH)分离群体，调查自交不亲和的表型，选择得到甘蓝型油菜自交不亲和DH系；
3)对步骤2)获得的DH系种子的含油量、芥酸含量和硫甙含量进行品质鉴定，结合SSR标记辅助选择，得到低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系；
4)种植步骤3)的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系，考察其后代与主选性状密切相关的株高、一次分枝数、一次分枝角果数、主花序长度、主花序角果数和单株产量6个性状，选择得到单株产量高于S-1300的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系；
5)利用步骤4)筛选出的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和DH系为母本，分别与四个甘蓝型油菜品种06-育9、华双5号、恢6178和恢5200杂交配制F1组合，考察F1单株的全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个性状；筛选得到全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个性状的一般配合力高于S-1300的低芥酸、低硫甙的甘蓝型油菜自交不亲和系。
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Legal Events
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Application publication date: 20080827 Assignee: WUHAN CMP SUPER SEEDS CO., LTD. Assignor: Wuhan Huazhong Agricultural University Assets Management Co., Ltd. Contract record no.: 2012420000159 Denomination of invention: Method for assist-breeding low erucic acid, low sulfuric glucoside cabbage type rape self-incompatible line with microspore cultivation and SSR making Granted publication date: 20100414 License type: Exclusive License Record date: 20120929 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: WUHAN CMP SUPER SEEDS CO., LTD. Assignor: Wuhan Huazhong Agricultural University Assets Management Co., Ltd. Contract record no.: 2012420000159 Date of cancellation: 20160323 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100414 Termination date: 20150327 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |