CN104488719A

CN104488719A - 一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法

Info

Publication number: CN104488719A
Application number: CN201410812965.0A
Authority: CN
Inventors: 平文丽; 李雪君; 丁燕芳; 孙计平; 孙焕; 俎焕新; 李旭辉; 李彦平; 朱景伟; 刘翔文; 宋鹏飞
Original assignee: Tobacco Research Institute Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Tobacco Research Institute Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2034-12-24
Also published as: CN104488719B

Abstract

本发明属于烟草育种和植物组培技术领域，具体涉及一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法。该方法包括以下步骤：（1）低温预处理花蕾、（2）消毒灭菌、（3）接种于改良MS培养基培养等步骤。本发明诱导获得烟草单倍体的技术思路是：花药脱分化→形成胚状体→直接形成完整花粉植株。由于这种培养方式更接近于植物体的发育过程，因而诱导单倍体植株的频率较高，从一个花药上可以诱导出多个花粉植株；同时采用本发明获得单倍体植株所需诱导时间较短，可以在一个月的时间里得到单倍体植株，整体的培养步骤操作也较为简便，因而在烟草杂交培育育种方面具有较好的推广应用价值。

Description

一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法

技术领域

本发明属于烟草育种和植物组培技术领域，具体涉及一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法。

背景技术

花药培养是诱导植物产生单倍体植株的育种手段之一，一直受到遗传育种界的重视。该方法起源于 20 世纪 60 年代，是指将未成熟的花药接种在人工培养基上进行培养、经过诱导分化形成为单倍体植株的过程。通过花药培养技术可以获得单倍体植株，单倍体植株的隐性性状能在早代就表现出来，因此可以及早对基因进行筛选和淘汰，通过对单倍体进行染色体加倍，可以获得性状十分稳定的纯合的二倍体，与常规的杂交育种相比，能够扩大变异范围、加速优异性状的转移与稳定、快速获得基因纯合的种质、提高育种工作的选择效率、明显缩短育种年限。花药培养技术已经在禾本科、茄科、十字花科作物以及许多药用植物的育种中得到了广泛的应用。目前，已经有三百余种植物花药培养获得成功，包括小麦、大麦、玉米、水稻、高粱、大豆、烟草、油菜、辣椒、黄瓜、苹果、葡萄、人参、地黄、枸杞等。早在 1974 年，我国科学家就利用单倍体技术培育出了世界上第一个单倍体作物新品种——烟草单育1号。

随着科学技术的发展，育种技术也不断推陈出新，诱变技术、原生质体融合技术、转基因技术、分子标记辅助选择、种质抗病性的快速鉴定、重要基因的克隆与验证等多项技术都已经广泛用于种质资源创新、杂交优势利用、品种选育等工作中。而近三十年，花药培养技术却未能在烟草育种中得到广泛的应用。究其原因，可能与花药培养过程操作复杂、对研究人员的无菌操作技术要求较高有一定关系。为了便于充分发挥花药培养技术的优势，将其广泛运用于作物遗传分析、功能基因分析等育种实践中，有必要简化花药培养创制单倍体、双单倍体群体等特殊种质的方法体系过程，以便花药培养技术能够和其他各项技术相结合，广泛应用于育种实践中。

发明内容

本发明目的在于提供一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法，相较于现有的花药培养技术，能够简化花药培养技术操作的复杂程度，较为快速的培养出烟草单倍体植株，较好的应用到烟草的育种实践中。

本发明所采取的技术方案如下。

一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法，包括以下步骤：

（1）从烟草花序上选取无病虫、生长良好、花冠刚刚伸出花萼的花蕾，花萼长度不超过1cm，将取好的花蕾迅速封装、编号，低温预处理，备用；一般而言，为获得合适的烟草花序，需要提前3~4个月时间播种所需的烟草品种；

所述低温处理是指将花蕾置于0℃~4℃条件下低温预处理2~3天；优选4℃低温预处理2天；

本发明中具体以烟草品种NC1071、中烟100与云烟87的杂交F1的两个烟草材料进行了实验；

（2）将步骤（1）中低温预处理后花蕾，在超净工作台内消毒灭菌，获得无菌花药，具体顺序为，向花蕾表面喷洒体积分数为70~75%的酒精消毒→纵切剖开花蕾，剥取花药→花药浸入体积分数为70~75%的酒精消毒50~70s（优选60s）→无菌水冲洗消毒后花药3次以上，每次3~5min；

（3）将步骤（2）中消毒后花药接种于改良MS培养基上25~27℃培养，培养分为暗培养和光培养两个过程，接种后首先于无光条件下暗培养10~14 d，然后转到弱光条件下培养至烟草小植株，所述弱光条件具体为每天光照8~10h，光照强度50~100 lx；

所述改良MS培养基为含有40g/L蔗糖的MS基本培养基。

本发明相较于现有的较为复杂的烟草花药单倍体培养技术而言，具有较为明显的技术优势，具体表现在：（1）消毒步骤简单，操作简便且安全性高；现有技术中的针对花蕾、花药消毒时所使用的药剂主要是次氯酸钠（NaClO）或升汞（HgCl2），而这两种药剂不仅对人体具有较大的毒性和伤害性，而且对于花药的损失也较大，严重影响了后续的组培效果，本发明通过改进采用普通的酒精消毒药剂，不仅无菌效果得到了较好的保障，而且对人无毒无害，对与花药也具有较小的损伤，确保了较好的组培效果；（2）花药的成活率较高；本发明通过将采摘后的花药进行低温预处理，较好的提高了后期组培时的花药成活率，并且能够较好的调整花药培养的操作时间，因而具有较好的推广应用性；（3）培养基制备简单易操作；在MS基本培养基中调整蔗糖浓度即可，因而易于制备。

总体而言，本发明诱导获得烟草单倍体的技术思路是：花药脱分化→形成胚状体→直接形成完整花粉植株，与现有的获得单倍体的技术思路（脱分化→形成愈伤组织→诱导丛生芽→诱导根）是不同的。由于这种培养方式更接近于植物体的发育过程，因而诱导单倍体植株的频率较高，例如，对于NC1071、中烟100与云烟87的杂交F1代这两个材料，花药单倍体的诱导率最高可以高达450%，亦即：从一个花药上可以诱导出多个花粉植株；同时采用本发明获得单倍体植株所需诱导时间较短，可以在一个月的时间里得到单倍体植株，整体的培养步骤操作也较为简便，因而在烟草杂交育种、快速选择纯化后代中具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明诱导烟草单倍体植株过程中各阶段烟草植株情况，其中：A. 取花冠刚刚伸出花萼（长度不超过1cm）的花蕾低温预处理后，表面灭菌；B.取花药置于培养基上无菌培养；C. 花药经胚状体途径，形成花粉苗丛；D.花粉苗无在成苗过程自发长出茁壮的根；E.将花粉苗丛分切成单个的花粉苗，转移到新培养基中；F.烟草单倍体植株。

图2为诱导成功的烟草单倍体植株叶片显微图像，从图中可以看出气孔保卫细胞中的叶绿体数。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，在具体介绍各实施例前，首先对本发明中所用到的部分实验仪器设备和实验药剂简要介绍如下。

改良MS培养基：配制时，溶剂为水，溶质采用Sigma公司出产的MS basial medium （with vitamin），用量为4.4 g·L^-1，pH调节至5.8~6.0，附加40 g·L^-1的蔗糖。凝固剂采用琼脂，浓度为8 g·L^-1。

实验材料：NC1071、中烟100与云烟87杂交F1代。

其中，NC1071是美国北卡罗来纳州大学农业试验站育成的烤烟品种，于1995年由中国农业科学院烟草研究所引进。其特征是高抗黑胫病0号小种，中感根结线虫病。

中烟100是中国烟草遗传育种研究（北方）中心以优质抗病为主攻方向，采用优质品种NC82为中心亲本与多抗性互补亲本9201杂交，再用NC82回交5代后，用系谱法定向选择培育而成的优质多抗烤烟新品种。

云烟87是云南省烟草科学研究所、中国烟草育种研究（南方）中心选育成的杂交种。2000年12月通过国家品种审定委员会审定。抗黑胫病，中抗南方根结线虫病。

主要仪器设备：

超净工作台（垂直单向流）VS-1300L-U，生产厂家：苏州安泰；

型号为MGC-300H的光照培养箱，生产厂家：上海一恒科学仪器有限公司。

实施例

本实施例分别以NC1071、中烟100与云烟87杂交F1代这两个材料进行了烟草植株的单倍体诱导实验，简要介绍如下。

一步法诱导烟草单倍体植株的方法，包括以下步骤：

（1）提前3~4个月时间播种所需的烟草品种。

大田种植NC1071：种植地点为河南省农业科学院烟草研究所许昌试验田；种植时间：2014年3月初播种，5月1日前后移栽，6月中旬到7月初，采摘花蕾进行实验。

室内培养中烟100与云烟87杂交F1代，成苗后，移栽到温室的花盆内，大约2个月左右即可采花蕾用于实验。诱导烟草单倍体植株实验时间与大田种植的NC1071品种同步进行。

实验中，选择烟草花粉时，在烟草初花时，选天气晴朗的时间，从烟草花序上选取无病虫、生长良好、花冠刚刚伸出花萼的花蕾，花萼长度不超过1cm，将取好的花蕾用塑料自封袋迅速封装、编号，置于冰盒上，带回实验室；低温预处理，备用；

所述低温处理是指将花蕾置于0~4℃条件下低温预处理2~3天；实验过程中，优选4℃低温预处理2天；花药生物活性损失较小，成活率较高，基本无影响。

（2）将步骤（1）中低温预处理后花蕾，超净工作台灭菌，具体顺序为，向花蕾表面喷洒体积分数为70~75%的酒精消毒→镊子、解剖刀纵切剖开花蕾，从花丝上剥取花药→花药浸入体积分数为70~75%的酒精消毒50~70s（操作中，为便于计时，通常优选60s），消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分→无菌水冲洗消毒后花药3次以上，每次3~5min；

（3）将步骤（2）中消毒后花药接种于改良MS培养基上25~27℃培养，接种时，首先将消毒后的花药置于无菌的玻璃器皿内，无菌滤纸吸干多余的水，然后用无菌镊子轻取花药接种到改良MS培养基上（含有40g/L蔗糖的MS基本培养基）。操作中，来自于同一花蕾上的5个花药可以置于同一接种瓶中。

培养过程包括暗培养和光培养两个过程，接种后首先于无光条件下暗培养10~14d（优选培养10d），然后转到弱光条件下培养，所述弱光条件具体为每天光照8~10h，光照强度50~100lx；培养4周左右后花药会逐渐发育成肉眼可见的小植株。

培养过程中随时记录、观察花药培养过程，部分培养结果如图1所示。从图1可以看出，本发明诱导单倍体的烟草植株的技术效果较为突出。

对某批次培养效果较好的花粉诱导成植株的诱导率进行统计，统计结果如下表。

材料名称	花粉苗数（个）	接种花药数（个）	诱导率%
				NC1071	45	10	450
中烟100×云烟87 F1代	10	5	200

表中，诱导率=（花粉苗数÷接种花药数）×100。

从上表数据可以看出，采用本发明后，从花药诱导单倍体植株的频率较高，对于特定品种例如NC1071、中烟100与云烟87的杂交F1代这两个材料，花药单倍体的诱导率可以高达200%~450%，亦即：可以从一个花药上诱导出多个单倍体植株，具有较好的组培效果。

诱导成功的单倍体烟草植株的染色体倍性鉴定

由于本发明的主要目的在于提供一种快速的培养出烟草单倍体植株的方法，因而只有当所诱导培养的植株为单倍体时，才能用于进一步的烟草育种使用。

在缺少流式细胞仪等大型仪器的情况下，发明人借鉴朱惠琴等的方法（朱惠琴，张宪银，薛庆中．烟草染色体倍性快速鉴定方法[J] 农业生物技术学报，2006，14(2)：255~258．），通过检查所诱导培养的烟草植株的烟叶下表皮的气孔保卫细胞中的叶绿体数来鉴定烟草倍性，简要介绍如下。

检测具体步骤为：在洁净载玻片上滴一滴水，取诱导成功的无菌烟草苗，撕下烟草的叶片的下表皮，贴在载玻片上，取盖玻片盖在叶表皮上，用滤纸吸去多余的水，在显微镜下观察气孔保卫细胞中的叶绿体、计数、拍照。

具体显微图像如图2所示。

从图中可以看出，本方法诱导出植株气孔保卫细胞中的叶绿体数在4~15个之间，符合单倍体植株的特征，因而表明所诱导的烟草植株确实为单倍体植株。

进一步的，将所诱导成功的单倍体植株用0.4%的秋水仙素加倍（加倍单倍体）后，即可以通过普通种植方式来繁育，可以直接用于烟草育种后期的筛选、研究，因而本发明在烟草育种实践中具有较好的应用价值。

Claims

1.一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）从烟草花序上选取无病虫、生长良好、花冠刚刚伸出花萼的花蕾，花萼长度不超过1cm，将取好的花蕾迅速低温预处理，备用；

（2）将步骤（1）中低温预处理后花蕾，消毒灭菌，获得无菌花药；

（3）将步骤（2）中消毒后无菌花药接种于改良MS培养基上25~27℃培养，

所述改良MS培养基为含有40g/L蔗糖的MS基本培养基。

2.如权利要求1所述一步法诱导烟草单倍体植株的方法，其特征在于，所述低温预处理是指将花蕾置于0℃~4℃条件下低温预处理2~3天。

3.如权利要求1所述一步法诱导烟草单倍体植株的方法，其特征在于，步骤（1）中所述烟草是指NC1071或中烟100与云烟87的杂交F1品种。

4.如权利要求1所述一步法诱导烟草单倍体植株的方法，其特征在于，步骤（2）中所述消毒灭菌采用体积分数为70~75%的酒精进行消毒灭菌。

5.如权利要求1所述一步法诱导烟草单倍体植株的方法，其特征在于，步骤（3）中所述培养分为暗培养和光培养两个过程，接种后首先于无光条件下暗培养10~14 d，然后转到弱光条件下培养至烟草小植株，所述弱光条件为每天光照8~10h，光照强度50~100 lx。