CN112293258A - 一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法，包括如下步骤：(1)选择辣椒F1代杂交种子；(2)种子培养；(3)幼苗培养；(4)幼苗二次培养；(5)穴盘移栽；(6)检测四倍体；(7)大棚定植；(8)F2代筛选。其有效解决了辣椒传统育种方法周期长，现有的单倍体育种技术难度大，应用范围狭窄的问题。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种技术领域，具体涉及一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法。
背景技术
辣椒是茄科辣椒属的一年生或多年生草本植物，原产于中南美洲，于17世纪传到中国。其果实含有丰富的胡萝卜素、维生素和辣椒素，营养价值很高。辣椒素是辣椒产生的一种次级代谢产物，具有驱寒、止痢、杀虫、增强食欲、促进消化等功效。因此，辣椒被当作一种重要的蔬菜及调味品，在世界各地广泛种植。我国辣椒种植面积和年产量不断增长，目前已成为世界上最大的辣椒生产国，辣椒产业也已成为我国最大的蔬菜产业。
随着人们生活水平不断改善，对辣椒品质的要求也相应提高。同时由于设施栽培面积不断扩大，迫切需要选育适用于设施栽培的品种。此外，由于重茬严重，导致疫病、炭疽病和病毒病等大面积发生，已成为影响辣椒生产的重大障碍。因此，选育品质优良、适合不同条件栽培和抗病的辣椒新品种，已成为广大育种工作者急需解决的问题。
杂种优势利用是利用父母双亲综合性状的相互作用，使子一代表现出优势互补。该育种方法在辣椒育种中已占领了主导地位，我国目前生产上应用的辣椒优良品种几乎都是杂种一代。辣椒杂种优势利用的前提是培育优良的自交系作为亲本。但辣椒是一种常异花授粉植物，天然杂交率为4％～10％，有的品种甚至高达25％。常规方法通过自交分离选育纯合稳定的自交系，一般需要进行6～8代选择，耗费时间长。因此，自交系的纯化速度已成为新品种培育的主要限制因素之一。
目前市场上的品种更新换代速度加快，对育种效率提出了更高的要求。以单倍体育种为代表的生物技术育种，能够极大地提高育种效率，目前已成为研究热点。单倍体育种主要是指通过培养花药或小孢子得到单倍体植株，然后用秋水仙碱等处理，加倍为双单倍体，从而直接获得纯合品系的育种方式。辣椒花药培养仍存在一系列技术难题，如基因型依赖、再生植株分化率比较低、愈伤化和褐化严重、花药胚状体诱导率低、胚崎形率较高等，极大地制约了辣椒单倍体育种技术的发展与应用。因此，急需寻找一种既能加快育种进程，又简便易操作的替代技术。
传统的杂交育种实践表明，杂交F2代的性状分离是不可避免的。然而，在育种过程中偶尔发现杂交F2代不分离的现象，如小麦、大麦、花生等作物中发现过，近年来在水稻杂交育种中多次发现。在F2代表现出的遗传稳定，可能在F1代就已经形成，因此，可以在杂交育种的早代(F2)进行选择，迅速育成纯合稳定的品种，从而大大缩短育种年限。但这种稳定的遗传及生物学机理目前仍不清楚。
目前，仅在水稻和油菜中获得了F2代纯合系，在辣椒中还未出现过F2代纯合系的报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其有效解决了辣椒传统育种方法周期长，现有的单倍体育种技术难度大，应用范围狭窄的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法，包括如下步骤：
(1)选择辣椒F1代杂交种子；
(2)种子培养：将步骤(1)中选用的辣椒F1杂交种子用消毒晾干后置于含秋水仙素580-600mg/L的MS培养基上，于24-25℃组培室中暗培养至种子发芽，子叶张开；
(3)幼苗培养：将步骤(2)得到的幼苗转移至含秋水仙素380-400mg/L的MS培养基上，于24-25℃，连续光照11-13h条件下继续培养至第一片真叶张开；
(4)幼苗二次培养：将步骤(3)得到的幼苗转移至含秋水仙素180-200mg/L的MS培养基中，于24-25℃，连续光照11-13h条件下继续培养，此时幼苗长出真叶2-3叶；
(5)穴盘移栽：将步骤(4)得到的幼苗从培养基内取出洗净，假植于穴盘内，穴盘置于20-25℃温室中，并加盖小拱棚，早晚各揭膜1次通风，每次18-20min，7-10d后去掉小拱棚；
(6)检测四倍体：当步骤(5)中的幼苗出现5-6叶时，检测加倍效果；
(7)大棚定植：选择步骤(6)检测结果为加倍成功的四倍体幼苗定植于大棚内，花期每个单株之间隔离，待辣椒自然成熟后收获辣椒种子；
(8)F2代筛选：将步骤(7)收获的辣椒种子常规播种育苗，幼苗长至5-6叶时再次采样，用检测倍型，挑选出二倍体单株，这些单株即F2代纯合系。
根据上述技术方案，本发明具有以下优点：
1.使用秋水仙素诱导四倍体辣椒，操作简便，技术难度小，只需要将种子在含秋水仙素的MS培养基上培养，不存在花药培养中遇到的基因型依赖、胚状体诱导率低、愈伤化和褐化严重等问题，解决了现有的单倍体育种技术难度大，应用范围狭窄的问题；
2.该方法可在1年时间内快速获得大量纯化的辣椒新材料，避免了杂交F2代的性状分离现象，保证了F2代的遗传稳定性，大大缩短了辣椒育种进程，解决了辣椒传统育种方法周期长的问题。
优选地，步骤(1)中，所述的F1代杂交种子的亲本亲缘关系较远。
根据上述优选技术方案，本发明具有以下优点：
所述的F1代杂交种子的亲本亲缘关系较远，提高了纯合二倍体单株的获得率；亲本亲缘关系越远，实验成功率越高。
优选地，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述MS培养基含有以下成分：
根据上述优选技术方案，本发明具有以下优点：
步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述的MS培养基，用于植物组织培养快速繁殖，提高获得纯合二倍体单株的效率。
优选地，步骤(2)所述消毒，使用70％-75％酒精消毒40s-45s。
根据上述优选技术方案，本发明具有以下优点：
使用70％酒精消毒40s，增加种子发芽率，提高获得纯合二倍体单株的效率。
优选地，步骤(2)所述的培养时长为10-15d。
优选地，步骤(3)所述的培养时长为14-15d。
优选地，步骤(4)所述的培养时长为15-20d。
优选地，步骤(7)所述隔离，使用40目防虫网。
使用40目防虫网隔离单株，防止天然异交对纯合二倍体单株的获得的影响。
优选地，步骤(2)所述含秋水仙素的MS培养基，秋水仙素浓度为600mg/L。
优选地，步骤(3)所述含秋水仙素的MS培养基，秋水仙素浓度为400mg/L。
优选地，步骤(4)所述含秋水仙素的MS培养基，秋水仙素浓度为200mg/L。
优选地，步骤(2)所述培养条件，具体为25℃暗培养。
优选地，步骤(3)所述培养条件，具体为25℃连续光照12h，培养15d。
优选地，步骤(4)所述培养条件，具体为25℃连续光照12h。
优选地，步骤(2)所述消毒，具体为70％酒精消毒40s。
优选地，优选地，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述MS培养基含有以下成分：
具体实施方式
实施例1
一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法，包括如下步骤：
(1)选择辣椒F1代杂交种子：选用中椒107(F1杂交品种)种子100粒；
(2)种子培养：在MS培养基中添加秋水仙素600mg/L，然后分装于直径9cm的培养皿内，厚1cm左右；再将步骤(1)中选用的辣椒F1杂交种子用70％酒精消毒40s，晾干后置于培养基上，每皿放置辣椒种子10粒，于25℃组培室中暗培养15d至种子发芽，子叶张开；
(3)幼苗培养：在MS培养基中添加秋水仙素400mg/L，然后分装于直径9cm的培养瓶内，厚1cm左右；将步骤(2)得到的幼苗从步骤(2)中的培养基上取出，无菌水清洗干净后转移至培养瓶内，于25℃，连续光照13h条件下继续培养15d至第一片真叶张开；
(4)幼苗二次培养：将步骤(3)得到的幼苗转移至含秋水仙素200mg/L的MS培养基中，于25℃，连续光照13h条件下继续培养20d，此时幼苗长出真叶3叶；
(5)穴盘移栽：将步骤(4)得到的幼苗从培养基内取出并用自来水冲洗干净，假植于穴盘内，穴盘置于25℃温室中，并加盖小拱棚，早晚各揭膜1次通风，每次20min，7d后去掉小拱棚；
(6)检测四倍体：当步骤(5)中的幼苗出现6叶时，选取完全张开的叶片，用打孔器取直径1cm左右圆片，将采取的新鲜样品在离心管内捣碎成匀浆，以未进行加倍处理的二倍体辣椒为对照，用流式细胞仪检测加倍效果；
(7)大棚定植：选择步骤(6)检测结果为加倍成功的四倍体幼苗定植于大棚内，田间管理按常规处理，花期每个单株用40目防虫网隔离，防止天然异交，待辣椒自然成熟后收获辣椒种子；
(8)F2代筛选：将步骤(7)收获的辣椒种子常规播种育苗，幼苗长至6叶时再次采样，用流式细胞仪检测倍型，挑选出二倍体单株；
(9)细胞学鉴定：对步骤(8)得到的F2单株进行细胞学鉴定，观察F2代单株根尖染色体；
(10)形态学鉴定：将步骤(8)得到的F2代单株继续自交获得F3株系。种植F3代株系，对个F2单株衍生的F3代株系进行形态学调查，包括质量性状(株型、叶形、叶色、花冠颜色、青熟果色、老熟果色、果型)和数量性状(株高、首花节位、心室数、果长、果径)。
其中，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述的MS培养基含有以下成分：
步骤(9)的细胞学鉴定结果表明染色体形态正常，条数为24条，与亲本一致；
如表1所示，步骤(10)的形态学鉴定结果显示，F3代的形态学性状与F2代基本一致；
表1实施例1中F2代与F3代的形态学性状
根据步骤(9)和步骤(10)的结果得知，获得的F2单株为纯合系。
实施例2
一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法，包括如下步骤：
(1)选择辣椒F1代杂交种子：选用线椒材料07-16作为母本，剥蕾进行人工去雄，以父本线椒材料07-24的花粉授粉杂交获得F1代杂交种子，取F1代杂交种子110粒；
(2)种子培养：在MS培养基中添加秋水仙素580mg/L，然后分装于直径9cm的培养皿内，厚1cm左右；再将步骤(1)中选用的辣椒F1杂交种子用75％酒精消毒45s，晾干后置于培养基上，每皿放置辣椒种子10粒左右，于24℃组培室中暗培养10d至种子发芽，子叶张开；
(3)幼苗培养：在MS培养基中添加秋水仙素380mg/L，然后分装于直径9cm的培养瓶内，厚1cm左右；将步骤(2)得到的幼苗从步骤(2)中的培养基上取出，无菌水清洗干净后转移至培养瓶内，于24℃，连续光照11h条件下继续培养14d至第一片真叶张开；
(4)幼苗二次培养：将步骤(3)得到的幼苗转移至含秋水仙素180mg/L的MS培养基中，于24℃，连续光照11h条件下继续培养15d，此时幼苗长出真叶2叶；
(5)穴盘移栽：将步骤(4)得到的幼苗从培养基内取出并用自来水冲洗干净，假植于穴盘内，穴盘置于20℃温室中，并加盖小拱棚，早晚各揭膜1次通风，每次18min，10d后去掉小拱棚；
(6)检测四倍体：当步骤(5)中的幼苗出现5叶时，选取完全张开的叶片，用打孔器取直径1cm左右圆片，将采取的新鲜样品在离心管内捣碎成匀浆，以未进行加倍处理的二倍体辣椒为对照，用流式细胞仪检测加倍效果；
(7)大棚定植：选择步骤(6)检测结果为加倍成功的四倍体幼苗定植于大棚内，田间管理按常规处理，花期每个单株用40目防虫网隔离，防止天然异交，待辣椒自然成熟后收获辣椒种子；
(8)F2代筛选：将步骤(7)收获的辣椒种子常规播种育苗，幼苗长至5叶时再次采样，用流式细胞仪检测倍型，挑选出二倍体单株。
(9)细胞学鉴定：对步骤(8)得到的F2单株进行细胞学鉴定，观察F2代单株根尖染色体；
(10)形态学鉴定：将步骤(8)得到的F2代单株继续自交获得F3株系。种植F3代株系，对个F2单株衍生的F3代株系进行形态学调查，包括质量性状(株型、叶形、叶色、花冠颜色、青熟果色、老熟果色、果型)和数量性状(株高、首花节位、心室数、果长、果径)；
(11)PCR鉴定：使用SSR分子标记对步骤(1)中的亲本和步骤(8)得到的F2单株进行PCR分析。
其中，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述的MS培养基含有以下成分：
步骤(9)的细胞学鉴定结果表明染色体形态正常，条数为24条，与亲本一致；
如表2所示，步骤(10)的形态学鉴定结果显示，F3代的形态学性状与F2代基本一致；
表2实施例2中F2代与F3代的形态学性状
步骤(11)的PCR电泳带型显示，每个单株都是07-16与07-24的杂交后代，并且每个单株的条带数目及带型一致。
根据步骤(9)、步骤(10)和步骤(11)的结果得知，获得的F2单株为纯合系。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选择辣椒F1代杂交种子；
(2)种子培养：将步骤(1)中选用的辣椒F1杂交种子用消毒晾干后置于含秋水仙素580-600mg/L的MS培养基上，于24-25℃暗培养至种子发芽，子叶张开；
(3)幼苗培养：将步骤(2)得到的幼苗转移至含秋水仙素380-400mg/L的MS培养基上，于24-25℃，每日连续光照11-13h条件下继续培养至第一片真叶张开；
(4)幼苗二次培养：将步骤(3)得到的幼苗转移至含秋水仙素180-200mg/L的MS培养基中，于24-25℃，每日连续光照11-13h条件下继续培养，此时幼苗长出真叶2-3叶；
(5)穴盘移栽：将步骤(4)得到的幼苗从培养基内取出洗净，假植于穴盘内，穴盘置于20-25℃温室中，并加盖小拱棚，早晚各揭膜1次通风，每次18-20min，7-10d后去掉小拱棚；
(6)检测四倍体：当步骤(5)中的幼苗出现5-6叶时，检测加倍效果；
(7)大棚定植：选择步骤(6)检测结果为加倍成功的四倍体幼苗定植于大棚内，花期每个单株之间隔离，待辣椒自然成熟后收获辣椒种子；
(8)F2代筛选：将步骤(7)收获的辣椒种子常规播种育苗，幼苗长至5-6叶时再次采样，检测倍型，挑选出二倍体单株，这些单株即F2代纯合系。
2.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述的MS培养基为MS基础培养基中加入1.0-1.2mg/L 6-苄基腺嘌呤、20-22mg/L蔗糖和7-8g/L琼脂。
3.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(2)中使用70％-75％酒精消毒40-45s。
4.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养时长为10-15d。
5.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(3)所述的培养时长为14-15d。
6.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(4)所述的培养时长为15-20d。
7.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(7)所述隔离方法为在单株幼苗之间设置40目防虫网。
8.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(2)所述含秋水仙素的MS培养基，秋水仙素浓度为600mg/L。
9.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(3)所述含秋水仙素的MS培养基，秋水仙素浓度为400mg/L。
10.根据权利要求1所述的快速获得辣椒纯合二倍体的方法，其特征在于，步骤(4)所述含秋水仙素的MS培养基，秋水仙素浓度为200mg/L。
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