CN107873514A - 一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，包括如下步骤：取烟草花粉细胞发育到单核中期至双核期的烟草花蕾进行低温处理后,将烟草花蕾中的烟草花药接种到发育诱导培养基中，遮光培养诱导烟草花药雄核发育成胚状体，再进行强光培养促进胚状体萌发得到花粉胚萌发幼苗；将得到的花粉胚萌发幼苗转入到壮苗生根培养基中进行壮苗生根。该方法克服了烟草雄核直接发育途径中花粉胚诱导频率不高、稳定性差，花药培养花粉细胞发育时期选择严格(单核靠边期)、特别是受供试材料的基因型影响大等诸多的弊端，将为烟草重要农艺特性遗传分析群体‑DH群体的建立及细胞工程育种提供一个新的、高效的、大众化应用的技术和方法。

Description

一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法
技术领域
本发明属于作物细胞工程技术领域，涉及烟草花药培养花粉胚的离体诱导技术，具体涉及一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法。
背景技术
烟草是重要的经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。烟草重要特性的遗传基础解析及品种改良是烟草生产的重要基础，近年来，随着细胞和分子生物学技术的发展，快速建立作物重要农艺特性的遗传分析群体和快速进行作物品种改良已成为现代作物遗传育种工作的重要方面之一，利用花药培养诱导烟草花粉细胞雄核发育已成为烟草遗传分析群体—DH群体构建及细胞工程育种的重要途径，尽管烟草是植物组织培养的模式植物；但烟草花药诱导单倍体频率稳定性差、受基因型影响大、易产生变异仍然是烟草花药诱导单倍体形成的制约因素，进一步优化烟草花药培养诱导单倍体的因素，建立稳定地、变异频率低、不依赖于基因型的烟草花粉胚的诱导方法，是烟草花培技术高效应用的当务之急。
利用花药培养诱导烟草雄核发育产生烟草单倍体有两个重要途径，一是直接发育，二是间接发育。直接发育是在无激素或低浓度激素诱导下烟草花粉细胞经花粉胚进而生成完整植株的过程，这一雄核发育方式由于不经过愈伤组织而直接通过胚状体发生完成，因此，再生植株变异小，遗传稳定性好，是人们期望的理想再生途径，但这一再生途径的再生频率不高、稳定性差，花药培养花粉细胞发育时期选择严格(单核靠边期)、特别是受供试材料的基因型影响大，成为制约这一技术高效应用的重要方面。进一步优化诱导烟草雄核直接发育途径中的相关因素，建立一种高效的诱导烟草花药雄核直接发育方法势在必行。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提出一种烟草花药培养高效诱导烟草花粉胚的方法，即高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，这一方法克服了烟草雄核直接发育途径中花粉胚诱导频率不高、稳定性差，花药培养花粉细胞发育时期选择严格(单核靠边期)、特别是受供试材料的基因型影响大等诸多的弊端。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：
一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，包括如下步骤：
取烟草花粉细胞发育到单核中期至双核期的烟草花蕾进行低温处理后,将烟草花蕾中的烟草花药接种到发育诱导培养基中，遮光培养诱导烟草花药雄核发育成胚状体，再进行强光培养促进胚状体萌发得到花粉胚萌发幼苗；将得到的花粉胚萌发幼苗转入到壮苗生根培养基中进行壮苗生根。
具体的，所述的发育诱导培养基包括向Nitsch H基本培养基中添加质量浓度为0.1mg/L的吲哚乙酸、0.1mg/L的6-呋喃基氨基嘌、15％的椰子汁、3％的蔗糖和0.6％的琼脂；
所述的壮苗生根培养基为1/2MS基本培养基中添加质量浓度为0.5mg/L的吲哚乙酸、2％的蔗糖和0.6％的琼脂。
具体的，所述的烟草花蕾进行低温处理的温度为3～5℃，低温处理的时间为48h。
最好的，所述的烟草花药接种到发育诱导培养基中的接种密度为40～60枚/瓶。
最好的，所述的遮光培养诱导烟草花药雄核发育成胚状体的遮光培养时间为40天。
优选的，所述培养的培养温度均为28±1℃。
还有，所述的强光培养的光照条件为3000～4000Lx。
详细的，所述的花粉胚萌发幼苗为具有2～3片叶的幼苗。
最好的，所述的发育诱导培养基和壮苗生根培养基的pH值均为5.6。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明首次提出一种高效的诱导烟草花药雄核直接发育的诱导方法。
(2)本发明通过花粉细胞发育时期选择、花培前低温处理、诱导培养基各成分的优化组合、培养条件的优化等比较研究，建立了一种不依赖于基因型(不同基因型诱导率差异小)、诱导效率高、稳定性好的诱导烟草花药雄核直接发育的方法。
(3)利用本发明的方法、在本发明规定的培养基、培养条件培养方法下，诱导烟草花药雄核直接发育效率高，几乎不受供试材料基因型的影响，烟草花药雄核直接发育效率可达25％以上。最高可达40％以上，且技术路线稳定可行。
(4)本发明建立的高效的烟草花药雄核直接发育的诱导方法，该方法克服了烟草雄核直接发育途径中花粉胚诱导频率不高、稳定性差，花药培养花粉细胞发育时期选择严格(单核靠边期)、特别是受供试材料的基因型影响大等诸多的弊端，将为烟草重要农艺特性遗传分析群体-DH群体的建立及细胞工程育种提供一个新的、高效的、大众化应用的技术和方法。
附图说明
图1为K326×双抗70F1代花药诱导的大量堆积的白色胚状体；
图2为TMK-12×吉烟5号F1代花粉胚萌发生长的情况；
图3为NC71×净叶黄、TMK-12×吉烟5号和烟草K326×双抗70F1代花粉胚在壮苗生根培养基上发育的健壮试管苗；
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步详细介绍。
具体实施方式
本发明提到的烟草花药雄核指的是烟草开花时形成或形成后的花粉粒(花粉细胞)中的细胞核。
本发明提到的烟草花药是烟草开花时形成的雄性器官组织，花药内含大量的花粉粒。一般双子叶植物开花时首先在一定位置形成花蕾(待开花的组织)，进一步生长开出花朵。花蕾中包含有雌蕊和雄蕊(花药组织)。烟草接种时烟草花粉细胞发育到单核中期-双核期，这一发育的时期段均在花蕾生长期间，所以，离体培养这一时段花药时在田间取回的是花蕾，对花蕾进行消毒后，才能剥取花蕾内的花药组织接种培养。
本发明所述的椰子汁为棕榈科植物椰树的果实椰果的抽取汁液。
本发明所述的吲哚乙酸为吲哚-3-乙酸indol-yl-3-acetic acid最初曾称为异植物生长素，亦称吲哚乙酸，缩写IAA，一种用作刺激植物生长的激素类试剂，广泛应用于农业生产中。
本发明的Nitsch H基本培养基为通用的基本培养基，配方为：硝酸钾(KNO3)：950mg/L，硝酸氨(NH4NO3)：720mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)：166mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：185mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：68mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)：27.8mg/L，乙二酸四乙钠(Na2EDTA)：37.3mg/L，硫酸锰(MnSO4·4H2O)：25mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：10mg/L，硼酸(H3BO3)：10mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：5.0mg/L，叶酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L。
本发明的1/2MS培养基为通用的培养基，即由通用MS培养基各种成分含量减半。基本培养基MS的配方为：硝酸钾(KNO3)：1900mg/L，硝酸氨(NH4NO3)：1650mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)：440mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：170mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)：27.8mg/L，乙二酸四乙钠(Na2EDTA)：37.3mg/L，硫酸锰(MnSO4·4H2O)：22.3mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：8.6mg/L，硼酸(H3BO3)：6.2mg/L，碘化钾(KI)：0.83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，氯化钴(CoCl2·6H2O)：0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素：10.0mg/L，盐酸吡哆锌：1.0mg/L，烟酸：1.0mg/L。
本发明提到的烟草花药雄核直接发育诱导培养基即培养基I，本发明提到的壮苗生根培养基即培养基II。
本发明的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，包括：步骤一，大田摘取烟草花粉细胞发育到单核中期-双核期的烟草花蕾，置4℃±1冰盒带回实验室，后置冰箱于4℃条件下低温处理48h；步骤二，处理后的烟草花蕾经常规消毒后分离出花药，花药于无菌条件下接种到培养基Ⅰ中，每瓶培养瓶中接种50枚花药(40～60枚/瓶也可)；步骤三，接种花药后的培养瓶在28±1℃、遮光条件下培养40天，后移置到28±1℃、3000～4000Lx强光照条件下培养促进胚状体萌发；步骤四，将步骤三得到的具2～3片叶的胚状体萌发苗转入到培养基Ⅱ中，于28±1℃、4000Lx强光照条件下壮苗生根；本发明首次提出一种高效的烟草花药雄核直接发育的诱导方法，进一步优化了烟草雄核直接发育诱导途径中的相关因素，建立起了一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导技术体系，该技术体系克服了烟草雄核直接发育途径中花粉胚诱导频率不高、稳定性差，花药培养花粉细胞发育时期选择严格(单核靠边期)、特别是受供试材料基因型影响大等诸多的弊端。
具体的，一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，包括如下步骤：
步骤一，大田摘取烟草花粉细胞发育到单核中期-双核期的花蕾，直接放入冰盒(4℃±1)带回实验室，置冰箱于4℃条件下低温处理48hs。
步骤二，处理后的烟草花蕾经常规消毒后，于无菌条件下将花蕾中分离的花药接种到培养基Ⅰ中，每瓶接种烟草花药50枚。
步骤三，接种花药后的培养瓶在28±1℃、遮光条件下培养，诱导烟草花药组织雄核直接发育，40天后培养花药组织陆续(不同时段)裂开，可见到花药组织内大量堆积的白色胚状体，这时将培养瓶移置到28±1℃、3000Lx～4000Lx强光照条件下培养促进胚状体萌发。
步骤四，步骤三诱导的烟草胚状体萌发至2～3片叶时，及时转入到培养基Ⅱ中，于28±1℃、4000Lx强光照条件下壮苗生根，两周后，胚状体苗发育成健壮的试管苗。
花蕾的常规消毒方法包括：将低温处理后的烟草花蕾依次经质量分数为70％的乙醇漂洗消毒10秒钟，0.1％HgCl2消毒10分钟、无菌水冲洗4次，后剥取烟草花药组织接种。
本发明探索了一种高效地、不依赖于基因型的烟草花药雄核直接发育的诱导方法，将为烟草重要农艺特性遗传分析群体-DH群体的建立及细胞工程育种提供一个新的、高效的、大众化应用的技术和方法。
本发明的烟草花蕾取样时期、运输保鲜、低温预处理、各个步骤所用培养基(培养基Ⅰ、培养基Ⅱ)及各步骤的培养条件(花药接种密度、培养温度、遮光培养、光照强度、光照转化时间、培养基的pH值、用于壮苗的烟草花粉胚幼苗的发育时期)，是发明人经长期的摸索研究才得出的结果，均与本发明方法能否得到稳定、高效、发育健壮的不定芽有密切联系，在使用本方法时，需严格按照本方法的技术方案进行。
实施例1：
以普通烟草NC71×净叶黄F1代为材料，本实施例提供一种烟草花药雄核直接发育诱导方法，具体步骤如下：
步骤一、大田摘取烟草NC71×净叶黄F1代花粉细胞发育到单核中期-双核期的花蕾，直接放入冰盒(4℃)带回实验室，置冰箱于4℃条件下低温处理48hs。
步骤二、处理后的烟草花蕾经常规消毒后，于无菌条件下接种到培养基Ⅰ中，每瓶接种烟草花药50枚。
摘取烟草NC71×净叶黄F1代花粉细胞发育到单核期-双核期的花蕾，于无菌条件下，用质量分数为70％酒精消毒10秒钟，0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗4次后接种于培养基Ⅰ中，每瓶接种50枚花药。
培养基Ⅰ为向1L Nitsch H基本培养基中附加质量浓度为0.1mg/L IAA(吲哚乙酸)、0.1mg/L 6BA(6-呋喃基氨基嘌呤)、15％椰子汁、3％蔗糖和0.6％琼脂。调整培养基Ⅰ的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm2)灭菌15分钟。
步骤三，接种花药后的培养瓶在遮光条件下培养，诱导烟草花药组织雄核直接发育，40天后培养花药组织裂开，可见到花药组织内大量堆积的白色胚状体，这时将培养瓶移置到强光照条件下培养促进胚状体萌发。
接种花药后的培养瓶在28±1℃、温度下遮光培养，40天后，花药组织裂开，花药组织内呈现大量堆积的白色胚状体(图1)，这时，将培养瓶移置到28±1℃温度、3000-4000Lx光照条件下培养，进一步促进花粉胚状体的发育(图2)。
步骤四，当步骤三中的胚状体萌发至2-3片叶时，及时转入到培养基Ⅱ中，于28±1℃、4000Lx强光照条件下壮苗生根，两周后，胚状体苗发育成健壮的试管苗。
培养基Ⅱ为1/2MS(MS培养基各成分减半)附加0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)、2％蔗糖和0.6％琼脂。调整培Ⅱ养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm2)灭菌15分钟。
利用这一技术体系，使烟草NC71×净叶黄F1花粉胚苗的诱导频率从对照(常用的方法)22.6％达到了35.3％。图3(左)为烟草NC71×净叶黄F1花粉胚苗在壮苗生根培养基上生长情况，可以看出生长健壮，发育良好，多次重复试验均得到相似的结果，可见本方法诱导烟草花药组织花粉细胞直接雄核发育具有很高的稳定性。
实施例2：
本实施例以烟草TMK-12×吉烟5号为材料，提供一种高效的烟草花药雄核直接发育的诱导方法，具体步骤同实施例1。
利用这一技术体系，使烟草TMK-12×吉烟5号花粉胚苗的诱导频率从对照(常用的方法)9.2％达到了28.8％。图3(右)为烟草TMK-12×吉烟5号F1花粉胚苗在生根壮苗培养基上生长情况，可以看出生长健壮，发育良好，多次重复试验均得到相似的结果，可见本方法诱导烟草花药组织花粉细胞直接雄核发育具有很高的稳定性。
实施例3：
本实施例以烟草K326×双抗70F1为材料提供一种高效的烟草花药雄核直接发育的诱导方法，具体步骤同实施例1。
利用这一技术体系，使烟草花粉胚苗的诱导频率从对照(常用的方法)11.8％达到了31.8％。图3(中)为烟草K326×双抗70F1花粉胚苗在生根壮苗培养基上生长情况，可以看出生长健壮，发育良好，多次重复试验均得到相似的结果，可见本方法诱导烟草花药组织花粉细胞直接雄核发育具有很高的稳定性。
以上实施例证明了本发明的方法对多种品种的烟草的诱导培养都是有效果的，该方法是有通用性的；下面的对比例的设置目的是为了重现上述技术方案的整个的研发过程，体现出本发明技术方案是经过发明人一系列的技术研究才能得到的，整个过程充满了很多的不确定因素。
对比例一：(低温处理对比)
本实施例以烟草TMK-12×吉烟5号为材料，除大田摘回的花蕾不经过低温处理外，其他条件与实施例1相同，则诱导效率比实施例1下降2.1个百分点，为26.7％。
对比例二：(光照处理对比)
本实施例以烟草TMK-12×吉烟5号为材料，除培养过程不经过避光再强光的培养，一直在强光下培养外，其他条件与实施例1相同，则诱导效率比实施例1下降2.2个百分点，为26.6％。
对比例三：(培养基I条件对比)
本实施例以烟草TMK-12×吉烟5号为材料，若培养基I中不加入额外的添加剂即仅采用Nitsch H基本培养基，其他条件与实施例1相同，则诱导效率为0；
若培养基I中添加15％的椰子汁，其他条件与实施例1相同，则诱导效率为3.5％；
若培养基I中添加15％的椰子汁和0.1％IAA，其他条件与实施例1相同，则诱导效率为9.2％；
若培养基I中添加15％的椰子汁、0.1％IAA和0.1％6BA，其他条件与实施例1相同，则诱导效率为28.8％；
研究还设置了多种添加剂浓度组合，但就诱导烟草雄核直接发育而言，本发明的添加剂配置组合和浓度(添加质量浓度为0.1mg/L的吲哚乙酸、0.1mg/L的6-呋喃基氨基嘌、15％的椰子汁、3％的蔗糖和0.6％的琼脂)是最佳的。
对比例四：(培养基II条件对比)
本实施例以烟草NC71×净叶黄F1为材料，培养基II中不加入额外的添加剂、仅加入一种添加剂或加入不同浓度的添加剂，最终的培养结果试管苗的生根数量不同，通过多次的对比筛选，最终确定在培养基II中加入0.5mg/L IAA、2％蔗糖和0.6％琼脂其试管苗生根数量最多，试管苗生长最壮。

Claims (9)

1.一种高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
取烟草花粉细胞发育到单核中期至双核期的烟草花蕾进行低温处理后,将烟草花蕾中的烟草花药接种到发育诱导培养基中，遮光培养诱导烟草花药雄核发育成胚状体，再进行强光培养促进胚状体萌发得到花粉胚萌发幼苗；将得到的花粉胚萌发幼苗转入到壮苗生根培养基中进行壮苗生根。
2.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的发育诱导培养基包括向Nitsch H基本培养基中添加质量浓度为0.1mg/L的吲哚乙酸、0.1mg/L的6-呋喃基氨基嘌、15％的椰子汁、3％的蔗糖和0.6％的琼脂；
所述的壮苗生根培养基为1/2MS基本培养基中添加质量浓度为0.5mg/L的吲哚乙酸、2％的蔗糖和0.6％的琼脂。
3.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的烟草花蕾进行低温处理的温度为3～5℃，低温处理的时间为48h。
4.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的烟草花药接种到发育诱导培养基中的接种密度为40～60枚/瓶。
5.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的遮光培养诱导烟草花药雄核发育成胚状体的遮光培养时间为40天。
6.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述培养的培养温度均为28±1℃。
7.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的强光培养的光照条件为3000～4000Lx。
8.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的花粉胚萌发幼苗为具有2～3片叶的幼苗。
9.如权利要求1所述的高效的烟草花药雄核直接发育诱导方法，其特征在于，所述的发育诱导培养基和壮苗生根培养基的pH值均为5.6。
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