CN101926285A - 克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，包括(1)选材：苜蓿成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后选取无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)将上述选取的外植体接种于体细胞胚胎发生诱导培养基上培养；(3)将上述经体细胞胚胎发生诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上培养；(4)将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上培养形成幼苗；(5)壮苗生根培养；(6)再生植株移栽、成活。本发明可有效地克服苜蓿高频体胚再生培养中不同品种及基因型限制问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率，提高育种效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种豆科牧草的高频体胚再生培养方法，更具体的讲涉及一种克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，属于植物学领域。
背景技术
苜蓿(Medicago sativa L.)以其突出的经济价值和生态功能在我国得到大面积的推广种植，并在农牧业的发展及生态环境的改善中发挥着无可替代的作用。而面对生产需要和现有的生产条件，苜蓿在产量、品质及抗性等方面都有待于进一步改良。将生物技术与常规育种方法结合起来进行苜蓿新品种培育，是改良苜蓿品质，提高育种效率的有效途径。
苜蓿是一种多年生的异花授粉植物，自交结实率很低，不到1％，目前栽培上使用的大部分苜蓿品种是综合品种，品种内个体间基因型差异很大，可以说每一粒种子就是一个单独的基因型，而采用生物技术进行品种改良的前提条件就是在组织培养过程中具有高频体胚再生能力，但苜蓿体细胞胚发生能力强烈依赖于其基因型，所以基因型障碍已经成为限制苜蓿，尤其是优良苜蓿高频体胚再生的瓶颈。
苜蓿组织培养研究已有30多年，国内外研究报告中所采用的外植体几乎包括苜蓿所有器官或组织，如茎尖、叶片、茎段、幼芽、子叶、下胚轴、上胚轴、花药、花粉、子房、胚珠、幼根、叶柄等，培养基有液体也有固体，多种基本培养基均使用过，得出的最佳外植体是下胚轴，关于苜蓿体胚再生植株已有一些报道，但这些研究获得的结果均表明苜蓿体细胞胚发生能力为基因型依赖性，所以这些研究也均难以解决苜蓿基因型障碍的问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可有效提高体细胞胚发生频率和再生植株频率的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种克服苜蓿基因型限制高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：
(1)选材：苜蓿成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；
(2)体细胞胚胎发生诱导：将上述选取的外植体接种于体细胞胚胎发生诱导培养基上，在室温27±2℃的条件下暗培养26～28天；
(3)胚继代形成培养：将上述经体细胞胚胎发生诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～8℃低温人工气候箱暗培养，然后在室温27±2℃的条件下暗培养28～30天；
(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～1500lx的条件下进行16h/d的光培养30～40天，形成幼苗；
(5)幼苗生长-驯化培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；
(6)生根的再生植株移栽、成活；
所述的幼苗生长驯化培养基为：1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；
所述的体细胞胚胎发生诱导培养基为：改良SH+6～10mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；
所述的胚继代形成培养基为：改良SH+2～5mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；
所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良MS+500mg/L 水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂。
上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中，常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硫酸铵 463mg/L；
硝酸钾 2830mg/L；
二水氯化钙 166mg/L；
七水硫酸镁 185mg/L；
无水磷酸二氢钾 400mg/L；
乙二胺四乙酸铁钠盐 1.4mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
一水硫酸锰 10mg/L；
硫酸锌 1.0mg/L；
硼酸 5.0mg/L；
碘化钾 1.0mg/L；
钼酸钠 0.1mg/L；
硫酸铜 0.2mg/L；
氯化钴 0.1mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素 5.0mg/L；
烟酸 5.0mg/L；
盐酸吡哆醇 5.0mg/L；
肌醇 1.0mg/L。
上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中，常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾 1900mg/L；
硝酸铵 1650mg/L；
七水硫酸镁 370mg/L；
无水磷酸二氢钾 170mg/L；
二水氯化钙 440mg/L；
乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L；
七水硫酸亚铁 27.8mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰 22.3mg/L；
硫酸锌 8.6mg/L；
硼酸 6.2mg/L；
碘化钾 0.83mg/L；
钼酸钠 0.25mg/L；
硫酸铜 0.025mg/L；
氯化钴 0.025mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素 10mg/L；
烟酸 1.0mg/L；
盐酸吡哆醇 1.0mg/L；
肌醇 100mg/L。
本发明的有益效果是：本发明通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，有效地克服了苜蓿高频体胚再生培养中不同品种及基因型限制问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。建立苜蓿高频体胚再生技术体系是保证苜蓿体细胞诱导变异、高效稳定遗传转化、获得大量可供筛选的突变植株的前提条件，通过优化简化苜蓿体细胞胚胎发生和植株再生培养基和技术体系，能有效的发挥转基因等生物技术在苜蓿现代育种中的作用，提高育种效率。
附图说明
图1为本发明所述的金达胚性愈伤组织示意图；
图2为本发明所述的三得利颗粒状胚性愈伤组织示意图；
图3为本发明所述的金达体细胞胚胎发育成球形胚、梨形胚和鱼雷胚的示意图；
图4为本发明所述的中牧1号体细胞胚胎的发育成球形胚、梨形胚和鱼雷胚的示意图；
图5为本发明所述的中牧1号不同时期的胚状体示意图；
图6为本发明所述的金达胚状体分化聚集成芽丛示意图；
图7为本发明所述的三得利胚状体分化聚集成芽丛示意图；
图8为本发明所述的三得利胚状体分化发育成幼苗示意图；
图9为本发明所述的三得利幼苗长成再生植株示意图；
图10为本发明所述的炼苗后准备移栽的植株示意图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例，详细说明本发明的具体实施方式：
图1为本发明所述的金达胚性愈伤组织示意图；图2为本发明所述的三得利颗粒状胚性愈伤组织示意图；图3为本发明所述的金达体细胞胚胎发育成球形胚、梨形胚和鱼雷胚的示意图；图4为本发明所述的中牧1号体细胞胚胎的发育成球形胚、梨形胚和鱼雷胚的示意图；图5为本发明所述的中牧1号不同时期的胚状体示意图；图6为本发明所述的金达胚状体分化聚集成芽丛示意图；图7为本发明所述的三得利胚状体分化聚集成芽丛示意图；图8为本发明所述的三得利胚状体分化发育成幼苗示意图；图9为本发明所述的三得利幼苗长成再生植株示意图；图10为本发明所述的炼苗后准备移栽的植株示意图。
一种克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：
(1)选材：选择12个品种，即：三得利、金达、阿尔冈金、得福、胜利者、中牧一号、紫花苜蓿8925、驯鹿、新疆大叶苜蓿、德宝、塞特、甘农2号，每个品种600粒种子，共7200个基因型；
用流水冲洗上述种子约0.5～1h，在无菌室用75％酒精消毒20～30秒，无菌水洗3～5次，0.1％升汞消毒6～8分钟，用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干水分，接种于幼苗生长驯化培养基上；
取上述萌发5～6天的无菌苗上、下胚轴剪成2～3mm长的小段，再生叶片在距叶基部2/3处垂直主脉切割，带叶柄部分，再垂直主脉横切2刀，造成伤口，茎包括茎柄，这些材料作为外植体，接种于体细胞胚胎发生诱导培养基上；
(2)胚发生愈伤组织诱导：将上述选取的外植体接种于体细胞胚胎发生诱导培养基上，在室温27±2℃的条件下暗培养26～28天；
(3)胚继代形成培养：将上述经体细胞胚胎发生诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～8℃低温人工气候箱暗培养，然后在室温27±2℃的条件下暗培养28～30天；
(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～1500lx的条件下进行16h/d的光培养30～40天，形成幼苗；
(5)壮苗生根培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；
(6)将生根的再生植株移栽到温室小花盆中，花盆中的土体的组分及重量百分比：泥炭土∶园土＝7∶3，移栽后每天浇水1～2次，待苗成活后逐渐减少浇水次数；
所述的体细胞胚胎发生诱导培养基为：改良SH+6～10mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；
所述的胚继代形成培养基为：改良SH+2～5mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；
所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良MS+500mg/L 水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂。
上述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中，常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硫酸铵 463mg/L；
硝酸钾 2830mg/L；
二水氯化钙 166mg/L；
七水硫酸镁 185mg/L；
无水磷酸二氢钾 400mg/L；
乙二胺四乙酸铁钠盐 1.4mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
一水硫酸锰 10mg/L；
硫酸锌 1.0mg/L；
硼酸 5.0mg/L；
碘化钾 1.0mg/L；
钼酸钠 0.1mg/L；
硫酸铜 0.2mg/L；
氯化钴 0.1mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素 5.0mg/L；
烟酸 5.0mg/L；
盐酸吡哆醇 5.0mg/L；
肌醇 1.0mg/L。
上述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中，常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾 1900mg/L；
硝酸铵 1650mg/L；
七水硫酸镁 370mg/L；
无水磷酸二氢钾 170mg/L；
二水氯化钙 440mg/L；
乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L；
七水硫酸亚铁 27.8mg/L。
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰 22.3mg/L；
硫酸锌 8.6mg/L；
硼酸 6.2mg/L；
碘化钾 0.83mg/L；
钼酸钠 0.25mg/L；
硫酸铜 0.025mg/L；
氯化钴 0.025mg/L。
有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素 10mg/L；
烟酸 1.0mg/L；
盐酸吡哆醇 1.0mg/L；
肌醇 100mg/L。
在具体的实施例中，植物生长调节剂的组合分别为：
实施例1
A.胚发生愈伤组织诱导培养基(改良SH+6mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良SH+5mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂)+D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例2
A.体细胞胚胎发生诱导培养基(改良SH+6mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良SH+5mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂)+D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例3
A.体细胞胚胎发生诱导培养基(改良SH+8mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良SH+5mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂)+D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例4
A.体细胞胚胎发生诱导培养基(改良SH+8mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良SH+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂)+D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例5
A.体细胞胚胎发生诱导培养基(改良SH+10mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良SH+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂)+D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
实施例6
A.体细胞胚胎发生诱导培养基(改良SH+10mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel)+B.胚继代形成培养基(改良SH+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L 6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel)+C.胚成熟萌发成苗培养基(改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂)+D.幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，上述所有培养基高压灭菌后pH在5.8左右。
将上述7200个外植体分别在6个实施例所述的植物生长调节剂组合上进行体细胞胚胎发生诱导培养、胚继代形成培养、壮苗生根培养、再生植株移栽。
以上实施例以实施例3为最佳实施例。
另外，上述的培养过程及结果如下：
(1)体细胞胚胎发生诱导培养：
将外植体(上、下胚轴、再生叶)放在体细胞胚胎发生诱导培养基上，在室温27±2℃，暗培养26～28天。每个实验(配方)均重复3次，共600个外植体分别在6种植物生长调节剂组合上测试胚发生愈伤组织诱导，通过显微观察看到：愈伤组织表面形成一些突起，突起细胞质浓，与周围细胞分开，有明显界限，说明这些分裂迅速的细胞是胚性细胞，这些愈伤组织是胚性愈伤组织(如图1所示)，上述所有实验都能获得胚性愈伤组织，但胚愈伤组织最高诱导率均是在含有合适浓度的植物生长素或合适比率植物生长素/细胞激动素的培养基上发生，过高的植物生长素或不合适的植物生长素/细胞激动素比率均会降低外植体胚愈伤组织发生率，胚发生愈伤组织最有效的组合是2，4-D 8mg/L和6-BA0.2mg/L，此组合易于大多数基因型诱导产生更多的胚性愈伤组织，上、下胚轴胚愈伤组织发生率平均提高13％以上(见表1)，因此可见只有植物生长素/细胞激动素配比合适，才能促进胚愈伤组织产生和形成。
表1外植体在SHG3胚愈伤组织发生率比较
(2)胚愈伤组织继代形成培养：
若将胚愈伤组织继续放在原诱导培养基上继代培养，保持较长时间，则会推迟体细胞胚形成和成熟发育，还有可能形成次生体细胞胚，所以将在诱导培养基上培养1个月左右的胚愈伤组织转接到胚继代形成培养基上，前5天放在4～8℃人工气候箱暗培养，之后取出放在室温27±2℃，暗培养28～30天。本实验通过设置低温/常温处理发现，在胚继代形成培养前期经过一定时间的低温处理有利于胚继代形成和成熟，胚继代形成培养基的特点为降低2，4-D浓度，添加水解酪蛋白，提高蔗糖和phytagel浓度。4个实验(配方)结果表明：适当降低2，4-D浓度，有利于体细胞胚形成，降低次生体细胞胚产生。4个实验中，最有效的组合是2，4-D 5mg/L和6-BA 0.5mg/L，能较大幅度提高体细胞胚成熟率，使上、下胚轴胚状体分化率平均提高了18％以上(见表2)，胚愈伤组织也不再增大疏松变成浅白或出现褐化，而是在胚愈伤组织表面出现粘性白色或粘性浅黄色愈伤或绿色颗粒状愈伤(如图1和图2所示)，这些胚性愈伤进一步发育会形成体细胞胚(即产生球形胚、梨形胚、鱼雷胚和子叶胚，如图3、图4和图5所示)。
表2外植体在改良MS上胚状体分化率比较
(3)胚成熟萌发成苗培养：
成熟对体细胞胚发育形成再生植株是非常重要的，而体细胞胚的形成和胚状体的萌发则必须降低2，4-D浓度或将其去除，将上述体细胞胚经过降低2，4-D浓度、提高蔗糖浓度(50g/L)和phytagel浓度(0.35)这样一个培养基脱水处理后，会促进80％的球形胚发育成鱼雷胚和子叶胚(如图3、图4和图5所示)，转接到改良MS+30g/L白糖+0.7％琼脂培养基上培养，会观察到大量分化小苗(如图6和图7所示)，每个分化小苗是由体细胞胚萌发而成的，体细胞胚进一步发育形成幼根、胚轴伸长长出子叶和真叶，最后发育为自由生长的幼苗(如图8和图9所示)。
(4)再生植株移栽：将分化小苗转接到幼苗生长驯化培养基(1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂)，待苗长得健壮移栽到小花盆进行炼苗(如图10所示)。
经过上述的过程培养的12个品种不同基因型不同部位体细胞胚胎发生率和胚状体分化率的结果见表3和表4：
表3苜蓿基因型不同部位体细胞胚胎发生率比较
表4苜蓿基因型不同部位胚状体分化率比较
从表3和表4中看出：中牧一号上、下胚轴体细胞胚胎发生率和胚状体分化率均最高，三得利次之，金达等10个苜蓿品种比它们稍差；12个品种上胚轴体细胞胚胎发生率依次为中牧一号＞三得利＞金达＞8925＞阿尔冈金＞得福＞德宝＞驯鹿＞塞特＞新疆大叶＞甘农2号＞胜利者；下胚轴体细胞胚胎发生率依次为中牧一号＞三得利＞金达＞阿尔冈金＞8925＞德宝＞得福＞驯鹿＞塞特＞新疆大叶＞甘农2号＞胜利者；上胚轴胚状体分化率依次为中牧一号＞三得利＞金达＞8925＞阿尔冈金＞得福＞德宝＞驯鹿＞塞特＞新疆大叶＞甘农2号＞胜利者；下胚轴胚状体分化率依次为中牧一号＞三得利＞金达＞阿尔冈金＞8925＞德宝＞得福＞驯鹿＞塞特＞新疆大叶＞甘农2号＞胜利者；再生叶不同品种基因型体细胞胚胎发生率和胚状体分化率都很高，均在85％以上，不同品种基因型间差异很小。上述结果说明上、下胚轴不同品种及基因型由于遗传背景的不同，对培养条件反应有一定的差异，但在相对一致的培养条件下均能得到体细胞胚和胚状体分化再生苗。
因此可以得出通过选择适宜外植体、改良基本培养基及成分、调整培养条件等配套措施，有效地克服了苜蓿高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚胎发生频率和再生植株频率的结论。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种克服苜蓿基因型限制高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：
(1)选材：苜蓿成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；
(2)体细胞胚胎发生诱导：将上述选取的外植体接种于体细胞胚胎发生诱导培养基上，在室温27±2℃的条件下暗培养26～28天；
(3)胚继代形成培养：将上述经体细胞胚胎发生诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～8℃低温人工气候箱暗培养，然后在室温27±2℃的条件下暗培养28～30天；
(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～1500lx的条件下进行16h/d的光培养30～40天，形成幼苗；
(5)幼苗生长-驯化培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；
(6)生根的再生植株移栽、成活；
所述的幼苗生长驯化培养基为：1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；
所述的体细胞胚胎发生诱导培养基为：改良SH+6～10mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；
所述的胚继代形成培养基为：改良SH+2～5mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；
所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂。
2.根据权利要求1所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
3.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硫酸铵 463mg/L；
硝酸钾 2830mg/L；
二水氯化钙 166mg/L；
七水硫酸镁 185mg/L；
无水磷酸二氢钾 400mg/L；
乙二胺四乙酸铁钠盐 1.4mg/L。
4.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
一水硫酸锰 10mg/L；
硫酸锌 1.0mg/L；
硼酸 5.0mg/L；
碘化钾 1.0mg/L；
钼酸钠 0.1mg/L；
硫酸铜 0.2mg/L；
氯化钴 0.1mg/L。
5.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素 5.0mg/L；
烟酸 5.0mg/L；
盐酸吡哆醇 5.0mg/L；
肌醇 1.0mg/L。
6.根据权利要求1所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
7.根据权利要求6所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾 1900mg/L；
硝酸铵 1650mg/L；
七水硫酸镁 370mg/L；
无水磷酸二氢钾 170mg/L；
二水氯化钙 440mg/L；
乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L；
七水硫酸亚铁 27.8mg/L。
8.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
四水硫酸锰 22.3mg/L；
硫酸锌 8.6mg/L；
硼酸 6.2mg/L；
碘化钾 0.83mg/L；
钼酸钠 0.25mg/L；
硫酸铜 0.025mg/L；
氯化钴 0.025mg/L。
9.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
盐酸硫胺素 10mg/L；
烟酸 1.0mg/L；
盐酸吡哆醇 1.0mg/L；
肌醇 100mg/L。
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