CN103314860B - 一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法，涉及植物组织培养技术领域。本方法是：①种子筛选；②种子处理；③种子消毒；④培养基制备，包括诱导培养基、继代培养基、分化培养基和植株保持培养基；⑤愈伤诱导；⑥继代培养；⑦愈伤组织分化；⑧再生苗的植株保持培养；⑨再生性能好的愈伤组织诱导。本发明不仅优化了遗传转化程序，大大缩短转化周期且保证具有较高的转化率，而且为后续的遗传转化提供了良好的受体材料。

Description

一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法。 

技术背景：

多年生黑麦草(Lolium perenne L.)属禾本科黑麦草属多年生草本植物，是我国一种重要的冷季型牧草和草坪草。多年生黑麦草草质优良，叶量丰富，茎叶柔嫩，适口性好，是马、牛、羊、兔草食家畜的优良牧草，也是养鱼的好饲料，产量高，营养价值高，是一草多用的优良牧草。同时，多年生黑麦草为冷季型草种，生长迅速成坪速度快，株型外观美丽，常作为庭院和风景区绿化的先锋草种与草地早熟禾等品种混播，也可与狗牙根等暖季型草坪混播，也可作为补栽材料，从而使草坪冬季保持绿色。

黑麦草对干旱、高热（高于35℃）和严寒（低于-15℃）的耐受能力较弱，对土壤盐碱性耐受能力中等，因而限制了其进一步的广泛栽培和利用；对其品种的改良一直是育种学家关注的重要问题。传统的品种改良一直依靠常规育种方法，即通过有性杂交的基因重组来传递遗传信息，虽然许多性状，如外观质量、持久性、抗逆性和产量等均已得到很大程度的改良，但周期很长，育种亲本资源获取有限，限制了进一步的发展。黑麦草作为异花风媒传粉植物，高度自交不亲和，优良的基因难以纯合稳定，势必造成其遗传改良困难且复杂。

近年来，随着植物基因工程的迅速发展，转基因技术在草品种改良中受到越来越广泛的重视。组织培养和遗传转化技术的发展为草品种的遗传改良开辟了更加广阔的天地。通过转基因方法，将调控优良性状的基因直接导入到植物体内，省时省力。建立高效的遗传转化体系是开展植物基因工程改良的重要前提。目前，所用的转化方法主要有基因枪法、原生质体直接吸入法、碳化硅纤维法以及农杆菌介导法。

农杆菌介导法具有转化效率高、可转移较大的DNA片段、转基因植株中外源基因拷贝数较低、遗传较稳定及整合机理清楚等优点被广泛应用。一个高频再生体系的建立是转基因的前提条件，一方面提供充足的受体材料，另一方面保证抗性愈伤组织的分化能够顺利进行。其实，愈伤组织的分化能力和选择品种的基因型有很大的关系，愈伤诱导率高的品种分化率不一定高，而且随着继代次数的增加，部分愈伤组织会丧失分化能力。利用农杆菌介导法转化黑麦草已有相关报道，但存在转化频率较低、重复性差等缺点。

因此，建立一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法，不仅优化了遗传转化程序，大大缩短转化周期且保证具有较高的转化率，而且为后续的遗传转化提供了良好的受体材料。

发明内容

本发明主要是针对多年生黑麦草愈伤组织再生困难、再生率低和受基因型制约等问题，提供一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法。

本发明的目的是这样实现的：

沿种子长轴线纵切诱导愈伤组织，提高出愈率；选用再生苗作为外植体诱导愈伤组织，从而使愈伤组织的再生效率提高。

具体地说，本方法包括下列步骤：

①种子筛选

称取多年生黑麦草种子5g置于培养瓶中，自来水浸泡16-24h，将漂浮于水

面的种子和水一起倾出，选取下层饱满的种子；

②种子处理

将饱满的种子用体积分数为50%的硫酸浸泡10 min，期间不断振荡，将硫酸倒掉后，用自来水冲洗3-4h；将冲洗好的种子放入研钵中轻微研磨去壳，倒入些水，磨掉的壳漂浮在水面上，会和水一并倾出，得去壳处理的种子；

③种子消毒

将经去壳处理的种子放入56℃水浴锅中恒温孵育15min，以杀死与黑麦草密切相关的内生菌；在超净工作台上，用75%的酒精消毒l min，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗6-8次，将种子在无菌滤纸表面吸干水分，晾干备用；

④培养基制备

a、诱导培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖30g/L，phytagel 3g/L，2,4-D 6.0mg/L，6-BA 0.05mg/L，KT 0.05mg/L；

b、继代培养培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖60 g/L，phytagel 3g/L，

 2,4-D 3.0mg/L，6-BA 0.05mg/L，KT 0.05mg/L；

c、分化培养基：以MS为基本培养基，附加麦芽糖30 g/L，phytagel 3g/L，

2,4-D 3.0mg/L，6-BA 2.5mg/L；

d、植株保持培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g/L，phytagel 3g/L，

2,4-D 3.0mg/L，6-BA 2.0mg/L；

培养基在高压灭菌前用0.1M氢氧化钠调整pH至5.8；

⑤愈伤诱导

将种子沿长轴线进行纵切处理，将两瓣种子切口处的一面放置在诱导愈伤的培养基上，25±1℃暗培养，培养4个星期后，待愈伤组织形成后，挑选白色至黄色、致密、外观有颗粒状突起、生长迅速和再生能力强的胚性愈伤组织进行继代培养；

⑥继代培养

选取颗粒状、淡黄色、结构致密和生长迅速的高质量胚性愈伤组织转移到继代培养基上，25±1℃条件下，暗培养4个星期；

⑦愈伤组织分化

继代了2次后的胚性愈伤组织转入分化培养基，25±1℃、16小时光照下，诱导愈伤组织的再分化；在淡黄色的胚性愈伤的表面会出现绿色的斑点，然后有小芽产生，小芽会分化出更多的叶片，成为小苗；

⑧再生苗的植株保持培养

能够在分化培养基上诱导长出绿苗的愈伤组织具有很好的再生性，将作为一个株系保持下去；置于植株保持培养基上，小苗会迅速生长，分蘖也会慢慢增多；

⑨再生性能好的愈伤组织诱导

以再生后小苗不断分蘖后形成的株系为材料，取该株系的每个分蘖株的中胚轴以上1cm的分生组织为外植体，纵向切成两半后，放置在愈伤诱导培养基进行诱导，培养条件不变，由此得到的愈伤的再生性能非常的高，几乎可以得到100%。

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果： 

①材料预处理：对种子进行筛选，保证所选种子的饱满度及活性，将瘪粒和烂掉的种子过滤；

②种子消毒彻底：饱满种子经预处理去壳，可确保消毒过程的彻底，56℃水浴孵育15min，可以有效杀死黑麦草的内生真菌；

③纵切提高出愈率：将种子沿长轴线一分为二切开，种胚被切伤，暴露在培养基上，直接受到激素的诱导，愈伤诱导率由此大大地提高；有些品种不容易诱导愈伤，出芽率远远大于出愈率，有的品种的出愈率几乎为零，针对这些品种都可以采取纵切的方法来诱导愈伤；

④提高再生率：升高继代培养基中的蔗糖浓度，对已长出的愈伤组织进行短期的改造增殖，使非胚性的愈伤转化为胚性愈伤，提升再生率；

⑤再生苗为外植体，再生率高：将再生苗作为一个株系保持培养后，选择中胚轴以上1cm的分生组织为外植体诱导愈伤，可以保证诱导出来的愈伤组织的再生率很高，可达100%。

总之，本发明不仅优化了遗传转化程序，大大缩短转化周期且保证具有较高的转化率，而且为后续的遗传转化提供了良好的受体材料。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明：

实例1：

材料：多年生黑麦草‘百灵鸟’的成熟种子

取5g黑麦草百灵鸟的种子放入培养瓶中，自来水浸泡16-24h，将漂浮于水面的种子和水一起倾出，保留下层饱满的种子用于消毒。将饱满的种子用体积分数为50%的硫酸搅拌10 min去壳，期间不断振荡，将硫酸倒掉后，用自来水冲洗3-4h。将冲洗好的种子放入研钵中轻微研磨去壳，倒入些水，磨掉的壳漂浮在水面上，会和水一并倾出。将经过处理的种子放入56℃水浴锅中恒温孵育15min，以杀死与黑麦草密切相关的内生菌。在超净工作台上，用75%的酒精消毒l min，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗6-8次，将种子在无菌滤纸表面吸干水分，晾干备用。

愈伤组织诱导：在无菌的条件下，对种子进行纵切处理，也就是用解剖刀将种子沿长轴线一分为二切开。将完整种子和纵切后的种子分别接种到愈伤组织诱导培养基（MS+6.0 mg/L 2,4-D+0.05 mg/L 6-BA +0.05mg/L KT + 30 g/L蔗糖+3g/L phytagel）培养基上，种子切口处接触培养基，置于黑暗处，在25℃环境下培养。每一处理接种50粒，设置3 个重复，30天后统计出愈率和胚性愈伤发生率。

愈伤组织继代：挑选白色至黄色，致密，外观有颗粒状突起，生长迅速，再生能力强的胚性愈伤组织进行继代培养。继代培养基上：MS+3 mg/L 2,4-D + 0.05 mg/L 6-BA + 0.05 mg/LKT + 60g/L蔗糖 + 3g/L phytagel，4个星期更换一次培养基，继代2次后。

表1 多年生黑麦草‘百灵鸟’的愈伤诱导情况

愈伤组织的分化：继代了2个星期后的胚性愈伤组织转入分化培养基进行分化试验。每一处理接种50 块愈伤组织，设置3个重复，光照培养光照强度约3000 lux，光照周期为14 h/d。分化培养基：MS +2.5 mg /L 6-BA+30 g /L的麦芽糖+phytagel 3g/L在淡黄色的胚性愈伤的表面会出现绿色的斑点，然后有小芽产生，小芽会分化出更多的叶片，成为小苗，30天后，统计分化率。

再生苗的植株保持培养：在分化培养基上诱导长出的绿苗，可以作为一个株系保持下去。植株保持培养基：MS+2mg/L6-BA+30g/蔗糖+phytagel 3g/L。在植株保持培养基上，小苗的生长迅速，分蘖也慢慢增多。

再生性能好的愈伤组织诱导：以再生绿苗不断分蘖后形成的株系为材料，取该株系的每个分蘖株的中胚轴以上1cm的分生组织为外植体，纵向切成2半后，放置在愈伤诱导培养基进行诱导，愈伤诱导的条件不变，诱导出来的愈伤经过继代后进行分化试验，统计分化率。

表2 多年生黑麦草‘百灵鸟’的愈伤组织分化情况

实例2：

材料：多年生黑麦草‘金牌’的成熟种子

取5g黑麦草‘金牌’的种子放入培养瓶中，自来水浸泡16-24h，将漂浮于水面的种子和水一起倾出，保留下层饱满的种子用于消毒。将饱满的种子用体积分数为50%的硫酸搅拌10 min去壳，期间不断振荡，将硫酸倒掉后，用自来水冲洗3-4h。将冲洗好的种子放入研钵中轻微研磨去壳，倒入些水，磨掉的壳漂浮在水面上，会和水一并倾出。将经过处理的种子放入56℃水浴锅中恒温孵育15min，以杀死与黑麦草密切相关的内生菌。在超净工作台上，用75%的酒精消毒l min，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗6-8次，将种子在无菌滤纸表面吸干水分，晾干备用。

愈伤组织诱导：在无菌的条件下，对种子进行纵切处理，即用解剖刀将种子沿长轴线一分为二切开。将完整种子和纵切后的种子分别接种到愈伤组织诱导培养基（MS+6.0 mg/L 2,4-D+0.05 mg/L 6-BA +0.05mg/L KT + 30 g/L蔗糖+3g/L phytagel ）培养基上，种子切口处接触培养基，置于黑暗处，在25℃环境下培养。每一处理接种50 粒，设置3 个重复，30天后统计出愈率和胚性愈伤发生率。

愈伤组织继代：挑选白色至黄色，致密，外观有颗粒状突起，生长迅速，再生能力强的胚性愈伤组织进行继代培养。继代培养基上：MS+3 mg/L 2,4-D + 0.05 mg/L 6-BA + 0.05 mg/LKT + 60g/L蔗糖 + 3g/L phytagel，4个星期更换一次培养基，继代2次后。

表3 多年生黑麦草 ‘金牌’的愈伤诱导情况

愈伤组织的分化：继代了2个星期后的胚性愈伤组织转入分化培养基进行分化试验。每一处理接种50 块愈伤组织，设置3个重复，光照培养(光照强度约3000 lux，光照周期为14 h/ d)。分化培养基：MS +2.5 mg /L 6-BA+30 g /L的麦芽糖+3g/L phytage在淡黄色的胚性愈伤的表面会出现绿色的斑点，然后有小芽产生，小芽会分化出更多的叶片，成为小苗，30天后，统计分化率。

再生苗的植株保持培养：在分化培养基上诱导长出的绿苗，可以作为一个株系保持下去。植株保持培养基：MS+2mg/L6-BA+30g/蔗糖+3g/L phytagel。在植株保持培养基上，小苗的生长迅速，分蘖也慢慢增多。

再生性能好的愈伤组织诱导：以再生绿苗不断分蘖后形成的株系为材料，取该株系的每个分蘖株的中胚轴以上1cm的分生组织为外植体，纵向切成2半后，放置在愈伤诱导培养基进行诱导，愈伤诱导的条件不变，诱导出来的愈伤经过继代后进行分化试验，统计分化率。

表4多年生黑麦草‘金牌’的愈伤组织分化情况

结果评价：

1、成熟种子作为外植体，经过硫酸处理和研磨之后，80%的种壳可被去掉。经过56℃水浴15min，可以有效的杀死黑麦草的内生真菌，接种后10天，观察培养基污染情况发现，污染率低于0.1%，这说明前期的去种壳和水浴处理都有助于使外植体消毒的更加彻底。

2、种子作为外植体诱导愈伤组织，纵切处理和完整种子的出愈率情况作比较，如表1、3所示，发现纵切后可以提高大大的提高出愈率和胚性愈伤组织发生率。例如，‘金牌’在不做纵切处理的情况下，出愈率很低，只有19%，胚性愈伤发生率只有4%，经过纵切后，种子的出愈率提高到76%，胚性愈伤所占的比例为24%。这说明种子经过纵切后，出愈率和胚性愈伤率能大幅度的提高。胚性愈伤组织经过继代，生长迅速，在短期内，可以获得大量的胚性愈伤组织。

将不同诱导来源的愈伤组织进行分化试验，统计分化率，如表2、4所示，发现：由再生绿苗中胚轴为外植体诱导的愈伤组织的再生率为100%，说明通过这个途径可以有效提高愈伤组织的再生率。

Claims (1)

1.一种提高多年生黑麦草愈伤组织再生率的方法，其特征在于包括下列步骤：

①种子筛选

称取多年生黑麦草种子5g置于培养瓶中，自来水浸泡16-24h，将漂浮于水

面的种子和水一起倾出，选取下层饱满的种子；

②种子处理

将饱满的种子用体积分数为50%的硫酸浸泡10 min，期间不断振荡，将硫酸倒掉后，用自来水冲洗3-4h；将冲洗好的种子放入研钵中轻微研磨去壳，倒入些水，磨掉的壳漂浮在水面上，会和水一并倾出，得去壳处理的种子；

③种子消毒

将经去壳处理的种子放入56℃水浴锅中恒温孵育15min，以杀死与黑麦草密切相关的内生菌；在超净工作台上，用75%的酒精消毒l min，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗6-8次，将种子在无菌滤纸表面吸干水分，晾干备用；

④培养基制备

a、诱导培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖30g/L，phytagel 3g/L，2,4-D 6.0mg/L，6-BA 0.05mg/L，KT 0.05mg/L；

b、继代培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖60 g/L，phytagel 3g/L，

2,4-D 3.0mg/L，6-BA 0.05mg/L，KT 0.05mg/L；

c、分化培养基：以MS为基本培养基，附加麦芽糖30 g/L，phytagel 3g/L，

2,4-D 3.0mg/L，6-BA 2.5mg/L；

d、植株保持培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g/L，phytagel 3g/L，

2,4-D 3.0mg/L，6-BA 2.0mg/L；

培养基在高压灭菌前用0.1M氢氧化钠调整pH至5.8；

⑤愈伤诱导

将种子沿长轴线进行纵切处理，将两瓣种子切口处的一面放置在诱导愈伤的培养基上，25±1℃暗培养，培养4个星期后，待愈伤组织形成后，挑选白色至黄色、致密、外观有颗粒状突起、生长迅速和再生能力强的胚性愈伤组织进行继代培养；

⑥继代培养

选取颗粒状、淡黄色、结构致密和生长迅速的高质量胚性愈伤组织转移到继代培养基上，25±1℃条件下，暗培养4个星期；

⑦愈伤组织分化

继代了2次后的胚性愈伤组织转入分化培养基，25±1℃、16小时光照下，诱导愈伤组织的再分化；在淡黄色的胚性愈伤的表面会出现绿色的斑点，然后有小芽产生，小芽会分化出更多的叶片，成为小苗；

⑧再生苗的植株保持培养

能够在分化培养基上诱导长出绿苗的愈伤组织具有很好的再生性，将作为一个株系保持下去；置于植株保持培养基上，小苗会迅速生长，分蘖也会慢慢增多；

⑨再生性能好的愈伤组织诱导

以再生后小苗不断分蘖后形成的株系为材料，取该株系的每个分蘖株的中胚轴以上1cm的分生组织为外植体，纵向切成两半后，放置在愈伤诱导培养基进行诱导，培养条件不变，由此得到的愈伤的再生性能非常的高，几乎可以得到100%。