CN105684894B - 一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3‑5℃的无菌水中浸泡7‑9小时后接种于诱导培养基中进行愈伤诱导；其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计3.8‑6.2mg/L的2,4D、0.18‑0.22mg/L的6‑BA和0‑0.12g/L酸水解酪蛋白。利用本发明所提供的方法，可以通过简单的操作步骤对多年生黑麦草愈伤组织进行诱导，不需要对种子进行划开处理，而且具有显著提高的出愈率和胚性愈伤率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体的，涉及一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法。
背景技术
愈伤组织在草坪草的遗传转化中通常被用作受体材料，用于农杆菌、基因枪等介导的遗传转化。同时愈伤组织也是细胞悬浮培养和原生质体培养的原材料。因此，愈伤组织培养是很多植物科学研究的基础材料，也是植株再生体系建立和遗传转化体系建立的基础。
诱导愈伤组织的形成和形态发生，是使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化最终形成愈伤组织的过程。愈伤组织由外植体脱分化产生，一些愈伤组织为胚性的，另一些为非胚性的。它们可以通过形态和细胞结构加以区分，胚性愈伤通常具有易脆、干燥、有序，颜色为白色或淡黄色。胚性愈伤组织具有全能性，经过进一步培养能分化为再生植株，而非胚性愈伤要分化则非常困难。
目前现有的诱导愈伤组织技术体系中仍然存在一些问题和局限，现有技术通常利用成熟胚为外植体，需显微镜下取成熟胚置于培养基上，操作过程均较为繁琐和复杂、愈伤组织诱导率不高，胚性愈伤获得率低；而利用种子做外植体的方案通常需经过种子划破和切割处理才能够提高愈伤组织诱导率，同样具有操作过程繁琐的缺陷，而且诱导率普遍低于50％。因此，需要继续摸索建立多年生黑麦草品种的愈伤组织诱导体系，简化诱导过程，提高愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织获得率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的操作过程复杂、诱导效率低下的缺陷，提供一种操作过程简单，愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织获得率高的多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法。
为了达到这一目的，本发明提供了一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3-5℃的无菌水中浸泡7-9小时后接种于诱导培养基中进行愈伤诱导；
其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计3.8-6.2mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA和0-0.12g/L酸水解酪蛋白。
可选的，所述多年生黑麦草种子的品种为高帽，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，6mg/L的2,4D、0.2mg/L的6-BA，不含有酸水解酪蛋白。
可选的，所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III或夜影，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，5.8-6.2mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA、0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白。
可选的，所述多年生黑麦草种子的品种为德比极品，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，3.8-4mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA、0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白。
可选的，所述愈伤诱导的步骤包括：在20-28℃下全黑暗培养67-77天，全黑暗培养过程中每30-35天换一次培养基继代一次，共继代2次。
可选的，全黑暗培养7天后将种子发出的芽拔除。
可选的，所述消毒处理并脱种皮的步骤包括：将多年生黑麦草种子4-5g置于含有浓度为1.2-1.8％的吐温-80和8.5-9.5％的次氯酸钠的溶液中搅拌40-50min脱去种皮，再用无菌水清洗3-6遍。
可选的，所述方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍，再用滤纸吸干种子表面的水分。
可选的，所述方法还包括在第一次继代时统计出愈率，在第二次继代时统计胚性愈伤率。
利用本发明所提供的方法，可以通过简单的操作步骤对多年生黑麦草愈伤组织进行诱导，不需要对种子进行划开处理，而且具有显著提高的出愈率和胚性愈伤率。
附图说明
图1是蒙特利Ⅲ种子诱导60天后获得的胚性愈伤组织。
图2是德比极品诱导60天后获得的胚性愈伤组织。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，所述方法包括以下步骤：将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3-5℃环境下的无菌水中浸泡7-9小时后接种于诱导培养基中进行愈伤诱导；
其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计3.8-6.2mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA和0.08-0.12g/L酸水解酪蛋白。
本发明所提供的方法选用多年生黑麦草种子作为外植体，所述多年生黑麦草种子至少选自夜影、蒙特利Ⅲ、高帽和德比极品中的一种。
在本发明所提供的方法中，在进行消毒处理前，可以先对多年生黑麦草种子进行筛选，去除不实种，具体的，可以将种子浸泡在水中，用清水冲洗掉漂浮的不实种，将筛选出的种子进行消毒处理。
本发明中，对于消毒处理并脱种皮的方法可以采用多种方式进行，为了获得更好的消毒效果，本发明将多年生黑麦草种子置于含有1.2-1.8％吐温-80和8.5-9.5％次氯酸钠的溶液中进行消毒，优选的，置于含有1％吐温-80和9％次氯酸钠的溶液中对种子进行消毒。为了在脱除种皮的过程中不对种子造成损伤，可以加入磁力转子对溶液进行搅拌，在搅拌的过程中，观察草种种皮脱离的情况，直至大部分种子的种皮脱落漂离种子，搅拌的时间可以为40-50min，优选的，搅拌的时间可以为45分钟。在脱皮结束后，在利用无菌水对脱皮后的种子清洗3-6遍。在进行最后一遍清洗后，不需要将无菌水倒出，可以直接对脱皮后的种子进行浸泡，具体的，可以将盛放种子的容器进行密封以避免污染，然后将密封后的容器置于4℃的冰箱中超过8小时，进行浸泡步骤。
本发明所提供的方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍，再用滤纸吸干种子表面的水分。具体的，可以将清洗后的种子置于铺有4层无菌滤纸的培养皿中，待滤纸将种子表面的水分吸干后，再将种子接种在诱导培养基中。
值得注意的是，本发明所提供的方法在接种时不需要对种子进行划破处理，可以直接将种子放置在诱导培养基上，一般的，可以按照每个平皿40粒种子的密度对种子进行排布。
在本发明所提供的方法中，所述诱导培养基的制备方法可以为在MS培养基中加入一定总量的2,4D、6-BA和酸水解酪蛋白(AHC)后调解pH值至6-7后在121℃下高压灭菌15min。优选的，所述诱导培养基的pH值为6。
在本发明的一种实施方式中，当所述多年生黑麦草种子的品种为高帽时，为了获得更好的诱导效果，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，6mg/L的2,4D、0.2mg/L的6-BA，不含有酸水解酪蛋白。
在本发明的一种实施方式中，当所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III或夜影时，为了获得更好的诱导效果，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，5.8-6.2mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA、0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白。
在本发明的一种实施方式中，当所述多年生黑麦草种子的品种为德比极品时，为了获得更好的诱导效果，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，3.8-4mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA、0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白。
根据本发明，所述愈伤诱导的步骤包括：在20-28℃下全黑暗培养67-77天，其中，每25-35天更换培养基继代一次，共继代2次。优选的，每30天继代一次，继代所更换的诱导培养基的成分不变。为了及时了解愈伤组织诱导的情况，所述方法还包括在第一次继代时统计出愈率，在第二次继代时统计胚性愈伤率。其中，出愈率＝(出愈数/外植体数)×100％；胚性愈伤率＝(胚性愈伤数/外植体数)×100％。
在愈伤诱导过程中，由于种子作为外植体进行愈伤组织诱导时发芽非常迅速，需要将种子发出的芽拔除，一般的，在全黑暗培养7天后开始将种子发出的芽拔除干净。
利用本发明所提供的方法获得的愈伤组织为胚性愈伤组织。
为衡量愈伤质量，根据李书平的标准(李书平等，1998)，依其形态特征，将愈伤组织分为4种类型。
类型1：愈伤组织乳白色、淡黄色，新鲜，质地中等，易碎，生长旺盛；类型2：愈伤组织呈乳白色，质地较松散，生长较快；类型3：愈伤组织呈青白色，透明水浸状，生长缓慢；类型4：愈伤组织呈白色，顶部生有气生根，生长迟缓。类型1和2可认为是胚性愈伤组织。
本发明所提供的方法还包括在获得愈伤组织后的后续处理步骤，当将愈伤组织用作多年生黑麦草农杆菌介导法的受体材料时，在利用农杆菌对愈伤组织进行侵染前，要对愈伤组织进行预处理，将愈伤组织转入新鲜的诱导培养基中进行预培养，预培养的时间可以为3-6天，通过预培养步骤可以显著提高胚性愈伤的活性。此处，胚性愈伤活性测试是通过基因枪遗传转化成功率定义的。利用本发明所提供的方法培养出来的胚性愈伤组织进行基因枪遗传转化，成功率较高。
下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
以下实施例中：
MS培养基的配方如表1所示：
表1
夜影种子、蒙特利Ⅲ种子、高帽种子和德比极品种子均由北京绿冠种业发展有限公司提供。
实施例1
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
将4g蒙特利Ⅲ种子装在50ml的离心管里，加入45ml的蒸馏水和5ml的次氯酸钠溶液(9％)，加入吐温-80(终浓度为1％)，放入磁力转子，在磁力搅拌器上，搅拌45分钟，至大部分种子的种皮脱落飘至溶液上层。过滤后得到的种子用无菌水清洗6遍后，保持无菌水在离心管中浸泡种子，封好盖子，放入4℃冰箱10小时。
用MS培养基配置AHC浓度为0.1g/L、6-BA浓度为0.2mg/L、2,4D浓度为6mg/L的诱导培养基，将诱导培养基高压灭菌后放置于超净工作台静置降温后倒在培养皿中等待接种。
将浸泡后的种子取出，重新用无菌水清洗3遍后，倒在铺有4层无菌滤纸的培养皿中，待滤纸吸干种子表面水份后，按一盘40粒种子的数量在培养基上接种。
将种子在25℃下全黑暗培养进行愈伤诱导30天后更新培养基进行继代一次，统计出愈率，此后，30天再继代一次，共计60天，统计胚性愈伤率。诱导过程中观察种子的出芽情况，及时将芽拔除。将出愈率(愈伤组织诱导率，简称出愈率)和胚性愈伤率列于表2。蒙特利Ⅲ种子诱导60天后获得的胚性愈伤组织见图1。
实施例2
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2,4D的浓度为6.2mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例3
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2,4D的浓度为5.8mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例4
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为0.18mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例5
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为0.22mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例6
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中AHC的浓度为0.08g/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例7
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中AHC的浓度为0.12g/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例8
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为夜影种子。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例9
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为高帽种子，培养基中不含有AHC。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例10
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为德比极品，诱导培养基中2,4D的浓度为4mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。德比极品诱导60天后获得的胚性愈伤组织见图2。
实施例11
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，所诱导的多年生黑麦草种子为德比极品，诱导培养基中2,4D的浓度为3.8mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例12
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2,4D的浓度为5.0mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例13
按照与实施例10相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2,4D的浓度为5.0mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例14
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中不添加AHC。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
实施例15
本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
按照与实施例9相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为0.22mg/L。诱导培养60天，出愈率和胚性愈伤率列于表2。
对比例1
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中2,4D的浓度为6.4mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
对比例2
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中6-BA的浓度为0.16mg/L。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
对比例3
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中不添加6-BA。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
对比例4
按照与实施例1相同的方法进行诱导，不同的是，诱导培养基中不添加2,4D。出愈率和胚性愈伤率列于表2。
表2
| 出愈率(％) | 胚性愈伤率(％) | |
| 实施例1 | 90.83 | 90.83 |
| 实施例2 | 86.22 | 86.22 |
| 实施例3 | 87.07 | 87.07 |
| 实施例4 | 86.59 | 86.59 |
| 实施例5 | 78.85 | 78.85 |
| 实施例6 | 88.76 | 88.76 |
| 实施例7 | 87.38 | 87.38 |
| 实施例8 | 86.67 | 86.67 |
| 实施例9 | 81.67 | 81.67 |
| 实施例10 | 75.83 | 75.83 |
| 实施例11 | 72.72 | 72.72 |
| 实施例12 | 81.67 | 81.67 |
| 实施例13 | 65.72 | 65.72 |
| 实施例14 | 71.2 | 71.2 |
| 实施例15 | 70.18 | 70.18 |
| 对比例1 | 64.67 | 64.67 |
| 对比例2 | 70.59 | 70.59 |
| 对比例3 | 47.06 | 47.06 |
| 对比例4 | 20.33 | 15.78 |
通过将实施例1-15的结果与对比例1-4的结果进行对比可以看出，利用本发明所提供的方法进行多年生黑麦草愈伤组织诱导时，出愈率和胚性愈伤率显著高于对比例所取得的诱导效果。
通过将实施例1的结果与实施例2和3的结果进行对比可以看出，当2,4D的浓度为本发明优选的浓度时，获得的出愈率和胚性愈伤率更高。
通过将实施例1的结果与实施例4和5进行对比可以看出，当6-BA的浓度为本发明优选的浓度时，获得的出愈率和胚性愈伤率更高。
通过将实施例10的结果与实施例11和13的结果进行对比可以看出，当对德比极品进行诱导时，2,4D的浓度为本发明优选的浓度时，获得的德比极品出愈率和胚性愈伤率更高。
通过将实施例9的结果与实施例15的结果进行对比可以看出，当对高帽进行诱导时，诱导培养基中各原料的浓度为本发明优选的浓度时，获得的高帽出愈率和胚性愈伤率更高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3-5℃的无菌水中浸泡7-9小时后接种于诱导培养基中进行愈伤诱导；
所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III；
其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，5.8-6.2mg/L的2,4D、0.18-0.22mg/L的6-BA、0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白；
所述愈伤诱导的步骤包括：在20-28℃下全黑暗培养67-77天，全黑暗培养过程中每30-35天换一次培养基继代一次，共继代2次。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，全黑暗培养7天后将种子发出的芽拔除。
3.根据权利要求1或2所述的诱导方法，其特征在于，所述消毒处理并脱种皮的步骤包括：将多年生黑麦草种子4-5g置于含有浓度为1.2-1.8％的吐温-80和8.5-9.5％的次氯酸钠的溶液中搅拌40-50min脱去种皮，再用无菌水清洗3-6遍。
4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍，再用滤纸吸干种子表面的水分。
5.根据权利要求1或4所述的诱导方法，其特征在于，所述方法还包括在第一次继代时统计出愈率，在第二次继代时统计胚性愈伤率。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20171114 Termination date: 20191127 |