CN105052498B - 一种建立dse与玉米共生体系的液体培养方法 - Google Patents

一种建立dse与玉米共生体系的液体培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种建立DSE与玉米共生体系的液体培养方法，属于微生物学、植物营养学和生态学领域。本发明利用表面消毒的玉米B73种子培养无菌苗，利用PDA培养基培养DSE菌丝体，将玉米无菌苗与DSE菌丝体在无菌的液体培养基中进行共培养，建立无杂菌干扰的植物‑真菌共生体系，主要包括玉米无菌苗的培养、DSE接种剂的准备、DSE与玉米共生体的建立及共生培养体系的检测步骤。其有益效果是：建立了DSE与玉米的无菌共培养液体体系，方法稳定高效、基质成分明确均一，为进一步研究DSE的侵染机制以及DSE与植物的共生机理提供理想模型，同时为其它真菌与共生植物的研究提供方法借鉴。

Description

一种建立DSE与玉米共生体系的液体培养方法
技术领域
本发明涉及一种建立DSE与玉米共生体系的液体培养方法，属于微生物学、植物营养学和生态学领域。
背景技术
深色有隔内生真菌（Dark Septate Endophytes, DSE）具有多样的宿主植物和广泛的生态分布，是植物根系的一个重要组成部分，在植物体中发挥着重要作用，具有广阔的应用前景。目前，对于DSE的研究逐渐深入，人们不再局限于了解DSE对植物生长及抗逆的影响，更进一步认识DSE的侵染机制以及DSE与植物的共生机理等成为研究的热点和难点。然而，现有DSE与植物共生培养的方法主要是在开放或半开放的条件下进行无菌苗的盆栽接种，不仅易被其它杂菌污染，而且采用的培养基质多为腐殖土、泥炭土、河沙或麦麸等，营养成分较为复杂，不利于DSE的生物学特性及共生体系的系统性研究，特别是在研究外源物质与共生体系的关系时，无法确保培养基质中外源物质的均一性和有效性。此外，上述固体培养方法只有部分植物根系与DSE充分接触，导致DSE在植物根部定殖率较低且均一性较差。因此，建立一个稳定高效的、培养基质成分明确均一的无污染共生体系迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种稳定高效、培养基质成分明确均一、培养体系无杂菌干扰的DSE与玉米共生体系的液体培养方法。
本发明建立的DSE与玉米共生体的液体培养方法，利用表面消毒的玉米种子培养无菌苗，利用PDA培养基培养DSE菌丝体，将玉米无菌苗与DSE菌丝体在无菌的液体培养基中进行共培养，建立无杂菌干扰的植物-真菌共生体系，主要包括下列步骤：
（1）玉米无菌苗的培养：挑选大小一致的玉米种子，放置于体积比为75%的乙醇溶液中，浸泡5 min，取出种子，无菌水清洗3次；然后将种子放置于体积比为10%的次氯酸钠溶液中，浸泡10 min，取出种子，无菌水清洗3次；表面消毒后的种子放置于无菌的湿润滤纸上，每瓶2颗，于22oC下黑暗培养3天，萌发后转入光照培养箱中，光照强度1800 Lux，光照时间和培养温度分别为16/8 h，25/22 oC，空气相对湿度70%，培养7天后，挑选生长一致的无菌苗备用；
（2）DSE接种剂的准备：活化DSE菌株后，接种到PDA培养基的平皿中，28 oC下黑暗倒置培养15天；用打孔器沿菌落边缘打成Φ6 mm菌块作为接种剂备用；
（3）DSE与玉米共生体的建立：将上述步骤得到的菌块和玉米无菌苗同时转移到用于二者共培养的无菌三角瓶中，每个三角瓶放入一株无菌苗，5块直径为6 mm的接种剂，添加无菌液体培养基使其刚好浸没幼苗根部，最后用无菌的PVA膜或PTFE膜封口，放置光照培养箱中，光照强度1800 Lux，光照时间和培养温度分别为16/8 h，25/22 oC，空气相对湿度70%；三天后，用无菌剪刀给封口膜十字开口，使玉米的叶片刚好能伸出瓶外；培养过程中，每隔2天添加无菌液体培养基20 mL，每次使玉米根部恰好浸没在培养基质中；
（4）共生培养体系的检测：共培养20天后，从三角瓶中取出玉米，用无菌水清洗玉米根部，取玉米侧根放入试管中，加入质量比为10%的KOH 使根样完全浸没，放入水浴锅中90 oC 解离至根样透明；经乳酸中和、酸性品红染色、乳酸甘油脱色后制片，于OLYPUS-BX51显微镜下观察DSE的定殖情况并计算其定殖率；同时，表面消毒清洗干净的玉米侧根，用无菌剪刀将根样剪成0.5 cm的片段，随机选取20个贴到PDA培养基上，每个平皿5个片段，所有平皿在28 oC下黑暗正置培养25天；在显微镜下观察制备的玻片，发现玉米根内有大量菌丝定殖并形成DSE的典型结构特征-微菌核；同时，从根样中只分离得到与接种剂形态特征相同的DSE菌株，进一步表明DSE与玉米的共生体系成功建立。
上述步骤（3）中的共培养培养基质为改良的1/2 MS液体培养基：NH4NO3 825 mg/L，KNO3 950 mg/L，CaCl2 .2H2O 220 mg/L，MgCl2 .7H2O 185 mg/L，KH2PO4 85 mg/L，KI 0.83 mg/L，H2BO3 6.20 mg/L，MnSO4 .4H2O 22.30 mg/L，ZnSO4 .7H2O 8.60 mg/L，Na2MoO4 .2H2O 0.25mg/L，CuSO4 .5H2O 0.025 mg/L，CoCl2 .6H2O 0.025 mg/L，FeSO4 .7H2O 27.8 mg/L，Na2EDTA.2H2O 37.3 mg/L，去离子水，pH 5.8。
上述步骤（4）中玉米侧根的表面消毒方法为：体积比70%的乙醇浸泡1 min，无菌水清洗3次，体积比10%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水清洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分。分离DSE的培养基为：PDA添加100 mg/L硫酸链霉素和氨苄青霉素。分离DSE的空白对照为：最后一次清洗根样的无菌水涂到添加100 mg/L硫酸链霉素和氨苄青霉素PDA培养基上，28 oC黑暗正置培养，25天后不生长任何菌落。
本发明的有益效果是：成功建立了DSE与玉米无菌共培养液体体系，方法稳定高效、基质成分明确均一，为进一步研究DSE的侵染机制以及DSE与植物的共生机理等提供理想模型，同时为其它真菌与共生植物的研究提供方法借鉴。
具体实施方式
实施例1：
本实施例建立的DSE与玉米共生体的液体培养方法，利用表面消毒的玉米种子培养无菌苗，利用PDA培养基培养DSE菌丝体，将玉米无菌苗与DSE菌丝体在无菌的液体培养基中进行共培养，建立无杂菌干扰的植物-真菌共生体系，主要包括下列步骤：
1、将玉米种子B73（公知全基因组数据库）放置于体积比为75%的乙醇溶液中，浸泡5 min，取出种子，无菌水清洗3次；将种子放置于体积比为10%的次氯酸钠溶液中，浸泡10min，取出种子，无菌水清洗3次。表面消毒后的种子放置于无菌的湿润滤纸上，在规格为Φ56 mm×Φ56 mm×91 mm（口径×胸径×高）的组培瓶中培养，每瓶2颗，于22 oC下黑暗培养3天，萌发后转入光照培养箱中，光照强度1800 Lux，光照时间和培养温度分别为16/8 h，25/22 oC，空气相对湿度70%，培养7天后，挑选生长一致的无菌苗备用。
2、取冷藏的试管斜面菌株H93（嗜鱼外瓶霉Exophiala pisciphila）活化，接种到PDA培养基的平皿中，28 oC下黑暗倒置培养15天。用打孔器沿菌落边缘打成Φ6 mm菌块作为接种剂备用。此外，将部分菌块转移到干净的平皿中，每个平皿5块，121 oC 高温高压间歇灭菌3次，每次2 h，作为空白对照。
3、配置改良的1/2 MS液体培养基（NH4NO3 825 mg/L，KNO3 950 mg/L，CaCl2 .2H2O220 mg/L，MgCl2 .7H2O 185 mg/L，KH2PO4 85 mg/L，KI 0.83 mg/L，H2BO3 6.20 mg/L，MnSO4 .4H2O 22.30 mg/L，ZnSO4 .7H2O 8.60 mg/L，Na2MoO4 .2H2O 0.25 mg/L，CuSO4 .5H2O0.025 mg/L，CoCl2 .6H2O 0.025 mg/L，FeSO4 .7H2O 27.8 mg/L，Na2EDTA.2H2O 37.3 mg/L，去离子水，pH 5.8），分装到规格一致的250 mL三角瓶中，每瓶30 mL，121 oC高温高压灭菌20min。待培养基质冷却后，将上述菌块和玉米无菌苗同时转移到共培养的三角瓶中（添加灭活H93的无菌苗为空白对照），最后用无菌的PVA膜或PTFE膜封口放置光照培养箱中，光照强度1800 Lux，光照时间和培养温度分别为16/8 h，25/22 oC，空气相对湿度70%。三天后，用无菌剪刀给封口膜十字开口，使玉米的叶片刚好能伸出瓶外。培养过程中，每隔2天添加无菌液体培养基20 mL，每次使玉米根部恰好浸没在培养基中。菌块、无菌苗的转移以及培养基质的添加均在超净工作台中进行。
4、共培养20天后，从三角瓶中取出玉米，用去离子水清洗玉米根部，取玉米侧根放入试管中，加入质量比为10%的KOH使根样完全浸没，放入水浴锅中90 oC解离至根样透明。经常规乳酸中和、酸性品红染色、乳酸甘油脱色后制片，于OLYPUS-BX51显微镜下观察DSE的定殖情况并计算其定殖率。同时，清洗干净的玉米侧根以体积比70%的乙醇浸泡1 min，无菌水清洗3次，体积比10%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水清洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分后，用无菌剪刀将根样剪成约0.5 cm的片段，随机选取20个贴到PDA培养基（添加100 mg/L硫酸链霉素和氨苄青霉素）上，每个平皿5个片段，此外，将最后一次清洗根样的无菌水涂到PDA培养基（添加100 mg/L硫酸链霉素和氨苄青霉素）上作为空白对照，所有平皿在28 oC下黑暗正置培养25天。
检测结果：在活体H93菌丝体与玉米的共生体系中，发现玉米根内有大量菌丝定殖并形成DSE的典型结构特征-微菌核，其中，菌丝的定殖率为17.5%，微菌核的定殖率为6.5%，DSE的定殖率为52%；在灭活H93菌丝体与玉米的共生体系中，玉米根样内只观察到根细胞。同时，只从活体H93菌丝体与玉米共生体系的根样中分离得到与H93形态特征相同的DSE菌株，且未分离得到其它菌株。此外，涂有无菌水的空白对照不生长任何菌落。表明H93与玉米的液体共生体系成功建立。

Claims (2)

1.一种建立DSE真菌与玉米共生体的液体培养方法，其特征在于：利用表面消毒的玉米种子培养无菌苗，利用PDA培养基培养深色有隔内生真菌菌丝体，即DSE菌丝体，将玉米无菌苗与DSE菌丝体在无菌的液体培养基中进行共培养，建立无杂菌干扰的植物-真菌共生体系，主要包括下列步骤：
(1)玉米无菌苗的培养：挑选大小一致的玉米种子，放置于体积比为75％的乙醇溶液中，浸泡5min，取出种子，无菌水清洗3次；将种子放置于体积比为10％的次氯酸钠溶液中，浸泡10min，取出种子，无菌水清洗3次；表面消毒后的种子放置于无菌的湿润滤纸上，每瓶2颗，于22℃下黑暗培养3天，萌发后转入光照培养箱中，光照强度1800Lux，光照时间和培养温度分别为16/8h，25/22℃，空气相对湿度70％，培养7天后，挑选生长一致的无菌苗备用；
(2)DSE接种剂的准备：活化DSE菌株后，接种到PDA培养基的平皿中，28℃下黑暗倒置培养15天；用打孔器沿菌落边缘打成Φ6mm菌块作为接种剂备用；
(3)DSE与玉米共生体的建立：将上述步骤得到的菌块和玉米无菌苗同时转移到用于二者共培养的无菌三角瓶中，每个三角瓶放入一株无菌苗，5块直径为6mm的接种剂，添加无菌液体培养基使其刚好浸没幼苗根部，最后用无菌的PVA膜或PTFE膜封口，放置光照培养箱中，光照强度1800Lux，光照时间和培养温度分别为16/8h，25/22℃，空气相对湿度70％；三天后，用无菌剪刀给封口膜十字开口，使玉米的叶片刚好能伸出瓶外；培养过程中，每隔2天添加无菌液体培养基20mL，每次使玉米根部恰好浸没在培养基质中；
(4)共生培养体系的检测：共培养20天后，从三角瓶中取出玉米，用无菌水清洗玉米根部，取玉米侧根放入试管中，加入质量比为10％的KOH使根样完全浸没，放入水浴锅中90℃解离至根样透明；经乳酸中和、酸性品红染色、乳酸甘油脱色后制片，于OLYPUS-BX51显微镜下观察DSE的定殖情况并计算其定殖率；同时，表面消毒清洗干净的玉米侧根，用无菌剪刀将根样剪成0.5cm的片段，随机选取20个贴到PDA培养基上，每个平皿5个片段，所有平皿在28℃下黑暗正置培养25天；在显微镜下观察制备的玻片，发现玉米根内有大量菌丝定殖并形成DSE的典型结构特征-微菌核；同时，从根样中只分离得到与接种剂形态特征相同的DSE菌株，进一步表明DSE与玉米的共生体系成功建立。
2.根据权利要求1所述的DSE与玉米共生体液体培养的方法，其特征在于步骤(3)中的共培养培养基质为改良的1/2MS液体培养基：NH4NO3 825mg/L，KNO3 950mg/L，CaCl2·2H2O220mg/L，MgCl2·7H2O 185mg/L，KH2PO4 85mg/L，KI 0.83mg/L，H2BO3 6.20mg/L，MnSO4·4H2O22.30mg/L，ZnSO4·7H2O 8.60mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2EDTA·2H2O 37.3mg/L，去离子水，pH5.8。
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