CN109122123B - 一种青稞-内生真菌共生体的构建方法 - Google Patents

一种青稞-内生真菌共生体的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109122123B
CN109122123B CN201810883850.9A CN201810883850A CN109122123B CN 109122123 B CN109122123 B CN 109122123B CN 201810883850 A CN201810883850 A CN 201810883850A CN 109122123 B CN109122123 B CN 109122123B
Authority
CN
China
Prior art keywords
highland barley
seedlings
endophytic fungi
culturing
seeds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810883850.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109122123A (zh
Inventor
李春杰
王正凤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou University
Original Assignee
Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou University filed Critical Lanzhou University
Priority to CN201810883850.9A priority Critical patent/CN109122123B/zh
Publication of CN109122123A publication Critical patent/CN109122123A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109122123B publication Critical patent/CN109122123B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for
    • A01G22/20—Cereals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Mushroom Cultivation (AREA)

Abstract

本发明提供一种青稞‑内生真菌共生体的构建方法，包括以下步骤：(1)青稞种子的消毒；(2)青稞无菌苗的培养；(4)接菌：在青稞无菌苗上胚轴部位进行人工接菌：在青稞无菌苗上胚轴处竖切小口，将培养好的菌丝塞入小口处，置于恒温(25±2)℃条件下黑暗培养7‑10天，然后在恒温(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间16h·d‑1条件下培养7‑10天，得到青稞幼苗；(5)移植：将的青稞幼苗洗净根部培养基后，移入基质中进行培养，直至种子收获；(6)内生真菌检测：移栽一段时间后检测内生真菌的接种情况，剔除接种未成功的幼苗，剩余幼苗成熟后收集种子。本发明通过在青稞上胚轴接种禾草内生真菌，构建了青稞‑内生真菌共生体，创建了新的青稞种质资源。

Description

一种青稞-内生真菌共生体的构建方法
技术领域
本发明属于农业育种技术领域，具体涉及青稞-内生真菌共生体的构建方法。
背景技术
禾草-内生真菌共生体的双重特性已经成为近20年来研究的热点领域之一。有关内生真菌可提高禾草抗逆性、促进宿主生长已被国际学术界所公认。Neotyphodium内生真菌的侵染也可通过增强抗旱性、耐盐性、耐重金属和营养物质的吸收来促进生长、提高竞争力；亦可通过生物碱的产生来增加宿主对昆虫、线虫、家畜、野生动物、病原真菌以及病毒的抗性，进而影响草地植物群落演替，改变食物链结构。
目前，全世界的温带禾草中约有10％的种类带有内生真菌，利用内生真菌进行禾草育种，特别是抗性育种是近年来国外草业育种的一个趋势。这种育种方法借助内生真菌对禾草各方面的增益和内生真菌随宿主种子垂直传播的种传特性进行。利用内生真菌进行的育种具有以下优势：首先，内生真菌不产生子实体，缺乏有性繁殖，决定了内生真菌的寄生特性不会造成种间、个体间的泛滥传播，对环境具备安全性；其次，通过内生真菌介导的目的性状可较稳定的得到表达，且目的性状还可具有通过侵染植株形成的种子保留的可能性，对育种具备高效性。有国外学者以“下一代的分子育种”对内生真菌育种进行称赞。
目前，国外对牧草黑麦草、高羊茅等牧草进行了人工接种，并且成功地构建了人工共生体，但对于青稞-内生真菌共生体构建成功未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明将抗虫的内生真菌，通过人工转接的方法引入青稞，建立有益无害的青稞-内生真菌共生体，培育优良青稞新品种，进而为草地畜牧业的健康稳定持续发展提供保障。具体来说，本发明提供一种青稞-内生真菌共生体的构建方法，通过在青稞上胚轴接种禾草内生真菌，来构建新的共生体，创建了新的青稞种质资源。
本发明提供一种青稞-内生真菌共生体的构建方法，包括以下步骤：
(1)青稞种子的消毒；
(2)青稞无菌苗的培养：将步骤(1)中消毒处理好的种子，置于培养基上进行培养，得到青稞无菌苗；
(3)扩大培养内生真菌菌丝；
(4)接菌：在青稞无菌苗上胚轴部位进行人工接菌：在青稞无菌苗上胚轴处竖切2-3mm小口，将培养好的菌丝塞入小口处，置于人工气候箱恒温(25±2)℃条件下黑暗培养7-10天，然后在恒温(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间16h·d-1条件下培养7-10天，得到青稞幼苗；
(5)移植：将步骤(4)中的青稞幼苗洗净根部培养基后，移入基质中进行培养，直至种子收获；
(6)内生真菌检测：移栽一段时间后检测内生真菌的接种情况，剔除接种未成功的幼苗，剩余幼苗成熟后收集种子。
作为优选，步骤(1)中，所述青稞种子的品种为柴青1号。
作为优选，步骤(2)中，所述培养基的制备方法为：在1L水中加琼脂30-40g，然后进行高温湿热灭菌。
作为优选，步骤(2)中，所述培养是于恒温培养箱(25±2)℃条件下黑暗培养3-5d。
作为优选，步骤(3)中，所述内生真菌菌丝具体为N.bromicola。
作为优选，步骤(5)中，所述基质由珍珠岩、蛭石和营养土组成；其中，珍珠岩：蛭石：营养土的体积比为2:3:1。
作为优选，步骤(5)中，所述培养时的培养条件为：(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间14h·d-1。
本发明提供一种抗虫效果好的青稞品种，是应用上述的方法制备得到的。
本发明通过在青稞上胚轴接种禾草内生真菌，构建了新的青稞-内生真菌共生体，创建了新的青稞种质资源，具有良好的抗虫效果。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为青稞接种内生真菌流程图。
图2为青稞叶鞘中内生真菌。
图3为青稞种子中内生真菌。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
青稞-内生真菌共生体的构建方法具体如下：
(1)植物材料选取及处理：选择色泽、大小均匀的青稞成熟种子，在流水下冲洗30分钟，然后用75％酒精处理3-5min，无菌水冲洗3-5次，用10％次氯酸钠消毒3-5min，无菌水冲洗3-5次，将种子置于无菌滤纸，直至种子水分吸干后待用。
(2)种子接种培养基制作：制作水琼脂培养基，即在1L水中加琼脂30-40g，在121℃下高压湿热灭菌20min，倒平板待用。
(3)无菌苗培养：取步骤(1)中消毒处理好的种子，置于水琼脂培养基上，于恒温培养箱(25±2)℃条件下黑暗培养3-5d，期间将意外染菌重复除去，得到青稞无菌苗。
(4)培养内生真菌菌丝：将N.bromicola内生真菌在PDA培养基培养2周。
(5)接菌：在青稞无菌苗上胚轴部位进行人工接菌：用手术刀在青稞无菌苗上胚轴处竖切2-3mm小口，将培养好的菌丝塞入小口处(对菌丝的加入量没有要求)，置于人工气候箱恒温(25±2)℃条件下黑暗培养7-10天，然后在恒温(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间16h·d-1条件下培养7-10天得到青稞幼苗。先黑暗培养7-10天有利于内生真菌菌丝在青稞体内的感染及生长，然后转入光照条件下有利于青稞幼苗的生长。
(5)移植：将步骤(4)中的青稞幼苗洗净根部培养基后，移入高压蒸汽灭菌后的基质(珍珠岩：蛭石：营养土的体积比＝2:3:1)中进行培养。培养条件为(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间14h·d-1，直至种子收获。
(6)内生真菌检测：移栽四周(此阶段内生真菌基本已经侵染青稞幼苗)后通过叶鞘检测法检测内生真菌的接种情况，剔除接种未成功的幼苗，待种子成熟后收集种子。种子苯胺蓝染液处理后，在显微镜下检测内生真菌菌丝体，从而获得接种成功的种子。
实施例1
青稞-内生真菌共生体的构建方法具体如下：
(1)植物材料选取及处理：选择色泽、大小均匀的青稞成熟种子，在流水下冲洗30分钟，然后用75％酒精处理4min，无菌水冲洗4次，用10％次氯酸钠消毒4min，无菌水冲洗4次，将种子置于无菌滤纸，直至种子水分吸干后待用；其中，青稞种子的品种是柴青1号，由甘肃省农科院提供。
(2)种子接种培养基制作：制作水琼脂培养基，即在1L水中加琼脂35g，在121℃下高压湿热灭菌20min，倒平板待用。
(3)无菌苗培养：取步骤(1)中消毒处理好的种子，置于水琼脂培养基上，于恒温培养箱25℃条件下黑暗培养4d，期间将意外染菌重复除去，得到青稞无菌苗。
(4)培养内生真菌菌丝：将N.bromicola内生真菌在PDA培养基培养2周。
(5)接菌：在青稞无菌苗上胚轴部位进行人工接菌：用手术刀在青稞无菌苗上胚轴处竖切2-3mm小口，将培养好的菌丝塞入小口处(对菌丝的加入量没有要求)，置于人工气候箱恒温25℃条件下黑暗培养8天，然后在恒温25℃、光照强度为2500lx、光照时间16h·d-1条件下培养9天，得到青稞幼苗。
(5)移植：将步骤(4)中的青稞幼苗洗净根部培养基后，移入高压蒸汽灭菌后的基质(珍珠岩：蛭石：营养土的体积比＝2:3:1)中进行培养。培养条件为25℃、光照强度为2500lx、光照时间14h·d-1，直至种子收获。
(6)内生真菌检测：移栽四周后通过叶鞘检测法检测内生真菌的接种情况，剔除接种未成功的幼苗。待种子成熟后收集种子，种子苯胺蓝染液处理后，在显微镜下检测内生真菌菌丝体，检测结果见图2和图3。从而获得接种成功的种子。
按照基因检测结果:这个N.bromicola内生真菌可产生peramine。对接种成功的青稞种子进行生物碱测定结果发现，新的共生体产生对昆虫具有毒性的peramine生物碱。即获得了具有抗虫效果的青稞新品种。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种青稞-内生真菌共生体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）青稞种子的消毒；
（2）青稞无菌苗的培养：将步骤（1）中消毒处理好的种子，置于培养基上进行培养，得到青稞无菌苗；
（3）扩大培养内生真菌菌丝；
（4）接菌：在青稞无菌苗上胚轴部位进行人工接菌：在青稞无菌苗上胚轴处竖切2-3mm小口，将培养好的菌丝塞入小口处，置于人工气候箱恒温(25±2)℃条件下黑暗培养7-10天，然后在恒温(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间16h·d-1条件下培养7-10天，得到青稞幼苗；
（5）移植：将步骤（4）中的青稞幼苗洗净根部培养基后，移入基质中进行培养，直至种子收获；
（6）内生真菌检测：移栽一段时间后检测内生真菌的接种情况，剔除接种未成功的幼苗，剩余幼苗成熟后收集种子；
步骤（3）中，所述内生真菌菌丝具体为N. bromicola。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述青稞种子的品种为柴青1号。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述培养基的制备方法为：在1L水中加琼脂30-40g，然后进行高温湿热灭菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述培养是于恒温培养箱(25±2)℃条件下黑暗培养3-5d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述基质由珍珠岩、蛭石和营养土组成；其中，珍珠岩：蛭石：营养土的体积比为2:3:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述培养时的培养条件为：(25±2)℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间14h·d-1。
CN201810883850.9A 2018-08-06 2018-08-06 一种青稞-内生真菌共生体的构建方法 Active CN109122123B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810883850.9A CN109122123B (zh) 2018-08-06 2018-08-06 一种青稞-内生真菌共生体的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810883850.9A CN109122123B (zh) 2018-08-06 2018-08-06 一种青稞-内生真菌共生体的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109122123A CN109122123A (zh) 2019-01-04
CN109122123B true CN109122123B (zh) 2021-11-02

Family

ID=64791676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810883850.9A Active CN109122123B (zh) 2018-08-06 2018-08-06 一种青稞-内生真菌共生体的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109122123B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113647301B (zh) * 2021-09-23 2022-05-03 深圳市万友工业设备有限公司 一种青稞地套种羊肚菌的高产方法
CN114793776A (zh) * 2022-03-31 2022-07-29 湖州中恒园林建设有限公司 一种江河沿岸地被绿化的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100584938C (zh) * 2008-03-03 2010-01-27 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一株植物内生真菌及其应用
CN101314760B (zh) * 2008-06-02 2010-04-21 南开大学 向草坪草人工转接天然禾草中的内生真菌的方法
CN102283117A (zh) * 2011-06-28 2011-12-21 淮海工学院 大豆组培苗和转化苗在无菌条件下培养结荚成熟技术
CN104335832A (zh) * 2013-08-05 2015-02-11 车瑾瑜 植物种子接种禾草内生真菌的方法
CN106576490B (zh) * 2016-11-25 2020-08-11 兰州大学 一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detrimental and neutral effects of wild barley– Neotyphodium fungal endophyte associations on insect survival;Stephen L. Clement等;《Entomologia Experimentalis et Applicata》;20051230;第119-125页 *
一株野大麦内生真菌的生物学与生理学特性;陈泰祥等;《草业科学》;20160930;第1658-1664页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109122123A (zh) 2019-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102150624A (zh) 半夏属植物的组培快繁方法
CN107529398B (zh) 一种生姜脱毒繁育方法
CN103283595B (zh) 一种草莓茎尖组织初代培养方法
CN109757373A (zh) 一种荆半夏组织培养快速繁殖方法
CN105532450A (zh) 杂交构树工厂化组织培养繁育的方法
CN102860259A (zh) 一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法
CN105961201A (zh) 草莓移栽苗组培方法
CN109122123B (zh) 一种青稞-内生真菌共生体的构建方法
CN112753582B (zh) 一种千年桐茎段消毒和快速增殖的方法
CN110476807B (zh) 一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法
CN105766636B (zh) 一种牡丹组织培养再生的方法
CN115606503B (zh) 一种紫菀的组织培养方法
CN104012406A (zh) 甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法
CN107173225B (zh) 用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法
CN109804913A (zh) 一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法
CN105613297B (zh) 薏苡组织培养快繁方法
CN109479721B (zh) 一种花生植株再生方法
CN107333659B (zh) 一种日中性草莓组培快繁培养基及组培快繁方法
CN103053429B (zh) 牵牛子离体胚轴植株再生的方法
CN110419448A (zh) 一种看麦娘组培快繁方法
CN104782501B (zh) 五月瓜藤种苗的培养方法
CN104221851A (zh) 一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法
CN104115748A (zh) 一种快速繁殖美国红栌的培养方法
CN102144559B (zh) 一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法
CN104429963B (zh) 一种马蔺游离花粉培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant