CN106576490B - 一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法，是将休眠的黑麦草内生真菌共生体种子先用体积浓度为50%的浓硫酸处理一段时间，冲洗掉浓硫酸后，再加入能够没过种子的水，低温处理一段时间，最后将种子置于40±1℃水中进行温水引发。本发明的方法具有以下有益效果：1.快速 按照以上方法进行操作，短时间内即可完成对种子休眠的破除；2.安全 在快速破除种子休眠的时候使用硫酸的浓度较低且用量较小，操作过程安全性高；3.操作简便 本方法涉及的程序极为简便，分别为浓硫酸浸种‑湿润低温储藏‑种子引发；4.提高种子萌发 对低温处理后的种子进行温水引发，有效提高种子发芽率。
Description
技术领域
本发明属于植物微生物互作和种子生理学技术领域，具体涉及一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法。
背景技术
黑麦草(Lolium perenne)原产西欧、北非和东南亚，最初在英国被驯化为牧草，现在作为一种优良的草坪和牧草在世界各温带地区广泛种植。黑麦草具有千粒重较大、发芽速率较高，成坪快、分蘖多、再生能力强、耐刈割、质地柔软等优异的坪用性状，在温带人工草地的建植中占有举足轻重的地位。同时其在适宜环境条件下生物量极高，对氮素等利用率较高，适口性好、放牧后再生能力强，耐践踏，恢复生长速度快，与三叶草等豆科牧草混播非常适宜各种反刍动物的消化吸收，具有良好的饲用价值。此外，黑麦草根系发达，具有较强的水土保持能力，其作为生态草种的潜力巨大。禾草内生真菌（Neotyphodium sp.）是一类生长在宿主体内完成全部或大部生活史而不显露任何外部症状的一类内寄生真菌，这类真菌的侵染能显著提高宿主禾草对生物及非生物胁迫的抗逆性。研究发现，世界各地黑麦种群中有很大一部分被内生真菌侵染，这种内生真菌的侵染显著提高了这类物种在种群中的竞争力。以新西兰为首的育种学家已经利用内生真菌这一优势培育出AR1、AR5, AR37 和NEA2等带内生真菌的优良草种，在市场上占有巨大份额。但是内生真菌侵染往往会增强宿主禾草的休眠特性，目前还没有一套成熟的方法去解决这一问题，来有效提高黑麦草内生真菌共生体栽培草地中的发芽率，出苗整齐度等问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法，能够在不损伤黑麦草-内生真菌共生体种子萌发力的前提下快速高效的打破种子休眠，提高种子发芽率，同时，种子的出苗整齐度高。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：
一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法，是将休眠的黑麦草内生真菌共生体种子先用体积浓度为50%的浓硫酸处理一段时间，冲洗掉浓硫酸后，再加入能够没过种子的水，低温处理一段时间，最后将种子置于40±1℃水中进行温水引发。
作为优选，所述将黑麦草内生真菌共生体用体积浓度为50%的浓硫酸处理一段时间时，处理时间为9-10分钟。
作为优选，所述低温处理时，处理温度为4±1℃。
作为优选，所述低温处理时，处理时间为3-12天。
作为优选，所述低温处理时，处理时间为6天。
作为优选，所述温水引发的处理时间为10-12分钟。
作为优选，温水引发后，将种子置于25±1℃，黑暗条件下进行培养14天。
作为优选，所使用的水均为蒸馏水。
本申请人经研究发现：
1.一定浓度的浓硫酸能在一定程度上破除种子的物理休眠，提高种子洁净度；
2. 低温能在一定程度上完全打破黑麦草种子的萌发，同时保证内生真菌的活力；
3. 低温处理过程中将种子浸泡在水中能有效减缓低温对种子和内生真菌带来的损伤；
4. 在低温处理完种子之后进行温水引发，提高种子萌发。
因此，基于以上原理，本发明先用一定浓度的浓硫酸对种子表面进行处理，一段时间之后滤掉浓硫酸，用自来水将种子冲洗干净，随后将冲洗干净的种子置于另外一个干净的200毫升烧杯中，加入150毫升蒸馏水，连同烧杯一起放置于4℃冰箱中进行低温处理一定时间即可完全打破种子休眠；最后进行温水引发，温水引发可进一步提高种子萌发。
本发明的方法具有以下有益效果：
1.快速 按照以上方法进行操作，短时间内即可完成对种子休眠的破除；
2.安全 在快速破除种子休眠的时候使用硫酸的浓度较低且用量较小，操作过程安全性高；
3.操作简便 本方法涉及的程序极为简便，分别为浓硫酸浸种-湿润低温储藏-种子引发；
4.提高种子萌发 对低温处理后的种子进行温水引发，有效提高种子发芽率。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为应用不同方法分别处理黑麦草内生真菌共生体种子的发芽势；
图2为应用不同方法分别处理黑麦草内生真菌共生体种子的发芽率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明的破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法步骤如下：
（1）将休眠的黑麦草内生真菌共生体的种子加入体积浓度为50%的浓硫酸，使种子完全浸泡在浓硫酸中；
（2）9-10分钟后滤掉浓硫酸，用自来水将种子冲洗干净；
（3）将冲洗干净的种子置于容器中，加入能够没过种子的蒸馏水，连同容器一起放置于4±1℃冰箱中进行低温处理；
（4）低温处理3-12天后，过滤种子，将种子置于40±1℃蒸馏水中进行温水引发；
（5）10-12分钟后过滤种子，将种子均匀摆放在铺有两层灭过菌滤纸的培养皿中进行TP发芽，置于25±1℃黑暗条件下进行培养，每天进行观察并统计发芽情况，14天后发芽结束，统计发芽势和发芽率。发芽势在42.5%-52.0%之间，发芽率在86.5%-94.5%之间。
实施例1 对比例
破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法步骤如下：
（1）取5g休眠的黑麦草内生真菌共生体的种子置于200毫升烧杯中；
（2）向装有种子的烧杯中加入100毫升50%浓硫酸，用玻璃棒不断搅动，使种子完全浸泡在浓硫酸中；
（3）10分钟后滤掉浓硫酸，用自来水将种子冲洗干净；
（4）作为对照，将种子均匀摆放在铺有两层灭过菌滤纸的培养皿中进行TP发芽，每皿50粒种子，4个重复，置于25±1℃黑暗条件下进行培养，每天进行观察并统计发芽情况，14天后发芽结束，统计发芽势和发芽率。
实施例2
本发明的破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法步骤如下：
（1）取5g休眠的黑麦草内生真菌共生体的种子置于200毫升烧杯中；
（2）向装有种子的烧杯中加入100毫升50%浓硫酸，用玻璃棒不断搅动，使种子完全浸泡在浓硫酸中；
（3）10分钟后滤掉浓硫酸，用自来水将种子冲洗干净；
（4）将冲洗干净的种子置于另外一个干净的200毫升烧杯中，加入150毫升蒸馏水，连同烧杯一起放置于4℃冰箱中进行低温处理；
（5）低温处理3天之后过滤种子，将种子置于40℃蒸馏水中进行温水引发；
（6）10分钟后过滤种子，将种子均匀摆放在铺有两层灭过菌滤纸的培养皿中进行TP发芽，每皿50粒种子，4个重复，置于25℃黑暗条件下进行培养，每天进行观察并统计发芽情况，14天后发芽结束，统计发芽势和发芽率。
在实施例3-5中，低温处理时间依次为6天、9天和12天，其余步骤均与实施例2相同。
以实施例1-5的方法分别处理黑麦草内生真菌共生体种子，结果参见图1和图2。
图1为应用不同方法分别处理黑麦草内生真菌共生体种子的发芽势；其中，LT1为应用实施例1的方法处理；LT2为应用实施例2的方法处理；LT3为应用实施例3的方法处理；LT4为应用实施例4的方法处理；LT5为应用实施例5的方法处理。
图2为应用不同方法分别处理黑麦草内生真菌共生体种子的发芽率；其中，LT1为应用实施例1的方法处理；LT2为应用实施例2的方法处理；LT3为应用实施例3的方法处理；LT4为应用实施例4的方法处理；LT5为应用实施例5的方法处理。
由图1可知：低温处理6天之后黑麦草种子的发芽势达到最大值（52.0%），显著（P<0.05）高于实例1、2、5，相对于对照处理将黑麦草种子的发芽势提高了28.4%。
由图2可知：低温处理6天之后黑麦草种子的发芽率也达到最大值（94.5%），显著（P<0.05）高于实例1、2、5，相对于对照处理将黑麦草种子的发芽率提高了9.9%。
实施例6
本发明的破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法步骤如下：
（1）取5g休眠的黑麦草内生真菌共生体的种子置于200毫升烧杯中；
（2）向装有种子的烧杯中加入100毫升50%浓硫酸，用玻璃棒不断搅动，使种子完全浸泡在浓硫酸中；
（3）9分钟后滤掉浓硫酸，用自来水将种子冲洗干净；
（4）将冲洗干净的种子置于另外一个干净的200毫升烧杯中，加入150毫升蒸馏水，连同烧杯一起放置于3℃冰箱中进行低温处理；
（5）低温处理6天之后过滤种子，将种子置于39℃蒸馏水中进行温水引发；
（6）11分钟后过滤种子，将种子均匀摆放在铺有两层灭过菌滤纸的培养皿中进行TP发芽，每皿50粒种子，4个重复，置于24℃黑暗条件下进行培养，每天进行观察并统计发芽情况，14天后发芽结束，统计发芽势和发芽率。
实施例7
本发明的破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法步骤如下：
（1）取5g休眠的黑麦草内生真菌共生体的种子置于200毫升烧杯中；
（2）向装有种子的烧杯中加入100毫升50%浓硫酸，用玻璃棒不断搅动，使种子完全浸泡在浓硫酸中；
（3）10分钟后滤掉浓硫酸，用自来水将种子冲洗干净；
（4）将冲洗干净的种子置于另外一个干净的200毫升烧杯中，加入150毫升蒸馏水，连同烧杯一起放置于5℃冰箱中进行低温处理；
（5）低温处理6天之后过滤种子，将种子置于41℃蒸馏水中进行温水引发；
（6）12分钟后过滤种子，将种子均匀摆放在铺有两层灭过菌滤纸的培养皿中进行TP发芽，每皿50粒种子，4个重复，置于26℃黑暗条件下进行培养，每天进行观察并统计发芽情况，14天后发芽结束，统计发芽势和发芽率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种破除黑麦草内生真菌共生体种子休眠的方法，其特征在于：是将休眠的黑麦草内生真菌共生体种子先用体积浓度为50%的浓硫酸处理一段时间，冲洗掉浓硫酸后，再加入能够没过种子的水，低温处理一段时间，最后将种子置于40±1℃水中进行温水引发；所述低温处理时，处理温度为4±1℃；所述低温处理时，处理时间为6-9 天。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述将休眠的黑麦草内生真菌共生体种子用体积浓度为50%的浓硫酸处理一段时间时，处理时间为9-10 分钟。
3.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述低温处理时，处理时间为6 天。
4.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述温水引发的处理时间为10-12 分钟。
5.根据权利要求1-4 任一项所述的方法，其特征在于：温水引发后，将种子置于25±1℃，黑暗条件下进行培养14 天。
6.根据权利要求5 所述的方法，其特征在于：温水引发后，将种子置于25±1℃，黑暗条件下进行培养14 天。
7.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所使用的水均为蒸馏水。
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