CN109804913A - 一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白羊草‑内生真菌共生体的构建方法，选择饱满的白羊草种子，剥去内稃，得到纯种子，将内生真菌菌丝扎入到发芽种子的分生组织部位，将完成转接的植株放回新PDA培养基，在黑暗和光照交替条件下培养一周，移栽到无菌蛭石，连续检测6个月染菌率。该方法操作简单，成功率高，可有效提高人工转接效率。将成功染菌植株的种子播种于野外原生生境中，从而达到培育稳定传代的白羊草内生真菌共生体，服务于脆弱生态系统植物‑微生物联合修复。

Description

一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法

技术领域

本发明涉及受损生态系统植物-微生物联合修复技术，特别涉及禾草-内生真菌共生体的构建方法，具体属于一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法。

背景技术

白羊草[Bohtriochloa ischaemum(L.)Keng]是禾本科孔颖草属多年生牧草，属于喜温中旱生植物。白羊草是根茎疏丛型下繁禾草，根系发达，具有短根茎，分蘖能力强，能形成大量基生叶丛。白羊草群落是我国暖温带森林草原区有代表性的植被类型，也是落叶阔叶林区森林破坏后出现的次生植被类型，广泛分布于黄土高原东南部和南部的低山丘陵、梁峁顶部的温暖带地段。此外，白羊草具有抗旱、抗病等特征，在矿区植被修复中具有较大的优势，逐渐成为优势种群。

内生真菌(Endophyte)为生活在活体植物地上部分的组织中，而不引起宿主植物明显病害症状的真菌。内生真菌的宿主植物包括草本、灌木、针叶树和藻类等多个类群，其中研究最为广泛的是与冷季型禾草共生的属内生真菌，全世界至少有30个属的禾草感染该属内生真菌。近年来研究发现，矿区生态修复中，白羊草感染多种内生真菌，其中，白羊草感染的sibiria内生真菌，及其共生体对生物与非生物胁迫具有优良的抗逆性，因此，成功构建白羊草-内生真菌共生体对提高生态修复效率具有重要意义。

传统的人工转接构建方法主要对人工栽培禾草进行幼苗转接，愈伤组织以及成株分蘖转接法为主。幼苗转接和愈伤组织转接不但容易损伤宿主植物，而且成活率较低，很难在野外成功感染宿主并稳定的传代。成株转接的成活率虽然有提高，但对天然禾草宿主的成功染菌率相对较低，不利于大面积的天然禾草生态修复。目前，还未找到一种较为可行的白羊草-内生真菌共生体构建方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种染菌率较高的白羊草-内生真菌共生体的构建方法，并将该方法应用到受损生态系统的生物修复中。

本发明提供的一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法，包括如下步骤：

(1)选择饱满的白羊草种子，将种子在无菌水中浸泡5分钟后，剥去内稃，得到纯种子置于灭菌后的干燥培养皿中；

(2)在超净台上，将种子胚轴朝下，且胚根对准菌落45°斜插入已纯化的内生真菌菌落中；

(3)在25℃黑暗条件下培养7-10天，观察培养皿上种子发芽情况，若有杂菌污染应及时切除；

(4)显微镜确定发芽种子的分生组织部位，先用无菌注射器针头扎一个小孔，不戳穿植株，然后挑取少量内生真菌新鲜菌丝，滚成球形，将球形菌丝扎入小孔内完成转接；

(5)将完成转接的植株放回新PDA培养基，在黑暗和光照交替条件下培养7天后，移栽到无菌蛭石，每1-2个月检测一次染菌率，检测6个月。

本发明方法还适用于感染同类内生真菌的天然禾草，如亚利桑那羊茅、羽茅、高羊茅等。

与现有技术相比，本发明有益效果：

本发明在共生体构建过程中采用种子剥去内稃、菌丝扎入植株分生组织部位等措施，显著提高转接植株成活率以及宿主的成功染菌率，实验结果表明，采用本发明方法成活植株中内生真菌转接的成功率白羊草达到97％，亚利桑那羊茅达到95％。将成功染菌植株的种子播种于野外原生生境中，可较好实现野外原生生境中种植禾草-内生真菌共生体的目的，利用其耐重金属性及抗逆优势，可提高脆弱生态系统植物-微生物联合修复效率。

附图说明

图1为白羊草内生真菌的转接位置示意图；

图2为白羊草分生组织接入内生真菌菌丝示意图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进一步描述，但本发明的应用范围并不仅限于此。

实施例1：白羊草内生真菌的转接方法

选择总共300白羊草种子，将种子浸泡在水中大约5分钟去内稃。在转接实验前，在显微镜下通过孟加拉红染色法检测确认没有感染内生真菌。种子表面灭菌后放置在PDA培养基上，每个培养皿中5个，置于25℃培养箱内暗培养10天。在超净台上，将种子胚轴朝下，且胚根对准菌落45°斜插入菌落中。观察种子的发芽情况，发芽后，用无菌镊子抽出菌落上已发芽的种子，放在周边PDA培养基上。在显微镜下，先找到植物的分生组织，用无菌注射器针头扎一个小孔(图1)(切勿戳穿植株)，然后挑取少量新鲜菌丝且滚成球形，直接扎入小孔内，放入内生真菌菌丝(图2)。将完成转接的植株放回新的PDA培养基，后用黑暗和光照交替培养7天(12h黑暗，12h光照)，移栽到无菌蛭石中，放入温室中生长，每1个月检测一次染菌率，检测6个月。实验结果表明，采用该方法进行人工转接，成活植株中内生真菌转接的成功率达到97％。

实施例2：亚利桑那羊茅内生真菌的转接方法

选择总共100粒亚利桑那羊茅种子，将种子浸泡在水中大约5分钟去内稃。在转接实验前，在显微镜下通过孟加拉红染色法检测确认没有感染内生真菌。种子表面灭菌后放置在PDA培养基上，每个培养皿中5个，置于25℃培养箱内暗培养7天。在超净台上，将种子胚轴朝下，且胚根对准菌落45°斜插入菌落中。观察10天内培养皿上种子的发芽情况，用无菌镊子抽出菌落上已发芽的种子，放在周边PDA培养基上。在显微镜下，先找到植物的分生组织，用无菌注射器针头扎一个小孔(切勿戳穿植株)，然后挑取少量新鲜菌丝且滚成球形，直接扎入小孔内，放入内生真菌菌丝。将完成转接的植株放回新的PDA培养基，后用黑暗和光照交替培养7天(12h黑暗，12h光照)，移栽到无菌蛭石中，放入温室中生长，每2个月检测一次染菌率，检测6个月。实验结果表明，采用该方法进行人工转接，成活植株中内生真菌转接的成功率达到95％。

Claims (2)

1.一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选择饱满的白羊草种子，将种子在无菌水中浸泡5分钟后，剥去内稃，得到纯种子置于灭菌后的干燥培养皿中；

(2)在超净台上，将种子胚轴朝下，且胚根对准菌落45°斜插入已纯化的内生真菌菌落中；

(3)在25℃黑暗条件下培养7-10天，观察培养皿上种子发芽情况，若有杂菌污染应及时切除；

(4)显微镜确定发芽种子的分生组织部位，先用无菌注射器针头扎一个小孔，不戳穿植株，然后挑取少量内生真菌新鲜菌丝，滚成球形，将球形菌丝扎入小孔内完成转接；

(5)将完成转接的植株放回新PDA培养基，在黑暗和光照交替条件下培养7天后，移栽到无菌蛭石，每1-2个月检测一次染菌率，检测6个月。

2.如权利要求1所述的一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法，其特征在于，所述的白羊草用亚利桑那羊茅替代。