CN101314760A

CN101314760A - 向草坪草人工转接天然禾草中的内生真菌的方法

Info

Publication number: CN101314760A
Application number: CNA2008100533814A
Authority: CN
Inventors: 任安芝; 高玉葆; 陈磊; 赵念席; 王银华; 谢凤行
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2008-06-02
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2028-06-02
Also published as: CN101314760B

Abstract

一种向草坪草人工转接天然禾草中的内生真菌的方法。包括在无菌条件下将确认无菌的种子接种到水－琼脂培养基表面轻压，将培养皿密封后放到恒温培养箱中暗培养，获得无菌胚芽鞘。人工转接时，先在胚芽鞘靠近上方的部位纵向划一个小口，深度以不戳穿胚芽鞘为准，然后将菌丝注入伤口中，接种后置于培养箱中暗培养；5天后用黑暗和光照交替培养4天，之后移栽到无菌蛭石中，用保鲜膜将花盆口封住，以增加周围空气湿度；移苗一周后将保鲜膜移开，室温培养，1个月后检测感染率。本发明同源转接成功率达93％，异源转接成功率达76％，该方法具有快速、便捷、成本低、成功率高等优点，很好地弥补了现有转接方法中普遍存在的成功率较低的不足。

Description

向草坪草人工转接天然禾草中的内生真菌的方法

【技术领域】：

本发明涉及抗逆性内生真菌的菌种筛选及其人工转接技术领域，特别是通过人工转接的方法将具有抗性的内生真菌转入草坪草中以获得具有抗性的草坪草种。

【背景技术】：

内生真菌是存在于健康植物的茎叶中但并不引起植物病害的一类真菌。现已在许多高等植物体内证实了内生真菌的存在，但以禾本科植物中最为常见。据统计，禾本科中至少有80个属、290余种植物被确认为含有内生真菌(Clay K.1990.Fungal endophytes of grasses.Annual Review ofEcology and Systematics 21：275-297.)，但大量的研究集中在两个具有重要经济意义的种即高羊茅和黑麦草上，已有的研究表明，内生真菌和禾本科植物之间是互惠共生的，内生真菌感染不仅可以刺激宿主植物的生长(Latch GCM，Hunt WF，Musgrave DR.1985.Endophytic fungi affect growth ofperennial ryegrass.New Zealand Journal of Agricultural Research，28：165-168)，而且可以增强宿主植物对生物干扰和非生物胁迫的抗性，所涉及的生物干扰有食草动物(Ball DM.1997.Significance ofendophyte toxicosis and current practices in dealing with the problem in the United States.Neotyphodium/grass interactions.New York：Plenum Press，395-410)和食草昆虫(Bultman，TL，Bell G，and Martin WD.2004.A fungal endophyte mediates reversal of wound-induced resistance and constrainstolerance in a grass.Ecology，85：679-685.)的取食、线虫(Eerens JPJ，Visker MHPW，Lucas RJ，1997.Influence of the ryegrass endophyte on phyto-nematodes.Neotyphodium/grass interactions.New York：Plenum Press，153-156.)和病原菌(Peters S，Draeger S，Aust HJ.1998.Endophyte-host interactions.I.Plant defense reactions to entophytic and pathogenic fungi.Symbiosis，25：193-211)的危害以及其它植物的竞争(Clay K，Holah J.1999.Fungal endophyte symbiosis and plant diversity in successional fields.Science，285：1742-1744)等；非生物胁迫则包括干旱(Read JC，Camp BJ.1986.The effect of fungalendophyte Acremonium coenophialum in tall fescue on animal performance，toxicity，and standmaintenance.Agronomie Journal，78：848-850；任安芝，高玉葆.2003.渗透胁迫下内生真菌感染对黑麦草幼苗生长的影响.生态学报，23(11)：2307-2317.)、贫瘠(Ren AZ，Gao YB，Zhou F.2007.Response of Neotyphodium lolii-infected perennial ryegrass to phosphorus deficiency.Plant Soil andEnvironment，53：113-119.)、重金属污染(Ren AZ，Gao YB，Zhang L，Xie FX.2006.Effects of Cadimumon growth parameters of endophyte-infected and endophyte-free ryegrass.Journal of Plant Nutrition andSoil Science，169：857-860.)等。

内生真菌与禾本科植物互利共生关系的物质基础是内生真菌在宿主体内产生或诱导宿主产生许多次生代谢产物，如生物碱和植物激素。宿主植物利用生长素(De Battista J P，Bacon C W，Severson R.1990.Indole acetic acid production by the fungal endophyte of tall fescue.Agronomie Journa，82：878-880)促进生长、利用生物碱提高对昆虫和病害的抗性、利用脱落酸(Bunyard B，Mclnnis T.Jr.1990.Evidence for elevated phytohormone levels in E+endophyte infected tall fescue.In：Proc.Int.Symp.Acremonium/Grass Interactions，Louisiana Agriculture Experiment Station，Baton Rouge.)促进植物在高温、干旱情况下关闭气孔，从而增强植物的抗旱、抗高温性能。然而，内生真菌对宿主植物的这一有益影响不仅与宿主植物的种类有关，更与内生真菌的种及品种密切相关(Morse LJ，FaethSH，Day TA.2007.Neotyphodium interactions with a wild grass are driven mainly by endophytehaplotype.Functional Ecology，21：813-822.)。因此，筛选已有的和采用人工接种法构建新的禾本科植物-内生真菌的优良共生体是内生真菌利用和改良的关键(邹文欣，谭仁祥.植物内生菌研究新进展.2001.植物学报，43(9)：881-892)。在草坪业上，含有内生真菌的草坪草因具有更强的抗性和竞争力，越来越多的发达国家已投入到开发含有内生真菌的新型草坪草种的研究中，其中既涉及培育含有高密度内生真菌的草坪草(Funk CR，White RH，Breen JP.1993.Importance of Acremoniumendophyte in turf grass breeding and management.Agriculture Ecosystems Environment，44：215-232.)，也包括筛选优良菌株，导入到原本性状良好、但抗性弱易产生病虫害的草坪草中，以提高其抗逆性。目前，美国、新西兰等国已有数十个羊茅和黑麦草品种投放市场。在商用的来自美国和欧洲的草坪草种子中，内生真菌含量已经作为与发芽率和净度相提并论的重要指标，出现在种子标签上(南志标李春杰.2004.禾草-内生真菌共生体在草地农业系统中的作用.生态学报，24：206-216.)。

我国是草原大国，有丰富的禾草资源，然而，这些丰富资源的利用却不尽如人意，目前，我国90％以上的草坪草种是依靠国外进口。截止2003年底，我国登记的13个禾本科草坪草品种中，绝大多数为引进品种，育成品种仅有1个，而杂交、生物技术等在草坪草育种中还未取得重大突破(彭燕，张新全，周寿荣.2005.我国主要草坪草种质资源研究进展.园艺学报，32：359-364.)。我国有丰富的内生真菌资源，目前已至少在天然草地的13属25种禾草中发现了内生真菌(南志标，李春杰.2004.禾草-内生真菌共生体在草地农业系统中的作用.生态学报，24：206-216.)，而在利用内生真菌提高禾草抗逆性育种方面的研究还几乎是空白。

禾本科植物内生真菌人工接种比较困难，即使是将内生真菌重新导入自然宿主，或将内生真菌在同种植物的不同植株之间转移成功率也不高。1985年，Latch和Christensen(Latch GCM，Christensen MJ.1985.Artificial infection of grass with endophytes.Association of applied biologists，107：17-24.)首次利用幼苗接种法获得了感染内生真菌的植株，他们在生长9天的幼苗的胚轴和胚芽鞘的连接处切一个小口，然后将菌丝插入其中，成功率为10.8％，成功率比较低的原因主要是由于幼苗受伤后死亡率较高造成的；同年，Johnson等人(Johnson MC，Siegel MR.1985.Infection of tallfescue with Acremonium coenophialum by means of callus culture.Plant disease，70：380-383.)用高羊茅和黑麦草的花梗诱导愈伤组织，然后将内生真菌接种到愈伤组织中，结果发现高羊茅愈伤组织分化的再生植株中有17％成功感染，而黑麦草愈伤组织分化的再生植株没有得到成功的感染，采用该方法的最大不利之处是持续时间过长，愈伤组织从诱导、继代、分化、转接到最后的检测持续时间需30周左右；近来，Johnson等人(Jonhson-Cicalese J，Secks ME，Lam CK.2000.Cross speciesinoculation of chewing and strong creeping red fescues with fungal endophytes.Crop Science，40：1485-1489.)尝试对成株分蘖进行转接，即在转接前修剪叶片至3cm，然后在根和茎连接处划一小口，然后将新鲜菌丝夹入口中，转接后在11％的分蘖中检测到了菌丝的存在。总之，就国际范围而言，已报道的成功的接种技术一方面成功率比较低，另一方面往往受到专利的保护，在我国关于内生真菌的人工转接技术还未见报道，因此内生真菌的人工接种技术已成为利用内生真菌提高禾草抗逆性育种的瓶颈，亟待有所突破。

【发明内容】：

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一株从我国天然禾草中筛选出的抗旱性和抗常见真菌病害都最佳的内生真菌菌种——Neotyphodium chisosum(该菌可从禾本科芨芨草属的羽茅种子或叶鞘中分离获得)，并将其转入常见草坪草高羊茅中，以增强草坪草抗旱和抗病害能力。

本发明提供的向草坪草人工转接天然禾草中的内生真菌的方法，包括：

第一、无菌胚芽鞘的获得

利用苯胺兰染色、显微镜下观察的方法检测待检测种子的染菌状况，确认其无菌后将无菌的种子经50％硫酸-5％次氯酸钠进行表面消毒，用无菌水冲洗3次，接着在无菌条件下将种子接种到水-琼脂培养基(20g琼脂溶于1000ml水中配制而成)表面轻压，将培养皿密封后放到恒温培养箱中暗培养(25±1℃)。3天后待种子长出胚芽鞘后用于人工转接。

第二、人工转接

无菌条件下将培养皿置于体视显微镜下，用预先吸入少量无菌水的一次性注射器先在胚芽鞘靠近上方的部位纵向划一个长约0.5-1mm的小口，深度以不戳穿胚芽鞘为准，然后用注射器从培养基上挑取内生真菌菌丝，推动注射器将菌丝注入伤口中，接种后置于培养箱中暗培养；5天后用黑暗和光照交替培养4天，每天12小时黑暗，12小时光照，之后移栽到无菌蛭石中，用保鲜膜将花盆口封住，以增加周围空气湿度；移苗一周后将保鲜膜移开，室温培养，1个月后检测感染率。

所述的内生真菌为子囊菌纲(Ascomycetes)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、瘤座菌族(Balansieae)的香柱菌属(

)的无性型Neotyphodium属的Neotyphodium chisosum。该菌可从禾本科芨芨草属的羽茅种子或叶鞘中经分离、纯化获得。

本发明的优点和积极效果：

本发明采用无菌胚芽鞘法进行了人工转接，同源转接成功率达93％，异源转接成功率达76％，该方法具有快速、便捷、成本低、成功率高等优点，很好地弥补了现有转接方法中普遍存在的成功率较低的不足，而且克服了类似愈伤组织诱导过程中所需的成本和时间问题。

【附图说明】：

图1是三种不同来源内生真菌的抗病原真菌能力的比较——内生真菌对病原菌的抑制作用，A：羽茅内生真菌和枝孢霉对峙、B：高羊茅内生真菌和枝孢霉对峙、C：黑麦草内生真菌和枝孢霉对峙、D：羽茅内生真菌和弯孢霉对峙、E：高羊茅内生真菌和弯孢霉对峙、F：黑麦草内生真菌和弯孢霉对峙；

图2是采用无菌胚芽鞘法进行抗性菌株同源回接和向草坪植物高羊茅的异源转接结果，其中，A、B、内生真菌在天然宿主羽茅中的分布情况，C、D、筛选出的菌株向其无菌宿主回接后的情况，E、F、筛选出的菌株向无菌高羊茅人工转接后的情况。

该内生真菌可从禾本科芨芨草属的羽茅种子或叶鞘中经分离、纯化获得，申请人实验室保藏有该菌种，公众如有需要，也可径直与申请人联系。

【具体实施方式】：

实施例1：

本发明涉及的内生真菌抗性菌株的筛选

内生真菌的收集、分离及纯化：收集了我国天然草地自东向西56个样地、43种、175个植物种群的牧草，首先对其进行内生真菌检测，然后对染菌率高的种群进行内生真菌的分离、纯化。

内生真菌的抗旱性筛选：用PEG-6000模拟干旱胁迫，设对照、轻度、中度和重度胁迫4个处理，每个处理5个重复，用YM培养基配制PEG的质量百分比浓度分别为0，10％，20％，40％的溶液(培养基的pH值＝6.0)，测得的水势分别为-0.17、-0.40、-1.02、-3.88MPa。无菌条件下取对数生长期的内生真菌菌悬液3ml至250ml的锥形瓶中(含100ml的YM培养基)振荡培养(250rpm/M，25℃)，当内生真菌进入衰亡期后，真空抽滤，烘干称重。计算各胁迫处理下的菌丝干重占对照干重的比值，来判断菌种的耐旱性。

内生真菌的抑菌实验

所选择的病原真菌为草坪草常见病原真菌：镰刀菌属Fusarium sp.、立枯丝核属Rhizoctonia sp.、枝孢霉属Cladosporium sp.、拟茎点属Phomopsis sp.、弯孢霉属Curvularia sp.(病原菌由华南农业大学资源环境学院植物病理系提供)。

用直径为5mm的打孔器在母菌上打孔得均匀的菌块，在离平板边缘1.5cm处对称接4个内生真菌菌块，在中央接等质量的病原菌，以不接内生真菌的为对照。每个处理三个重复，交叉实验，逐日观察抑菌作用，当内生真菌与病原菌相交后，用毫米刻度尺测量内生真菌、病原菌和对照的半径，计算抑菌率。

抗性菌株的种类鉴定

本发明获得的抗性菌株分离自禾本科芨芨草属植物羽茅，该植物感染内生真菌为我们首次报道，该菌种经形态观察、培养特征以及分子生物学rDNA-ITS基因序列分析，确认其种名为Netyphodium chisosum(Ren AZ，Gao YB，Wang YH，Zhang X，Wei YK.2008.Diversity ofclavicipitaceous fungal endophytes in Achnatherum sibiricum in natural grasslands of China.Symbiosis，46：21-31.)。从不同地理种群分离的内生真菌在形态上有比较大的差异，但他们的ITS序列差异很小，因此把它们归为同种。主要菌株的序列分析结果已提交到NCBI的GenBank中，相应的序列号为DQ675576-DQ675588。

实施例2：

内生真菌向草坪草的人工转接方法，包括：

第一、无菌胚芽鞘的获得

利用苯胺兰染色、显微镜下观察的方法检测待检测种子的染菌状况，确认其无菌后将无菌的种子经50％硫酸-5％次氯酸钠进行表面消毒，用无菌水冲洗3次，接着在无菌条件下将种子接种到水-琼脂培养基(20g琼脂溶于1000ml水中)表面轻压，将培养皿密封后放到恒温培养箱中暗培养(25±1℃)，6粒/皿。3天后待种子长出胚芽鞘后用于人工转接。

第二、人工转接

无菌条件下将培养皿置于体视显微镜下，用预先吸入少量无菌水的一次性注射器先在胚芽鞘靠近上方的部位纵向划一个长约0.5-1mm的小口，深度以不戳穿胚芽鞘为准，然后用注射器从培养基上挑取一定量的内生真菌菌丝，推动注射器将菌丝注入伤口中，接种后置于培养箱中暗培养；5天后用黑暗和光照交替培养4天，每天12小时黑暗，12小时光照，之后移栽到无菌蛭石中，用保鲜膜将花盆口封住，以增加周围空气湿度；移苗一周后将保鲜膜移开，室温培养，1个月后检测感染率。同源转接成功率达93％，异源转接成功率达76％。

)的无性型Neotyphodium属的Neotyphodium chisosum。

实施例3、本发明效果试验

一、本发明所获得的抗性菌株的抗旱性和抗真菌病害能力的评价

考虑到感染高羊茅和黑麦草的内生真菌Neotyphodium coenophialum和Neotyphodium lolii对宿主植物抗生物干扰和非生物胁迫方面的有益影响已经被大量的实验证据所证实，本发明将筛选出的抗性菌株(Y)分别与分离自高羊茅(所采用的2个品种分别为Millennium、Ruby，简称M、R)和黑麦草(所采用的2个品种分别为SR4000、Justus，简称S、Ju)的内生真菌的抗性进行比较，结果见表1、2和图1：

表1抗旱性比较——不同浓度PEG胁迫下内生真菌菌丝干重与对照的比值

表2抗病原真菌能力的比较——内生真菌对病原菌的生长抑制率(％)

注：各行中不同字母表示差异显著p＜0.05，相同字母表示差异不显著

二、无菌胚芽鞘转接效果评价

将筛选出的抗性菌株采用无菌胚芽鞘转接的方式分别进行向宿主植物羽茅的同源回接和向草坪植物高羊茅的异源转接，结果发现转接后幼苗的成活率和成功感染率均很高，后者远高于目前报道的人工转接方式的成功率，结果见表3和图2。

表3筛选菌株的无菌胚芽鞘转接结果

Claims

1、一种向草坪草人工转接天然禾草中的内生真菌的方法，其特征在于，该方法包括：

第一、无菌胚芽鞘的获得

将确认无菌的种子经50％硫酸-5％次氯酸钠进行表面消毒，用无菌水冲洗，接着在无菌条件下将种子接种到由每20g琼脂溶于1000ml水中配制的水-琼脂培养基表面轻压，将培养皿密封后放到恒温培养箱中，25±1℃暗培养；3天后待种子长出胚芽鞘后用于人工转接；

第二、人工转接

无菌条件下将培养皿置于体视显微镜下，用预先吸入少量无菌水的一次性注射器先在胚芽鞘靠近上方的部位纵向划一个长0.5-1mm的小口，深度以不戳穿胚芽鞘为准，然后用注射器从培养基上挑取内生真菌菌丝，推动注射器将菌丝注入伤口中，接种后置于培养箱中暗培养；5天后用黑暗和光照交替培养4天，之后移栽到无菌蛭石中，用保鲜膜将花盆口封住，以增加周围空气湿度；移苗一周后将保鲜膜移开，室温培养，1个月后检测感染率。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内生真菌为子囊菌纲(Ascomycetes)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、瘤座菌族(Balansieae)的香柱菌属

的无性型Neotyphodium属的Neotyphodium chisosum该菌可从禾本科芨芨草属的羽茅种子或叶鞘中分离获得。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于黑暗和光照交替培养是指每天12小时黑暗，12小时光照。