CN105713953A - 烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法 - Google Patents

烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，属于植物病原鉴定技术领域。本发明采用组培瓶法鉴定烟草黑胫病菌生理小种，培育、浸染的环境条件更加稳定，有利于加速烟草、病原菌的生长，大幅缩短育苗周期和浸染周期，同时还可避免杂菌及其他生理小种对鉴定结果产生干扰，且通量高，能最大限度地节约人力、物力，实现对烟草黑胫病菌生理小种的高通量、快速、准确鉴定。相较大田法和温室法，鉴定快速，结果更加准确、稳定和可靠，具有较高的应用价值。同时也能为烟草其他病害病原菌的生理小种鉴定提供一种思路。

Description

烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，属于植物病原鉴定技术领域。
背景技术
烟草黑胫病是一种世界性的毁灭性土传卵菌病害。20世纪80年代后期，随着我国烟草种植面积的不断扩大，烟草黑胫病迅速扩展。由于不同烟草黑胫病菌生理小种在致病力方面表现差异，因此需要对烟田中黑胫病菌生理小种进行密切监测。截止到目前为止，国际上已报道的烟草黑胫病菌生理小种有5种，其中美国报道的有4种，即0、1、3和4号小种，非洲报道的有1种，即2号小种，而我国仅发现0号和1号小种。
公开号CN101671720A的发明专利公开了一种病圃中烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，步骤如下：(1)测定鉴别寄主在田间的抗病反应：在病圃中栽培鉴别寄主，烤烟烟叶采收后挖根调查，按国家标准对鉴定品种进行分级和抗性评价，结合烟草黑胫病菌0、1、2和3号小种的寄主反应判断生理小种类型；(2)测定菌株在TTC固体培养基中的颜色变化：从病圃中随机采集不同品种的病株，分离纯化病原并鉴定，再进行TTC法测定，根据颜色变化判断黑胫病菌生理小种类型；(3)结合步骤(1)、(2)的鉴定结果，判断生理小种类型；步骤(1)中鉴别寄主在田间的抗病反应在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行，利用有病连作烟田作病圃，诱其自然发病，于06～08年在自然病圃中种植N.plumbaginifolia、NC1071、L8、N.nudicaulis、红大(CK)、K326(CK)、潘圆黄、BL-921、CV78-5等品种，小区随机排列，三次重复，每品种每重复种植一行，每行35株；栽培管理常规漂浮育苗、适龄移栽，烟苗成活后田间多浇水，保证田间湿度，施肥按常规管理。该方法虽能对烟草黑胫病菌的生理小种作出初步鉴定，但由于大田栽培受环境因素影响较大，试验结果的准确性仍有待考证。一般的，烟草黑胫病菌生理小种的鉴定在温室条件下通过根源接种进行，但是该方法需要配备温室设施，且菌株接种至少需要7～8周龄的烟草幼苗(幼苗在接种前需移植)，操作费时费力。因此有必要建立一种能稳定、快速鉴定烟草黑胫病菌生理小种的方法，从而最大限度地节约人力和物力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能稳定、快速鉴定烟草黑胫病菌生理小种的方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)不同鉴别寄主对各个烟草黑胫病菌生理小种的抗病反应
无菌条件下，将经消毒处理的不同鉴别寄主的种子分别接种到组培瓶中无菌培养基上，每个组培瓶接种一粒，培养至鉴别寄主幼苗长出5～6片真叶；将烟草黑胫病菌不同生理小种的菌丝分别接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，每个组培瓶接种一种生理小种，共培养2～3周，感病对照和抗病对照同上操作，统计不同鉴别寄主对烟草黑胫病菌各生理小种的抗病反应；
(2)感染样品中烟草黑胫病菌生理小种的判定
从感染样品中分离、纯化出病原菌，将初步鉴定为烟草黑胫病菌的病原菌菌丝接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，统计不同鉴别寄主对病原菌的抗病反应，对比步骤(1)中统计结果，判定病原菌的生理小种类型。
步骤(1)中所述消毒处理的方法为：将经浸种处理的种子依次置于乙醇、次氯酸钠溶液中消毒，无菌水洗净后再接种到培养基上。其中，浸种处理为本领域常规操作，如在无菌水中浸泡3～5天；消毒处理中乙醇的浓度可为65～75％，时间20～40s，次氯酸钠溶液的浓度可为5～15％，时间10～20min；无菌水洗涤3～5次即可清除残留于种子表面的次氯酸钠。
步骤(1)中所述鉴别寄主的筛选方法可参照文献(苗圃,王海涛,李淑君等.河南省烟草黑胫病菌生理小种鉴定,西北农业学报,2013,22(10):204-220)中记载。优选的，鉴别寄主的品种为L8、NC1071、Florida301和小黄金1025，鉴别寄主对烟草黑胫病菌各生理小种的抗病反应见下表1。
步骤(1)中所述培养基为可供烟草种子萌发及幼苗生长的培养基，一般情况下也满足烟草黑胫病菌不同生理小种的生长需要。例如可选用MS培养基、B5培养基等。
步骤(1)中所述培养的条件优选为：温度24～32℃，湿度50～70％，光照强度2500～3500Lx，光周期14～18h/d，时间35～45d。更优为：温度26～30℃，湿度50～70％，光照强度3000Lx，光周期16h/d，时间40d。
步骤(1)中所述菌丝为新鲜培养的烟草黑胫病菌生理小种的菌丝，可适量接种，如0.8～1.2mg。接种可参照以下步骤操作：在均匀长满烟草黑胫病菌菌丝的培养平板上，利用打孔器在距离平板中心等距的位置打孔，获取直径为0.5cm的带菌丝的培养基碟片，将其投入到生长有鉴别寄主幼苗的组培瓶中即可。
步骤(1)中所述感病对照的品种可选用红大，抗病对照的品种可选用K326。
步骤(1)中所述统计抗病反应的方法为本领域常规技术，可参照已公开专利文献(公开号CN101671720A)中方法，病害分级标准、抗性评价标准也与之相同。
步骤(2)中所述病原菌的分离、纯化方法为本领域常规技术，可参照以下步骤操作：将疑似感染烟草黑胫病菌的烟株洗净后晾干，用灭菌刀将茎杆剖开，从碟片状的病键交界处取髓部组织(大小约3mm×3mm)，依次用10％次氯酸钠、75％乙醇进行表面消毒处理，无菌水漂洗后用无菌滤纸吸干水分，接种到燕麦琼脂培养基上，于28℃恒温箱中培养2～3d，根据烟草黑胫病菌典型特征(如菌落形态、颜色、菌丝形态等)挑取边缘菌落，接种到新的燕麦琼脂培养基上，于28℃恒温箱中进行纯化培养。
步骤(2)中所述初步鉴定为将病原菌的菌落形态、菌丝形态、孢子囊形态、游动孢子形态等与烟草黑胫病菌的典型特征进行比对，判定其是否具有烟草黑胫病菌的典型特征，如果有则初步鉴定为烟草黑胫病菌，反之则否；初步鉴定方法为本领域常规技术。具体可参照以下步骤进行：将纯化的病原菌接种到燕麦琼脂培养基上，于28℃恒温箱中暗培养7d，观察菌落形态和菌丝形态；继续培养20～25天，采用水中产孢法将生长旺盛的烟草黑胫病菌于28℃恒温箱中暗培养48h，诱导产生孢子囊，在显微镜下观察病原菌的孢子囊形态；再将含孢子囊的悬浮液置于4℃冰箱中15～30min，取出于室温下放置片刻，在显微镜下观察病原菌的游动抱子形态；结合病原菌菌落形态、菌丝形态、孢子囊形态和游动孢子形态作出初步鉴定。
步骤(2)中所述菌丝接种方法同上。
本发明的有益效果：
相较大田鉴定法和温室鉴定法，本发明中组培瓶法鉴定烟草黑胫病菌生理小种更加快速，鉴定结果更加准确、稳定和可靠。
本发明中组培瓶鉴定法的环境条件稳定，有利于加速烟草、病原菌的生长，大幅缩短育苗周期和浸染周期(普通大田鉴定需要至少90天，组培鉴定大约50天)，同时还能避免杂菌及其他生理小种对鉴定结果产生干扰，通量高，能最大限度地节约人力和物力，从而实现对烟草黑胫病菌生理小种的高通量、快速、准确鉴定，该方法经济实用，具有较高的应用价值，能够为烟草其他病害病原菌的生理小种鉴定提供一种思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中菌株NX3的菌落形态图；
图2为菌株NX3的菌丝形态图；
图3为各鉴别寄主接种黑胫病菌LS2菌丝前后的生长状况图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)不同鉴别寄主对各个烟草黑胫病菌生理小种的抗病反应
a.分别将鉴别寄主(即烟草品种L8、NC1071、Florida301和小黄金1025)的种子在无菌水中浸泡100h，吸干表面水分后自然晾干；将浸种回干的种子用浓度70％的乙醇消毒30s，再用浓度10％的次氯酸钠消毒15min，最后用无菌水洗涤4次，清除残留于种子表面的次氯酸钠；
b.无菌条件下，将经消毒处理的鉴别寄主种子分别接种到盛装有MS培养基的组培瓶中，每个组培瓶接种一粒(每个烟草品种设4个重复，每个重复10个组培瓶)，组培瓶口用0.22μm滤膜封口，置于温度28℃、湿度60％、光照强度3000Lx、光周期16h/d条件下培养40d；
c.采用燕麦琼脂培养基培养烟草黑胫病菌不同生理小种，在均匀长满烟草黑胫病菌0号小种菌丝的10cm平板上，用打孔器在距离平板中心5cm的位置打孔，得到3个直径0.5cm带菌丝的培养基碟片(每个碟片上菌丝重1mg)，并将其投入到上述生长有鉴别寄主幼苗的组培瓶中，与鉴别寄主幼苗共培养2周，共培养的条件同上，其他生理小种1号、2号、3号同上操作；
感病对照红大和抗病对照K326浸染操作同步骤a、b、c；
燕麦琼脂培养基为：30g燕麦片加1000mL水，煮沸1h，用纱布过滤后补水至1000mL，加琼脂粉11g(10～12g均可)，溶解后分装灭菌；
d.按照烟草黑胫病分级标准逐株记录各烟株的病级数，并计算不同生理小种浸染后鉴别寄主的病情指数，统计不同鉴别寄主对各个烟草黑胫病菌生理小种的抗病反应，结果见下表1；
烟草黑胫病病害分级标准如下：
0级：全株无病；
1级：茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎；
3级：茎部病斑环绕茎围1/3～1/2，或1/3～1/2叶片轻度凋萎,或下部少数叶片出现病斑；
5级：茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2～2/3叶片凋萎；
7级：茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎；
9级：病株基本枯死；
病情指数计算公式如下：
病指＝Σ(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100；
抗性评价标准：
高抗：病情指数0～5，用HR表示；
抗：病情指数5.01～25，用R表示；
中抗：病情指数25.01～50，用MR表示；
中感：病情指数50.01～75，用MS表示；
感：病情指数75以上，用S表示。
表1不同鉴别寄主对各个烟草黑胫病菌生理小种的抗病反应
(2)感病烟株中烟草黑胫病菌生理小种的判定
从河南省多个县区(包括三门峡陕县、南阳内乡、南阳淅川、三门峡灵宝、三门峡卢氏、周口鹿邑、洛阳汝阳、洛阳洛宁等)采集疑似感染烟草黑胫病菌的烟株28份，自来水洗净晾干后用灭菌刀将烟株的茎杆剖开，从碟片状的病键交界处取大小3mm×3mm的髓部组织，依次用10％次氯酸钠消毒1min，75％乙醇消毒1min，再用无菌水漂洗2次，将漂洗过的组织用无菌滤纸吸干水分，再接种到燕麦琼脂培养基上，做好标记，置于28℃恒温箱中培养3d，根据烟草黑胫病菌典型特征(如菌落形态、颜色、菌丝形态等)挑取边缘菌落，接种到新的燕麦琼脂培养基上，于28℃恒温箱中纯化培养7d；
将纯化的病原菌接种到燕麦琼脂培养基上，于28℃恒温箱中暗培养7d，观察菌落形态和菌丝形态；继续培养21天，采用水中产孢法将生长旺盛的烟草黑胫病菌于28℃恒温箱中暗培养48h，诱导产生孢子囊，在显微镜下观察病原菌的孢子囊形态；再将含孢子囊的悬浮液置于4℃冰箱中25min，取出于室温下放置3min，在显微镜下观察病原菌的游动抱子形态；结合病原菌菌落形态、菌丝形态、孢子囊形态和游动孢子形态特征，初步鉴定有28份感病烟株均感染烟草黑胫病菌(菌株NX3的菌落形态见图1，菌丝形态见图2)；
将初步鉴定为烟草黑胫病菌的菌丝接种到生长有鉴别寄主幼苗的组培瓶中，共培养16d(共培养条件同上)，其中鉴别寄主幼苗培养同步骤(1)中a、b操作，菌丝接种同步骤(1)中c操作；图3为各鉴别寄主接种黑胫病菌LS2菌丝前后的生长状况图，图中A、B为小黄金1025接种前后的生长状况，C、D为L8接种前后的生长状况，E、F为NC1071接种前后的生长状况，G、H为Florida301接种前后的生长状况；
按照烟草黑胫病分级标准逐株记录各烟株的病级数，并计算烟草黑胫病菌浸染后鉴别寄主的病情指数，统计不同鉴别寄主对从各感病烟株中分离得到的烟草黑胫病菌的抗病反应，对照表1中分类结果，判定感病烟株中烟草黑胫病菌的生理小种类型，结果见下表2。
表2不同鉴别寄主对从各感病烟株中分离得到的烟草黑胫病菌的抗病反应

Claims (9)

1.烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)不同鉴别寄主对各个烟草黑胫病菌生理小种的抗病反应
无菌条件下，将经消毒处理的不同鉴别寄主的种子分别接种到组培瓶中无菌培养基上，每个组培瓶接种一粒，培养至鉴别寄主幼苗长出5～6片真叶；将烟草黑胫病菌不同生理小种的菌丝分别接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，每个组培瓶接种一种生理小种，共培养2～3周，感病对照和抗病对照同上操作，统计不同鉴别寄主对烟草黑胫病菌各生理小种的抗病反应；
(2)感染样品中烟草黑胫病菌生理小种的判定
从感染样品中分离、纯化出病原菌，将初步鉴定为烟草黑胫病菌的病原菌菌丝接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，统计不同鉴别寄主对病原菌的抗病反应，对比步骤(1)中统计结果，判定病原菌的生理小种类型。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述消毒处理的方法为：将经浸种处理的种子依次置于乙醇、次氯酸钠溶液中消毒，无菌水洗净后再接种到培养基上。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：消毒处理中乙醇的浓度为65～75％，时间20～40s；次氯酸钠溶液的浓度为5～15％，时间10～20min。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述鉴别寄主的品种为L8、NC1071、Florida301和小黄金1025。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述培养基为MS培养基、B5培养基中任一种。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述培养的条件为：温度24～32℃，湿度50～70％，光照强度2500～3500Lx，光周期14～18h/d，时间35～45d。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于：培养的条件为：温度26～30℃，湿度50～70％，光照强度3000Lx，光周期16h/d，时间40d。
8.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述菌丝的接种量为0.8～1.2mg新鲜菌丝。
9.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述感病对照的品种为红大，抗病对照的品种为K326。
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