CN104313117B - 利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法。其技术方案是：葡萄白粉菌菌株小种分离、纯化与侵染；通过rDNA序列扩增与进化分析而获得高致病性的葡萄白粉菌菌株NAFU1；并分析该菌株的保存与扩繁；利用该菌株接种葡萄离体叶片，用台盼蓝染色接种后不同时间病叶，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞坏死出现等指标，快速准确的检测葡萄的抗病性。本发明保存扩繁的白粉菌产孢量大，孢子新鲜，致病性强，克服了传统田间鉴定周期长、重复性差、受气候影响的缺点，不但可以提高大规模检测葡萄种质资源抗病性效率，而且对开展大规模快速鉴定葡萄种质资源及其杂种后代和转基因葡萄植株抗病性具有直接参考价值。

Description

利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法

技术领域

本发明涉及一种植物抗病性鉴定方法，特别是涉及一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片鉴定抗病性的方法，属于生物工程领域。

背景技术

葡萄白粉菌是严重危害葡萄生产的重要真菌病害之一。目前广泛栽培的欧洲葡萄极易感病，严重影响到葡萄的产量和品质。传统的化学防治方法虽有效果，但因其残留高，污染重，严重影响葡萄产品的食用安全，威胁人体健康，污染生态环境，使其应用受到限制。生产实践表明，防治葡萄白粉病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种,所以抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种及抗性监测等工作中重要的一环。

长期以来，葡萄育种者从国内外广泛收集了大量葡萄种质资源，并对其进行了抗病性鉴定。经大量研究表明，利用抗病性鉴定的有效方法，科学、准确、快速地鉴定葡萄种质资源对白粉病的抗性程度，是提高抗病育种效率、加速育种进程的关键环节。

目前葡萄白粉病抗性鉴定方法主要有两种，一种是田间自然发病鉴定法；第二种是室内人工喷雾接种鉴定法，田间自然发病鉴定是目前应用最广泛的方法，菌株来源于大田，其小种数量和种类多样性、代表性较好，故鉴定结果较能准确反映当地当时的实际情况，具有成本低、操作简便易行的特点，缺点是对气候、季节依赖性强，鉴定次数少，重复性差。室内人工喷雾接种鉴定法是目前常用的人工接种方法，优点是通过人工控制葡萄白粉菌发病条件，可不受田间季节的限制而常年进行试验，结果快速，缺点是喷雾接种的浓度控制困难，接种用菌株的收集、保存与合理选择是长期、连续的工作，并且接种用的小种数量、种类的多样性与田间试验方法相比具有一定局限性。同时以上两种方法的共同不足是需要辅助材料较 多，鉴定周期较长，如需要明显观察到病斑，然后才能根据病斑大小统计病情指数，而这个过程至少需要15-20天，甚至更长时间，这极大地影响了葡萄种质资源大规模鉴定利用的速度和效率，从而影响到葡萄育种进程。因此，进一步开发科学、准确、快速地鉴定葡萄种质资源白粉病抗性的方法，无论是对加速葡萄抗病育种的实践，还是对丰富葡萄与病原菌互作的理论，都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服目前田间自然发病鉴定法与室内人工喷雾接种鉴定法鉴定葡萄白粉病抗性所存在的缺陷，而公开一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

a.葡萄白粉菌菌株小种分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，选择其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，即为鉴定用葡萄白粉菌菌株小种；

b.葡萄白粉菌菌株小种侵染

采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌菌株小种接种葡萄健康叶片，检测菌株小种对葡萄的侵染过程；

c.葡萄白粉菌菌株小种rDNA序列扩增

收集菌株小种纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到菌株小种保守区DNA片段序列；

d.葡萄白粉菌菌株小种进化分析

用葡萄白粉菌菌株小种保守区DNA片段序列在NCBI进行序列比对及进化分析，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株；

e.葡萄白粉菌菌株小种保存与扩繁

采用直接扫落接种在盆栽葡萄叶片上，摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片和喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片三种保存方法，对葡萄白粉菌菌株小种进行保存与扩繁；

f.用葡萄白粉菌菌株小种接种葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性

取葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片，压片接种葡萄白粉菌菌株小种，分别在接种后不同时间段采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察，通过统计孢子萌发及菌丝生长情况，检测葡萄对白粉病抗性。

本发明保存扩繁的白粉菌产孢量大，孢子新鲜，致病性强，鉴定不需要较多辅助材料，周期短，操作简便，效果较好；利用本发明不但对开展大规模快速鉴定葡萄种质资源及其杂种后代和转基因葡萄植株抗病性具有直接参考价值，而且对开展相关其他植物抗病性鉴定，具有一定借鉴意义，也对加速作物抗病育种进程，提高育种效率，丰富作物与病原菌互作理论，提供重要支撑作用。

附图说明

附图1为本发明葡萄白粉菌菌株NAFU1分离及侵染过程

A：葡萄白粉菌菌株NAFU1的单孢分离；B：NAFU1孢子仅膨大，但尚未萌发；C：NAFU1孢子开始萌发，菌丝生长正常；D：NAFU1菌丝生长旺盛，遍布葡萄叶片，可以看见明显的孢子梗。

附图2为本发明PCR扩增葡萄白粉菌菌株NAFU1保守区DNA及进化树分析

A：M为DL2000marker；1-5：葡萄白粉菌NAFU1保守区序列PCR扩增片段，泳道2未有扩增产物；B：葡萄白粉菌NAFU1进化关系分析。

附图3为本发明葡萄白粉菌NAFU1离体叶片保存与扩繁

A：活体植株接种保存扩繁白粉菌；B：离体叶片插于MS培养基中，采用压片接种保存白粉菌；C：离体叶片插于MS培养基中，采用喷洒菌液接种保存白粉菌。

附图4为本发明用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄离体叶片，检测抗病性

白河-35-1、通化-3、白河-13为中国野生葡萄，‘无核白’为欧洲葡萄，压片接种葡萄白粉菌NAFU1，分别在接种后0，24，48和96h采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察菌丝生长情况，标尺为100μm。

附图5为本发明用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种葡萄杂交后代植株离体叶片，检测抗病性。

A：葡萄杂交后代；B：感病葡萄株系菌丝生长情况；C：抗病葡萄株系菌丝生长情况，红色箭头所指为坏死的细胞，标尺为100μm。

附图6为本发明用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种温室转基因葡萄植株离体叶片，检测抗病性。

A：未转基因葡萄菌丝生长情况；B：转基因葡萄株系菌丝生长情况，红色箭头所指为坏死的细胞；C：未转基因葡萄在叶片清晰可见一层白粉，而转基因葡萄未见明显白粉，红色箭头所指为出现的一些坏死斑，标尺为100μm。

具体实施方式

以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述：

实施例一：用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄种质资源离体叶片鉴定抗病性

a.葡萄白粉菌菌株NAFU1分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在发病严重的葡萄园采集感染葡萄白粉菌的叶片，置于冰壶中带回实验室，选取病原菌发病症状明显的新鲜病叶置于密封袋中，待其发病达到特别明显后，从感染白粉菌的病叶上扫落白粉菌到新鲜的葡萄叶片上，然后将接种后的葡萄叶片置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15d后，得到单克隆菌落，待该白粉菌单克隆长到直径为1cm时，用小毛笔蘸取该单克隆菌落再接种到新鲜、干净的葡萄叶片上进行培养，10-15d后再次重复此过程，共重复五次这种单克隆菌落分离过程，如附图1-A所示；将分离纯化获得葡萄白粉菌病原菌菌株编号，分别保存，经对上述分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定要求，遂将其保存扩繁，命名为NAFU1(西北农林科技大学英文名Northwest A&F University和白粉菌1号的缩写)；

b.葡萄白粉菌菌株NAFU1侵染

为进一步检测NAFU1对葡萄的侵染过程，采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌接种移栽7周的葡萄组培苗健康叶片，在接种后1d、2d、3d、4d、5d、7d、10d采样，台盼蓝染色，普通显微镜下观察菌丝生长，如附图1-B，C，D所示，NAFU1接种葡萄叶片1d，孢子仅膨大，但尚未萌发，接种葡萄叶片3d，孢子开始萌发，菌丝生长正常，接种葡萄叶片10d后，菌丝生长旺盛，遍布葡萄叶片，可以看见明显的附着孢，表明白粉菌生长良好，可以用于后续的快速检测；

c.葡萄白粉菌菌株NAFU1rDNA序列扩增

收集NAFU1纯化后的白粉菌分生孢子0.1-0.2g，置入1.5ml离心管中，常规CTAB法提取NAFU1基因组DNA，无菌水溶解DNA，以NAFU1基因组DNA为模板，用白粉菌保守区通用引物ITS4：5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'和NS7：5'GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC3'进行PCR扩增，反应程序为：94℃3min，94℃30S，50℃30S，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃10min，高保真LA酶，扩增出一条800-1000bp单一条带，电泳结果如附图2-A所示,将扩增出的葡萄白粉菌DNA片段连接到pMD19-T克隆载体，提取质粒，将酶切鉴定正确的菌液送北京华大公司测序，得到葡萄白粉菌保守区DNA片段的序列；

d.葡萄白粉菌菌株NAFU1进化分析

将得到的葡萄白粉菌NAFU1保守区DNA片段的序列在NCBI进行序列比对，用MEGA5.0软件，构建进化树，分析葡萄白粉菌菌株NAFU1的进化关系，如附图2-B所示，确认NAFU1是葡萄白粉菌，可以用于后续的快速检测；

e.葡萄白粉菌NAFU1保存与扩繁

对分离纯化得到的葡萄白粉菌NAFU1进行保存，先后尝试以下三种保存方法：

e.1直接接种在盆栽葡萄叶片上：取感病葡萄叶片，用刷子将白粉菌孢子扫到盆栽健康葡萄叶片上，置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15d后，如附图3-A所示，可见到明显的病斑；

e.2取离体葡萄叶片插于MS固体培养基中，用病叶摩擦接种离体叶片，然后置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15天后，如附图3-B所示，可见到明显的病斑；

e.3收集病叶，在无菌水中涮洗，将孢子溶于水中，喷洒接种于插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片，然后置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，15-20天后，如附图3-C所示，可 见到明显的病斑；

f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄种质资源离体叶片鉴定抗病性

取大田栽植葡萄种质资源离体叶片，压片接种葡萄白粉菌NAFU1，分别在接种后0，24，48和96h采样，将样品置于10ml离心管中，加入浓度为0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去，然后用普通显微镜观察菌丝生长情况，如附图4所示，刚接种时孢子尚未萌发，接种后24h，感病材料‘无核白’葡萄清晰可见菌丝生长，其余葡萄叶片上只见孢子萌发，未见明显菌丝，接种后48h，感病材料‘无核白’葡萄菌丝生长更加旺盛，感病野生葡萄株系白河-13可以看见明显的菌丝生长，但没有‘无核白’葡萄多，抗病葡萄如白河35-1菌丝更少，接种后96h，感病材料‘无核白’葡萄不但菌丝生长更加旺盛，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄如白河35-1、通化-3叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，表明植物抗病性出现，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞坏死出现等指标，可以快速、准确检测该葡萄的抗病性；

实施例二：用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种葡萄杂交后代植株离体叶片鉴定抗病性

a.葡萄白粉菌菌株NAFU1分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，将该菌株命名为NAFU1；

b.葡萄白粉菌菌株NAFU1侵染

采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌NAFU1接种葡萄健康叶片，检测NAFU1对葡萄的侵染过程；

c.葡萄白粉菌菌株NAFU1rDNA序列扩增

收集NAFU1纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到NAFU1保守区DNA片段序列；

d.葡萄白粉菌菌株NAFU1进化分析

将得到葡萄白粉菌NAFU1保守区DNA片段的序列在NCBI进行序列比对，构建进化树，分析葡萄白粉菌菌株NAFU1的进化关系，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株；

e.葡萄白粉菌NAFU1保存与扩繁

e.1直接接种在盆栽葡萄叶片上保存，

e.2摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片保存，

e.3喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片保存；

f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种葡萄杂交后代植株离体叶片鉴定抗病性

f.1葡萄杂交后代植株准备

将葡萄杂交后代种子播种于温室，播种基质为泥炭：珍珠岩：蛭石＝8:1:1，温度22±1℃，光照强度12000LX，相对湿度70-85％，待播种生长6周后，生长情况如图5-A所示，取健康、正常叶片用于后续检测；

f.2台盼蓝染色

以上述温室播种生长6周、健康、正常的葡萄杂交后代为材料，分别剪取从顶端向下第3、第4片叶片，插于清水中，用压片法接种葡萄白粉菌NAFU1，在接种后4-5d采样，将样品置于10ml离心管中，加入浓度为 0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去；

f.3镜检观察

在奥林巴斯普通光学显微镜下观察经上述台盼蓝染色的叶片，如图5-B,C所示，接种5d后，感病葡萄株系可以看见明显的菌丝生长，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，表明植物抗病性出现。

实施例三：用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种温室转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性

a.葡萄白粉菌菌株NAFU1分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，将该菌株命名为NAFU1；

b.葡萄白粉菌菌株NAFU1侵染

采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌NAFU1接种葡萄健康叶片，检测NAFU1对葡萄的侵染过程；

c.葡萄白粉菌菌株NAFU1rDNA序列扩增

收集NAFU1纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到NAFU1保守区DNA片段序列；

d.葡萄白粉菌菌株NAFU1进化分析

将得到葡萄白粉菌NAFU1保守区DNA片段的序列在NCBI进行序列比对，构建进化树，分析葡萄白粉菌菌株NAFU1的进化关系，表明获得了一 个新的葡萄白粉菌菌株；

e.葡萄白粉菌NAFU1保存与扩繁

e.1直接接种在盆栽葡萄叶片上保存，

e.2摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片保存，

e.3喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片保存；

f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种温室转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性

f.1温室转基因葡萄植株准备

将生长健壮的转基因葡萄组培苗移栽于炼苗室，移栽基质为泥炭：珍珠岩：蛭石＝8:1:1，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度90-95％，待移栽生长8周后，移栽于温室中，温度22±1℃，光照强度13000LX，相对湿度70-80％，继续生长4周后，取健康、正常叶片用于后续检测；

f.2台盼蓝染色

以上述温室移栽生长4周、健康、正常的转基因葡萄为材料，分别剪取从顶端向下第3、第4片叶片，插于清水中，用压片法接种葡萄白粉菌NAFU1，在接种后4-5d采样，将样品置于10ml离心管中，加入浓度为0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去；

f.3镜检观察

在奥林巴斯普通光学显微镜下观察经上述台盼蓝染色的叶片，如图6-A,B所示，接种5d后，未转基因葡萄可见明显的菌丝生长，而且可见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，如图6-C所示，接种15d后，未转基因葡萄在叶片清晰可见一层白粉，而转基因葡萄未见明显白粉，出现一些坏死斑，表明植物抗病性出现。

取大田栽植葡萄离体叶片，压片接种葡萄白粉菌NAFU1，分别在接种后0，24，48和96h采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察菌丝生长情况，根据附图4的结果，结合原来的田间自然发病鉴定结果，统计出葡萄对白粉病抗性结果如附表，结果表明，离体叶片和田间自然发病鉴定结果符合程度较高。

利用葡萄白粉菌菌株NAFU1检测大田栽植葡萄对白粉病抗性结果统计表

R:抗病；HR：高抗；I:中等；S：感病 。

Claims (1)

1.利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征是通过以下技术方案实现的：

a.葡萄白粉菌菌株小种分离与纯化

在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，选择其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，即为鉴定用葡萄白粉菌菌株小种；

b.葡萄白粉菌菌株小种侵染

采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌菌株小种接种葡萄健康叶片，检测菌株小种对葡萄的侵染过程；

c.葡萄白粉菌菌株小种rDNA序列扩增

收集菌株小种纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到菌株小种保守区DNA片段序列；

d.葡萄白粉菌菌株小种进化分析

用葡萄白粉菌菌株小种保守区DNA片段序列在NCBI进行序列比对及进化分析，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株；

e.葡萄白粉菌菌株小种保存与扩繁

采用直接扫落接种在盆栽葡萄叶片上，摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片和喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片三种保存方法，对葡萄白粉菌菌株小种进行保存与扩繁；

f.用葡萄白粉菌菌株小种接种葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性

取葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片，压片接种葡萄白粉菌菌株小种，分别在接种后不同时间段采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察，通过统计孢子萌发及菌丝生长情况，检测葡萄对白粉病抗性。