CN103181321A - 一种抗寒无核葡萄育种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗寒无核葡萄育种的方法，利用我国原产的极抗寒的野生山葡萄（或其与欧亚种葡萄杂交的F1抗寒优株）做父本，与欧亚种葡萄种子败育型无核品种进行杂交，借助胚挽救技术获得抗寒基因与无核性状结合的杂种植株，进一步对杂种植株进行早期抗寒性相关生理生化指标的测定和抗寒性的综合评价以及进行无核性状的分子检测，以选育抗寒无核葡萄新品种。该方法克服了传统杂交育种技术培育抗寒无核葡萄难度大、周期长、效率低的缺点，比传统杂交育种方法节省育种时间4年以上。通过该方法选育的无核葡萄抗寒性强，适栽范围广，果实品质好，开创了抗寒无核葡萄育种新领域。

Description

一种抗寒无核葡萄育种的方法

一、技术领域

本发明涉及一种植物育种技术，特别涉及一种抗寒无核葡萄育种的方法。

二、背景技术

葡萄是世界上重要的水果，被广泛应用于鲜食、酿酒、制干等方面，特别是无核葡萄食用方便，深受消费者的青睐，目前已成为国际消费的重要趋势和生产发展的方向。生产上栽培的无核葡萄品种绝大多数属于欧亚种葡萄，品质优良但抗寒性差，在我国北方地区冬季常发生冻害，严重时造成树体死亡，冻害一直是制约我国北方地区葡萄生产发展的主要因子，在最低温度低于-15℃的葡萄产区不得不进行树体冬季埋土防寒，但繁重的冬季埋土与春季出土工作，不仅增加了生产成本投入，而且为沙尘暴的发生提供了条件，不利于我国葡萄产业的可持续发展和环境保护。因此，培育抗寒无核葡萄新品种是解决生产问题的根本。

我国是葡萄属(Vitis)植物的原产地之一，野生葡萄资源十分丰富，其中山葡萄（Vitis amurensis）是葡萄属中最抗寒的种，可耐-40℃～-50℃的低温，是极为宝贵的抗寒种质资源。利用野生葡萄资源自身的抗寒性，通过杂交育种是培育抗寒葡萄新品种的重要途径。迄今为止，我国主要利用抗寒的野生葡萄与欧亚种葡萄有核品种杂交，选育出了抗寒有核酿酒品种。在具体的杂交育种实践中，如果用抗寒的野生山葡萄做母本与欧亚种种子败育型无核葡萄做父本杂交，由于山葡萄经济性状不佳且遗传力很强，在杂种一代很难获得品质优良且是无核的葡萄植株；如果以无核葡萄做母本杂交，由于无核葡萄不能形成种子，因而无法获得杂种植株。因此，通过常规杂交途径培育抗寒无核葡萄极其困难。1982年美国葡萄育种家D.W. Ramming发明了无核葡萄胚挽救技术，他采用欧亚种种子败育型无核葡萄品种间杂交，获得了无核葡萄杂种，解决了无核葡萄不能做杂交母本的问题，提高了无核葡萄育种的效率，缩短育种时间4～5年，但欧亚种葡萄品种间杂交难于获得抗寒性强的无核葡萄新品种。在通过一定的技术手段获得杂种植株之后，加快新品种选育进程的方法就是对杂种植株进行早期鉴定筛选，以节省育种时间。不同葡萄种、株系、品种、杂种的抗寒性不同，葡萄植株受到低温逆境时，植物体会发生一系列生理、生化变化以抵抗低温危害，因而可以通过测定植物体内的相关抗寒指标来评价其抗寒性。对于植物抗寒性相关生理、生化指标的测定已有不少报道，但尚未见在葡萄抗寒育种中应用。此外，自上世纪90年代以来，分子标记技术迅速发展，分子标记辅助育种加快了对杂种的鉴定筛选，在实践中取得了明显的成效。利用分子标记技术如序列特异扩增区域（SCAR）技术检测与目标性状连锁的分子标记，具有快速、简便、成本低、不受季节的限制而在实验室完成等优点，因而受到世界植物育种界的广泛重视，但目前该技术还没有广泛应用于抗寒无核葡萄育种领域。

三、发明内容

本发明的目的是解决常规杂交育种中培育抗寒无核葡萄难度大、周期长、见效慢的问题，而公开一种抗寒无核葡萄育种的方法。

本发明技术研究人员在大量的实验令人惊喜地中发现，采用适当的杂交组合、借助胚挽救技术、对杂种幼苗进行早期抗寒性鉴定和分子检测无核性状的综合育种方法，能够缩短抗寒无核葡萄育种时间，提高育种效率，加快育种进程。

本发明所述方法，培育出抗寒无核葡萄仅需约6年时间，与现有常规杂交育种培养抗寒葡萄技术相比（现有常规育种技术需大约10年时间），大大缩短了培育周期，缩短培育时间在4年以上，见效更快。

本发明采用的技术方案是：采用我国原产的极抗寒的野生山葡萄两性花株系或雄株做父本，或极抗寒的野生山葡萄与欧亚种葡萄杂交F1抗寒优株做父本，以欧亚种种子败育型无核葡萄品种做母本，进行杂交，在杂种幼胚败育之前从果实中取出胚珠，将胚珠接种在培养基（ER培养基+水解络蛋白500mg/L）上进行离体培育（胚挽救），60d后从胚珠中剥取裸胚在萌发培养基（WPM培养基+BA0.2mg/L）上培养成苗，获得杂种植株；对杂种植株进行早期抗寒性的生理指标鉴定和无核性状的分子鉴定，筛选出抗寒无核葡萄新种质，最后按照育种程序选育出抗寒无核葡萄新品种。

四、具体实施方式

1. 春季4月份当山葡萄（如黑龙江实生、双优）及其杂种（如北醇）的花序上有5%的花开放时，采集花序带回实验室，剥出花冠及花药置于干净纸片上，于日光灯下干燥至花药裂开，花粉散出。花粉经纱网过筛后，研磨至手触摸有滑腻感，外观如面粉状，装入灭菌后的医用青霉素小瓶，封口，低温干燥处贮藏备用。

2. 选择母本（无核白、火焰无核、红宝石无核、红无籽露、波尔莱特等种子败育型无核葡萄品种）植株上发育一致的的健壮花穗若干，于花前2～3d去雄，防止自花授粉，注意不要伤及柱头。掐去穗尖（花穗1/5～1/4处），对花穗喷水以防止花粉污染和保持柱头湿润，立即套袋和挂牌标记。

3. 当柱头开始分泌水滴状黏液时（去雄后第2～3天），用毛笔或脱脂棉蘸取少量上述花粉进行人工授粉，以24h为间隔，连续授粉3次。

4. 以第一次授粉日期作为取材时期的第0天，在设定的花后日期摘取果穗，每个种子败育型无核葡萄品种的最佳取材时期不同，例如无核白、火焰无核、红宝石无核、红无籽露、波尔莱特的取材时间分别是花后36d、40～49d、60d、51～53d、55d。采集的果穗带回实验室。

5. 将带有1~2cm果柄的果粒用剪刀剪下，放入纱网，于流水下冲洗30～45min。

6. 将冲洗过的果粒置超净工作台上用75%乙醇浸泡30～60s，然后用无菌水冲洗3次，再将浆果放入0.1%升汞溶液中浸泡8～10min，用无菌水冲洗3～5次，最后用手术刀将果粒切开，从剖开的果粒中选取长度大于2mm的胚珠，将其培养在ER+CH500mg/L的固液双层培养基中，每个三角瓶（150ml）内接种20个胚珠，在培养室内（25±1）℃中暗培养60d。

7. 在解剖镜下剖开胚珠，在胚珠内的喙端发现的白色胚即为发育胚，将发育胚接种到WPM+BA0.2mg/L培养基上。培养室温度为（25±1）℃，光照2000～2500lx，12～14h。幼胚在培养基上萌发成苗。

8. 对每一成苗的杂种单株剪取单芽茎段，插入1/2MS+IBA0.2mg/L培养基上继代扩繁，获得3～4株生根的试管苗。

9. 第二年春季3月份对扩繁的试管苗在培养室内（25±1）℃加强光照（3000lx，14～16h）培养1周。

10. 在超净工作台上取出试管苗，用无菌水洗去根部的培养基，栽入营养钵中的培养基质（蛭石：腐殖质土=1:1，经高压灭菌）中，浇透1/10MS+IBA0.05mg/L的营养液，用一次性透明塑料杯罩住苗子保湿，置于炼苗室内炼苗，温度25±1℃，弱光下培养。

11. 1周后浇透0.1%的多菌灵溶液一次；2周后再浇透一次1/10MS+IBA0.05mg/L的营养液，并逐渐打开塑料杯下部，使塑料杯内湿度逐渐下降；3周后再浇透0.1%的多菌灵溶液一次，光照提高至2 000～2500lx；4周时去除塑料杯，并根据情况浇水；5周时可将营养钵置于田间塑料大棚内培养，注意控制棚内温度不高于30℃,2～3天浇一次水；6～7周时将苗子从营养钵中取出，定植于大棚中的土壤中，浇透水。

12. 加强肥水管理，当苗子长到50cm高时摘心，促其加粗生长；随后对长出的付稍多次摘心。8～9月份注意增加磷钾肥的施用。

13. 在6～10月份可采取每个植株的幼叶，提取DNA，用无核基因探针进行PCR扩增，以检测是否拥有无核基因的SCAR标记，并对检测结果进行记录。具体操作如下：

13.1 用改良CTAB法提取葡萄胚挽救苗的脱氧核糖核酸（DNA）。

13.2 取适量的DNA母液，用双蒸水将之稀释为100倍，在核酸、蛋白测定仪上测OD260/OD230、OD260/OD280比值，若 OD260/OD280比值在1.60～1.90之间，OD260/OD230在大于2.0可用于PCR扩增。

13.3 无核基因探针GSLP1的序列：5′CCAGTTCGCCCGTAAATG 3′，由上海生物工程公司合成。

13.4  PCR反应体系为：10×Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μl(2.0mM)，dNTPs2.0μL（250μM），Taq DNA聚合酶0.2μL (5U·μL^-1)（均为大连Takara公司产品），无核基因探针1.0μL，模板DNA（20ng·μL^-1）3.0μL，ddH₂O14.8μL，最后覆盖25μL石蜡油在PTC-100型PCR仪上进行反应。

扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，45个循环；最后一个循环72℃延伸10min；停止于4℃。

13.5 PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳电泳分离。凡是拥有一条569bp的DNA条带（SCAR标记），即表明该胚挽救苗具有无核性状。

14. 在11月上旬当塑料大棚内温度降至4℃左右时，采取种植在大棚内的每个葡萄植株的叶片若干枚，带回实验室，分别测定其电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛的含量共5项指标（同时测定山葡萄黑龙江实生作为高抗寒对照）。具体操作如下：

14.1 电导率的测定，采用DDS-11型电导仪直接测定相对电导率。

各取经上述低温胁迫后的葡萄叶片，用蒸馏水冲洗干净并用滤纸吸干表面水分，称取1.0g，置于刻度试管中，加入20ml去离子水，室温下静置25min后真空泵抽气机中渗透15min，取出室温静置5h后用DDS-307型电导仪测定电导值（C1），煮沸30min后，静置5h至室温并定容到20ml，测定电导值（C2）。按以下公式计算电解质渗出率（%）。

电解质渗出率（%）= C1/C2×100

14.2可溶性糖的测定，采用蒽酮比色法。

各称取经低温胁迫后的葡萄叶片0.2g，放入三角瓶中，加蒸馏水20ml，在水浴中加盖煮沸20min，冷却后用漏斗过滤转入100ml容量瓶中并定容至刻度，再量取1ml稀释至5ml。取待测液1ml放入另一个试管中并加蒽酮试剂（由2g蒽酮溶于1000mL 80%的亚硫酸配成）4ml，在水浴中煮沸显色10min，取出冷却后，测定620nm波长下的吸光值。根据标准曲线，求出可溶性糖含量（%）。

可溶性糖含量（%）= ( C×V1)/(FW×10⁶)×100

C为由标准曲线上查得的可溶性糖含量（μg）；V1为提取液总体积（ml）；FW为样品重（mg）。

14.3可溶性蛋白的测定，采用考马斯亮蓝（G-250）比色法。

各称取经低温胁迫后的葡萄叶片0.2g放入研钵中，加5ml蒸馏水和少量石英砂后冰浴中研成匀浆，转移到离心管中, 4000r/min下离心10min。取上清液1ml，加入10%考马斯亮蓝G-250试剂5ml，摇匀，放置5min后，测定595nm波长下的吸光值。根据标准曲线，求出可溶性蛋白质含量（mg/g）。

          可溶性蛋白质含量（mg/g）= (C×V1)/(A×FW×1000)

C为有标准曲线上查得的可溶性蛋白质含量（μg）；V1为提取液总体积（ml）；FW为样重（g）；A为测定时加样量（ml）。

14.4脯氨酸的测定，采用茚三酮比色法。

各称取经低温胁迫后的葡萄叶片0.2g，放入三角瓶中，加入3%磺基水杨酸溶液5ml后，在沸水浴中显色提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，取滤液2ml，加入2ml冰乙酸及2ml酸性茚三酮试剂，水浴中煮沸显色30min，冷却后加入4ml甲苯萃取30s，取上层液至离心管中，在3000r/min离心5min，取上层脯氨酸红色甲苯溶液，用紫外分光光度仪在520nm波长下比色，求得吸光度值。并根据标样的标准曲线和公式求得游离脯氨酸含量（μg/g）。

           脯氨酸含量（μg/g）= (C×V1/A)/FW

C为有标准曲线上查得的游离脯氨酸的含量（μg）；V1为提取液总体积（ml）；A为测定时加样量（ml）；FW为样品重（g）。

14.5丙二醛的测定，采用硫代巴比妥酸法。

各称取经低温胁迫后的葡萄叶片0.2g，放入加入石英砂和5ml三氯乙酸的冰浴研钵中研磨成匀浆，转移到离心管中，4000r/min下离心10min，取上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入0.6%硫代巴比妥酸2ml摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10min（自试管中溶液出现小气泡开始计时），到时间后，立即将试管取出放入冷水浴中，待试管内溶液冷却后，3000r/min离心15min，分别测定上清液在450nm、532 nm、600 nm波长下的光度值（以0.6%硫代巴比妥酸溶液2ml加2ml水作对照）以计算出丙二醛的含量(nmol/g FW^-1)。

丙二醛含量(nmol/g FW-1) = 6.452×(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.559×A₄₅₀×V1/（V2×FW）

V1为提取液总体积（ml）；FW为样品鲜重（g）；V2 为测定用提取液体积（ml）。

15. 利用隶属函数法综合评价每个杂种植株的抗寒性。

15.1数据标准化

有些指标的量纲不同，需要对数据进行标准化处理。

                                                                           

     其中xi为性状原始数据，di为标准差，

为性状原始数据平均数。

15.2隶属函数的计算方法

采用隶属函数法综合各项指标进行葡萄杂种单株的抗寒性评价。公式为：

      

            （正相关）  

      

             （负相关）

其中，Uij表示i种类j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmin表示所有种类j指标的最小值；Xjmax表示所有种类j指标的最大值；i表示某个杂种单株；j表示某项指标。

                        

根据公式计算出的隶属函数值，用其5项指标的平均数作为其平均隶属度。以山葡萄株系黑龙江实生作为高抗寒对照，按照平均隶属度将葡萄杂种植株的抗寒性分为5级：0.70～1.00为高抗，1级；0.60～0.69为抗，2级；0.40～0.59为中抗，3级；0.30～0.39为低抗，4级；0～0.29为不抗，5级。

16. 选出拥有无核基因标记GSLP1-569且为抗寒的植株，即是希望获得的抗寒无核单株。例如：获得的新品系03-2-16（火焰无核×黑龙江实生）即拥有无核基因标记GSLP1-569，田间表现为果实无核、红色；测定的抗寒性5项指标分别是相对电导率为68.01%，可溶性糖9.78%，可溶性蛋白1.9mg/g，丙二醛5.4 nmol/g，脯氨酸28μg/g，平均隶属度0.52，属于中抗，抗寒性强于母本火焰无核（平均隶属度0.21，属于不抗），但弱于父本黑龙江实生（平均隶属度0.76，属于高抗）。

17. 对筛选的抗寒无核单株重点培养，第3年结果后，按照育种程序对果实性状进行鉴定，并在不同生态区进行高接和繁殖自根苗，进行区域试验，进一步鉴定其结果性状和抗逆性（特别是抗寒性）和适应性，连续进行3年，最后对表现优良者上报审定新品种。

经试验证明，通过本发明方法进行育种抗寒无核葡萄，仅需6年时间即可选育出抗寒无核葡萄新品种，周期短，见效快。

Claims (8)

1.一种抗寒无核葡萄育种的方法，其特征在于采用原产我国的极抗寒的野生山葡萄、或极抗寒的野生山葡萄与欧亚种葡萄杂交的F1抗寒优株做父本，以经济性状好的欧亚种葡萄种子败育型无核品种做母本，进行田间人工杂交，36~60天后，采取幼小杂交胚珠进行离体培养，以获得大量杂交后代胚挽救幼苗，对获得的大量胚挽救幼苗后代进行早期抗寒性相关生理生化指标的测定和抗寒性综合评价，并利用检侧葡萄无核基因的脱氧核糖核酸（DNA）探针进行无核性状的分子检测，以筛选出抗寒无核葡萄新种质，并最终选育出抗寒无核葡萄新品种。

2.按照权利要求1所述的抗寒无核葡萄育种的方法，其特征是采取以下具体实施方法：

春季4月份当山葡萄或其杂种的花序上有5%的花开放时，采集花序带回实验室，剥出花冠及花药置于干净纸片上，于日光灯下干燥至花药裂开，花粉散出；花粉经纱网过筛后，研磨至手触摸有滑腻感，外观如面粉状，装入灭菌后的医用青霉素小瓶，封口，低温干燥处贮藏备用；

选择母本为种子败育型无核葡萄品种的植株上发育一致的的健壮花穗若干，于花前2～3d去雄，防止自花授粉，注意不要伤及柱头，掐去穗尖，对花穗喷水以防止花粉污染和保持柱头湿润，立即套袋和挂牌标记；

当柱头开始分泌水滴状黏液时，用毛笔或脱脂棉蘸取少量步骤(1)所得花粉进行人工授粉，以24h为间隔，连续授粉3次；

以第一次授粉日期作为取材时期的第0天，在设定的花后日期摘取果穗，每个种子败育型无核葡萄品种的最佳取材时期不同，采集的果穗带回实验室；

将带有1~2cm果柄的果粒用剪刀剪下，放入纱网，于流水下冲洗30～45min；

将冲洗过的果粒置超净工作台上用75%乙醇浸泡30～60s，然后用无菌水冲洗3次，再将浆果放入0.1%升汞溶液中浸泡8～10min，用无菌水冲洗3～5次，最后用手术刀将果粒切开，从剖开的果粒中选取长度大于2mm的胚珠，将其培养在ER+CH500mg/L的固液双层培养基中，每个三角瓶内接种20个胚珠，在培养室内25±1℃中暗培养60d；

在解剖镜下剖开胚珠，在胚珠内的喙端发现的白色胚即为发育胚，将发育胚接种到WPM+BA0.2mg/L培养基上，培养室温度为25±1℃，光照2000～2500lx，12～14h，幼胚在培养基上萌发成苗；

对每一成苗的杂种单株剪取单芽茎段，插入1/2MS+IBA0.2mg/L培养基上继代扩繁，获得3～4株生根的试管苗；

第二年春季3月份对扩繁的试管苗在培养室内、25±1℃下，加强光照3000lx，14～16h，培养1周；

在超净工作台上取出试管苗，用无菌水洗去根部的培养基，栽入经高压灭菌后的营养基质为蛭石：腐殖质土=1:1的营养钵中，浇透1/10MS+IBA0.05mg/L的营养液，用一次性透明塑料杯罩住苗子保湿，置于炼苗室内炼苗，温度25±1℃，弱光下培养；

1周后浇透0.1%的多菌灵溶液一次；2周后再浇透一次1/10MS+IBA0.05mg/L的营养液，并逐渐打开塑料杯下部，使塑料杯内湿度逐渐下降；3周后再浇透0.1%的多菌灵溶液一次，光照提高至2000～2500lx；4周时去除塑料杯，并根据情况浇水；5周时可将营养钵置于田间塑料大棚内培养，注意控制棚内温度不高于30℃,2～3天浇一次水；6～7周时将苗子从营养钵中取出，定植于大棚中的土壤中，浇透水；

加强肥水管理，当苗子长到50cm高时摘心，促其加粗生长；随后对长出的付稍多次摘心；8～9月份注意增加磷钾肥的施用；

在6～10月份可采取每个植株的幼叶，提取DNA，以无核基因探针GSLP1进行PCR扩增，以检测是否拥有无核基因的SCAR标记GSLP1-569，并对检测结果进行记录；

在11月上旬当大棚内温度降至4℃左右时，采取每个植株的叶片若干枚，带回实验室，分别测定其电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛的含量共5项指标，同时测定山葡萄黑龙江实生作为高抗寒对照； 

利用隶属函数法综合评价每个杂种植株的抗寒性；

选出拥有无核基因SCAR标记GSLP1-569且为抗寒的植株，即是希望获得的抗寒无核单株。

3.权利要求2所述的方法，其中步骤(2)中种子败育型无核葡萄品种选自无核白、火焰无核、红宝石无核、红无籽露或波尔莱特。

4.权利要求2所述的方法，其中步骤(4)中种子败育型无核葡萄品种的最佳取材时期为：无核白36d、火焰无核40-49d、红宝石无核60d、红无籽露51-53d、波尔莱特55d。

5.权利要求2所述的方法，其中步骤(13)中检测结果的具体操作步骤为：

  (1) 用改良CTAB法提取葡萄胚挽救苗的脱氧核糖核酸；

(2) 取适量的DNA母液，用双蒸水将之稀释为100倍，在核酸、蛋白测定仪上测OD260/OD230、OD260/OD280比值，若 OD260/OD280比值在1.60～1.90之间，OD260/OD230在大于2.0可用于PCR扩增；

(3) 无核基因探针GSLP1的序列：5′CCAGTTCGCCCGTAAATG 3′；

(4)  PCR反应体系为：10×Buffer2.5μL，2.0mM的MgCl₂1.5μl，250μM的dNTPs2.0μL，5UL^-1的Taq DNA聚合酶0.2μL，无核基因探针GSLP1为1.0μL，20ngL^-1的模板DNA 3.0μL，ddH₂O14.8μL，最后覆盖25μL石蜡油在PTC-100型PCR仪上进行反应；

扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，45个循环；最后一个循环72℃延伸10min；停止于4℃；

(5)  PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳电泳分离,凡是拥有一条569bp的DNA条带，即表明该胚挽救苗具有无核性状。

6.权利要求2所述的方法，其中步骤(14)中所述5项指标测定的具体操作方法为：

电导率的测定，采用DDS-11型电导仪直接测定相对电导率；

可溶性糖的测定，采用蒽酮比色法；

可溶性蛋白的测定，采用考马斯亮蓝（G-250）比色法；

脯氨酸的测定，采用茚三酮比色法；

丙二醛的测定，采用硫代巴比妥酸法。

7.权利要求2所述的方法，其中步骤(15)所述隶属函数法综合评价步骤为：

数据标准化

有些指标的量纲不同，需要对数据进行标准化处理：

                             

    其中xi′为性状原始数据，di为标准差，为性状原始数据平均数；

隶属函数的计算方法

采用隶属函数法综合各项指标进行葡萄杂种单株的抗寒性评价，公式为：

      

            正相关  

      

             负相关

其中，Uij表示i种类j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmin表示所有种类j指标的最小值；Xjmax表示所有种类j指标的最大值；i表示某个杂种单株；j表示某项指标；    

                         

根据公式计算出的隶属函数值，用其5项指标的平均数作为其平均隶属度，以山葡萄株系黑龙江实生作为高抗寒对照，按照平均隶属度将葡萄杂种植株的抗寒性分为5级：0.70～1.00为高抗，1级；0.60～0.69为抗，2级；0.40～0.59为中抗，3级；0.30～0.39为低抗，4级；0～0.29为不抗，5级。

8.权利要求2所述的抗寒无核葡萄育种的方法进一步包括对筛选的抗寒无核单株重点培养步骤，第3年结果后，按照育种程序对果实性状进行鉴定，并在不同生态区进行高接和繁殖自根苗，进行区域试验，进一步鉴定其结果性状和抗逆性、抗寒性及适应性，连续进行3年，最后对表现优良者上报审定新品种。