CN109906802B

CN109906802B - 耐热型菊花的筛选方法

Info

Publication number: CN109906802B
Application number: CN201910323451.1A
Authority: CN
Inventors: 王亚琴; 孔令接
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CN109906802A

Abstract

本发明公开了一种耐热型菊花的筛选方法，该方法包括以下步骤：在苗期对菊花做高温胁迫处理，观察统计检测各品种体现出来的高温伤害症状严重程度、幼苗存活率高低、氧化损伤程度，及热激相关基因表达水平的高低；对花期菊花做高温胁迫处理，观察统计检测各品种体现出来的高温伤害症状严重程度、能否开花，以及有关生理指标的高低；将菊花幼苗栽培于热带地区田间，进行生理生化指标测定，观察统计各品种的开花率和花期的长短；综合三个步骤中所有指标结果的优略，筛选出耐热型的菊花品种。本发明结合高温胁迫处理和田间栽培试验，是高效综合获得耐热品种(系)的有效途径。这对于在南方高温地区引进栽培，进行耐热菊花品种选育将是一种很好的研究手段。

Description

耐热型菊花的筛选方法

技术领域

本发明涉及植物品种筛选方法，具体涉及耐热型菊花的筛选方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属宿根草本多年生花卉，是中国十大传统名花、世界四大切花和十大盆花之一，具有极高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。

菊花性喜温和冷凉气候，生长发育适温在15～25℃之间，25℃以上高温不利于菊花生长。已有研究报道，菊花在气温32℃以上时生长缓慢，夏季能耐40℃高温，但基本停止生长。夏季高温易造成菊花的生育障碍，受高温因素的制约，菊花生长发育受阻，花期推迟，大量出现柳芽，甚至产生高温伤害。

我国南方热带地区(如广东等省份)常受亚热带季风气候影响，北回归线从中南部穿过，光热充足、霜期短，适合多种盆栽小菊的引进、栽培和选育，但在全球温室效应逐年加剧的情况下，广州夏季持续时间长，极端气温有时高达42℃，持续性高温和极端高温已成为限制植物生长发育的主要因子之一，不仅会对菊花的设施栽培造成巨大损失，还会影响夏季切花菊的生产和市场供应。因此，在生产上急需选育耐热的夏菊品种。

尽管目前对耐热的分子机理已有所了解，通过转基因技术可获得耐热性更好的菊花品种。但是获得转基因植株的时间太长，而且转基因的难易与品种有关，目前菊花转基因技术还不够成熟，基因成功转入到菊花品种还比较困难。

之前的研究多数是观察试验菊花品种在模拟高温下的耐热比较，然而，一方面，人工模拟直接鉴定会受设备因素限制，以及不能完全模拟所有自然条件且对实验材料的量有所限制。另一方面，田间试验结果容易受地点的影响，在当地试验结果可靠性小。

迄今为止，未发现在热带地区引进菊花并选育耐热菊花品种的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐热型菊花的筛选方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种耐热型菊花的筛选方法，包括以下步骤：

(1)苗期高温胁迫处理

将供试的各品种菊花幼苗置于昼夜温度40-50℃/35-45℃下高温培养12-48h，随后做恢复性培养；高温培养和恢复性培养过程重复3次；

然后，观察、统计、检测各品种体现出来的高温伤害症状严重程度、幼苗存活率高低、氧化损伤程度，及热激相关基因表达水平的高低；

所述的高温伤害症状包括萎蔫幼梢恢复比例、黄化与枯焦率、失水率等；

所述的氧化损伤程度包括二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色、氯化硝基四氮唑蓝(nitro-tetrazolium chloride blue，NBT)染色和台盼蓝(Trypon Blue)染色，以及测定过氧化氢(Hydrogen Peroxide，H₂O₂)和超氧阴离子(superoxide anion，O₂ ^.-)的含量；

所述的热激相关基因包括CmHSP70(heat shock protein 70)、CmHSP90(heatshock protein 90)、CmHSP(heat shock protein)和CmsHSP(small heat shock protein)等基因；

所述的幼苗是指具有8-10片叶子，长势基本一致、健康的植株；

(2)花期高温胁迫处理

将各供试菊花品种绿蕾期(整个花苞为绿色)、露色期(舌状花紧紧地交迭在一起，露出颜色)、初花期(花序最外轮花伸直)的植株置于昼夜温度35-40℃/30-35℃高温培养1-3天，再置于38℃-42/33-37℃高温培养1-3周，随后做恢复性培养；高温培养和恢复性培养过程重复3次；

然后，观察、统计、检测各品种体现出来的高温伤害症状严重程度、能否开花，以及有关生理指标的高低；

所述的高温伤害症状是指叶片萎蔫程度；

步骤(1)和(2)中，所述的幼苗和植株在进行高温培养之前，先进行1天以上的适应性培养；

所述的适应性培养，其温度是昼夜温度25℃/20℃；

步骤(1)和(2)中，所述的恢复性培养，是浇足水转入20-25℃/15-20℃下培养1-3周；

步骤(1)和(2)的培养过程中，光照强度为4000lx，光周期为昼/夜：10-12h/12-14h，相对湿度为65％；

(3)高温条件下的田间栽培试验

将供试的各品种菊花幼苗栽培于热带地区田间，在绿蕾期、露色期、初花期、盛花期(花序完全开放)、末花期(单花序最外轮花萎蔫)进行生理生化指标测定，观察、统计各品种的开花率和花期的长短；

步骤(2)和(3)中，所述的生理生化指标包括叶片导电率、叶片中丙二醛含量和脯氨酸含量等；

所述的花期包括单花序花期和群体花期；

综合三个步骤中所有指标结果的优略，筛选出耐热型的菊花品种。

在耐热型菊花的筛选中，选择哪些与耐热性能有关的指标是值得深思和推敲的事情。这其中，表型观察和统计是最为直观可靠的指标，如叶片萎蔫程度、幼梢下垂萎蔫率，成熟功能叶片的卷缩率、黄化与枯焦率和存活率。

在苗期和花期，高温胁迫下，各菊花品种的叶片随处理时间的延长，失水程度不同，且耐热性强的品种在高温胁迫下水分流失较慢，失水率较耐热性差的品种低。因此失水率是反映耐热性能的很好指标。

高温胁迫下菊花体内会积累活性氧，O₂ ^.-和H₂O₂含量检测、以及DAB和NBT染色结果都一样程度反映了活性氧积累程度，与耐性性能相关。

高温会加剧膜脂过氧化作用，甚至会损伤植物细胞膜系统，造成植物细胞损伤，如破坏DNA和蛋白质结构、膜脂氧化等，台盼蓝染色结果可以反映这些变化。

热激蛋白(heat shock protein,HSP)(热激基因)是当生物体遭受高于其正常生长温度8-12℃时，在一定时间内合成的或含量突然增加的一类特殊蛋白质。通过检测热激基因的表达水平，可以反映耐性性能的强弱。

高温胁迫导致细胞原生质膜的结构和功能首先受到破坏，使细胞膜透性增大，细胞内电解质外渗，造成组织浸出液的电导率增大。因此，可以通过测定组织浸出液的电导率，判断电解质外渗以及高温伤害的程度。

高温使膜脂过氧化作用加剧，甚至会损伤植物细胞膜系统，此过程的产物之一是丙二醛，它常被作为膜脂过氧化作用的一个主要指标。

渗透调节也是植物忍耐和抵御高温逆境的重要生理机制之一。植物在高温逆境下，一些渗透调节物质会主动积累，这是渗透调节的关键。其中，脯氨酸是最常见和有效的渗透调节物质。因此本发明选择了这些指标。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明通过人工环境高温胁迫处理和田间试验相结合的方法，可更有力确定及选育耐热菊花品种。目前，采用人工气候箱高温处理探究植物的耐热性已是一个广泛被应用的方法，在拟南芥、水稻、烟草、菊花等植物中均有报道。但在耐热性品种选育方面，仅仅通过单一的研究手段(人工气候箱高温处理)来鉴定耐热品种通常是不够的。因为利用人工气候箱进行高温处理，可能会受设备因素限制，不能完全模拟所有自然条件且对实验材料的量有所限制，因此需进行田间栽培试验。因为在自然高温条件下，可通过观察或统计植物较为直观的性状变化指标，对其耐热性进行评价。而且可根据植物在生理生化特性上的耐热表现，选择与耐热密切相关的指标对植物进行耐热性鉴定，进一步深入研究植物的耐热机理。

2、本发明结合高温胁迫处理和田间栽培试验，是高效综合获得耐热品种(系)的有效途径。这对于研究菊花对高温胁迫的耐受性，扩大菊花的适应地区，从而打破菊花的季节和地区限制，在南方高温地区引进栽培，进行耐热菊花品种选育将是一种很好的研究手段。

3、本发明为进一步开展菊花品种的筛选及其新品种推广应用提供一定的理论依据，也可为其他观赏植物耐热性机理的研究和耐热性品种的选育提供参考。

附图说明

图1是苗期高温胁迫处理6个菊花品种与本地菊高温胁迫耐受性的表型比较

图2是各菊花品种苗期高温处理后成活率分析。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图3是苗期不同菊花品种高温(45℃/40℃)处理24h和恢复处理1周后幼稍下垂萎蔫率分析。误差为标准误，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图4是苗期不同菊花品种高温处理和恢复处理后成熟功能叶片卷缩率分析。误差为标准误，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图5是苗期不同菊花品种高温处理和恢复处理后黄化与枯焦率分析。误差为标准误。

图6是各菊花品种苗期高温(45℃/40℃)胁迫处理下各菊花品种幼苗叶片失水率分析。

图7是高温前和高温后各菊花品种幼苗叶片的DAB染色。

图8是高温前和高温后各菊花品种幼苗叶片的NBT染色。

图9是高温胁迫处理各菊花品种苗期植株叶片H₂O₂含量变化。误差为标准误。

图10是高温胁迫处理各菊花品种苗期植株叶片O₂ ^.-含量变化。误差为标准误。

图11是高温前和高温后各菊花品种幼苗叶片台盼蓝染色。

图12是高温胁迫处理各菊花品种幼苗叶片电导率。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图13是高温胁迫处理各菊花品种幼苗叶片MDA含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图14是苗期高温处理下各菊花品种热激基因CmHSP70的表达水平。误差为标准误。

图15是苗期高温处理下各菊花品种热激基因CmHSP90的表达水平。误差为标准误。

图16是苗期高温处理下各菊花品种热激基因CmHSP的表达水平。误差为标准误。

图17是苗期高温处理下各菊花品种热激基因CmsHSP的表达水平。误差为标准误。

图18是绿蕾期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种与本地菊耐热性的表型比较。

图19是绿蕾期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片电导率变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图20是绿蕾期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片MDA含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图21是绿蕾期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片脯氨酸含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图22是露色期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种与本地菊耐热性的表型比较。

图23是露色期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片电导率变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图24是露色期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片MDA含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图25是露色期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片脯氨酸含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图26是初花期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种与本地菊耐热性的表型比较。

图27是初花期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片电导率变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图28是初花期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片MDA含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05

图29是初花期高温(40℃/35℃)处理下各菊花品种叶片脯氨酸含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图30自然条件下各菊花品种不同生育期叶片电导率变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图31自然条件下各菊花品种不同生育期叶片MDA含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图32自然条件下各菊花品种不同生育期叶片脯氨酸含量变化。误差为标准误，柱状图上方不同小写字母表示差异显著，p<0.05。

图33是试验期大棚内的最高温度和最低温度曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

一种耐热型菊花的筛选方法，包括以下步骤：

(1)苗期高温胁迫处理表型和热害症状分析

1.处理方法：将供试的每个品种各10盆菊花幼苗移入智能人工气候箱(RXZ-380A，宁波江南仪器厂)中，光照强度为4000lx，光周期为12h/12h(昼/夜)，相对湿度为65％。

菊花苗首先于25℃/20℃(昼夜)适应性培养24h，然后进行45℃/40℃高温胁迫处理24h，随后浇足水转入23℃/18℃进行恢复生长1周，重复3次。

期间进行高温热害症状统计、成活率统计以及分别取高温前、高温处理后、恢复处理后各菊花品种幼苗成熟叶(从生长点向下数第2-5片完全展开的叶片)进行生理指标测定。试验设3个重复。

2.苗期菊花叶片高温伤害症状记录

观测统计幼梢下垂萎蔫率(图3)、成熟功能叶片的卷缩率(中部向下弯折或沿主脉合拢下垂、卷曲叶片与全部成熟叶比)(图4)、黄化与枯焦率(1/4以上面积黄化或枯焦的叶片与全部成熟叶比)(图5)，统计幼苗存活率(图2)。

3.取长势一致的有8-10片叶子的菊花幼苗叶片4-5片，立即称取鲜重作为初始重量(W₀)，然后放到干净烘干的锡箔纸上，放置于45℃的培养箱中持续6h，每隔30min称一次重量(Wt)。失水率＝(W₀-W_t)/W₀。实验重复3次。结果图6。

通过观察高温后6个菊花品种和本地菊的菊花苗的表型(图1)和热害症状统计分析，发现与本地菊相比，‘奥金’受伤害程度最轻，基本不萎蔫，只是叶片稍微萎蔫下垂，植株顶端仍保持绿色，‘丰韵里’和‘早黄’次之，且恢复后‘奥金’几乎全部植株都能生长，存活率接近90％。

苗期菊花叶片高温伤害症状记录显示，不管是高温胁迫还是恢复生长，‘奥金’的幼稍下垂萎蔫率、成熟功能叶片卷缩率、黄化与枯焦率都显著低于本地菊及其他品种(p<0.05)，且恢复后‘奥金’幼稍下垂萎蔫率、成熟功能叶片卷缩率也显著低于高温后(p<0.05)。‘丰韵里’和‘早黄’恢复生长后幼稍下垂萎蔫率、成熟功能叶片卷缩率显著低于高温后，黄化与枯焦率在高温后和恢复后无明显差异，但都低于本地菊与其他品种。由此可见‘奥金’的高温耐受性最好，‘丰韵里’和‘早黄’次之。

(2)苗期高温处理氧化损伤及活性氧定位和定量分析

1.二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色

将菊花叶片全部浸染在DAB和NBT染色液中，抽真空5min。然后将DAB染色的材料置黑暗中培养24h，光下染1h；NBT染色的材料置于摇床光下染色4.5h。吸出染色液，加入95％乙醇，隔水加热至绿色全褪，褪色期间需不断更换乙醇。放置一段时间后扫描拍照。DAB染色和NBT染色结果分别如图7和图8。

2.过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂ ^.-)的测定

分别取高温前、高温后和恢复生长后的菊花叶片，称取0.05g。H₂O₂的提取用1ml预冷的丙酮，在通风橱中冰浴研磨成匀浆后，移入离心管，12000×g、4℃离心20min，取上清液，用Sangon Biotech公司的过氧化氢定量分析试剂盒方法测定。O₂ ^.-的提取用1ml预冷的O₂ ^.-提取缓冲液，冰浴的研钵中研磨成匀浆后，移到离心管中，12000×g、4℃离心20min，取上清液，用Solarbio的超氧阴离子(OFR)含量检测试剂盒方法测定。过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂ ^.-)的测定结果分别如图9和图10。

3.台盼蓝(Trypon Blue)染色

将叶片浸泡在染色液中，先水浴煮沸处理2min，再取出在室温平衡1h，吸出染液，加入2.5g/mL的三氯乙醛溶液，水浴煮沸脱色20min，再次吸出液体，加入95％乙醇，放置一段时间后，扫描拍照。台盼蓝染色结果如图11。

4.膜透性测定(电导率)采用电导法测定

将叶片用去离子水冲洗干净(2-3)次，再用5mm打孔器避开叶脉部分打30个孔，再用去离子水清洗，吸水纸吸干多余水分，再平均置于3个盛有10ml去离子水的试管中，每支试管10片小圆片，盖紧盖子，室温下静置3h，用PP-15-P11电导仪测定电导率R1。将试管置于沸水中煮沸30min，组织死亡和电解质释放完全后，冷却后再测定其电导率R₂。以相对电导率表示细胞膜的渗漏率。相对电导率(％)＝(R₁/R₂)×100％。电导率测定结果如图12。

5.丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定

取菊花叶片(去叶脉)，随机称取3个重复，每个重复称取0.1g，于冰浴的研钵中研磨，先加1ml预冷的磷酸缓冲液(pH值7.8)研磨成匀浆，转移至离心管，再加2ml pH值7.8磷酸缓冲液冲洗干净研钵，转至离心管，4℃，10000×g离心20min，上清液用于MDA，采用硫代巴比妥酸法测定。MDA含量测定结果如图13。

通过对高温前和高温后菊花叶片活性氧定位和定量分析及氧化损伤分析，发现‘奥金’叶片的DAB染色、NBT染色以及台盼蓝染色均最浅，且H₂O₂含量、O₂ ^.-含量、电导率及MDA含量最低。说明高温胁迫后‘奥金’的H₂O₂和O₂ ^.-积累水平低，氧化应激能力强，并且在高温胁迫下能维持更高的膜稳定性。

(3)热激相关基因的表达分析

1.设计引物

根据查阅文献找到菊花热激响应相关基因的cDNA序列，根据已得到的cDNA片段序列，利用生物软件Primer Premier 5.0，设计qRT-PCR引物。在靠近片段序列的5′端设计上游引物，在靠近片段序列的3’端设计下游引物，具体序列如表1。

表1热激相关基因所用引物序列

2.QRT-PCR定量热激相关基因

利用FOREGENE公司的Plant Total RNA Isolation Kit Plus试剂盒方法步骤提取菊花叶片总RNA，按照公司TOYOBO公司ReverTra Ace Qpcr RT Master Mix with gDNARemover说明书操作，进行反转录得cDNA作为PCR模板。

反转录方法：

1)RNA变性反应体系：500ng RNA，加ddH2O至6ul。反应程序为65℃，5min。

2)DNase反应，冰上操作：在1)中加2ul的4xDNMMC(已加gDNA Remmover)。反应程序为：37℃，5min。

3)逆转录，冰上操作：在2)中加2ul的5xRTMMII。反应程序：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；-20℃保存。

QRT-PCR具体方法：

1)反应体系：10ul 2xRealStar Green Fast Mixture，0.4ul的PCR primer，0.4ul的cDNA，8.8ul的ddH₂O。

反应程序为：95℃2min，95℃15s，60℃30s，plateread，Go to 2,39X，65℃31s，65℃5s+0.5℃/cycle，Ramp 0.5℃/s，Plateread，GO to7，60X。

取苗期菊花高温处理前、高温后及恢复后的叶片，用FOREGENE的Plant Total RNAIsolation Kit Plus试剂盒提取RNA，进行反转录获得cDNA，通过QRT-PCR检测CmHSP70、CmHSP90、CmHSP和CmsHSP基因的表达量。

结果如图14-图17所示，发现高温胁迫1h，‘奥金’的CmHSP70、CmHSP90、CmHSP、CmsHSP表达水平迅速增加，均显著高于其他菊花品种(p<0.05)，且在3h、6h时CmHSP90仍显著高于其他品种(p<0.05)，CmHSP70、CmHSP、CmsHSP则仍保持高表达水平。这可能与‘奥金’有较强的耐热性有关。

(4)花期高温胁迫处理

1.处理方法：绿蕾期、露色期和初花期高温胁迫处理：将每个品种各6盆菊花移入智能人工气候箱(RXZ-380A，宁波江南仪器厂)中，光照强度为4000lx，光周期为8h/16h(昼/夜)，相对湿度为65％。花期菊花植株首先于25℃/20℃(昼夜)适应性培养1天，然后温度升至38℃/33℃培养1天，然后温度升至40℃/35℃高温胁迫处理1周，随后浇足水转入23℃/18℃进行恢复生长2周，重复3次。分别采取高温前，高温后，恢复后各菊花品种成熟叶(从生长点向下数第2-5片完全展开的叶片)进行生理指标测定。试验设3个重复。结果如图18、图22和图26。

生理指标测定：

A、膜透性测定(电导率)采用电导法测定

将叶片用去离子水冲洗干净(2-3)次，再用5mm打孔器避开叶脉部分打30个孔，再用去离子水清洗，吸水纸吸干多余水分，再平均置于3个盛有10ml去离子水的试管中，每支试管10片小圆片，盖紧盖子，室温下静置3h，用PP-15-P11电导仪测定电导率R₁。将试管置于沸水中煮沸30min，组织死亡和电解质释放完全后，冷却后再测定其电导率R₂。以相对电导率表示细胞膜的渗漏率。

相对电导率(％)＝(R₁/R₂)×100％

电导率测定结果如图19、图23和图27所示。

B、丙二醛(MDA)

取菊花叶片(去叶脉)，随机称取3个重复，每个重复称取0.1g，于冰浴的研钵中研磨，先加1ml预冷的磷酸缓冲液(pH值7.8)研磨成匀浆，转移至离心管，再加2ml pH值7.8磷酸缓冲液冲洗干净研钵，转至离心管，4℃，10000×g离心20min，上清液用于MDA的测定，采用硫代巴比妥酸法测定。MDA如图20、图24和图28所示。

C、游离脯氨酸含量的测定

采用茚三酮比色法。每个品种取10片叶子，剪碎随机称取3个重复，每个重复称取0.05g，用3％磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为3ml，匀浆液转入玻璃离心管中，在沸水浴中浸提10min(提取过程中要经常摇动)，冷却后以4000xg离心10min。取上清液待测。测定参考李玲等的方法。游离脯氨酸含量的测定结果如图21、图25和图29所示。

通过模拟广州夏季高温自然条件，对本地菊、‘奥金’、‘丰韵里’、‘早黄’、‘四季菊’和‘奥彩’的绿蕾期、露色期、初花期进行高温胁迫处理(图19)，发现‘奥金’叶片萎蔫程度最轻，花蕾基本呈挺立状态，恢复生长后，能正常开花。‘本地菊’和‘丰韵里’也基本能开花，但部分出现畸形和枯萎。其余品种损伤严重。说明‘奥金’在花期高温耐受性最明显，‘本地菊’和‘丰韵里’次之。

分别在苗期高温胁迫，花期高温胁迫及实验对照组对菊花叶片进行生理指标测定，发现苗期和花期各种方法处理下，‘奥金’MDA含量和电导率均处于低水平，而脯氨酸含量处于高水平。

(5)自然高温条件下各菊花品种的田间试验(广州)

将本地菊，‘奥金’，‘丰韵里’，‘早黄’，‘四季菊’，‘奥彩’，‘奥红’8个菊花品种于2017年5月把扦插生根的菊花苗定值于华南师范大学花卉大棚中，花盆直径为16cm(1株/盆)，基质为泥炭土和蛭石混合土，常规管理。选取生长健壮、长势一致的菊花植株，取自顶部下数第2-5片叶子，在绿蕾期、露色期、初花期、盛花期、末花期进行生理生化指标测定，3次重复。测定结果如图30、图31和图32所示。期间(5-10月)用温度计(上海医用仪器厂生产)测定试验期大棚内靠近菊花植株顶部区域的最高温度和最低温度，结果见图33，可见5月下旬开始，试验大棚中温度持续升高，且6、7、8和9月均处于高温状态，说明高温持续时间长，平均高温达40℃左右，符合高温胁迫环境，可用于筛选耐热菊花品种。

本研究在广州自然高温条件下，探讨花发育不同时期的菊花叶片的生理指标变化，发现，与其他品种相比，‘奥金’的电导率和MDA含量在开花过程变化比较平缓，且在整个花期过程电导率和MDA含量水平较低(图30、图31)。这与苗期和花期高温胁迫处理的结果相符，说明‘奥金’机体具有较强的维持膜稳定的能力。通过在开花过程对脯氨酸含量的检测，发现‘丰韵里’和‘早黄’在绿蕾期脯氨酸含量最低，露色期最高，之后下降，这也反映出‘丰韵里’和‘早黄’在露色期就受到高温胁迫影响；而本地菊和‘四季菊’则是初花期时脯氨酸含量最高，之后显著下降(p<0.05)。可能是随着花的发育时间延长，自然温度升高，植物体内碳源供应不足导致脯氨酸合成受阻，因此在花发育后期脯氨酸含量下降。有趣的是，从绿蕾期到末花期，‘奥金’的脯氨酸含量持续缓和升高。这可能与‘奥金’的高温耐受性有关(图32)。

通过每天调查花序开放状况，包括单花序花期(初花单花序最外轮花伸直至末花单花序最外轮花萎蔫时间)、群体花期(开放率10％为初花期、枯萎率70％为末花期，期间为群体花期长度)、盲花率(不能开放和非正常开放的花序数总花序数)和最大开放率。

开放率＝1-盲花率。

结果如表2所示：

表2各菊花品种与本地菊的生长状况及花期形状分析

由表2可见，‘奥金’，‘丰韵里’，‘早黄’的单花序平均花期最长，为10d左右，而群体花期则是‘奥金’和‘丰韵里’较长，其中‘奥金’的单花序花期和群体花期均最长分别为11.33d和20d。另外，‘奥金’的盲花率最低，最大开花率最高。表明其花期适应高温的能力较强。

综合以上实验结果可以看出，耐热型菊花品种优选‘奥金’，其次是‘丰韵里’，再次是‘早黄’。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> 耐热型菊花的筛选方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EF1α-F

<400> 1

ttttggtatc tggtcctgga g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EF1α-R

<400> 2

ccattcaagc gacagactca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmHSP90-F

<400> 3

gaacttggtg acacggatga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmHSP90-R

<400> 4

atgcagcatt taagtccttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmHSP70-F

<400> 5

aaagaaccag aacccgtgac 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmHSP70-R

<400> 6

atgtcaaagc agactgtgat ctgtg 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmHSP-F

<400> 7

gcatgggaag cattgacata 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmHSP-R

<400> 8

aaggaaaaat gaccttgcca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmsHSP-F

<400> 9

atgcgaaaat ggaggaagtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CmsHSP-R

<400> 10

agcctgcaat gtcaatagcc 20

Claims

1.一种耐热型菊花的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）苗期高温胁迫处理

步骤（1）所述的高温伤害症状包括萎蔫幼梢恢复比例、黄化与枯焦率、失水率；

步骤（1）所述的氧化损伤程度包括二氨基联苯胺染色、氯化硝基四氮唑蓝染色和台盼蓝染色，以及过氧化氢和超氧阴离子的含量；

步骤（1）所述的热激相关基因包括CmHSP70、CmHSP90、CmHSP、CmsHSP；

步骤（1）所述的幼苗是指具有8-10片叶子的植株；

（2）花期高温胁迫处理

将各供试菊花品种绿蕾期、露色期、初花期的植株置于昼夜温度35-40℃/30-35℃高温培养1-3天，再置于38℃-42/33-37℃高温培养1-3周，随后做恢复性培养；高温培养和恢复性培养过程重复3次；

步骤（2）所述的高温伤害症状是指叶片萎蔫程度；

步骤（1）和（2）中，所述的恢复性培养，是浇足水转入20-25℃/15-20℃下培养1-3周；

（3）高温条件下的田间栽培试验

将供试的各品种菊花幼苗栽培于热带地区田间，在绿蕾期、露色期、初花期、盛花期、末花期进行生理生化指标测定，观察、统计各品种的开花率和花期的长短；

步骤（2）和（3）所述的生理生化指标包括叶片电导率、叶片中丙二醛含量和脯氨酸含量；

步骤（3）所述的花期包括单花序花期和群体花期；

综合三个步骤中所有指标结果的优劣，筛选出耐热型的菊花品种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，所述的幼苗和植株在进行高温培养之前，先进行1天以上的适应性培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的适应性培养，其温度是昼夜温度25℃/20℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）的培养过程中，光照强度为4000lx，光周期为昼/夜：10-12 h/12-14 h，相对湿度为65%。