CN109197490A - 一种提高牡丹耐热性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高牡丹耐热性的方法。所述方法是在牡丹植株叶面喷施SA、CaCl₂或ABA中的至少一种；所述SA的喷洒浓度为100μmol/L，CaCl₂的喷洒浓度为40 mmol/L，ABA的喷洒浓度为40 mmol/L。

Description

一种提高牡丹耐热性的方法

技术领域

本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种提高牡丹耐热性的方法。

背景技术

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组落叶灌木，为我国传统名花，自古以来有“百花之王”的美誉，深受人们的喜爱。近年来，我国南方地区如上海，浙江，杭州，长沙，邵阳等地对牡丹进行了规模化的人工栽培。在栽培生产中发现，南方地区的春末至夏季的高温天气，使得牡丹茎叶热害严重，植株提早枯萎，地下根系发育不良，对其产量和品质产生不利影响。因此，提高牡丹耐热性是亟待解决的问题。

牡丹在我国南方地区如湖南等地栽培生产时出现对高温的不适应现象。南方地区夏季的高温天气，使得牡丹茎叶热害严重，植株提早枯萎，有机物积累有限，地下根系发育不良；最终导致牡丹的产量和品质降低。因此，缓解高温对牡丹的伤害是亟待解决的问题。目前国内外关于牡丹耐热性方面的研究较少，且关于外源物质对牡丹耐热性的影响研究鲜有报道。以中国知网和谷歌学术为数据库，共查到10余篇中外文献与牡丹耐热性研究相关。现有的牡丹耐热性研究方法主要是将牡丹幼苗或者叶片置于不同温度的培养箱中，如25℃、30℃、35℃、40℃；或是单一高温处理，如40℃、45℃；或是在室外自然高温处理。通过测定高温胁迫期间，或高温胁迫后牡丹叶片的生理指标，来揭示牡丹的抗性生理变化。同时，对牡丹在高温胁迫后形态变化进行观察分析。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种提高牡丹耐热性的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述提高牡丹耐热性的方法是在牡丹植株叶面喷施SA、CaCl₂或ABA中的至少一种；所述SA的喷洒浓度为100μmol/L，CaCl₂的喷洒浓度为40mmol/L，ABA的喷洒浓度为40mmol/L。

优选地，所述提高牡丹耐热性的方法是在牡丹植株叶面喷施浓度为100μmol/L的SA。

下面对本发明作进一步说明：

水杨酸是植物体内重要的内源生长物质，在种子发芽、细胞生长修复、气孔关闭、衰老相关基因的表达、酶活性的升高及不利环境下进行光合作用等方面起着重要作用。另外，SA在抗逆胁迫方面也有一定作用，比如热害、冷害、干旱胁迫及重金属胁迫等。已有大量研究表明，适宜浓度的SA处理能提高植物的耐热性。Dat等首次报道了外源SA处理能够提高白芥苗的耐热性。随后，这些结果在许多植物上得以证实。通过对高羊茅、玉米、番茄等植物的耐热性研究发现，SA处理能提高高温胁迫下叶片SOD、POD、CAT、APX等几种主要抗氧化酶的活性，促进抗氧化系统循环的快速有效运转，降低ROS的积累，抑制膜脂过氧化，表现为MDA含量的降低。也有研究认为，SA处理植株不能提高高温胁迫下POD和APX的活性。说明，SA在不同植物上，对不同的抗氧化酶会产生不同的影响。同时，SA处理促进了渗透调节物质：游离脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的积累，维持了细胞正常的渗透压，提高植物的耐热性。

此外，SA对植物耐热性的提高效果还与SA浓度、植物种类、植物苗龄有关。贾思振等的研究表明，30000μmol/L的SA处理能有效减轻高温对菊花幼苗叶片的伤害，而水聚德的研究表明提高青梗菜幼苗耐热性的SA浓度相对较低，为100μmol/L。符冠富对水稻的研究表明，常温下适宜浓度SA促进水稻颖花分化，但高浓度SA严重降低每穗粒数。然而高温下100μmol/L—50000μmol/LSA处理每穗粒数均高于对照。无论常温或高温，100μmol/LSA处理效果最好，其每穗粒数及产量均显著高于对照。

钙是植物生长发育必需的大量元素之一，Ca²⁺能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，可作为植物信号转导的第二信使来传递胞外信息。许多试验表明，钙活跃地参与调节和控制植物的许多生理活动。已知在胁迫条件下，细胞内游离Ca²⁺常常显著增加，这种增加可以启动基因表达，激活一系列生化反应，使植物能够适应环境胁迫。越来越多的证据表明，钙能提高植物组织或细胞的多种抗性，如抗冷性、抗旱性、抗盐性、抗重金属毒害、抗热性。在多种作物上的研究表明，外源施用钙能提高植物的耐热性。对于钙提高植物耐热性的作用机理，还未有明确答案。Klein研究认为，外源Ca²⁺可以促进热激蛋白的合成，在热激过程中细胞质内Ca²⁺浓度提高，从而提高作物的耐热性。另有观点认为高温逆境条件下外源施用Ca²⁺可明显提高抗氧化酶系统的活性，降低细胞渗透势，防止膜质过氧化，保持细胞膜的完整性，从而提高作物的耐热性。陈贵林等研究表明，Ca²⁺处理能显著降低高温胁迫下茄子幼苗MDA含量和O^2-产生速率，提高SOD和POD活性，减轻谷胱甘肽(GSH)的破坏，从而提高茄子幼苗的耐热性。李同根等研究表明，高温胁迫下叶面喷施CaCI₂溶液，可增强皖贝母叶片SOD、POD酶活性，提高游离脯氨酸和可溶性蛋白含量，显著降低相对电导率；提高叶绿素与类胡萝卜素含量、叶片光合效率，从而可减轻高温胁迫对皖贝母叶片的伤害。而Jiang等的研究则表明，外源Ca²⁺增强了两种冷季型草：Festuca arundinacea L.和Poa pratensis L.的耐热性，这种增强与抗氧化酶活性的维持和膜脂质过氧化的减少有关，但与渗透势和渗透调节无关。

脱落酸是植物体内广泛存在的内源激素，参与植物的多个生长发育过程，如抑制种子萌发、促进种子休眠、果实成熟、叶片衰老脱落等过程。同时，研究发现，ABA在植物干旱、高盐、低温、高温、重金属、病虫害等逆境胁迫反应中起着重要作用，可以提高许多植物的抗逆性，是植物的抗逆诱导因子，因而被称为植物的“胁迫激素”。在ABA减轻植物高温伤害研究方面已有相关报道。ABA提高植物的耐热性与其在高温胁迫下能诱导抗氧化酶活性的升高、内源ABA含量的增加、热激蛋白的产生有关。陈于陇等对棉花的研究表明，ABA浸种、根部灌施处理显著提高了棉苗POD活性；ABA叶面喷施处理显著提高了棉苗CAT活性。邓斌的研究表明，ABA在高温条件下能有效缓解匍茎翦股颖的胁迫伤害，可能与ABA处理提高渗透调节能力，抑制蛋白降解密切相关。

具体实施方式

1.试验地概况

室外育苗地位于长沙市中南林业科技大学校园内。室内试验地为中南林业科技大学风景园林学院园林植物实验室。

2.试验材料

供试植物为牡丹品种‘凤丹’(P.ostii‘Fengdan’)、‘香丹’(P.‘Xiangdan’)的一年生幼苗。‘凤丹’和‘香丹’种子于2016年8月采购自湖南省邵阳县郦家坪镇牡丹种植基地。种子经沙藏生根发芽后，种植于7cm*10cm*8cm(底直径×上口直径×高)规格的营养钵中(1苗/盆)，栽培基质为泥炭：蛭石：河沙＝3:1:1(V:V:V)，常规栽培管理。待幼苗复叶的三个小叶发育成熟后，选取高度和长势一致，健康的植株用于试验。

主要仪器：中器PQX-450HPL人工气候箱、756P紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、雷磁DDSJ-308A电导率仪、AR423CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)

3.试验方法

3.1筛选诱导牡丹幼苗耐热性的最适SA、CaCl₂、ABA浓度

分为两个试验，试验1的目的是确定诱导牡丹幼苗耐热性的最适外源SA、CaCl₂、ABA浓度。方法如下：将试验苗用蒸馏水冲洗3遍后移入人工气候箱中预处理，箱内温度设为25℃/20℃(昼/夜)；光照强度为3000lx，光周期为14h/12h；湿度为80％。5d后对上述植株叶面喷施不同浓度的SA溶液：0.1、10、100、1000、10000μmol/L；不同浓度的CaCl₂溶液：0.1、5、10、20、40、60、80mmol/L；不同浓度的ABA溶液：0.1、1、10、20、40、60、80mg/L；以喷施蒸馏水作为对照。用于喷施的SA溶液、CaCl₂溶液、ABA和蒸馏水均用NaOH溶液调节pH至7。每株喷施约10mL，每天17：00进行喷施，连续喷施3d。随后将幼苗置于40℃的高温下黑暗胁迫2d，湿度设为80％。为减轻高温引起的水分胁迫伤害，高温胁迫期间对幼苗进行补水保湿。每个浓度梯度处理9株苗，3次重复。高温胁迫后测定幼苗的热害指数及叶片电解质渗透率。

3.2SA、CaCl₂、ABA对高温胁迫下牡丹幼苗生长和生理的影响

试验2是在试验1的基础上进行，为明确外源SA、CaCl₂、ABA诱导牡丹幼苗耐热性的作用机理。方法如下：将用于试验的牡丹幼苗预处理后，喷施蒸馏水、100μmol/L SA溶液、40mmol/L CaCl₂溶液、40mg/L ABA溶液，预处理和喷施方法同试验1。试验2共设置5个试验组：

(1)空白对照(CK)：常温(25℃/20℃，昼/夜)+蒸馏水；

(2)HT处理(HT)：高温(40℃/30℃，昼/夜)+蒸馏水；

(3)SA处理(HT+SA)：高温+100μmol/LSA；

(4)CaCl₂处理(HT+CaCl₂)：高温+40mmol/LCaCl₂；

(5)ABA处理(HT+ABA)：高温+40mg/LABA。

每个试验组各处理15株苗，3次重复。三个试验组的光照条件、湿度均同预处理。高温胁迫期间每天对幼苗进行补水保湿。高温胁迫6d后，将植株移入日光温室中恢复，温室中温度约为25℃/18℃(昼/夜)，自然光照，常规管理。在高温胁迫的第0d、第2d、第4d、第6d及恢复7d后，观测幼苗热害指数，并采取等大小的功能叶片测定叶绿素含量、电解质渗透率、MDA含量、SOD活性、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量；此外，恢复7d后测定幼苗的茎叶干质量和根干质量。

3.3指标测定

(1)干质量的测定

将幼苗用蒸馏水快速冲洗干净，吸干表面水分。随后将幼苗分为地上部分和根系，置于105℃烘箱中杀青10min后转至60℃烘干至恒重，用天平称量干质量。

(2)热害指数的测定

热害指数的观测参考张佳平等的方法。热害分级为：0级，茎叶几乎无热害；1级，少于1/4的茎叶萎蔫或焦尖；2级，1/4—1/2的茎叶焦边；3级，1/2—3/4的茎叶穿孔或枯焦；4级，3/4以上的茎叶枯焦；5级，植株枯萎或枯死。

热害指数＝Σ(某级别数值×该级别的株数)/(最高级数值×该品种观察总株数)*100％。其数值越小，表明植株耐热性相对越强。

(3)叶绿素含量的测定

采用乙醇丙酮混合液浸泡法。将新鲜牡丹叶片洗净，用吸水纸吸干表面水分，去除大叶脉后，将叶片剪碎成约0.1cm×0.5cm的的小细丝，混匀备用。按体积比配制浸提液，乙醇：丙酮＝1:1。在黑暗中浸提，每支试管加入浸提液10mL，样品0.1g，3次重复。浸提过程中不时摇动，待叶片变白后测定其吸光度。样品分别于645nm、663nm波长下测定吸光度，叶绿素含量的计算公式为:

C＝(12.7×D_663nm－2.69×D_645nm)×V/(1000m)+(22.9×D_645nm－4.68×D_663nm)×V/(1000m)

式中：D_663nm、D_645nm分别为相应波长下的吸光度；V为提取液体积(mL)；m为所取叶片质量(g)，C的单位为mg/g。

(4)电解质渗透率的测定

采用电导仪法测定。将牡丹叶片清洗干净后用去离子水润洗3遍，用吸水滤纸吸干液面水分。剪去叶中脉和叶边缘，将叶片剪碎，分析天平上取称三份0.1g(三次重复)，放入试管中，加入15ml去离子水，塞上试管塞，然后在室温下浸提24h。用电导仪测定浸泡电导率值(EC1)。然后置沸水浴中煮沸20min，冷却1h后摇匀，测其煮沸电导率值(EC2)。按下式计算电解质渗透率(Rec):

电解质渗透率(％)＝(EC1/EC2)*100％

(5)MDA含量的测定

采用TBA显色法测定。称取洗净、擦干剪碎(去叶脉)的牡丹叶片0.1g三份(即3个重复)，放入冰浴的研钵中，加入4mL 10％TCA，研磨至匀浆，并转移至离心管(5mL)中，于4000r/min离心10min，上清液为样品提取液。吸取上清液2mL(对照加2mL蒸馏水)，加入2mL0.5％TBA溶液，混匀，在试管上加盖塞，于沸水浴中反应20min(自试管内溶液出现小气泡开始计时)后，立即将试管取出并迅速冷却，随后4000r/min离心10min。取上清液测定450nm、532nm、600nm波长下的吸光度值。蒸馏水对照。计算：根据以下两个公式算出单位鲜重组织中的MDA含量。

MDA浓度(μmol/L)＝6.45×(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56×A₄₅₀

(6)渗透调节物质含量的测定

a.游离脯氨酸含量的测定

采用茚三酮显色法。首先，制作脯氨酸标准曲线。配制浓度分别为0.0μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、15.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL的标准脯氨酸溶液。分别吸取上述各标准溶液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，加入到10mL带塞试管中，沸水浴中加热15min，用分光光度计测定520nm处的光密度值，以0μg/mL浓度为空白对照。以脯氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，制作标准曲线。

随后，称取牡丹叶片0.1g(三份，三次重复)，剪碎后加入适量80％乙醇、石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至10mL的试管中，用80％乙醇洗研钵，将洗液移入相应的试管中，最后用80％乙醇定容至10mL。随后在80℃水浴加热20mim。为去除干扰的氨基酸，向提取液中加入1勺人造沸石和少于活性炭，强烈震荡5min。随后在离心机中12000转，离心8min，获得提取液。

游离脯氨酸含量的测定：吸取上述提取液2mL于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2mL的80％乙醇作对照。分别向上述各试管中加入2mL的冰醋酸、2mL的茚三酮试剂，然后沸水浴中加热15min。冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度，从标曲中查出每毫升被测样品中脯氨酸的含量。

植物体中游离脯氨酸含量(mg/g)＝(C×V/A)/(W×1000)

C：提取液中脯氨酸浓度(μg/mL由标准曲线求得)

V：提取液总体积(mL)

A：测定时所取上清液体积(mL)

W：样品重(g)

b.可溶性糖含量的测定

采用蒽酮比色法测定。取6支10mL试管，从0—5分别编号，按表1加入各试剂。将各管快速摇动混匀后，在沸水浴10min。冷却后，在620nm波长下测定光密度，用0号试管做空白调零。以光密度为纵坐标，葡萄糖含量(μg)为横坐标绘制标准曲线。

表1可溶性糖标准曲线

称取剪碎混匀的新鲜样品0.1g，在研钵中磨成匀浆，倒入20mL的大试管中，用蒸馏水定容至15mL，塞上试管塞，在沸水浴中水浴20min，取出冷却后过滤入100mL定容瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至100mL。取待测样品提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度。每个样品，重复测定3次。可溶性糖含量的计算如下：

可溶性糖含量(mg/g)＝(C×V/A×N)/(W×10³)

式中，C：标准方程求得的糖量(μg)

A：测定时吸取样品液体积(mL)

V：提取液总量(mL)

N：稀释倍数

W：样品重量(g)

(3)可溶性蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝染色法测定。取6支具塞试管，分别加入0、200、400、600、800、1000μg/mL的牛清白蛋白溶液0.1mL，每支试管中再加入5mL考马斯亮蓝G-250，塞上塞子，摇匀，放置5min钟后在595nm波长下比色测定，以牛血清白蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

称取新鲜样品叶片0.1g(三份，即重复测定3次)，加入适量液氮，用50mmol/L的pH7.8的磷酸缓冲液研磨提取，定容至4mL，提取液于4℃下10000r/min离心15min，上清液用于可溶性蛋白含量、SOD活性的测定。取10mL具塞试管若干支，吸取样品提取液1mL放入试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，塞上塞子，充分摇匀，静置5min后，以空白做参比，在595nm波长下比色，根据测定样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得蛋白质含量(ug)，按以下公式计算:

式中，C：查的的蛋白质含量(μg)

V_T：提取液总体积(mL)

V_S：测定时样品用量(mL)

W_F：样品重量(g)

(7)SOD活性的测定

采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定。取10mL小烧杯若干，4只作为对照，其余用作测定样品，按照表2顺序加入各溶液。

表2 SOD反应液组分表

将各烧杯中的溶液混合均匀后，把对照的其中1只烧杯放置在黑暗处，其余3只对照烧杯和样品一起放于4000lx光下反应20min，各个试管受光要一致，温度为25℃。反应结束后，以不照光的对照管为空白，分别测定其他烧杯在560nm下的吸光值。SOD活性单位以抑制NBT光化学反应的50％为一个酶活性单位(U)。按下列公式计算SOD活性：

SOD活性(U/g)＝(A_CK-A_E)×V_t/(W×V_S×A_CK×50％)

式中，A_CK：照光对照管吸光度

A_E：样品管吸光度

V_t：提取液总体积(mL)

V_S：测定时加样量(mL)

W：样品鲜重(g)

4实验结果

100μmol/L SA对牡丹耐热性的诱导效果最佳。

Claims (2)

1.一种提高牡丹耐热性的方法，其特征在于，所述方法是在牡丹植株叶面喷施SA、CaCl₂或ABA中的至少一种；所述SA的喷洒浓度为100 μmol/L，CaCl₂的喷洒浓度为40 mmol/L，ABA的喷洒浓度为40 mmol/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是在牡丹植株叶面喷施浓度为100μmol/L的SA。