CN112056212B - 一种培育多倍体杨树的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培育多倍体杨树的方法及其应用，所述方法包括将杨树枝条插于培养基质中，在15～25℃、50～80％相对湿度下培养3～10天，在所述杨树枝条上切口形成愈伤组织；使用多倍体诱变剂处理所述愈伤组织至诱变充分，解除处理后继续培养。本发明发现，杨树扦插枝条上切口在适宜的温湿条件下培养可以形成愈伤组织，进一步施加多倍体诱变剂处理即可实现多倍体杨树的培育，诱导率达到42.9％左右。本发明解决了以往杨树体细胞染色体加倍过程或依赖胚胎学观察或依赖组织培养等技术的问题，具有易操作、成本低廉、诱导效率高、保存率高等优点，而且可保证诱导获得的多倍体当年成苗，是杨树体细胞染色体加倍的理想途径。

Description

一种培育多倍体杨树的方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种培育多倍体杨树的方法及其应用。

背景技术

多倍体育种对于杨树遗传改良的重要地位已被广泛认可(Kang XY.Polyploidinduction techniques and breeding strategies in poplar.In:Mason AS(ed)Polyploidy and hybridization for crop improvement.CRC Press,Boca Raton,2016,pp 76–96)，多倍体杨树品种已在现有林业生产中发挥了巨大价值。体细胞染色体加倍是杨树多倍体诱导的重要途径之一。该途径主要是利用染色体加倍诱变剂处理具有分生能力的体细胞，抑制有丝分裂中期的姊妹染色单体分离，从而形成加倍的细胞，获得多倍体。体细胞染色体加倍是一种非常适宜的可高度维持诱变原始材料优良种性的同源多倍体诱导方式，可有效用于倍性效应遗传基础的研究。

为了实现杨树的体细胞染色体加倍，一些方法被陆续研发。首先，Wang等利用秋水仙碱和高温处理处于第一次有丝分裂的合子，成功获得了31株杨树四倍体植株，四倍体诱导率最高为7.41％(Wang J,Shi L,Song SY,Tian J,Kang XY.Tetraploid productionthrough zygotic chromosome doubling in Populus.Silva Fennica,2013,47(2):id932)。该方法依赖于通过大量胚胎学实验而建立的合子第一次有丝分裂时机的即时判别方法(王君，康向阳，鲁敏，吴峰.一种杨树四倍体植株的诱导方法.国家发明专利ZL200910086773.5)，而且由于杨树是雌雄异株，合子来自于双亲配子融合，以合子染色体加倍获得的多倍体无法完全继承双亲的优良种性。其次，Cai等利用秋水仙碱处理小青杨无菌叶片，诱导叶片不定芽染色体加倍获得了四倍体植株，诱导率达到14.6％(Cai X,KangXY.In vitro tetraploid induction from leaf explants of Populus pseudo-simoniiKitag.Plant Cell Rep,2011,30:1771-1778)；Liu等利用秋水仙碱处理三倍体品种‘银中杨’离体培养的叶片，诱导叶片不定芽染色体加倍获得了六倍体植株，六倍体诱导率最高为16.89％(Liu WT,Zheng YF,Song SY,Huo BB,Li DL,Wang J.In vitro induction ofallohexaploid and resulting phenotypic variation in Populus.Plant Cell TissOrgan Cult,2018,134(2):183-192)。这种四倍体诱导方法高度依赖无菌组织培养操作，需建立高效的叶片不定芽再生体系，试验工作量大、周期长，操作步骤繁杂，对无菌操作技术水平要求较高。显然，目前亟需研发更加便捷、技术操作要求低、周期短、能保证植株正常生长的杨树多倍体高效诱导方法。

发明内容

为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种培育多倍体杨树的方法及其应用，通过对扦插于培养基质上的杨树枝条上切口形成的愈伤组织进行多倍体诱导得到多倍体不定芽，诱导率高。

第一方面，本发明提供一种培育多倍体杨树的方法，包括：

将杨树枝条插于培养基质中，在15～25℃、50％～80％相对湿度下培养3～10天，在所述杨树枝条上切口处形成愈伤组织；

使用多倍体诱变剂处理所述愈伤组织至诱变充分，解除处理后继续培养。

所述杨树枝条优选为扦插用的杨树插条。

本发明偶然发现在杨树扦插过程中，在特定的温度和湿度下培养几天后，上切口并未干枯，而是形成愈伤组织，并且快速分化后形成大量不定芽。这一过程为本发明开展体细胞染色体加倍提供了很好的条件，不仅有效避免了对组培条件的依赖，而且取材和操作都十分便利。进而本发明通过实验验证发现，以扦插或水培条件结合体细胞染色体加倍，可有效实现多倍体的高效诱导，诱导率要显著高于现有技术中的诱导方法。基于此，本发明提供一种培育多倍体杨树的方法，在杨树多倍体培育领域有重要意义。

所述使用多倍体诱变剂处理所述愈伤组织至诱变充分可以采用现有技术所公知的诱变技术进行。在此基础上，本发明发现如下的诱变方式可以取得最优的诱变效果(高诱变率)：

使用0.025％～0.05％浓度的秋水仙碱溶液处理24～48h；

使用5～10mg/L浓度的安磺灵处理24～72h；

使用10～50mg/L浓度的氟乐灵处理24～72h。

进一步地，在所述解除处理后继续培养的过程中，还包括：

对所述愈伤组织经过培养形成的不定芽进行倍性检测，去除未加倍和嵌合体的不定芽。所述倍性检测优选为：在所述不定芽长出2～3片幼叶时，采集多个叶片混合后通过流式细胞仪进行倍性检测。

进一步地，在所述将杨树枝条插于培养基质中前，还包括：去除所述杨树枝条上的休眠芽。这一操作有利于防止休眠芽提前萌发而影响插条上切面愈伤组织和不定芽的形成。

进一步地，所述培养基质为固体培养基质或液体培养基质，所述固体培养基质包括以下重量份的成分：

草炭2～4份、珍珠岩1～3份和河沙1～3份。

进一步地，在使用固体培养基质时，当不定芽生长至3cm以上高度后，用透气保水的沙土进行培土。以此方法可以保证不定芽可以健壮生长。

所述液体培养基质为：自来水或包含1/4～1/2的Hoagland’s营养液的自来水。

以此两种基质成分进行扦插，可以使不定芽保持较好的生长状态。

进一步地，所述杨树枝条为1～2年生、直径为1.5～2.5cm，长度为12～15cm的杨树硬枝插条。

本发明进一步提供所述方法在杨树多倍体育种的应用。

本发明具备如下有益效果：

1、本发明方法充分利用了杨树扦插繁殖和水培过程对原始材料的高效利用，既节约材料又节约空间，操作简单、技术难度低，工作量少、周期短、效率高，诱导当年即可生长为可进一步繁殖的多倍体苗木，显著缩短育种周期，提高育种效率。

2、本发明方法通过对杨树种质进行体细胞染色体加倍，诱导获得的多倍体可有效维持原始材料的优良种性，与原始材料经扦插繁殖产生的苗木可组成异细胞型配对材料，为开展倍性效应的遗传分析提供理想的研究材料。

3、本发明方法可推广性好。对于不同的杨树种质，甚至其他树种，只要可通过扦插繁殖或水培生根，均可采用本发明方法高效诱导多倍体，并且诱导率高，达到42.9％以上，有效推动林木多倍体育种技术进步。

4、本发明方法充分利用了愈伤组织脱分化和再分化过程，可实现种质材料的保幼复壮，并结合多倍体诱导，可实现多倍体巨大性等遗传改良，非常适用于用材林、防护林和特种用途林等遗传改良应用。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的在杨树插条上表面形成层区域形成的愈伤组织图片；

图2为本发明实施例1提供的经过染色体加倍后的愈伤组织处不定芽的发育状况；

图3为本发明实施例1提供的经过染色体加倍后的‘汇林88’二倍体流式细胞分析图；

图4为本发明实施例1提供的经过染色体加倍后的‘汇林88’四倍体流式细胞分析图；

图5为本发明实施例2提供的经过染色体加倍后四倍体小青杨的不定芽发育状况；

图6为本发明实施例2提供的将二倍体小青杨、四倍体小青杨和诱导获得的八倍体小青杨样品混合后的流式细胞分析图；

图7为本发明实施例3提供的水培条件下经秋水仙碱处理后形成的‘汇林88’不定芽发育情况；

图8为本发明实施例3提供的经过染色体加倍后的‘汇林88’四倍体流式细胞分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、植株均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例采用的杨树试验材料选择课题组从内蒙古通辽市林科院采集的二倍体杨树品种‘汇林88’的硬枝插条，粗度为2.2cm，长度为12cm。

1、扦插

于北京林业大学温室，将‘汇林88’的插条扦插于25cm(口内径)×25cm(高)的花盆中，花盆中盛装经高温高压灭菌的扦插基质，基质为草炭土：珍珠岩：河沙＝2:1:1，扦插后浇透水，并覆盖塑料薄膜在15～25℃、50～80％相对湿度下培养。

2、加倍处理

扦插后约3d，在插条上切面的形成层区域可观察到愈伤形成(图1)，扦插8d后愈伤组织进一步发育。此时，用脱脂棉将插条上切面完全覆盖，滴加0.05％和0.1％秋水仙碱溶液分别避光处理24h和48h，处理结束后去除脱脂棉，用自来水冲洗切面以去除残留的秋水仙碱。

3、加倍后管理

秋水仙碱处理结束后，继续将花盆用塑料薄膜覆盖，保温保湿培养。期间，注意观察愈伤处不定芽的发育(图2)。当不定芽长至1cm以上，有2-3片幼叶时可采样进行倍性检测。本实例每个插条形成不定芽13-22个。

4、倍性水平分析

当不定芽长出2-3片幼叶后，用剪刀从各幼叶上分别取半片叶片进行混合，在细胞核裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用30μm尼龙网过滤后加入荧光染色液DAPI染色后上样。用流式细胞仪进行检测，以确定诱变芽体的倍性，结果分别见图3、图4。本实例共检测获得四倍体芽体16个，嵌合体芽体37个，四倍体诱导率高达42.9％。

5、多倍体芽体的管理

对芽体进行倍性分析后，及时将未加倍的芽体摘除，仅保留成功加倍的芽体，而且为保证芽体健壮发育，每个插条上最终仅保留1-2个生长健壮的加倍芽体继续生长。用湿沙轻轻覆盖插条上切面，将芽体基部覆盖于湿沙内，定期喷水，保证保留的加倍芽体正常健壮生长。

实施例2

本实施例的试验材料选择课题组前期诱导获得的小青杨四倍体硬枝插条，粗度为2.6cm，长度为12cm。

1、扦插

于北京林业大学温室，将小青杨四倍体的插条扦插于25cm(口内径)×25cm(高)的花盆中，花盆中盛装经高温高压灭菌的扦插基质，基质为草炭土：珍珠岩：河沙＝2:1:1，扦插后浇透水，并覆盖塑料薄膜在15～25℃、50～80％相对湿度下培养。

2、加倍处理

扦插后约5d，在插条上切面的形成层区域可观察到愈伤形成，扦插10d后愈伤组织进一步发育。此时，用脱脂棉将插条上切面完全覆盖，滴加0.05％秋水仙碱溶液避光处理36h，处理结束后去除脱脂棉，用自来水冲洗切面以去除残留的秋水仙碱。

3、加倍后管理

秋水仙碱处理结束后，继续将花盆用塑料薄膜覆盖，保温保湿培养。期间，注意观察愈伤处不定芽的发育。当不定芽长至1cm以上(图5)，有2-3片幼叶时可采样进行倍性检测。本实例插条形成不定芽14个。

4、倍性水平分析

当不定芽长出2-3片幼叶后，用剪刀从各幼叶上分别取半片叶片进行混合，在细胞核裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用30μm尼龙网过滤后加入荧光染色液DAPI染色后上样。用流式细胞仪进行检测，以确定诱变芽体的倍性，结果分别见图6。本实施例检测获得八倍体芽体4个，嵌合体芽体7个。

5、多倍体芽体的管理

对芽体进行倍性分析后，及时将未加倍的芽体摘除，仅保留成功加倍的芽体，而且为保证芽体健壮发育，每个插条上最终仅保留1-2个加倍后的芽体继续生长。

实施例3

本实施例采用的杨树试验材料选择课题组从内蒙古通辽市林科院采集的二倍体杨树品种‘汇林88’的硬枝插条，粗度为2.2cm，长度为12cm。

1、水培

于北京林业大学温室，将‘汇林88’的硬枝插条水培于10cm(上内径)×20cm(高)的塑料水杯中，水杯中盛装自来水，置于15～25℃、50～80％相对湿度下培养，每2天换水一次。

2、加倍处理

水培约6d，在插条上切面的形成层区域可观察到愈伤形成，水培10d后愈伤组织进一步发育。此时，用脱脂棉将插条上切面完全覆盖，滴加0.05％秋水仙碱溶液分别避光处理24h，处理结束后去除脱脂棉，用自来水冲洗切面以去除残留的秋水仙碱。

3、加倍后管理

秋水仙碱处理结束后，继续将水培的插条进行保温保湿培养。当不定芽形成并长至1cm以上(图7)，有2-3片幼叶时可采样进行倍性检测。本实例每个插条形成不定芽8-19个。

4、倍性水平分析

当不定芽长出2-3片幼叶后，用剪刀从各幼叶上分别取半片叶片进行混合，在细胞核裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用30μm尼龙网过滤后加入荧光染色液DAPI染色后上样。用流式细胞仪进行检测，以确定诱变芽体的倍性(结果如图8所示)。本实例共检测获得四倍体芽体10个，嵌合体芽体7个，四倍体诱导率高达37.0％。

5、多倍体芽体的管理

对芽体进行倍性分析后，及时将未加倍的芽体摘除，仅保留成功加倍的芽体，而且为保证芽体健壮发育，每个插条上最终仅保留1-2个加倍后的芽体继续生长。待水培生根后，将生根的枝条直接栽植到土壤中即可。

对比例1

本对比例采用的杨树试验材料选择生长于内蒙古通辽市林科院舍伯吐苗圃的‘汇林88’苗木，胸径为1.8-2.2cm。

1、截干

选择生长良好的苗木，于1.3m胸高处用枝剪水平对苗木进行截断，保证截面光滑整齐。

2、激素处理

立即在截面上覆盖脱脂棉，滴加3mg/L TDZ溶液在脱脂棉上，以浸湿脱脂棉为宜，用保鲜膜包裹截面，扎紧，然后将裁剪好的锡箔纸盖在截面上。24h后移去脱脂棉，并用蒸馏水轻微冲洗截面，除去残留TDZ。然后将湿泥覆盖在截面上，包裹保鲜膜，扎紧，并盖上锡箔纸避光。

3、秋水仙碱加倍处理

根据天气情况每隔5天左右更换湿泥，保持截面的湿润。定期观察截面愈伤组织生长情况，待能肉眼观察到愈伤组织时，用脱脂棉覆盖愈伤组织，并滴加0.05％秋水仙碱溶液进行处理，24h和48h后去除脱脂棉，蒸馏水冲洗截面，除去残留的秋水仙碱，换用湿泥覆盖，包裹保鲜膜，扎紧，并盖上锡箔纸避光。

4、加倍后管理

注意观察愈伤处不定芽的发生，当不定芽长出后，去除湿泥等覆盖物，让不定芽见光促进生长。本对比例每插条形成不定芽4～11个。

5、倍性水平分析

当不定芽长出2-3片幼叶后，用剪刀从各幼叶上分别取半片叶片进行混合，在细胞核裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用30μm尼龙网过滤后加入荧光染色液DAPI染色后上样。用流式细胞仪进行检测，以确定诱变芽体的倍性，检测获得四倍体芽体5个，嵌合体芽体11个，四倍体诱导率最高为16.7％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种培育多倍体杨树的方法，其特征在于，包括：

将杨树枝条插于培养基质中，在15~25℃、50%~80%相对湿度下培养3~10天，在所述杨树枝条上切口处形成愈伤组织；

使用多倍体诱变剂处理所述愈伤组织至诱变充分，解除处理后继续培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述解除处理后继续培养的过程中，还包括：

对所述愈伤组织经过培养形成的不定芽进行倍性检测，去除未加倍和嵌合体的不定芽。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述倍性检测为在所述不定芽长出2~3片幼叶时，采集多个叶片混合后通过流式细胞仪进行倍性检测。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在所述将杨树枝条插于培养基质中前，还包括：去除所述杨树枝条上的休眠芽。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述使用多倍体诱变剂处理所述愈伤组织至诱变充分选自以下任一种：

使用0.025%~0.05%浓度的秋水仙碱溶液处理24~48 h；

使用5~10 mg/L浓度的安磺灵处理24~72 h；

使用10~50 mg/L浓度的氟乐灵处理24~72 h。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基质为固体培养基质或液体培养基质，所述固体培养基质包括以下重量份的成分：

草炭2~4份、珍珠岩1~3份和河沙1~3份。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当不定芽生长至3 cm以上高度后，用透气保水的沙土进行培土。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述液体培养基质为：自来水或包含1/4~1/2的Hoagland’s营养液的自来水。

9.根据权利要求1-3任一项所述方法，其特征在于，所述杨树枝条为1~2年生、直径为1.5~2.5 cm，长度为12~15 cm的杨树硬枝插条。

10.权利要求1-9任一项所述方法在杨树多倍体育种中的应用。

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