CN111937742A - 芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法，所述方法包括：以芙蓉菊属二倍体耐盐种质芙蓉菊为母本，菊属二倍体种质甘菊为父本，进行人工杂交育种。通过幼胚离体培养，保证远缘杂交胚的继续发育，避免了胚败育问题。杂交后代生长良好，成株期可正常开花。对F1代材料进行杂种形态学观察和SSR分析，最终获得芙蓉菊和甘菊的真杂种后代。本发明克服了芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂交障碍，获得了远缘杂种后代，提高了杂种成活率，缩短了菊花培育周期，创制了一批新种质。

Description

芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体地说，涉及芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法。

背景技术

世界各国育种者都在致力于挖掘更多菊花近缘属优异资源，对广义菊属的许多种进行大量杂交尝试，以期培育更加丰富的新种质。包括菊属与匹菊属(王四清， 1993)、日本滨菊属与菊属(Ohishi，1996)、菊属与菊蒿属(Abd EI-Twab et al.， 1999)等。但对于芙蓉菊属和菊属植物杂交的相关研究较少。

芙蓉菊(Crossostephium chinense)，菊科芙蓉菊属单属单种，为我国特有，产于东南沿海地区。常绿亚灌木。叶常狭倒披针形，常全缘，两面密被灰色柔毛，质地厚；花径约0.5cm，淡黄色，无舌状花，花期11月下旬到翌年1月。芙蓉菊是少有的天然异色叶和芳香植物，又有耐盐碱、抗风及病虫害少等特性，所以广泛应用于园林。杨海燕(2016年)以8份广义菊属野生种为实验材料，对盐胁迫下生理指标综合分析，证明芙蓉菊是一种优异的耐盐种质；林双冀(2017年)对盐胁迫下芙蓉菊和其它4种菊属植物的解剖结构及生理指标变化研究，表明芙蓉菊具有独特的耐盐机理。国内关于芙蓉菊的研究主要集中在药用功能及耐盐机理方面，有关育种的研究甚少。

甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)是菊科菊属植物，茎直立，自中部以上多分枝或仅上部伞房状花序分枝。舌状花黄色，为盐敏感型植物。

菊花生产在我国呈区域化发展，沿海和北方地区的盐碱地限制了菊花的栽培推广。利用耐盐野生种质(如芙蓉菊)进行远缘杂交从而培育具有较强耐盐性的菊花品种是菊花育种的一个重要方向。胚拯救作为克服远缘杂交障碍的重要手段在菊属植物间已有所应用，但由于芙蓉菊无舌状花、未成熟胚小且难以剥离，相关技术在芙蓉菊属中的应用并不多。利用胚拯救技术获得的芙蓉菊和甘菊的杂种后代，一方面继承了芙蓉菊的耐盐性状，可作为遗传材料用于细胞学和分子学研究，另一方面，作为桥梁可以显著提高芙蓉菊属和菊属的杂交亲和性。

发明内容

本发明的目的是提供芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种芙蓉菊与甘菊属间远缘杂种的创制方法，其是以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属甘菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。

先前研究发现，芙蓉菊和甘菊在人工杂交时结实率较低，尤其甘菊为母本、芙蓉菊为父本时结实率为零。因此，本发明是以芙蓉菊为母本、甘菊为父本进行的远缘杂交。

本发明中，芙蓉菊、甘菊均为二倍体。

所述方法具体包括：

1)亲本准备：培养两亲本使花期相遇；

2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉授粉并套袋；

3)胚珠剥取：取杂交授粉后10-18天(优选授粉后16天)的头状花序，取出胚珠；

4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；

5)杂种F1代的获得：待幼苗根长至1cm以上，移植到基质中，进行炼苗后上盆常规管理；

6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种F1代的表型观察，并结合SSR分析，从F1 代植株中筛选出真杂种。

前述的方法，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对雌花进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠。

优选地，消毒灭菌的方法包括：用70％-75％酒精对雌花表面消毒30-45秒，无菌水冲洗后，用8％-13％H₂O₂水溶液灭菌10-15分钟，再无菌水冲洗。

更优选地，消毒灭菌的方法包括：用70％酒精对雌花表面消毒30秒，无菌水冲洗后，用12％H₂O₂水溶液灭菌10分钟，再无菌水冲洗。

前述的方法，步骤4)中所述诱导培养基含有6-BA和NAA。所述生根培养基含有NAA。

不同杂交组合胚培养，对培养基的要求不尽相同。在其它菊花近缘属植物杂交中，有文献报道使用MS+2.0mg/L KT+1.0mg/L IAA培养基可获得栽培菊花‘钟山金桂’和黄金艾蒿的杂交后代(陈发棣，2011)；也有文献报道使用MS+0.2mg/L IAA 培养基可得到木茼蒿和蒿子秆的杂交后代，但发芽率仅为12.9％(Hisao Ohtsuka， 2008)。通过使用含6-BA和NAA的MS培养基进行芙蓉菊属间杂交后代胚培养进而获得愈伤组织及杂种幼苗的相关研究鲜见报道。

所述诱导培养基为含有1.0-2.0mg/L 6-BA和0.2-1.0mg/L NAA，pH5.6-5.8的MS培养基。

优选地，所述诱导培养基为含有1.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA、pH5.6的MS培养基；含有2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA、pH5.6的MS培养基；含有2.0mg/L 6-BA 和0.5mg/L NAA、pH5.4的MS培养基；含有2.0mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA、pH5.7的 MS培养基；或含有1.0mg/L6-BA和0.5mg/L NAA、pH5.8的MS培养基。

更优选地，所述诱导培养基为含有1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA，pH5.8的MS 培养基。

所述生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA，pH5.8。

前述的方法，步骤4)中进行诱导培养和生根培养的条件为：温度20-25℃(优选 20℃)，每日光照16h，光照强度约1600-2000lx(优选2000lx)；诱导培养4-6周后转为生根培养。

前述的方法，步骤5)中所述基质由蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合而成。

炼苗的条件为：温度27-30℃，相对湿度60-70％，培养约30-45天。

前述的方法，步骤6)中所述表型选自株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长、花序长、舌状花数和管状花数等中的至少一种。其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长及花序长介于父母本之间的确定为真杂种。

本发明中，进行分子生物学检测所用引物选自SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4、SEQ ID NO:5-6、SEQ ID NO:7-8、SEQ ID NO:9-10和SEQ ID NO:11-12所示引物中的至少一对。

当杂交后代材料的扩增谱带中同时出现父母本特异条带或者父本特异条带时，即可判定其为真杂种。

本发明中，母本可选用芙蓉属二倍体野生种芙蓉菊(Cr.chinense)，父本可选用菊属二倍体野生种甘菊(C.lavandulifolium)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明将具有较强耐盐性的芙蓉菊作为母本，是非常理想的耐盐育种材料。

(二)在组织培养技术上比较了不同胚胎发育时期、不同激素配比培养基的培养效果，获得了胚珠最佳接种时期和最适培养基。筛选出授粉后16天的幼胚离体培养效果最好，此时发芽率最高。诱导培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.8 的培养效果最好，能达到84.26％的出愈率和19.44％的发芽率。本发明最终得到28株正常开花的真杂种后代植株。

(三)本发明利用形态学观察和SSR分析技术对芙蓉菊与甘菊属间杂种真实性进行鉴定。

(四)本发明使大量属间杂交胚继续发育成正常植株，有效避免了胚早衰问题，获得了大量杂交后代，实现了芙蓉菊和甘菊的属间远缘杂交。

(五)本发明使利用广义菊属菊花新种质进行菊花育种成为可能，同时有利于菊花起源演化及芙蓉菊属与菊属亲缘关系方面的深入研究。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中芙蓉菊、甘菊和杂种后代开花植株对比图。其中，A：母本芙蓉菊；B：芙蓉菊与甘菊杂种后代F1-14；C：父本甘菊。

图2为本发明较佳实施例中芙蓉菊、甘菊和杂种后代叶部性状对比图。其中，a：甘菊叶部、b-e：杂种后代叶部、f：芙蓉菊叶部。

图3为本发明较佳实施例中芙蓉菊、甘菊和杂种后代花部性状对比图。其中，a：甘菊花部、b-e：杂种后代花部、f：芙蓉菊花部。

图4为本发明较佳实施例中筛选到的6种SSR引物对远缘杂种F1-19真假性鉴定的扩增结果。其中，A：引物①在亲代及子代中的扩增结果；B：引物②在亲代及子代中的扩增结果；C：引物③在亲代及子代中的扩增结果；D：引物④在亲代及子代中的扩增结果；E：引物⑤在亲代及子代中的扩增结果；F：引物⑥在亲代及子代中的扩增结果。

具体实施方式

本发明针对目前我国特有菊花资源育种利用率低、遗传基础狭窄、培育菊花品种耐盐性弱等问题，利用耐盐野生种芙蓉菊为母本与甘菊杂交，通过幼胚拯救技术解决两者在远缘杂交时存在的杂种胚败育、杂交不结实等问题，最终得到芙蓉菊和甘菊的远缘杂交后代。本发明提供一种利用幼胚拯救获得芙蓉菊与甘菊属间远缘杂种的方法，包括以下步骤：

1)亲本准备：母本选用2n＝18的芙蓉菊，父本选用2n＝18的甘菊。

2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉授粉并套袋。

3)胚珠剥取：取步骤2)杂交授粉后10-18天的头状花序，在超净工作台剥取雌性小花，进行表面消毒灭菌，然后剥掉子房壁，取出胚珠。

4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；共设置5种培养基类型，6-BA与NAA浓度为变量(mg/L)，每板接种约9个胚珠。

5)生根培养：4周后转入生根培养基，培养基类型为1/2MS+0.1mg/L NAA， pH5.8。培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx。

6)杂种F1代植株获得：待小苗根长至1cm以上，移植到基质(粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1，体积比)中进行炼苗。一个月后，上盆常规管理。

7)形态学观察：对父母本及后代材料进行形态学观察和统计，其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长及花序长介于父母本之间的确定为真杂种。

8)SSR鉴定：采用SSR分析技术对芙蓉菊和甘菊远缘杂交获得的杂种后代真实性进行判断。

优选地，步骤1)所用母本材料芙蓉菊需进行花期调整，八月份开始8小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。

优选地，步骤2)所述的授粉时间为上午9-10时或下午3-4时，同一花序重复授粉 2次，每天授粉一次。

优选地，步骤2)所述套袋为授粉后套硫酸纸袋。

优选地，步骤3)所述取的是杂交授粉后生长发育10-18天的头状花序。

优选地，步骤3)所述雌性小花消毒灭菌的方法为：用70％酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再用12％H₂O₂水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。

优选地，步骤4)所述幼胚离体培养的培养基为含有1.0-2.0mg/L 6-BA和0.2-1.0mg/L NAA，pH5.6-5.8的MS培养基。具体分别为培养基A：1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.6；培养基B：2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，pH5.6；培养基C：2.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA，pH5.4；培养基D：2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA，pH5.7；培养基E：1.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA，pH5.8。

优选地，步骤5)所述生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA，pH5.8，即在1/2MS 基本培养基中添加0.1mg/L NAA。

优选地，步骤6)所述杂种F1代植株移栽种植的方法为先开瓶炼苗2-3天，然后bay移栽到粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1的穴盘中，培养30天后上盆常规管理。

优选地，步骤7)包括测定株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长、花序长；每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长、叶宽的测定，并分别测定叶柄长；每株随机选择三个完全盛开的花序，测量其花序的长宽，并记录每个花序的舌状花数和管状花数。

优选地，步骤8)使用的SSR引物如下：

引物①

重复碱基：(TG)7

引物序列(5’-3’)：F:CTCCGCTCAATTTCCATGTT和R:CATAGCGCCTCAAC GGTAAT(SEQID NO:1-2)

引物②

重复碱基：(TTG)5

引物序列(5’-3’)：F:GACACAGGATGAGTTGGCCT和R:GAGGTATCACGTG CGATGAG(SEQID NO:3-4)

引物③

重复碱基：(ATG)7

引物序列(5’-3’)：F:TCTAGCAAGGAAAGGCGGTA和R:TCATGGTCACGGTC ACAGTC(SEQID NO:5-6)

引物④

重复碱基：(TG)6

引物序列(5’-3’)：F:TGGTTCCTATTTGGTTCCCA和R:CGAAAACACACACT AAAAACACA(SEQ ID NO:7-8)

引物⑤

重复碱基：(TTG)6

引物序列(5’-3’)：F:AGGCGATAGAGGGTACGGAT和R:TGGTATGGGTCCA AATTGCT(SEQID NO:9-10)

引物⑥

重复碱基：(CA)6

引物序列(5’-3’)：F:AATTCACAAACAATATGACACCAA和R:CTGATGACC CTGAGGCATTT(SEQ ID NO:11-12)

优选地，步骤8)当杂交后代材料的扩增谱带中同时出现父母本特异条带或者父本特异条带时，即可判定其为真杂种。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1利用幼胚拯救技术获得芙蓉菊与甘菊的属间杂种后代

利用幼胚拯救技术获得芙蓉菊和甘菊的属间杂种后代，所述方法包括以下步骤：

1)亲本准备：母本选用我国特产的芙蓉菊属二倍体耐盐野生种芙蓉菊(Cr.chinense)，父本选用菊属二倍体野生种甘菊(C.lavandulifolium)，父母本均为公知公用品种。对芙蓉菊进行花期调整，八月份开始8小时的短日照养护，使其十月中旬达到盛花期。

2)远缘杂交：在国家花卉工程中心小汤山苗圃，将芙蓉菊与甘菊在温室内进行杂交。在开花前2天对母本进行人工去雄并套袋隔离，取父本新鲜花粉授粉并套袋；于上午10时或下午4时授粉，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。

3)胚珠剥取：取步骤2)杂交授粉后得到的10-18天不同发育时期的头状花序，放入冰箱短期保存，两天内接种完毕。在超净工作台上剥取雌性小花，以70％酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再以12％H₂O₂水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次；在灭菌纸上用刀切开雌性小花子房，然后剥掉子房壁，取出胚珠。

4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；设置5种不同激素配比的MS 培养基，6-BA与NAA(北京拜尔迪生物技术有限公司)浓度为变量(mg/L)，分别为培养基A：1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.6；培养基B：2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，pH5.6；培养基C：2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.4；培养基D： 2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA，pH5.7；培养基E：1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA， pH5.8。每板约接种9个胚珠。表1结果表明，培养授粉后14天的胚珠，其出愈率最高，高达65％，但授粉后16天的胚珠其发芽率最高，高达19.30％；在MS培养基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA(pH5.8)的E型培养基获得最高的出愈率和发芽率，出愈率高达84.26％，发芽率高达19.44％，远远高于其他菊花胚拯救结果。本实施例采用胚拯救技术一共分离培养了251个胚珠，得到179个愈伤组织，最终长出幼苗32株。

表1不同胚龄的胚珠及不同激素类型的培养基对幼胚离体培养的影响

5)生根培养：4周后将得到的萌发幼胚转入生根培养基，1/2MS+0.1mg/L NAA，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；观察幼胚出现丛生芽的情况，直至发育成杂种幼苗。

6)杂种F1代植株获得：待小苗根长至1cm以上，将得到的杂种F1代植株进行2-3 天的开瓶炼苗，通过逐渐降低相对湿度和增强光照使小苗适应大田的自养生长和有菌环境。取出植株并洗净附着在其表面的培养基，移植到基质为粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1 的穴盘中。一个月后上盆常规管理。最终获得28株芙蓉菊和甘菊的杂种后代大苗。实施例2利用形态学观察和SSR分析鉴定芙蓉菊和甘菊属间杂种的真实性

利用形态学观察和SSR分析鉴定实施例1中获得的芙蓉菊和甘菊属间杂种的真实性，所述方法包括以下步骤：

1、利用形态学鉴定杂种真实性

1)将杂交父母本及杂交后代于5月份露地定植，进行常规养护管理。秋季，对父母本及后代材料进行形态学观察和统计，包括测定株高、冠幅、叶部性状和花部性状。

2)每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长、叶宽的测定，并分别测定叶柄的长度；每株随机选择三个完全盛开的花序，测量其花序的长宽，并记录每个花序的舌状花数和管状花数；其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长及花序长介于父母本之间的确定为真杂种。

图1、表2对杂交父母本及后代的株型观察统计表明，杂种后代的株型、冠幅等均介于双亲之间，具有父母本的综合性状；图2、表2对杂交父母本及后代叶部性状的观察统计表明：杂种后代叶阔卵形、羽状分裂、叶淡绿色更接近于父本甘菊，但边缘为钝尖齿；叶厚纸质、毛稀疏、叶柄长介于双亲之间，具有父母本的综合性状；图3、表2对杂交父母本及后代花部性状的观察统计表明：杂种的花序直径、花心直径介于父母本之间，管状花数量与父母本相差不大。父本甘菊具舌状花，母本芙蓉菊无舌状花，而杂种后代具舌状花，且舌状花数量接近甘菊。

表2芙蓉菊、甘菊及芙蓉菊×甘菊杂种后代的株型、叶部、花部形态特征

2、利用SSR技术鉴定杂种真实性

1)将32株杂种后代及亲本小苗的幼嫩新叶，置于硅胶中，-20℃保存，然后提取DNA，对测试的亲本和子代均采用CTAB法提取总DNA。将提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取质量，后全部稀释至50ng/uL，将DNA样品置于-20℃保存备用。

2)引物合成由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。从杂交组合中选取6个子代和两个亲本，共8个样品，利用12对SSR引物(表3)对杂交亲本及子代进行扩增，进行引物筛选，最后获得6对多态性好、稳定性高的引物，包括SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4、SEQ IDNO:5-6、SEQ ID NO:7-8、SEQ ID NO:9-10和SEQ ID NO:11-12 所示引物，分别对应于表3中引物编号2、5、7、13、20和gi298301343。

表3 12对SSR引物信息

3)利用筛选的SSR引物对亲本及32个杂种后代进行扩增，后续荧光毛细管电泳。交由北京睿博兴科生物技术有限公司，利用ABI377(Applied Biosystems)全自动分析仪对扩增产物进行检测与分析。通过GeneMaxker2.2.0软件对数据进行统计。当后代材料的扩增谱带中同时出现父母本特异条带或者父本特异条带时，即可判定其为真杂种。通过对图4及其他扩增图谱的观察，最后我们可以判定28个杂交后代为真杂种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

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序列表

<110> 北京林业大学

<120> 芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法

<130> KHP201112540.6

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctccgctcaa tttccatgtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catagcgcct caacggtaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacacaggat gagttggcct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggtatcac gtgcgatgag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagcaagg aaaggcggta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcatggtcac ggtcacagtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggttcctat ttggttccca 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgaaaacaca cactaaaaac aca 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggcgataga gggtacggat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggtatgggt ccaaattgct 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aattcacaaa caatatgaca ccaa 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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Claims (10)

1.芙蓉菊与甘菊的属间远缘杂种创制方法，其特征在于，以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属甘菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以芙蓉菊为母本，甘菊为父本进行远缘杂交；

优选地，芙蓉菊、甘菊均为二倍体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：

1)亲本准备：培养两亲本使花期相遇；

2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉授粉并套袋；

3)胚珠剥取：取杂交授粉后10-18天的头状花序，取出胚珠；

4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；

5)杂种F1代的获得：待幼苗根长至1cm以上，移植到基质中进行炼苗，之后上盆常规管理；

6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种F1代的表型观察，并结合SSR分析，从F1代植株中筛选出真杂种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对雌花进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠；

优选地，消毒灭菌的方法包括：用70％-75％酒精对雌花表面消毒30-45秒，无菌水冲洗4次，再用8％-13％H₂O₂水溶液灭菌10-15分钟，无菌水冲洗5次；

优选地，取杂交授粉后16天的头状花序。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述诱导培养基含有6-BA和NAA；和/或

所述生根培养基含有NAA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为含有1.0-2.0mg/L 6-BA和0.2-1.0mg/L NAA的MS培养基，pH5.6-5.8；

优选地，所述诱导培养基为含有1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA，pH5.8的MS培养基。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA，pH5.8。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中进行诱导培养和生根培养的条件为：温度20-25℃，每日光照16h，光照强度1600-2000lx；诱导培养4-6周后转为生根培养；和/或

步骤5)中所述基质由蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合而成；和/或

炼苗的条件为：温度27-30℃，相对湿度60-70％，培养30-45天。

9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述表型选自株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长、花序长、舌状花数和管状花数中的至少一种。

10.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中进行分子生物学检测所用引物选自SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-4、SEQ ID NO:5-6、SEQ ID NO:7-8、SEQ IDNO:9-10和SEQ ID NO:11-12所示引物中的至少一对。

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