CN113951131B - 一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法 - Google Patents

一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，本发明首先利用保持系和不育系同步进行改良，从根本上缩短了育种年限；其次以同组合内后代不育株为对照通过全基因组比对同组合内后代可育的保持株，并快速剔除携带微效恢复基因保持株，从而可将具有有利性状的常规稻、恢复系或地方品种作为供体父本，解决现有保持系遗传基础狭窄的问题；再者先用大群体的标记筛选打断不良等位基因的连锁累赘，再通过全基因组SNP标记基因型的聚类分析，挑选遗传背景接近的不育株和保持株进行成对杂交，从而解决优良性状聚合难的问题，在杂交水稻的育种中具有重要的推广应用价值。

Description

一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不 育系的方法
技术领域
本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法。
背景技术
杂交水稻育种技术是保障我国粮食安全的一项重要技术。多年来，中国三系杂交水稻因其高产稳产、制种生产相对安全，在中国及全世界得到广泛应用。然而，由于三系水稻不育系核质互作不育遗传特性的限制，选育三系不育系需要先进行保持系的改良，而且选育新质源的保持系也比较困难，传统的保持系培育方法多数是通过保持系间的杂交实现的，这就限制了新的优良基因及新种质资源在三系保持系和不育系上的应用，制约了三系杂交稻的进一步发展，导致市场上严重缺乏优质多抗的三系杂交稻的不育系及组合。
当前，现有的三系水稻不育系选育方法主要存在以下几个问题：（1）需要先改良保持系之后再对不育系进行核置换。传统的表型选择育种方法，至少需要14个育种季，并且需要依赖大量的杂交来测试保持系的不育保持能力，转育不育系的每个环节都需要进行花粉镜检筛选和套袋处理，需要投入大量的精力和资金。而一般的标记辅助回交转育方法，也是采用先进行保持系的改良再回交转育不育系的思路，虽然在一定程度上缩短了育种时间，但也至少需要10个育种季，并且一样需要在不育系转育环节进行大量的花粉镜检操作，而且只是减少了部分人力劳动，资金的投入可能更多。（2）受核质互作不育遗传特性的影响，要使不育系的雄性不育性状得到保持，保障新保持系不被恢复基因所干扰，保持系的选育要求非常严格，保持系的改良一般是保持系和保持系杂交，遗传距离和血缘较近。（3）水稻基因组中存在大量微效恢复基因，应用优质抗病恢复系、常规稻或地方品种对保持系进行改良时，杂交选育过程中的这些微效恢复基因难以剔除干净，选育成功率低。因此，要克服三系水稻不育系在选育过程中存在的上述问题，必须将常规育种技术与分子育种技术相结合。
目前，水稻基因组测序技术的快速发展，大量研究成果的涌现，以及测序费用的快速下降，给育种家利用基因组分析技术、分子标记技术来快速选育聚合多个优异性状的三系水稻保持系和不育系提供了契机。因此，有必要开发一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，以解决现有三系水稻不育系选育方法年限长、遗传基础狭窄、优良性状聚合难等问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，解决了现有三系水稻不育系选育方法年限长、遗传基础狭窄、优良性状聚合难的问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，该方法包括以下步骤：
S1、以待改良的水稻保持系B为母本，以携带改良目标性状基因的水稻品种为父本，通过常规有性杂交后获得F1代种子；
S2、将F1代种子分成两份，一份种植到田间，一份保存好留待下一季使用，以待改良的水稻保持系B为母本，选择田间性状表现较好，杂种优势强的F1代组合为父本，通过常规有性杂交获得BC1F1种子；
S3、将步骤S2中用作杂交的F1代组合的保存备份种子种植到田间，然后以待改良的水稻保持系B的配套不育系A为母本，以所述F1代组合为父本，通过常规有性杂交获得AF1代种子；
S4、将步骤S2中获得的BC1F1种子种植到田间，成熟后混收，获得BC1F2种子；
S5、将步骤S3获得的AF1种子种植到田间，挑选可育的、农艺性状优良的单株，混收获得AF2种子；
S6、将步骤S4获得的BC1F2种子浸种催芽，种植8千-1万株在秧盘内，单苗种植，用营养液或育秧基质培养，或摆放在秧田中培养，待秧苗生长出3片叶子后取样抽提DNA，用主效恢复基因Rf03、Rf04以及目标性状相关基因的连锁标记或基因标记对所有单株进行检测，筛选出携带Rf03、Rf04无恢基因型，但携带目标性状相关基因等位基因型的单株，并种植到大田，成熟后挑选农艺性状优良的单株，分单株收获BC1F3种子，同时编号取叶片抽提DNA进行全基因组重测序；
S7、将S5的AF2种子种植到田间，种植量为3千-4千株，单苗种植，抽穗后10天观察育性，挑选出不育、分蘖多的单株，编号取叶片抽提DNA进行目标性状相关基因的连锁标记或基因标记筛选，保留携带纯合等位基因型的单株进行全基因组重测序，同时割去已抽出的穗子，挖出稻蔸培养备用；
S8、将中选BC1F3单株按步骤S6的编号顺序种植成小区，并将步骤S6获得的单株测序结果与步骤S7获得的不育株稻蔸测序结果进行分析，筛选出与不同不育株遗传距离最接近的BC1F3单株，然后在成熟期根据综合性状表现，选择综合性状优良的单株留种，获得BC1F4种子，同时割去成熟分蘖，挖出稻蔸培养备用；
S9、以步骤S7获得的不育株稻蔸为母本，并以根据步骤S8中的基因组分析结果筛选出的与其遗传距离最接近的BC1F3单株为父本，通过常规有性杂交获得A2F1种子；
S10、将步骤S9中同一杂交组合的A2F1种植成小区，抽穗其套袋，抽穗后10天观察育性，剔除不育不彻底组合对应的BC1F3单株，其余组合的A2F1小区割蔸，留侧生分蘖萌发新的穗子，与对应的BC1F4小区大量杂交，获得A3F1种子，所述A3F1种子即为培育得到的保持系，同时从对应的BC1F4小区中选综合性状表现优良的单株留种，并种植成BC1F5小区，所得BC1F5即为培育所得的不育系。
优选地，步骤S1中所述携带改良目标性状基因的水稻品种包括携带改良目标性状基因的优良恢复系或常规稻或地方品种。
为解决现有三系水稻不育系选育方法年限长、遗传基础狭窄、优良性状聚合难等问题，本发明利用水稻基因组分析技术开发了一种快速选育三系水稻保持系和不育系的方法（具体的技术流程如图1所示），对杂交水稻的育种方法和手段进行了改进，首先，利用保持系和不育系同步进行改良（具体见步骤S3），只需要7个育种季便可选育得到三系水稻保持系和不育系，从而从根本上缩短了育种年限，解决了现有三系水稻不育系选育方法年限长的问题；其次，其次以同组合内后代不育株为对照通过全基因组比对同组合内后代可育的保持株，并快速剔除携带微效恢复基因保持株（具体见步骤S8），从而可将具有有利性状的常规稻、恢复系或地方品种作为供体父本，解决现有保持系遗传基础狭窄的问题；再者，先用大群体（8千-1万单株）的标记筛选打断不良等位基因的连锁累赘（具体见步骤S6、S7），再通过全基因组SNP标记基因型的聚类分析（具体见步骤S8），挑选遗传背景接近的不育株和保持株进行成对杂交（具体见步骤S9），从而解决优良性状聚合难的问题。
优选地，步骤S1中所述改良目标性状是母本B所没有的待改良的优良性状。
进一步地，步骤S1中所述携带改良目标性状基因的水稻品种包括黄广油占。当然，其他携带改良目标性状基因的水稻品种同样适用于本发明。
优选地，步骤S1中所述水稻保持系B包括三系水稻保持系广8B。当然，其他带有明显缺陷的待改良优质稻同样适用于本发明。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，首先利用保持系和不育系同步进行改良，从根本上缩短了育种年限，解决了现有三系水稻不育系选育方法年限长的问题；其次以同组合内后代不育株为对照通过全基因组比对同组合内后代可育的保持株，并快速剔除携带微效恢复基因保持株，从而可将具有有利性状的常规稻、恢复系或地方品种作为供体父本，解决现有保持系遗传基础狭窄的问题；再者先用大群体的标记筛选打断不良等位基因的连锁累赘，再通过全基因组SNP标记基因型的聚类分析，挑选遗传背景接近的不育株和保持株进行成对杂交，从而解决优良性状聚合难的问题。可见，采用本发明方法进行杂交水稻的育种工作，可以有效解决现有三系水稻不育系选育方法年限长、遗传基础狭窄、优良性状聚合难的问题，在杂交水稻的育种中具有重要的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明快速选育三系水稻保持系和不育系的技术流程图；
图2为以黄广油占为供体快速选育三系水稻保持系和不育系的技术流程图；
图3为新广B与广8B小区成熟期的对照图；
图4为新广A与恢复系华占的花粉育性镜检对照图；
图5为新广A套袋穗子与不套袋穗子的比较（方框内为套袋穗子）。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1 一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法
广8A为本单位（广东省农业科学院水稻研究所）育成的优良不育系（对应的保持系为广8B），该不育系具有增城丝苗型稻米的品质，配合力强，综合农艺性状优良。2010年7月通过广东省技术鉴定，目前已经育成通过省级审定的杂交组合有34个。以广8A配组选育的广8优169、广8优2168、广8优金占和广8优165等三系杂交稻组合，多次被推选为广东省主导品种，在省内大面积推广种植。广8A不育系较大的缺陷是易感稻瘟病，后期叶片早衰，因此需要改良其稻瘟病抗性，并提高后期叶片的持绿时间。黄广油占是高抗稻瘟病的高产常规品种（携带抗稻瘟病基因Pi2），丰产性好，熟色好，适应性广，也多次被推选为广东省主导品种。该品种同时也是配合力强的优良恢复系和亲本材料，以它为父本组配杂交组合通过广东省审定的品种有2个，以它为亲本育成通过审定的常规稻品种有24个。
本发明以黄广油占为供体，改良广8A的稻瘟病抗性和叶片持绿时间，其技术流程如图2所示，具体方法包括以下步骤：
2017年晚季（第一季）：
（1）以待改良的三系水稻保持系广8B为母本，以携带抗稻瘟病基因Pi2的常规稻黄广油占为父本，进行常规有性杂交后，获得F1代种子。
2018年早季（第二季）：
（2）将F1代种子分成两份，一份种植到田间，一份保存好留待下一季使用。以待改良的水稻保持系广8 B为母本，以F1代杂交组合为父本，进行常规有性杂交，获得BC1F1种子。
2018年晚季（第三季）：
（3）将步骤（2）中用作杂交的F1代组合保存备份的种子种植到田间，以待改良的水稻保持系广8 B的配套不育系广8 A为母本，以此F1代杂交组合为父本，进行常规有性杂交，获得AF1代种子。
（4）将步骤（2）中获得的BC1F1种子种植到田间，成熟后混收，获得BC1F2种子。
2019早季（第四季）：
（5）将步骤（3）获得的AF1种子种植到田间，挑选可育的、农艺性状优良的单株，混收后获得AF2种子。
（6）将步骤（4）获得的BC1F2种子浸种催芽，种植约8000株在秧盘内，单苗种植，用Yoshida水稻营养液（北京华越洋生物科技有限公司，浓度463.9mg/L，PH值5.0）培养。待秧苗生长出3片叶子后取样抽提DNA，用主效恢复基因Rf03、Rf04的连锁标记ZRf03、ZRf04，以及抗稻瘟病基因Pi2的基因标记W-Pi2对所有单株进行检测，基因检测方法参照文献“杨义强,朱林峰,李晓芳,等.抗稻瘟病基因Pi2的基因特异性KASP标记开发与应用[J/OL].植物遗传资源学报:1-11[2021-09-23].https://doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20210327001.”，筛选出携带Rf03、Rf04无恢基因型，但携带Pi2抗性等位基因型的单株，并种植到大田。成熟后挑选农艺性状优良的单株，分单株收获后得到BC1F3种子，同时将中选的50个单株编号（符合目标的单株有多少编多少，一般不会很多，50-100个之间）取叶片抽提DNA进行全基因组重测序。
2019晚季（第五季）：
（7）将步骤（5）的AF2种子种植到田间，种植3000株左右，单苗种植，抽穗后10天观察育性，挑选出不育、分蘖多的单株30个（不育的数量不会多，剔除病株、长势差的，有多少编多少），编号取叶片抽提DNA进行抗稻瘟病基因Pi2的基因标记W-Pi2筛选【W-Pi2基因筛选方法同步骤（6）】，保留携带纯合抗病等位基因型的单株，并进行全基因组重测序，同时割去已抽出的穗子，挖出稻蔸转移到塑料盆培养备用。
（8）将中选的BC1F3单株按步骤（6）的编号顺序种植成5行每行10株的小区。将步骤（6）获得的单株测序结果与步骤（7）获得的不育株稻蔸测序结果进行聚类分析，筛选出与不同不育株遗传距离最接近的BC1F3单株。成熟期根据小区株型、有效穗数、穗长、结实率、粒型等综合性状表现，选择综合性状优良的单株留种，获得BC1F4种子，同时割去成熟分蘖，挖出稻蔸移到塑料盆培养备用。
（9）以步骤（7）获得的不育株稻蔸新抽出的稻穗为母本，并根据步骤（8）的基因组分析结果筛选出的与其遗传距离最接近的BC1F3单株，以该单株在步骤（8）的稻蔸中新抽出的稻穗为父本，进行常规有性杂交，获得A2F1种子。
2020早季（第六季）：
（10）将步骤（9）中同一杂交组合的A2F1种植成小区，抽穗期套袋，抽穗后10天观察育性。种植步骤（8）中选择的BC1F3单株种子成为BC1F4代小区。根据A2F1的育性考察结果，如果步骤（8）中中选的某一单株，与步骤8中的某一不育株杂交，后代A2F1不育不彻底，则剔除该单株。如果步骤（8）中中选的某一单株，与步骤8中的某一不育株杂交，后代A2F1不育彻底，则从该单株种子种植成的小区中选单株再跟A2F1大量杂交，获得A3F1种子。同时从BC1F4小区中选综合性状表现优良单株留种。
2020晚季（第七季）：
（11）将步骤（10）中的A3F1杂交组合和对应BC1F4单株（步骤（10）留种的单株）进行种植成小区，其中，抽穗期A3F1小区套袋，抽穗后10天观察育性，发现所有A3F1不育彻底，将BC1F4单株种植成BC1F5小区，发现BC1F5小区整齐一致，已可以定型。选择代表型BC1F5小区，命名为新广B（保持系），对应的不育A3F1小区命名为新广A（不育系），大量杂交繁育不育系种子，收获代表型小区种子进行下一季扩繁。
对新广B与广8B进行DUS测试。由图3可以看出，新广B的叶色比广8B更绿一些，叶片衰老速度更慢一些。在吕田（广州市从化区）的稻瘟病鉴定圃的鉴定结果也表明新广B的稻瘟病抗性等级为抗。新广A的花粉镜检结果100%不育（图4），田间套袋结果也表明自交完全不结实，异交结实率高（图5）。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以待改良的水稻保持系B为母本，以携带改良目标性状基因的水稻品种为父本，通过常规有性杂交后获得F1代种子，所述携带改良目标性状基因的水稻品种为携带改良目标性状基因的优良恢复系或常规稻或地方品种；
S2、将F1代种子分成两份，一份种植到田间，一份保存好留待下一季使用，以待改良的水稻保持系B为母本，选择田间性状表现较好，杂种优势强的F1代组合为父本，通过常规有性杂交获得BC1F1种子；
S3、将步骤S2中用作杂交的F1代组合的保存备份种子种植到田间，然后以待改良的水稻保持系B的配套不育系A为母本，以所述F1代组合为父本，通过常规有性杂交获得AF1代种子；
S4、将步骤S2中获得的BC1F1种子种植到田间，成熟后混收，获得BC1F2种子；
S5、将步骤S3获得的AF1种子种植到田间，挑选可育的、农艺性状优良的单株，混收获得AF2种子；
S6、将步骤S4获得的BC1F2种子浸种催芽，种植8千-1万株在秧盘内，单苗种植，用营养液或育秧基质培养，或摆放在秧田中培养，待秧苗生长出3片叶子后取样抽提DNA，用主效恢复基因Rf03、Rf04以及目标性状相关基因的连锁标记或基因标记对所有单株进行检测，筛选出携带Rf03、Rf04无恢基因型，但携带目标性状相关基因等位基因型的单株，并种植到大田，成熟后挑选农艺性状优良的单株，分单株收获BC1F3种子，同时编号取叶片抽提DNA进行全基因组重测序；
S7、将S5的AF2种子种植到田间，种植量为3千-4千株，单苗种植，抽穗后10天观察育性，挑选出不育、分蘖多的单株，编号取叶片抽提DNA进行目标性状相关基因的连锁标记或基因标记筛选，保留携带纯合等位基因型的单株进行全基因组重测序，同时割去已抽出的穗子，挖出稻蔸培养备用；
S8、将中选BC1F3单株按步骤S6的编号顺序种植成小区，并将步骤S6获得的单株测序结果与步骤S7获得的不育株稻蔸测序结果进行分析，筛选出与不同不育株遗传距离最接近的BC1F3单株，然后在成熟期根据综合性状表现，选择综合性状优良的单株留种，获得BC1F4种子，同时割去成熟分蘖，挖出稻蔸培养备用；
S9、以步骤S7获得的不育株稻蔸为母本，并以根据步骤S8中的基因组分析结果筛选出的与其遗传距离最接近的BC1F3单株为父本，通过常规有性杂交获得A2F1种子；
S10、将步骤S9中同一杂交组合的A2F1种植成小区，抽穗其套袋，抽穗后10天观察育性，剔除不育不彻底组合对应的BC1F3单株，其余组合的A2F1小区割蔸，留侧生分蘖萌发新的穗子，与对应的BC1F4小区大量杂交，获得A3F1种子，所述A3F1种子即为培育得到的保持系，同时从对应的BC1F4小区中选综合性状表现优良的单株留种，并种植成BC1F5小区，所得BC1F5即为培育所得的不育系。
2.根据权利要求1所述的一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，其特征在于，步骤S1中所述改良目标性状是母本B所没有的待改良的优良性状。
3.根据权利要求1所述的一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，其特征在于，步骤S1中所述携带改良目标性状基因的水稻品种包括黄广油占。
4.根据权利要求1所述的一种利用水稻基因组分析技术快速选育三系水稻保持系和不育系的方法，其特征在于，步骤S1中所述水稻保持系B包括三系水稻保持系广8B。
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