CN109006456B - 一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法，利用分子标记技术对甜椒核雄性不育两用系AB91的不育基因(msms)和可育基因(MSMS)进行标记，在甜椒核雄性不育两用系转育的F2代育性发生分离时，在苗期利用分子标记辅助选择对不育株和可育株进行鉴定，淘汰基因型为MSMS的可育株，筛选出基因型为MSms的可育株，直接用于不育系的转育。本发明在苗期利用分子标记辅助选择，简化转育程序，提高育种效率，建立更加简便的甜椒核雄性不育转育技术，减少大量的繁琐工作，节省人力、物力、财力，降低了育种成本。

Description

一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法
技术领域
本发明属于蔬菜育种技术领域，涉及一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法。
背景技术
甜椒是我国栽培面积较大的主要蔬菜之一，甜椒杂种优势显著，因此培育杂交种是提高产量、改良品质、增强抗逆性的一个有效途径。目前利用甜椒雄性不育系培育杂交种，可解决利用自交系培育甜椒杂交种，蕾期人工去雄操作难度大，用工多，成本高，纯度难以保证等问题，可大大降低了杂交制种难度和成本，是目前甜椒杂优利用最为先进、经济、有效的途径。也是倍受国内外蔬菜育种学家重视的方法。
甜椒雄性不育遗传类型主要有细胞核雄性不育型(GMS)和核质互作雄性不育型(CMS)两种类型。甜椒核质互作型不育系只有实现不育系、保持系、恢复系“三系”配套才能培育出杂交种，在生产上应用。由于甜椒缺乏恢复源，选育出优良恢复系培育成杂交种难度较大，是目前限制核质互作型不育系在杂种优势利用中应用的主要障碍。且“三系”自身的选育、繁殖保存程序也繁琐。利用甜椒核雄性不育两用系培育杂交种，其核雄性不育两用系一系两用即是不育系又是保持系，而且同时育成，从而简化育种程序和繁殖保存程序，且恢复源广泛，组配自由度大,易选育出优良恢复系，可较快地培育出杂种优势显著的杂交种。
利用甜椒核雄性不育两用系培育杂交种，选育农艺性状不同的雄性不育两用系，是培育不同类型、多样化杂交种的关键技术和物质基础。甜椒核雄性不育两用系的选育一般是以甜椒核雄性不育系为母本，以符合育种目标的优良甜椒自交系为父本，通过杂交、自交、测交、姊妹交的方法，选育新的农艺性状优良的甜椒核雄性不育两用系。在选育过程中，F2代的育性开始分离，其群体不育株(msms)占25％，可育株(有两种基因型MSMS和MSms)占75％。选择可育株与不育株杂交，其后代育性表现有两种类型，即基因型为MSMS的可育株与不育株杂交，其后代育性表现为全可育，不能选育出新的甜椒核雄性不育两用系；只有选择基因型为MSms的可育株与不育株杂交，其后代育性发生分离且可育株与不育株分离比例符合1：1的群体，才有可能选育出新的甜椒核雄性不育两用系。但F2代可育株从表型性状无法区别MSMS和MSms这两种基因型，只能选择符合育种目标性状的可育株单株分别与不育株成对测交，这样需要配置大量的测交组合，工作量大，第二年再分别种植每一对测交组合,花期根据育性表现，淘汰全可育测交组合(即基因型为MSMS的可育株与不育株杂交的组合)，选择育性发生分离且可育株与不育株分离比例符合1：1的测交组合(即基因型为MSms的可育株与不育株杂交组合)进行姊妹交，选育新的甜椒核雄性不育两用系。因此，在F2代和F3代增加了33％工作量，浪费了大量的人力、物力、财力和精力。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法，利用分子标记技术对甜椒核雄性不育两用系的不育基因和可育基因进行标记，简化转育程序，提高育种效率。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法，包括以下操作：
1)以甜椒核雄性不育两用系AB91群体内的不育株为母本，其雄性不育性由一对隐性核基因msms控制；以具有显性基因MSMS的甜椒自交系为父本，进行杂交后获得杂交种F1代；
2)种植杂交种F1代，F1代表现全可育，可育株基因型为MSms，可育株自交留种，得到自交种F2代；
3)将自交种F2代播种在育苗穴盘中，F2代育性开始分离，其群体内有不育株和可育株，可育株有两种基因型MSMS和MSms；
4)在F2代幼苗长到4-5片叶大小时，每个单株分别编号，分别取嫩叶提取DNA并编号；
以P1、P2作为引物对提取的甜椒幼苗叶片DNA进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并银染；
其中，前端引物P1为：TAAAACACGGGATGCAGCTACTA；
后端引物P2为：AAGTTCCTTTTCGTGTAACGACC；
电泳结果中扩增出片段大小为75bp特异性条带的单株为不育株，其基因型为msms；扩增出片段大小为150bp特异性条带的单株为纯显性可育株，基因型为MSMS；扩增出片段大小分别为75bp和150bp特异性条带的单株为杂合基因可育株，基因型为MSms；
在苗期淘汰纯显性可育株，保留不育株和杂合基因可育株；
5)将保留的不育株和杂合基因可育株分别定植在网纱棚内，开花期淘汰农艺性状不良的不育株和可育株，分别选择符合育种目标性状的不育株与可育株成对测交，从不育株上收获测交组合种子，不同组合分别编号；
6)在网纱棚内分别种植不同测交组合，其育性表现分离，可育株与不育株分离比例符合1：1；淘汰农艺性状不良的测交组合，在符合育种目标性状的测交组合内，选择符合育种目标性状的不育株与可育株成对姊妹交；
采种时，根据父本、母本性状淘农艺性状不良及不符合育种目标性状的姊妹交组合，选择符合育种目标性状的姊妹交组合留种、分别编号；
7)将符合育种目标性状的姊妹交组合分别种植在网纱棚内，在这些姊妹交组合内，继续进行姊妹交，在保持后代育性分离比例均符合1：1的同时，对农艺性状进行淘汰、选择，连续3代姊妹交，得到符合育种目标性状的新的甜椒核雄性不育两用系。
所述的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应总体系为20μL:DNA模板2μl、0.1μM的正反引物各1μl、10mmol/L dNTPs 1.6μl、10×PCRBuffer 2μl、5UTaq酶0.2μL，不足部分用ddH2O补充；
PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保存。
所述的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，所述符合育种目标性状包括以下性状中的一种或几种：果实灯笼形、果大肉厚、抗病、座果率高。
所述的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，所述的淘汰农艺性状不良是淘汰熟性、果实性状、抗逆性、抗病性表现不良的植株。
引物对与P1、P2作为与核雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记的应用；
所述的引物对与P1、P2的核苷酸序列分别为：
P1：TAAAACACGGGATGCAGCTACTA；
P2：AAGTTCCTTTTCGTGTAACGACC。
进一步的，在甜椒核雄性不育两用系的选育过程中引物对P1、P2引物作为分子标记进行辅助育种选育的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
现有技术中可育株从表型性状无法区别MSMS和MSms这两种基因型，其中基因型MSMS可育株占1/3，基因型MSms可育株占2/3)，只能选择符合育种目标性状的可育株单株分别与不育株成对测交，这样在F2代需要配置大量的测交组合(其中1/3测交组合后代全可育，将在F3代被淘汰)，工作量大。在F3代播种、育苗、种植的育种田面积、定植用工、田间管理等都增加了1/3工作量，浪费了1/3人力、物力、财力和精力。
本发明利用分子标记技术对甜椒核雄性不育两用系AB91的不育基因(msms)和可育基因(MSMS)进行标记，在甜椒核雄性不育两用系转育的F2代育性发生分离时，在苗期利用分子标记辅助选择对不育株和可育株进行鉴定，淘汰基因型为MSMS的可育株，筛选出基因型为MSms的可育株，直接用于不育系的转育。这样在F2代定植用工、种植的育种田面积减少1/3，配置的测交组合及测交组合的采种减少1/3；在F3代播种、育苗、定植、种植的育种田面积、用工等都减少了1/3工作量，减少了1/3人力、物力、财力和精力。本发明在苗期利用分子标记辅助选择，简化转育程序，提高育种效率，建立更加简便的甜椒核雄性不育转育技术，减少大量的繁琐工作，节省人力、物力、财力，降低了育种成本。
附图说明
图1为F2代不同基因型电泳检测结果，其中，纯显性可育株(MSMS)在150bp处扩增出特异性条带；纯隐性不育株(msms)在75bp处扩增出特异性条带；杂合型可育株(MSms)在75bp和150bp处均扩增出特异性条带.
图2为F2代49个单株电泳检测结果，其中，10个植株扩增出片段大小为75bp的特异性条带，为纯隐性不育株；15个植株扩增出片段大小为150bp的特异性条带，为纯显性可育株；24个植株扩增出两个特异性条带，分别为75bp和150bp，为杂合型可育株。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
甜椒雄性不育系AB91是农艺性状稳定一致的甜椒核雄性不育两用系，其不育株率稳定在50％，群体分别有50％的不育株(msms)和50％的可育株(Msms)，且不育性状由一对隐性核不育基因控制并可以稳定遗传(相当于近等基因系)。
SSR是一种由2-6个核苷酸作为基本重复单元(基元)串联组成的重复序列，重复序列对整个有机体的进化、遗传信息的传递和变异的发生等过程都有着重要的影响。在还不了解该核不育分子构成的情况下，本发明利用SSR通过以下操作对该性状进行标记，初步将该不育基因定位：
1.建立纯显性可育株(MsMs)基因池、纯隐性不育株(msms)基因池和杂合体可育株(Msms)基因池。
甜椒核雄性不育两用系AB91中的可育株(为杂合体，基因型Msms)自交，F2代得到不育植株(msms)和可育植株(两种基因型Msms、MsMs)共251个单株，分别编号，分别提取DNA，并检测DNA质量和浓度。为区别可育植株(两种基因型Msms、MsMs)，将F2代可育植株(Msms、MsMs)分别单株自交留种，根据F3代育性鉴定结果，筛选出纯显性可育株(MsMs)、杂合体可育株(Msms)。
利用F2代分别提取的251个单株的DNA，根据F3代育性鉴定结果，利用筛选出纯显性可育植株(MsMs)、杂合体可育植株(Msms)和隐性不育植株(msms)，建立纯显性可育植株(MsMs)基因池、纯隐性不育植株(msms)基因池和杂合体可育植株(Msms)基因池。每个基因池由10个单株构成。
2.甜椒核不育基因SSR分子标记的筛选
利用设计的SSR引物对所构建的杂合基因池、纯显性基因池和纯隐性基因池进行分子标记筛选，P1、P2引物在三个基因池中具有多态性，其在纯显性基因池中扩增出150bp的特异性条带，在纯隐性基因池中扩增出75bp的特异性条带；在杂合基因池中扩增出75bp和150bp两条特异性条带。证明筛选P1P2引物是与雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记。利用筛选的P1P2引物对F2代进行验证，其结果与田间育性鉴定结果吻合一致。证明筛选P1P2引物是与雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记。
结果表明：在不育系的选育过程中利用筛选，P1P2引物是与雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记；在不育系的选育过程中P1P2引物能够作为分子标记进行辅助育种选育。
本发明提出的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，包括以下操作：
1)以甜椒核雄性不育两用系AB91群体内的不育株为母本，其雄性不育性由一对隐性核基因msms控制；以具有显性基因MSMS的甜椒自交系为父本，进行杂交后获得杂交种F1代；
2)种植杂交种F1代，F1代表现全可育，可育株基因型为MSms，可育株自交留种，得到自交种F2代；
3)将自交种F2代播种在育苗穴盘中，F2代育性开始分离，其群体内有不育株和可育株，可育株有两种基因型MSMS和MSms；
4)在F2代幼苗长到4-5片叶大小时，每个单株分别编号，分别取嫩叶提取DNA并编号；
以P1、P2作为引物对提取的甜椒幼苗叶片DNA进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并银染；
其中，前端引物P1为：TAAAACACGGGATGCAGCTACTA；
后端引物P2为：AAGTTCCTTTTCGTGTAACGACC；
电泳结果中扩增出片段大小为75bp特异性条带的单株为不育株，其基因型为msms；扩增出片段大小为150bp特异性条带的单株为纯显性可育株，基因型为MSMS；扩增出片段大小分别为75bp和150bp特异性条带的单株为杂合基因可育株，基因型为MSms(电泳检测结果如图1所示)；
在苗期淘汰纯显性可育株，保留不育株和杂合基因可育株；
5)将保留的不育株和杂合基因可育株分别定植在网纱棚内，开花期淘汰农艺性状不良的不育株和可育株，分别选择符合育种目标性状的不育株与可育株成对测交，从不育株上收获测交组合种子，不同组合分别编号；
6)在网纱棚内分别种植不同测交组合，其育性表现分离，可育株与不育株分离比例符合1：1；淘汰农艺性状不良的测交组合，在符合育种目标性状的测交组合内，选择符合育种目标性状的不育株与可育株成对姊妹交；
采种时，根据父本、母本性状淘农艺性状不良及不符合育种目标性状的姊妹交组合，选择符合育种目标性状的姊妹交组合留种、分别编号；
7)将符合育种目标性状的姊妹交组合分别种植在网纱棚内，在这些姊妹交组合内，继续进行姊妹交，在保持后代育性分离比例均符合1：1的同时，对农艺性状进行淘汰、选择，连续3代姊妹交，得到符合育种目标性状的新的甜椒核雄性不育两用系。
引物P1、P2扩增产物对不育株的判断为：
75bp特异性条带的单株为不育株，其基因型为msms；
扩增出片段大小为150bp特异性条带的单株为纯显性可育株，基因型为MSMS；
扩增出片段大小分别为75bp和150bp特异性条带的单株为杂合基因可育株，基因型为MSms。
下面给出具体的实施例。
甜椒核雄性不育两用系AB91-HY031的选育方法，包括以下操作：
步骤1：以甜椒核雄性不育两用系AB91群体内的不育株为母本(AB91由河北省农林科学院经济作物研究所提供，AB91是基于在田间发现的甜椒雄性不育株，经多代选育，育成由一对隐性核基因控制的甜椒核雄性不育两用系)，以优良自交系HY031(由山西朔州引进的031杂交种经多代自交选育出HY031自交系)为父本，进行杂交，获得杂交种一代F1。
步骤2：种植杂交种一代F1，育性表现全可育，可育株基因为MSms,可育株自交留种，得到自交种F2。
步骤3：将自交种F2种子播种在50孔的育苗穴盘中，育苗基质采用草炭和蛭石(培养基中草炭和蛭石的比例按2:1的质量比构成)，F2代育性开始分离，其群体内有不育株(msms)和可育株，可育株有两种基因型MSMS和MSms。
步骤4：在幼苗长到4-5片叶大小时，每个单株分别编号，共298株，分别取嫩叶提取DNA，并标明每个单株的编号。
步骤5：以人工设计合成一对特异核苷酸序列P1、P2作为引物，对提取的甜椒幼苗叶片DNA进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染。
前端引物P1序列为：TAAAACACGGGATGCAGCTACTA；
后端引物P2序列为：AAGTTCCTTTTCGTGTAACGACC；
PCR反应总体系为20μL:DNA模板2μl、正反引物(0.1μM)各1μl、10mmol/L dNTPs1.6μl、10×PCR Buffer(含MgCl2)2μl、5UTaq酶0.2μL，不足部分用ddH2O补充。
PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保存。
73个植株扩增出片段大小为75bp的特异性条带，78个植株扩增出片段大小为150bp的特异性条带，147个植株扩增出两个特异性条带，分别为75bp和150bp。扩增出大小为75bp条带的73个单株为不育株(msms)，扩增出大小为150bp条带的78个单株为纯显性可育株(MSMS)，扩增出大小分别为75bp和150bp两条特异性带的147个单株为杂合基因可育株(MSms)。电泳检测结果如图2所示。
步骤6：在苗期淘汰扩增出大小为150bp条带的78个纯显性可育株(MSMS)，保留扩增出大小为75bp条带的73个不育株(msms)和扩增出片段大小分别为75bp和150bp两条特异性带的147个可育株(MSms)。
步骤7：将保留的73个不育株(msms)和147个可育株(MSms)分别定植在网纱棚内，开花期淘汰农艺性状不良的不育株和可育株，分别选择符合育种目标性状的不育株与可育株，分别编号后成对测交，不同测交组合分别编号(不1×可1、不2×可2、不3×可3····，其中不1×可1为不育株1与可育株1的测交)，共获得28个测交组合，分别从不育株上收获测交组合种子。
步骤8：在网纱棚内分别种植28个测交组合，其育性均表现分离，可育株与不育株分离比例均符合1：1。淘汰农艺性状不良的测交组合，在农艺性状较优良的12个测交组合内，分别选择符合育种目标性状的不育株与可育株分别编号后成对姊妹交，不同姊妹交组合分别编号。采种时，再次淘农艺性状不良、不符合育种目标性状的测交组合。在入选的5测交组合不1×可1、不5×可5、不8×可8、不16×可16、不20×可20内，根据母本不育株、父本可育株的性状，淘农艺性状不良、不符合育种目标性状的姊妹交组合，选择符合育种目标性状的姊妹交组合32个分别留种，并注明编号。
步骤9：将选择符合育种目标性状的32个姊妹交组合分别种植在网纱棚内，在这些姊妹交组合内，继续进行姊妹交，在保持后代育性分离比例均符合1：1的同时，对熟性、果实性状、抗逆性、抗病性等农艺性状进行淘汰、选择，连续3代姊妹交，其中不8×可8—不3×可3—不1×可1不育性稳定、不育株率稳定在50％左右、不育度为100％，果实灯笼形，果大肉厚，抗病、座果率高、符合育种目标性状，为新选育的甜椒核雄性不育两用系，定名为AB91-HY031。
结合以上实施例，结果表明P1P2引物是与核雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记；本发明提出以下应用：
引物对与P1、P2作为与核雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记的应用。
在甜椒核雄性不育两用系的选育过程中引物对P1、P2作为分子标记进行辅助育种选育的应用。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，包括以下操作：
1)以甜椒核雄性不育两用系AB91群体内的不育株为母本，其雄性不育性由一对隐性核基因msms控制；以具有显性基因MSMS的甜椒自交系为父本，进行杂交后获得杂交种F1代；
2)种植杂交种F1代，F1代表现全可育，可育株基因型为MSms，可育株自交留种，得到自交种F2代；
3)将自交种F2代播种在育苗穴盘中，F2代育性开始分离，其群体内有不育株和可育株，可育株有两种基因型MSMS和MSms；
4)在F2代幼苗长到4-5片叶大小时，每个单株分别编号，分别取嫩叶提取DNA并编号；
以P1、P2作为引物对提取的甜椒幼苗叶片DNA进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并银染；
其中，前端引物P1为：TAAAACACGGGATGCAGCTACTA；
后端引物P2为：AAGTTCCTTTTCGTGTAACGACC；
电泳结果中扩增出片段大小为75bp特异性条带的单株为不育株，其基因型为msms；扩增出片段大小为150bp特异性条带的单株为纯显性可育株，基因型为MSMS；扩增出片段大小分别为75bp和150bp特异性条带的单株为杂合基因可育株，基因型为MSms；
在苗期淘汰纯显性可育株，保留不育株和杂合基因可育株；
5)将保留的不育株和杂合基因可育株分别定植在网纱棚内，开花期淘汰农艺性状不良的不育株和可育株，分别选择符合育种目标性状的不育株与可育株成对测交，从不育株上收获测交组合种子，不同组合分别编号；
6)在网纱棚内分别种植不同测交组合，其育性表现分离，可育株与不育株分离比例符合1：1；淘汰农艺性状不良的测交组合，在符合育种目标性状的测交组合内，选择符合育种目标性状的不育株与可育株成对姊妹交；
采种时，根据父本、母本性状淘汰农艺性状不良及不符合育种目标性状的姊妹交组合，选择符合育种目标性状的姊妹交组合留种、分别编号；
7)将符合育种目标性状的姊妹交组合分别种植在网纱棚内，在这些姊妹交组合内，继续进行姊妹交，在保持后代育性分离比例均符合1：1的同时，对农艺性状进行淘汰、选择，连续3代姊妹交，得到符合育种目标性状的新的甜椒核雄性不育两用系。
2.如权利要求1所述的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应总体系为20μL:DNA模板2μl、0.1μM的正反引物各1μl、10mmol/L dNTPs 1.6μl、10×PCR Buffer 2μl、5UTaq酶0.2μL，不足部分用ddH2O补充；
PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保存。
3.如权利要求1所述的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，所述符合育种目标性状包括以下性状中的一种或几种：果实灯笼形、果大肉厚、抗病、座果率高。
4.如权利要求1所述的甜椒核雄性不育两用系的选育方法，其特征在于，所述的淘汰农艺性状不良的测交组合是淘汰熟性、果实性状、抗逆性、抗病性表现不良的植株。
5.引物对P1、P2作为与核雄性不育两用系AB91携带的隐性核不育基因紧密连锁的分子标记的应用；
所述的引物对P1、P2的核苷酸序列分别为：
P1：TAAAACACGGGATGCAGCTACTA；
P2：AAGTTCCTTTTCGTGTAACGACC。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在甜椒核雄性不育两用系的选育过程中引物对P1、P2作为分子标记进行辅助育种选育的应用。
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