CN112913681B - 一种创制抗根肿病白菜种质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种创制抗根肿病白菜种质的方法。本发明公开的创制抗根肿病白菜种质的方法，包括：A1)将含有萝卜C染色体的白菜与含有萝卜H染色体的白菜杂交，得到F1代；A2)F1代自交，得到F2代；A3)从F2代中选择含有萝卜H和C染色体、形态接近白菜的抗根肿病植株与白菜回交，得到F2BC1代；A4)F2BC1代自交，从其自交后代中选择含有萝卜H和C染色体且形态类似白菜的抗根肿病植株，即为抗根肿病白菜种质。
Description
技术领域
本发明涉及农业育种领域中，一种创制抗根肿病白菜种质的方法。
背景技术
根肿病(clubroot)是一种由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的世界性土传病害，病原菌侵染植株根部形成根瘤而导致植株萎蔫凋亡。该病害传染性很强，寄主范围广，所有十字花科植物均可被侵染，而且病菌在土壤生存时间长，可达7年以上，很难防治。近些年我国白菜根肿病危害十分严重，在病区每年都会导致严重的减产，甚至绝产，造成巨大的经济损失。利用抗病品种可以解决根肿病危害问题，但是白菜(Brassica rapa ssp.pekenensis)高感根肿病，缺乏抗源。国外科学家已经利用欧洲芜菁的抗根肿病品种作为抗源，将根肿病抗性导入到白菜，培育出了抗根肿病的白菜品种。然而，这些抗病品种在生产上应用之后，会逐渐失去抗性而变成易感。究其原因，一方面白菜中的根肿病抗性来源单一，均来自欧洲芜菁；另一方面根肿病菌生理小种发生变异会使有些抗病品种逐渐丧失抗性变为感病。因此，创造新的根肿病抗源，对培育白菜新的抗根肿病品种至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何创制抗根肿病白菜种质。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种创制抗根肿病白菜种质的方法，所述方法包括：将萝卜的C染色体和H染色体导入白菜中，得到抗根肿病白菜。
上述方法可包括：
A1)将含有萝卜C染色体的白菜与含有萝卜H染色体的白菜杂交，得到F1代；
A2)F1代自交，得到F2代；
A3)从F2代中选择含有萝卜H和C染色体、形态接近白菜的抗根肿病植株与白菜回交，得到F2BC1代；
A4)F2BC1代自交，从其自交后代中选择含有萝卜H和C染色体且形态类似白菜的抗根肿病植株，即得到抗根肿病白菜种质。
上述方法中，含有萝卜C染色体的白菜通过将含有萝卜C染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系与回交亲本白菜进行杂交、回交、自交、筛选含有萝卜C染色体并且形态特征接近白菜的植株得到。
其中，回交、自交和筛选均可根据情况多次进行。在本发明的一个实施例中，所述含有萝卜C染色体的白菜通过将含有萝卜C染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系与回交亲本白菜依次进行杂交、回交、筛选、自交、筛选、回交、筛选、自交、筛选得到。所述筛选均为选择含有目的萝卜染色体且形态特征接近白菜的植株。该过程中均可选择含有萝卜C染色体的植株。
在本发明的一个实施例中，所述含有萝卜C染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系为甘蓝型油菜异源萝卜附加系C3/26-21。
上述方法中，含有萝卜H染色体的白菜通过将含有萝卜H染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系与回交亲本白菜进行杂交、回交、自交、筛选含有萝卜H染色体并且形态特征接近白菜的植株得到。
其中，回交、自交和筛选均可根据情况多次进行。在本发明的一个实施例中，所述含有萝卜H染色体的白菜通过将含有萝卜H染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系与回交亲本白菜依次进行杂交、回交、筛选、自交、筛选、回交、筛选、自交、筛选得到。所述筛选均为选择含有目的萝卜染色体且形态特征接近白菜的植株。该过程中均可选择含有萝卜H染色体的植株。
在本发明的一个实施例中，所述含有萝卜H染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系为甘蓝型油菜异源萝卜附加系H1/8。
所述形态特征接近白菜是指株型、叶形、叶色、叶缘、蜡粉等主要农艺性状接近白菜。
所述回交亲本白菜为只要为白菜品种或自交系即可。在本发明的一个实施例中，所述回交亲本白菜为白菜559。
上述方法中，萝卜C染色体采用引物对RH-148对待测植株的基因组DNA进行PCR扩增检测，利用所述RH-148能扩增得到188bp的DNA片段的待测植株含有萝卜C染色体，利用所述RH-148不能扩增得到188bp的DNA片段的待测植株不含有萝卜C染色体，所述RH-148由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成。
萝卜C染色体还可通过显微镜进行检测。
上述方法中，萝卜H染色体采用引物对RsSH167对待测植株的基因组DNA进行PCR扩增检测，利用所述RsSH167能扩增得到250bp的DNA片段的待测植株含有萝卜H染色体，利用所述RsSH167不能扩增得到250bp的DNA片段的待测植株不含有萝卜H染色体，所述RsSH167由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成。
萝卜H染色体还可通过显微镜进行检测。
所述RH-148和/或所述RsSH167，也属于本发明的保护范围。
所述RH-148和/或所述RsSH167的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1、提高白菜根肿病抗性；
X2、制备提高白菜根肿病抗性产品；
X3、培育抗根肿病白菜；
X4、制备培育抗根肿病白菜产品。
萝卜的C染色体和H染色体的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1、提高白菜根肿病抗性；
X2、制备提高白菜根肿病抗性产品；
X3、培育抗根肿病白菜；
X4、制备培育抗根肿病白菜产品。
本申请发明人利用甘蓝型油菜异源萝卜附加系作为桥梁，通过附加系与白菜的有性杂交，将萝卜染色体从甘蓝型油菜附加系转入到白菜，获得整套含单个萝卜染色体的白菜异源萝卜附加系。对整套白菜异源萝卜附加系及其白菜亲本进行根肿病抗性鉴定的结果显示所有附加系都表现感病。通过将不同白菜异源萝卜附加系进行杂交，重组白菜中附加的萝卜染色体，创制出附加萝卜C和H染色体的白菜具有根肿病抗性。
附图说明
图1为根肿病病情分级标准。
图2为白菜异源萝卜附加系(上图)和白菜559(下图)的感病症状。
图3为F2(hc)部分单株照片。其中，9级的植株为白菜559，其余为F2(hc)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的9个甘蓝型油菜异源萝卜附加系A2/8-4、B2/l1-21、C3/26-21、D3/33-2、E1/9、Fl/54-41、G1/6-1、H1/8、I4/15-5均记载在“丁云花，油菜异附加系中萝卜染色体分子标记及定位研究，中国农业科学院学位论文，2005年”中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。其中，A2/8-4、B2/l1-21、C3/26-21、D3/33-2、E1/9、Fl/54-41、G1/6-1、H1/8、I4/15-5分别只含有萝卜的A、B、C、D、E、F、G、H、I染色体。
白菜559：京研益农(北京)种业科技有限公司。
实施例1、白菜抗根肿病种质的创制
本实施例分别利用作为母本的9个甘蓝型油菜异源萝卜附加系A2/8-4、B2/l1-21、C3/26-21、D3/33-2、E1/9、Fl/54-41、G1/6-1、H1/8和I4/15-5，以及作为父本的白菜559创制了白菜抗根肿病种质。具体步骤如下：
1、甘蓝型油菜异源萝卜附加系与白菜559杂交，获得F1：
第一年在9月下旬-11月上旬把9个甘蓝型油菜异源萝卜附加系A2/8-4、B2/l1-21、C3/26-21、D3/33-2、E1/9、Fl/54-41、G1/6-1、H1/8和I4/15-5和白菜559分别播种于72孔的穴盘中育苗，30天左右苗龄，当植株长至四叶一心时定植到不加温的日光温室，经过冬季自然低温感应完成春化，在翌年春季3、4月份抽薹开花。如果冬季低温积累不足以完成春化，可进行人工低温处理促使其花芽分化，适宜的春化条件为：幼苗长至5片真叶时置于5℃低温处理8周，然后移至10℃处理3周左右，再在15℃处理2周，然后即可通过春化，抽薹开花。
第二年3、4月份，分别以9个甘蓝型油菜异源萝卜附加系为母本、白菜559为父本进行杂交。在开花前2-3天，分别将父、母本花枝已经开放的花朵摘除，用硫酸纸袋套住未开花的蕾枝，纸袋下口用曲别针卡住。母本于开花前1-2天蕾期人工去雄，取父本花粉抹在母本柱头上进行人工杂交授粉。每个组合授粉100个蕾以上，授粉后套袋隔离，至花谢摘袋。到6月份种子成熟，每个组合分别采种，获得9个甘蓝型油菜异源萝卜附加系与白菜559杂交的杂交种F1，将A2/8-4、B2/l1-21、C3/26-21、D3/33-2、E1/9、Fl/54-41、G1/6-1、H1/8和I4/15-5得到的杂交种分别记为为F1a，F1b，F1c，F1d，F1e，F1f，F1g，F1h，F1i。
2、杂种F1与白菜回交，获得BC1：
第二年9-11月将上述9个杂交种F1a，F1b，F1c，F1d，F1e，F1f，F1g，F1h，F1i和父本白菜559播种育苗，30天左右苗龄，当植株长至四叶一心时定植到不加温的日光温室，经过低温春化后，在翌年春季3、4月份抽薹开花。如果冬季低温积累不足以完成春化，可按上文的方法进行人工低温处理促使其花芽分化。
第三年3、4月份9个杂交种F1a，F1b，F1c，F1d，F1e，F1f，F1g，F1h，F1i和白菜559抽薹开花。分别以9个杂交种F1a，F1b，F1c，F1d，F1e，F1f，F1g，F1h，F1i为母本、白菜559为父本，进行回交。如上述步骤1的方法进行蕾期套袋隔离，人工去雄、授粉，取白菜559的花粉分别授到9个杂交种F1a，F1b，F1c，F1d，F1e，F1f，F1g，F1h，F1i的柱头上，每个回交授粉200个蕾以上，建立200株以上的BC1群体。9个BC1群体分别采种,将9个杂交种F1a，F1b，F1c，F1d，F1e，F1f，F1g，F1h，F1i得到的BC1群体分别编号为BC1a，BC1b，BC1c，BC1d，BC1e，BC1f，BC1g，BC1h，BC1i。
3、BC1的鉴定与选择：
第三年9-11月将上述9个BC1群体BC1a，BC1b，BC1c，BC1d，BC1e，BC1f，BC1g，BC1h，BC1i播种，待长出真叶之后单株提取DNA。采用SDS法提取植株基因组总DNA。分别用萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H和I特异的SSR分子标记对相应的BC1群体进行外源萝卜染色体的鉴定，萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H，和I特异标记的片段大小分别为222bp、171bp、188bp、219bp、209bp、240bp、174bp、280bp、250bp。引物对序列如表1所示。
表1、引物信息
将所得PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测。
用上述萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H，和I特异的SSR引物分别对相应9个BC1群体BC1a，BC1b，BC1c，BC1d，BC1e，BC1f，BC1g，BC1h，BC1i中的每个个体的基因组DNA进行PCR扩增，选择能扩增出相应特异片段的BC1个体。具体如下：
在BC1a群体中选择利用萝卜A染色体的特异引物RsSA020能扩增出222bp条带的单株，所得单株即含有萝卜A染色体；在BC1b群体中选择利用萝卜B染色体的特异引物RsSH034能扩增出200bp条带的单株，所得单株即含有萝卜B染色体；在BC1c群体中选择利用萝卜C染色体的特异引物RH-148能扩增出188bp条带的单株，所得单株即含有萝卜C染色体；在BC1d群体中选择利用萝卜D染色体的特异引物RM-8能扩增出267bp条带的单株，所得单株即含有萝卜D染色体；在BC1e群体中选择利用萝卜E染色体的特异引物RsSA108能扩增出209bp条带的单株，所得单株即含有萝卜E染色体；在BC1f群体中选择利用萝卜F染色体的特异引物引物RM-59能扩增出293bp条带的单株，所得单株即含有萝卜F染色体；在BC1g群体中选择利用萝卜G染色体的特异引物RsSA014能扩增出181bp条带的单株，所得单株即含有萝卜G染色体；在BC1h群体中选择利用萝卜H染色体的特异引物RsSH167能扩增出250bp条带的单株，所得单株即含有萝卜H染色体；在BC1i群体中选择利用萝卜I染色体的特异引物RsSA012能扩增出186bp条带的单株，所得单株即含有萝卜I染色体。
将上述用萝卜染色体特异标记选择出来的单株移栽到日光温室，继续进行形态学的鉴定和选择，调查其株型、叶形、叶色、叶缘、蜡粉等主要农艺性状，选择形态性状偏向白菜的单株，下一步进行自交，其余的单株拔除淘汰。
4、回交一代(BC1)自交，获得BC1F2：
第四年春季,上述步骤3入选的BC1植株抽薹开花，同样采用蕾期套袋人工辅助自交授粉，单株收种，获得BC1F2，9个BC1群体分别得到9个BC1F2群体。每份材料自交200个蕾以上，保证每个BC1F2群体在200株以上。
5、BC1F2的鉴定与选择：
第四年9-11月将上述9个BC1F2群体和白菜559播种，待长出真叶之后提取基因组总DNA，按照步骤3的方法，分别用萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H和I特异的SSR分子标记对相应的BC1F2群体进行外源萝卜染色体的鉴定，淘汰没有扩增出目的特异片段的单株，选留能扩增出特异标记，即携带有外源萝卜染色体的BC1F2单株。
在此基础上，对这些带有外源萝卜染色体的BC1F2单株再进行形态学鉴定，选择株型、叶形、叶色、叶缘、蜡粉等主要农艺性状类似白菜的单株，其余的单株拔除淘汰。
6、BC1F2与白菜回交，获得BC2F2：
第五年春季上述入选的BC1F2植株和白菜559抽薹开花，同样采用蕾期套袋隔离，人工去雄做回交授粉，以BC1F2单株为母本，白菜559为父本，进行回交，获得BC2F2，9个BC1F2群体分别得到9个BC2F2群体。每个回交组合授粉200-300个蕾，保证BC2F2群体在300株以上。
7、BC2F2的鉴定与选择：
第五年9-11月将上述9个BC2F2群体和白菜559播种，待长出真叶之后提取基因组总DNA。按照步骤3的方法，分别用萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H和I特异的SSR分子标记对相应的BC2F2群体进行外源萝卜染色体的鉴定，淘汰没有扩增出目的特异片段的单株，选留能扩增出特异标记，即携带有外源萝卜染色体的BC2F2单株。
在此基础上，对这些带有外源萝卜染色体的BC2F2单株进行形态学鉴定，选择株型、叶形、叶色、叶缘、蜡粉等主要农艺性状具有白菜形态学特征的单株，其余单株拔除淘汰。
8、BC2F2的自交，获得BC2F3
第六年春季上述筛选得到的BC2F2植株抽薹开花，采用蕾期套袋隔离，进行人工辅助单株自交，单株采种，得到9个BC2F3群体。每个单株自交200-300个蕾，以保证每个BC2F3群体在200株以上。
9、BC2F3的鉴定与选择：
第六年8-11月将上述9个BC2F3群体播种，待长出真叶之后提取基因组总DNA。按照步骤3的方法，分别用萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H和I特异的SSR分子标记对相应的BC2F3群体进行外源萝卜染色体的鉴定，淘汰没有扩增出目的特异片段的单株，选留能扩增出特异标记，即携带有外源萝卜染色体的BC2F3单株。在此基础上，对这些带有外源萝卜染色体的BC2F3单株进行形态学鉴定，选择具有白菜形态学特征的单株，获得9个白菜异源萝卜附加系，分别编号为AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI
所得到的白菜异源萝卜附加系具有如下特征：AA含有萝卜的两条A染色体，AB含有萝卜的两条B染色体，AC含有萝卜的两条C染色体，AD含有萝卜的两条D染色体，AE含有萝卜的两条E染色体，AF含有萝卜的两条F染色体，AG含有萝卜的两条G染色体，AH含有萝卜的两条H染色体，AI含有萝卜的两条I染色体。
10、根肿病抗性鉴定：
利用苗期人工接种抗性鉴定方法对上述附加单个萝卜染色体的白菜异源萝卜附加系AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI进行根肿病人工抗性鉴定，以白菜559为对照。
根肿病抗性鉴定方法如下：
菌液制备：将10克田间采集的根肿组织切碎，加50mL灭菌水，在研钵中研细或用榨果汁机研碎，然后用4层纱布过滤，滤液移入一干净的50mL离心管，3100r/min离心15min，弃上清液，沉淀重溶于50mL灭菌水，3100r/min离心10min，此步操作可重复2-3次。弃上清液，在沉淀中加5mL 50％蔗糖水溶液，混匀后，3100r/min离心10min,用移液枪把上清液小心移入一干净的离心管，加30mL灭菌水，3100r/min离心10min，弃上清液，沉淀重溶于30mL灭菌水，3100r/min离心10min，此步操作可重复2次，最后沉淀溶于100mL灭菌水，即得到休眠孢子提取液，备用。取一滴休眠孢子提取液于载玻片上，盖上盖玻片，于600倍显微镜下镜检。将根肿病菌体眠孢子浓度调整为1×107个/ml，即得到接种菌液，置于4℃冷藏保存。
接种方法：将种子播于装有消毒土的50孔穴盘中，用Eppendorf移液枪吸取1mL根肿菌接种液，注射于种子周围，每穴播一粒种子，接种1mL菌液，每个单株接种的菌量相等。每个群体接种30株，三次重复。接种后苗床土温控制在25℃左右，土壤保持湿润。50-60天后调查发病情况。
病情分级标准，如图1，具体描述如下：
0级：根部生长正常，无症状；
1级：侧根或主根有极少微小肿瘤，肿瘤面积占全部根系10％以下；
3级：侧根或主根上有少量较小肿瘤，肿瘤面积占全部根系10％～30％(包括10％，不包括30％)；
5级：侧根或主根上有较多或较大肿瘤，呈圆形或纺锤形，肿瘤面积占全部根系30％～50％(包括30％，不包括50％)；
7级：侧根或主根上有大肿瘤，呈圆形或纺锤形，肿瘤面积占全部根系50％～75％(包括50％，包括75％)；
9级：肿瘤扩展至下胚轴，主根或侧根全部为大块肿瘤，肿瘤面积占全部根系75％以上。
病情指数计算公式：
根据病情指数确定待测植株的根肿病抗性情况，抗性分级标准如下：
高抗：0-11.11％(不包括11.11％)；
抗病：11.12-33.33％(包括11.11％，不包括33.33％)；
耐病：33.33-55.55％(包括33.33％，不包括55.55％)；
感病：55.55-77.77％(包括55.55％，不包括77.77％)；
高感：77.77-100％(包括77.77％)。
根肿病菌接种鉴定结果：上述获得的附加单个萝卜染色体的白菜异源萝卜附加系AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI和白菜559的病情指数均为100％，高感根肿病(如图2)。
11、白菜异源萝卜附加系进行两两杂交
第七年春天，白菜异源萝卜附加系AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI植株抽薹开花，按照下表9个白菜异源萝卜附加系进行两两杂交，采用蕾期套袋人工授粉，每个组合杂交50个蕾，分别采种，获得不同杂种F1。
表2、杂交方法
| 附加系 | AB | AC | AD | AE | AF | AG | AH | AI |
| AA | F<sub>1(ab)</sub> | F<sub>1(ac)</sub> | F<sub>1(ad)</sub> | F<sub>1(ae)</sub> | F<sub>1(af)</sub> | F<sub>1(ag)</sub> | F<sub>1(ah)</sub> | F<sub>1(ai)</sub> |
| AB | F<sub>1(bc)</sub> | F<sub>1(bd)</sub> | F<sub>1(be)</sub> | F<sub>1(bf)</sub> | F<sub>1(bg)</sub> | F<sub>1(bh)</sub> | F<sub>1(bi)</sub> | |
| AC | F<sub>1(cd)</sub> | F<sub>1(ce</sub> | F<sub>1(cf)</sub> | F<sub>1(cg)</sub> | F<sub>1(ch)</sub> | F<sub>1(ci)</sub> | ||
| AD | F<sub>1(de)</sub> | F<sub>1(df)</sub> | F<sub>1(dg)</sub> | F<sub>1(dh)</sub> | F<sub>1(di)</sub> | |||
| AE | F<sub>1(ef)</sub> | F<sub>1(eg)</sub> | F<sub>1(eh)</sub> | F<sub>1(ei)</sub> | ||||
| AF | F<sub>1(fg)</sub> | F<sub>1(fh)</sub> | F<sub>1(fi)</sub> | |||||
| AG | F<sub>1(gh)</sub> | F<sub>1(gi)</sub> | ||||||
| AH | F<sub>1(hi)</sub> |
第七年9-11月将上述获得的F1播种，待长出真叶之后提取基因组总DNA，按照步骤3的方法，分别用萝卜染色体A，B，C，D，E，F，G，H和I特异的SSR分子标记对相应的F1进行外源萝卜染色体的鉴定，每个F1均采用其亲本含有的染色体对应的引物对进行鉴定，比如F1(ab)分别用萝卜染色体A、B特异的SSR分子标记分别进行外源萝卜染色体A、B的鉴定，可以先用萝卜染色体A特异的SSR标记引物RsSA020对F1(ab)的所有单株进行PCR扩增，筛选能扩增出222bp特异带的所有单株，再用萝卜染色体B特异的SSR标记引物RsSH034进行扩增，选择能扩增出200bp特异带的所有单株，即为含萝卜染色体A和B的F1(ab)。
同理，筛选得到如下附加萝卜两条染色体的单株：含萝卜染色体A和C的F1(ac)，含萝卜染色体A和D的F1(ad),含萝卜染色体A和E的F1(ae),含萝卜染色体A和F的F1(af),含萝卜染色体A和G的F1(ag),含萝卜染色体A和H的F1(ah),含萝卜染色体A和I的F1(ai),含萝卜染色体B和C的F1(bc),含萝卜染色体B和D的F1(bd),含萝卜染色体B和E的F1(be),含萝卜染色体B和F的F1(bf),含萝卜染色体B和G的F1(bg),含萝卜染色体B和H的F1(bh),含萝卜染色体B和I的F1(bi),含萝卜染色体C和D的F1(cd),含萝卜染色体C和E的F1(ce),含萝卜染色体C和F的F1(cf),含萝卜染色体C和G的F1(cg),含萝卜染色体C和H的F1(ch),含萝卜染色体C和I的F1(ci),含萝卜染色体D和E的F1(de),含萝卜染色体D和F的F1(df),含萝卜染色体D和G的F1(dg),含萝卜染色体D和H的F1(dh),含萝卜染色体D和I的F1(di),含萝卜染色体E和F的F1(ef),含萝卜染色体E和G的F1(eg),含萝卜染色体E和H的F1(eh),含萝卜染色体E和I的F1(ei),含萝卜染色体F和G的F1(fg),含萝卜染色体F和H的F1(fh),含萝卜染色体F和I的F1(fi),含萝卜染色体G和H的F1(gh),含萝卜染色体G和I的F1(gi),含萝卜染色体H和I的F1(hi)。
将上述获得的附加两个萝卜染色体的白菜异源萝卜附加系进行根肿病抗性鉴定，方法同步骤10。以白菜559为感病对照，每个群体接种30株，三次重复。接种50-60天后待感病对照白菜559出现明显症状后调查发病情况。结果F1的病情指数范围为17.5％-100％，选择病情指数最低的F1(hc)植株(病情指数为17.5％)，定植于温室，用于自交。
12、抗病F1(hc)自交
第八年春季，上述抗病的F1(hc)植株抽薹开花，蕾期进行套袋隔离，分别在蕾期或花期取本植株上的花粉进行自交授粉，分别自交300个蕾左右，收获得到F2(hc)。
第八年秋季按步骤10的方法对F2(hc)进行根肿病抗性鉴定，播种200粒种子，以白菜559为感病对照，接种50-60天待感病对照出现明显症状后调查发病情况。不同单株对根肿病抗性出现不同的反应，如图3，筛选形态学性状接近白菜的抗病F2(hc)植株(病级为3级以下)定植于温室，用于回交。
13、抗病F2(hc)植株与白菜回交
第九年春季，抗病的F2(hc)植株抽薹开花，与白菜559进行回交。以抗病的F2(hc)单株为母本，蕾期去雄、套袋隔离；以白菜559为父本，蕾期套袋隔离。在母本的蕾期或花期取父本花粉进行人工辅助授粉，每个单株分别授粉100个蕾，分别采种，获得回交世代F2BC1(hc)。
14、F2BC1(hc)根肿病抗性鉴定：
将所得F2BC1(hc)种子播种，在苗期进行根肿病抗性鉴定，播种200粒种子，以白菜559为感病对照。接种50-60天后在感病对照白菜559出现明显症状时调查F2BC1(hc)发病情况。筛选病级为3级以下、并且形态学性状类似白菜的单株，即为抗根肿病的白菜种质。
利用萝卜染色体h和染色体c特异的SSR分子标记检测上述各单株的染色体，具体利用表1的RsSH167和RH-148分别对上述各单株的基因组DNA进行PCR扩增，结果显示，各抗病单株均能扩增得到188bp和280bp条带，而感病单株均仅能得到188bp和280bp条带中的一条或不能得到这两种条带中的任一条，说明，抗病单株含有萝卜染色体h和染色体c，感病单株含有萝卜染色体h或染色体c或不含萝卜染色体。
在显微镜下观察各单株的染色体情况，也得到了同样的结果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种创制抗根肿病白菜种质的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ctttctcctt tttcttcgtt tcag 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cttcctttcc atgattgata gacc 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gatagatact gtctgaactt gaaaa 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
tcagtaaagc ctccacgagt 20
Claims (3)
1.一种创制抗根肿病白菜种质的方法，包括：
A1）将含有萝卜C染色体的白菜与含有萝卜H染色体的白菜杂交，得到F1代；所述含有萝卜C染色体的白菜通过将含有萝卜C染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系C3/26-21与回交亲本白菜进行杂交、回交、自交、筛选含有萝卜C染色体并且形态特征接近白菜的植株得到；所述含有萝卜H染色体的白菜通过将含有萝卜H染色体的甘蓝型油菜异源萝卜附加系H1/8与回交亲本白菜进行杂交、回交、自交、筛选含有萝卜H染色体并且形态特征接近白菜的植株得到；
A2）F1代自交，得到F2代；
A3）从F2代中选择含有萝卜H染色体和C染色体、形态接近白菜的抗根肿病植株与白菜回交，得到F2BC1代；
A4）F2BC1代自交，从其自交后代中选择含有萝卜H染色体和C染色体且形态类似白菜的抗根肿病植株，即为抗根肿病白菜种质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：萝卜C染色体采用引物对RH-148对待测植株的基因组DNA进行PCR扩增检测，利用所述RH-148能扩增得到188bp的DNA片段的待测植株含有萝卜C染色体，利用所述RH-148不能扩增得到188bp的DNA片段的待测植株不含有萝卜C染色体，所述RH-148由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：萝卜H染色体采用引物对RsSH167对待测植株的基因组DNA进行PCR扩增检测，利用所述RsSH167能扩增得到250bp的DNA片段的待测植株含有萝卜H染色体，利用所述RsSH167不能扩增得到250bp的DNA片段的待测植株不含有萝卜H染色体，所述RsSH167由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成。
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