CN106472300A - 一种创制能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜种质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种创制能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜种质的方法，其是通过携带萝卜染色体的甘蓝型油菜与白菜进行有性回交和自交，将萝卜染色体导入到白菜，同时利用SSR分子标记检测技术及细胞镜检方法，选育含萝卜染色体和目标染色体数目的白菜，创建能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜新种质。本发明以甘蓝型油菜作为萝卜染色体的载体，通过它与白菜的回交将萝卜染色体传递给白菜，避免了白菜与萝卜之间的直接杂交，这种芸薹属内的杂交比芸薹属与萝卜属之间的属间杂交更容易成功，并且只有1对萝卜染色体与白菜基因组整合，可以避免用整个萝卜基因组杂交引起的更多遗传累赘，因此还可以提高目标性状的转移和选择效率。这种方法为远缘杂交利用提供了一条新的思路。

Description

一种创制能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜种质的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种创制能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜种质的方法。
背景技术
白菜和萝卜是我国的两种重要蔬菜，分别属于十字花科的芸薹属和萝卜属。在蔬菜作物杂交育种中，利用种间、属间、科间的远缘杂交在提高作物的抗病性和抗逆性、提高作物品质、创造新类型或新种质等方面发挥了重要的作用，已成为解决植物基因资源匮乏的重要手段，它可以解决近缘杂交不能解决的问题。因此，越来越被育种家们重视和利用，在植物遗传育种中已有广泛的应用，如在小麦、棉花、油菜、黄瓜等多种作物上通过种间或属间杂交进行品种改良，获得了丰富的遗传变异类型。
但是，有性远缘杂交经常会遇到杂交不亲和、杂种不育、杂种后代遗传变异复杂等问题。尽管白菜与萝卜同属十字花科，但白菜属于芸薹属芸薹种(基因组A，n＝10)，而萝卜属于萝卜属萝卜种(基因组R，n＝9)。白菜和萝卜直接杂交后代没法继续回交的研究(李旭峰等，1995)。事实证明，萝卜与芸薹属植物杂交获得杂种非常困难，而且杂种高度不育，难以继续回交。为了克服两者之间杂交的不亲和问题，许多学者尝试用不同技术和方法，如：植株嫁接后杂交、混合花粉授粉、化学药物处理等，但这些技术和方法对芸薹属植物与萝卜的远缘杂交几乎没有效果。后来组织培养技术和体细胞融合技术推动了这一领域的发展，如通过原生质体融合技术将萝卜的细胞质雄性不育基因转入芸薹属蔬菜，获得白菜细胞质雄性不育材料。与有性杂交相比，体细胞融合技术虽然可以在一定程度上克服远缘杂交不亲和性，但存在结果不确定性、成本偏高等缺陷，难以得到广泛的应用。
因此，寻求一种能克服远缘杂交障碍，使白菜与萝卜可以通过有性杂交获得有利用价值的杂种后代的方法，对白菜育种具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种创制携带萝卜染色体的白菜种质的方法。
本发明提供的方法，为以附加萝卜d染色体的甘蓝型油菜作为萝卜染色体的载体，将所述萝卜染色体转移到白菜或具备白菜生物学特性的植物，得到携带萝卜染色体的白菜或具备白菜生物学特性的植物。
上述方法包括如下步骤：
1)将所述附加萝卜d染色体甘蓝型油菜作为母本，所述白菜或具备白菜生物学特性的植物作为父本，进行杂交，得到F1代植株；选取含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为30的所有F1代单株，记作F1-A；
2)将所述F1-A单株作为母本，所述白菜作为父本，回交，得到BC1群体；选取含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为21，且形态与所述白菜相同或接近的所有BC1单株，命名为BC1-A；
3)将所述BC1-A单株自交，得到BC1F2群体，选取含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为22，且形态与所述白菜相同或接近的所有BC1F2单株，为能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜或能稳定遗传的携带萝卜染色体具备白菜的生物学特性植物。
上述根尖细胞的染色体数为单个根尖细胞中的染色体数。
上述方法中，所述选取含有萝卜d染色体的方法为用SSR标记RSSH173-219的引物对对植株进行分子鉴定，选取含有该标记的植株；
所述SSR标记RSSH173-219的引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
上述方法中，所述选取符合所需根尖细胞的染色体数的植株的方法为显微镜镜检。
上述方法中，所述附加萝卜d染色体的甘蓝型油为甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系05-1CGMCC No.3596。
甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系05-1CGMCC No.3596在白菜育种中的应用也是本发明保护的范围。
含萝卜d染色体的白菜在形态上不是唯一的，只要具备白菜的生物学特性即可。
甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系05-1于2010年1月27日，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.3596，分类命名：油菜brassica napus；该附加系记载在公开号为102138515A的专利中，该专利的申请号为201010104342X，授权号为ZL201010104342X，申请日为2010.2.1。
本发明的实验证明，本发明可以克服萝卜与白菜之间的远缘杂交障碍，通过有性回交将萝卜染色体导入白菜且在白菜基因组背景中能稳定遗传的方法。
与传统的白菜和萝卜直接远缘杂交方法相比，本发明以甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系(基因组AACC+dd)作为白菜(基因组AA)与萝卜(基因组RR)的中间桥梁，用附加萝卜d染色体的甘蓝型油菜与白菜进行杂交，两者完全亲和，解决了白菜与萝卜之间不亲和的问题；并且只有1对萝卜染色体与白菜基因组整合，可以避免用整个萝卜基因组杂交引起的更多遗传累赘，因此这种方法不但可以克服白菜与萝卜之间的远缘杂交障碍，避免了白菜与萝卜之间的直接杂交，提高目标性状的转移和选择效率,这种芸薹属内的杂交比芸薹属与萝卜属之间的属间杂交更容易成功；为白菜与萝卜的远缘杂交提供了一条新的思路与方法，为白菜遗传育种创造更多的遗传变异。基因组成是纯合的就可以稳定遗传
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
附图说明
图1为SSR分子鉴定图。泳道从右到左分别是Marker，1个白菜亲本，1个附加系亲本，1个F1，1个BC1，其余为BC1F2。
具体实施方式
下述实施例中所用的父本白菜可以从商业途径获得，获得的含萝卜d染色体的白菜在形态上不是唯一的，只要具备白菜的生物学特性即可。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系于2010年1月27日，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.3596，分类命名：油菜brassica napus；该附加系记载在公开号为102138515A的专利中，该专利的申请号为201010104342X，授权号为ZL201010104342X，申请日为2010.2.1。
实施例1、创制含萝卜染色体的白菜的育种方法
具体步骤如下：
一、杂交及F1代植株鉴定
1、杂交
第一年10月播种甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系和白菜，11月分别定植5株苗于日光温室。次年3月，以甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系为母本，白菜(后代回交以此为轮回亲本)为父本进行杂交授粉；开花前2-3天，父母本花枝分别套袋隔离。母本蕾期去雄，取父本的花粉涂抹于母本的柱头上，每株杂交20个蕾。6月份杂交种子成熟，得到F1代种子1000粒以上。
2、F1代植株分子鉴定
利用萝卜d染色体的SSR标记RSSH173-219检测F1是否含有萝卜d染色体，有该标记的植株为含有萝卜d染色体，具体方法如下：
采用SDS法提取亲本和F1植株幼苗叶片DNA，用SSR引物RSSH173进行PCR扩增。
SSR引物RSSH173序列如下，扩增片段大小为219bp：
FW-primer：5'-TGAGCAGAGAAGAGAATCTAGAGACA-3'(序列1)；
BW-primer：5'-CAATAACCATTAAATTGTAAACCGAA-3'(序列2)。
上述PCR扩增的反应体系为：8ng/μL DNA 1.6μL，5×PCR Buffer 1.2μL，10μM FW-primer 0.15μL，10μM BW-primer 0.15μL，5U Taq DNA聚合酶0.048μL，最后用ddH2O补齐6μL。
上述PCR扩增的程序为：94℃(5min)，94℃(30s)-50℃(30s)-72℃(30s)45个循环，之后72℃7min，4℃保存。
PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测。
F1代植株的DNA用SSR引物SSH173做PCR均能扩增出如图1所示的219bp的特异条带，即F1代植株含有萝卜d染色体。
3、F1染色体镜检
染色体镜检方法：先固定F1植株幼苗根尖，取2～3mm左右根尖于饱和对二氯苯溶液中避光处理4h，后转入现配的卡诺固定液(无水乙醇：冰醋酸以3：1混合)中固定3～24h。取固定后的根尖进行解离，先用蒸馏水漂洗根尖2～3次,然后将根尖放入已预热的1mol/L盐酸中60℃水浴6－8分钟，再转入蒸馏水中浸泡10分钟以上。切取根尖用卡宝品红染液染色4-6分钟，常规压片后在OLYMPUS BH-2显微镜下镜检染色体。结果F1根尖细胞的染色体数目是30。
选取F1代植株中分子鉴定含有萝卜d染色体，且根尖细胞中染色体数为30的植株，命名为F1-A(基因组为AAC+d)。
二、回交及鉴定
1、回交
第二年10月播种上述一鉴定得到的F1-A和白菜，11月定植各5株。次年3月以F1-A单株作为母本，白菜为轮回父本进行回交，每株授粉30个蕾。授粉方法同步骤一的1，得到的种子为BC1。
2、BC1分子鉴定
利用萝卜d染色体的SSR标记RSSH173-219检测BC1群体各单株是否含有萝卜d染色体，有该标记的植株为含有萝卜d染色体，具体方法如上述一的2，结果供试的120株BC1中鉴定出58株带该标记的单株，用于进一步的染色体鉴定。
3、显微镜镜检根尖细胞染色体
用显微镜镜检上述分子标记鉴定含有萝卜d染色体的BC1植株的根尖细胞的染色体数目，具体方法如上述一的3，结果筛选出9株根尖细胞的染色体数为21的BC1单株。
4、形态观察
观察BC1单株的形态，选取BC1群体中分子鉴定含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为21，且形态与白菜相同或接近的植株5株，命名为BC1-A(基因组为AA+d)。
三、BC1自交及鉴定
1、BC1自交
第三年10月将上述二鉴定得到的5个BC1-A单株播种定植于温室，次年3月进行自交，即取某单株自身的花粉涂抹于自身花朵柱头上，每株授粉30个蕾，套袋隔离，种子成熟后得到BC1F2。
2、BC1F2分子鉴定
利用萝卜d染色体的SSR标记RSSH173-219检测BC1F2群体各单株是否含有萝卜d染色体，有该标记的植株为含有萝卜d染色体，具体方法如上述一的2，结果137个BC1F2单株中鉴定出92株含有萝卜d染色体的个体。
3、显微镜镜检根尖细胞染色体
用显微镜镜检上述分子标记鉴定含有萝卜d染色体的BC1F2单株根尖细胞染色体，具体方法如上述一的3，选择根尖细胞的染色体数为22的BC1F2单株23株。
4、形态观察
观察BC1F2单株的形态，选取BC1F2单株中分子鉴定含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为22，且形态与白菜相同或接近的植株，即为目的选育植株，命名为携带有萝卜d染色体的白菜(基因组为AA+dd)。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种创制能稳定遗传的携带萝卜染色体的白菜种质的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tgagcagaga agagaatcta gagaca 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
caataaccat taaattgtaa accgaa 26

Claims (6)

1.一种创制携带萝卜染色体的白菜种质的方法，为以附加萝卜d染色体的甘蓝型油菜作为萝卜染色体的载体，将所述萝卜染色体转移到白菜或具备白菜生物学特性的植物，得到携带萝卜染色体的白菜或具备白菜生物学特性的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)将所述附加萝卜d染色体甘蓝型油菜作为母本，所述白菜或具备白菜生物学特性的植物作为父本，进行杂交，得到F1代植株；选取含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为30的所有F1代单株，记作F1-A；
2)将所述F1-A单株作为母本，所述白菜作为父本，回交，得到BC1群体；选取含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为21，且形态与所述白菜相同或接近的所有BC1单株，命名为BC1-A；
3)将所述BC1-A单株自交，得到BC1F2群体，选取含有萝卜d染色体，且根尖细胞的染色体数为22，且形态与所述白菜相同或接近的所有BC1F2单株，为能携带萝卜染色体的白菜或能携带萝卜染色体具备白菜的生物学特性植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述选取含有萝卜d染色体的方法为用SSR标记RSSH173-219的引物对对植株进行分子鉴定，选取含有该标记的植株；
所述SSR标记RSSH173-219的引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述选取符合所需根尖细胞的染色体数的植株的方法为显微镜镜检。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述附加萝卜d染色体的甘蓝型油为甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系05-1 CGMCC No.3596。
6.甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系05-1 CGMCC No.3596在白菜育种中的应用。
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