CN106035066B - 油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法，包括：1）油菜种间及远缘材料的染色体数目调查，确定基因组大小；2）根据油菜种间及远缘材料的染色体数目或基因组大小确定杂交的父母本位置；3）在花期，人工去雄进行种间或远缘杂交；4)对杂交后不易获得种子的远缘杂交后代采取胚挽救的形式获得F₁植株；5）用油菜双单倍体诱导系对种间及远缘杂交F₁代授粉；6）诱导后代的染色体数目观察、遗传稳定性、结实性鉴定；7）诱导稳定后代用于油菜育种材料转育。本发明方法可在油菜3个栽培种种间杂交及远缘杂交中灵活运用，克服种间杂交和远缘杂交F₁自交不结实或自交不亲和性现象，提高油菜育种效率，降低人力、物力成本。

Description

油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法

技术领域：

本发明与农业有关，特别与油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法有关。

背景技术：

油菜是我国主要的油料作物，属于十字花科，芸薹属植物，包括3个栽培种，甘蓝型油菜（Brassica napus，芸苔（aa，n=10）与甘蓝（cc，n=9）通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，根据染色体来源判断为四倍体，2n=38）；白菜型油菜（Brassia campestris L. 包括原产中国的芸苔和油白菜。中国又称小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色体组为aa，n=10，根据来源染色体组来源判断为二倍体，2n=20，）；芥菜型油菜（Brassicajuncea，, 由芸薹(aa，n=10)和黑芥(bb，n=8)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一个复合种，根据染色体来源判断为四倍体，2n=36）。与油菜近缘的物种，包括甘蓝、花菜（花椰菜）、青菜、榨菜、白菜、黑芥、埃塞俄比亚芥、白芥等，同属十字花科不同属的植物包括诸葛菜、紫罗兰、萝卜、板蓝根、萝卜甘蓝、玛卡等物种。

近年来的基础研究发现，作物的种间或亚种间杂种优势更为突出。因此，为进一步提高油菜单位面积产量，扩大杂种优势利用资源很有必要。同时，油菜中的病害也越来越多，自身的基因无法实现抗病效果，需要从种间或近缘以及远缘植物中通过有性杂交得形式加以利用。如近年来我国上江上游及中游地区十字花科作物中出现的严重病害根肿病泛滥成灾，在常规的油菜、甘蓝、萝卜、白菜、青菜、花菜中都出现大面积的减产或绝收，且没有找到抗病基因，相应的抗病育种无法开展，化学药剂处理效果并不明显。最近的研究发现在大白菜和萝卜甘蓝型中发现了对根肿病具有明显抗病效果的基因。开展油菜抗病育种首先要将这些基因或基因家族转移到油菜中，因此，油菜的远缘杂交就必须开展，而油菜与萝卜甘蓝及大白菜杂交，F₁不易获得自交种子，且转育抗病基因资源的周期相当漫长。同时，油菜3个栽培种间也有部分优秀基因资源，如果将3个油菜栽培种进行种间杂交，将野生或地方品种优良基因到转育推广油菜品种中，再选育基因型稳定的遗传后代，需要10—20年的时间，其难度可想而知。因为油菜种间及远缘杂交染色体数目和来源不同，存在严重的基因隔离现象，相互进行种间、远缘杂交不容易获得遗传稳定的后代，给油菜基因交换、转育有利基因到生产品种带来较大困难。通常会出现F1自交结实差或不结实等现象，只能通过回交或开放授粉的形式获得后代，且后代分离严重，很难获得稳定遗传的株系，同时也会引入更多的非目标性状基因，对目标性状的定向选择难度加大，选育周期延长。

目前，在油菜中还未有诱导系或双单倍体诱导系的报道。所谓“诱导系”是指，用该植物作为父本用其花粉对同类植株授粉，能诱导同类植株（母本）产生相应的效应，如产生单倍体、双单倍体（DH系）等。在植物中运用诱导系进行新品种选育最多的是玉米，但玉米中的诱导系也只是单倍体诱导系。最早出现的玉米单倍体诱导系为stock6，该诱导系只能诱导玉米产生单倍体，然后单倍体植株再进行人工染色体加倍形成纯合二倍体（双单倍体），且诱导效率较低，一般诱导效率在10%以下（以收获种子中获得单倍体数计算）。

发明内容：

本发明的目的为了提供一种能快速、有效，只需3代（2年或3年）获得稳定纯合系株系，提高了油菜资源创新的效率和途径的油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法。

本发明的目的是这样来实现的：

本发明油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法，包括如下具体步骤：

1)对油菜种间及远缘材料通过植物根尖染色体观察，进行染色体数目调查或通过流式细胞仪确定基因组大小；

2）将具有目标性状的甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜或油菜近缘(甘蓝、白菜、黑芥、埃塞俄比亚芥等)、远缘（诸葛菜、萝卜、板蓝根、萝卜甘蓝等十字花科植物）材料两两杂交、聚合杂交或回交；根据上述步骤1）确定杂交过程中基因组小的材料作父本，染色体数目大或基因组大的材料作母本；

3）上述步骤2）中确定的母本材料在花期进行人工去雄，并套袋隔离，人工去雄2-4天后，取上述步骤2）中确定的父本给去雄母本进行人工授粉，授粉后套袋隔离，对远缘杂交采取授粉后10—20天进行实验室胚挽救处理，保证获得远缘杂交F₁植株；

4)对上述步骤3）中杂交后代、聚合杂交后代、回交后代以及胚挽救材料，在初花期对花蕾进行人工去雄，为保证获得诱导后代，去雄数目在100个花蕾以上，并套袋隔离；

5)用油菜双单倍体诱导系花粉对上述步骤4）中去雄后2—4天植株进行人工授粉，并套袋隔离，收获其授粉后结实种子；

6)对上述步骤5）获得种子进行种植，苗期利用流式细胞仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体或具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，选择正常育性、二倍体或四倍体植株，单株套袋自交；

7）上述步骤6）为获得单株自交种子，在不清楚染色体数目及油菜类型的情况下，采用蕾期，剥蕾强制自交的方式尽可能的获得自交种子；

8)上述步骤7）中单株自交种子（二倍体或四倍体）进行株系种植，调查株系形态一致性、结实性，并通过分子标记（SSR或SRAP）鉴定株系一致性及稳定性；

9)上述步骤8）中稳定株系观察染色体数目及染色体行为是否出现异常，获得的稳定遗传及结实性好的种间、远缘杂交植株，根据目标性状(如高含油、抗逆性好、丰产性强、品质优良、适应性好等特点)进入新一轮材料选择或直接形成油菜杂交育种亲本材料或品系等；

10）上述步骤9）稳定株系根据染色体数目（2n=38,2n=20,2n=36）和外型判断为甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜，这些稳定株系直接与之对应的油菜类型的不育类型进行测交，选育恢复系、保持系；

11）上述步骤10）中获得的稳定的白菜型油菜品系需要株系内群体授粉的方式获得。

本发明方法在3个栽培油菜种种间杂交以及近缘、远缘杂交转育优良基因到推广油菜品系及品种中，提高栽培油菜的产量、抗病、抗逆等特性。采用本发明获得油菜种间杂交、远缘杂交稳定后代借助了油菜双单倍体诱导系能诱导油菜及近缘属种母体植株在F1代发生孤雌生殖，在F₂代形成稳定的双单倍体个体，F₃代进行稳定性、一致性鉴定，获得稳定遗传后代。

上述油菜双单倍体诱导系选育方法，包括如下步骤；

（1）选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：

①将两个油菜亲本材料杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍获得加倍后的F₁代植株；

②加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代，对F₃代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系——早代稳定系；

③获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，F₁代、F₂代鉴定早代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F₁分离，F₂代出现部分稳定株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系；

（2）选育携带显性遗传性状、具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜：

①具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交（如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶、高芥酸等性状），得到杂交F₁代种子，上述杂交F₁种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F₁植株；

②对加倍的带显性性状的F₁植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株，带显性性状的多倍体的植株主要是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状（如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶、高芥酸等性状）的六倍体或八倍体油菜植株；

（3）油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：

①倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株；

②上述单株测交后代如果出现全不育、为正常倍性即二倍体或四倍体油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系；

上述方法中获得油菜双单倍体诱导系选育是将两个亲本材料杂交F₁代种子或具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，具体方法如下：

1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12—17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基上；

2）让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度23—25⁰C，白天光照12—16小时，光照强度2000—3000勒克斯，夜晚暗培养8—12小时，待植株长到1—2片真叶时，从下胚轴处剪下植株继续在第二培养基上生长；

3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养；

4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3—7天，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15—30分钟后移栽到温室中，温室温度16⁰C—25⁰C，相对湿度60—80%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6—苄基腺嘌呤 0.5—1.5mg

染色体加倍诱导剂 30—70mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第一培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6—苄基腺嘌呤 0.5—1mg

染色体加倍诱导剂 20—40mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第二培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α—萘乙酸 0.03—0.5mg

染色体加倍诱导剂 5—20mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第三培养基的pH=5.8—6.0，

上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6—1.2g

α—萘乙酸 0.5—1mg。

油菜双单倍体诱导系能直接诱导油菜产生双单倍体后代，无需进行人工染色体加倍来获得纯合系；且诱导效率高，最高可达100%，一般的诱导效率都在50%以上。双单倍体诱导系诱导母体植株产生双单倍体的主要原理是：诱导系能诱导母体植株，大孢子生殖细胞（卵细胞）产生孤雌生殖效应，且卵细胞能进行染色体加倍，即卵细胞孤雌生殖产生的后代就双单倍体。

上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。

本发明方法可以快速（3代）、高效获得油菜育种上或基础研究中具有应用价值的油菜种间、远缘杂交稳定后代，克服杂种F₁无法自交的结实的现象；且本方法应用范围广，不仅适用于油菜种间杂交也适用于油菜远缘杂交后代的选育，为油菜遗传育种、抗病育种资、杂交优势利用奠定坚实基础。

本发明方法可以快速用于油菜种间、远缘杂交专于油菜育种资源新材料。可以在2年或3代的时间内获得种间杂交或远缘杂交稳定株系，大大节约油菜资源创新、抗病、抗逆育种时间和周期，提高育种效率。

本发明方法油菜双单倍体诱导系（六倍体或八倍体植株）的基本原理是：诱导系具有孤雌生殖诱导基因，诱导系作父本时，诱导系染色体（或基因）没有与母体植株染色体融合，而是诱导母体植株（即卵细胞）产生孤雌生殖效应，且母体植株卵细胞染色体自身加倍形成双单倍体。

本发明方法具有以下优点：

1、该方法可以在油菜3个栽培种种间杂交及远缘杂交后代中应用，覆盖整个油菜及近缘属种作物，应用范围广；

2、本方法可以克服油菜种间杂交及远缘杂交F₁自交不结实或自交不亲和现象；

3、本方法直接获得稳定遗传的油菜种间杂交或远缘杂交后代，F₁代无需开放授粉或回交转育等措施，减少优良基因的转育时间；

4、本方法可以高效、快速，在3代(2—3年)，获得稳定纯合的油菜种间杂交或远缘杂交新材料；

5、本方法可直接诱导油菜种间杂交及远缘杂交F1获得稳定的二倍体株系，无需进行人工染色体加倍，可一步形成稳定后代。

附图说明：

图1为油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交新材料的流程图。

图2为油菜双单倍体诱导系选育流程图。

图3为获得油菜早代稳定系的方法流程图。

图4为油菜双单倍体诱导系Y3560选育流程图。

图5为油菜双单倍体诱导系Y3380选育流程图。

图6为油菜双单倍体诱导系Y4958的选育流程图。

图7为油菜早代稳定系P3—2选育流程图。

图8为甘白杂交(甘蓝型油菜与白菜型油菜)种间杂交后代新品系XB—16的选育。

图9为甘芥杂交（甘蓝型油菜与芥菜型油菜）种间杂交后代新品系XJ—3的选育。

图10为甘蓝型油菜与诸葛菜远缘杂交后代新品系GZG—6的选育。

图11为甘蓝型油菜与萝卜甘蓝远缘杂交后代新品系GLG—11的选育。

图12为P3—2四倍体油菜根尖染色体倍性鉴定图。

图13为P3—2四倍体流式细胞倍性鉴定图。

图14为Y3380流式细胞倍性鉴定图。

图15为为Y3560流式细胞倍性鉴定图。

图16为Y4958流式细胞倍性鉴定图。

具体实施方式：

实施例1：

参见图1、图2、图6、图8，甘蓝型油菜与白菜型油菜杂交转育优良基因到甘蓝型油菜中扩大甘蓝型油菜的基因资源是甘蓝型油菜资源创新、新材料创制的主要途径。甘蓝型油菜蓉B0464与白菜型油菜雅安黄YH种间杂交，期望将YH中的早熟、高含油、黄籽基因导入甘蓝型油菜中。用甘蓝型油菜蓉B0464作母本，白菜型油菜雅安黄YH作父本进行杂交获得杂交F₁，F₁代花期剥蕾去雄，用本申请人获得的油菜双单倍体诱导系Y4958作父本进行授粉诱导，F₂代（诱导后代）单株种植，并进行流式细胞检测、选育性正常、倍性（四倍体）正常、无诱导系显性性状（花叶）植株套袋自交，F₃代按株系种植，鉴定株系内性状一致性和稳定性，选育出一个株系内遗传稳定的种间杂交后代新品系XB—16(四倍体，2n=38)，该品系含油率高（49％）、褐黄籽、熟期较蓉B0464提早15天，但芥酸含量较高，还需要与双低甘蓝型油菜进行新一轮杂交选育才能在生产上运用。

本实施例中，油菜双单倍体诱导系是通过以下方法获得的：

参见图2、图3、图4、图12、图13、图15，由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系P3—2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F₁代出现分离，且这3个组合F₂代出现稳定株系，说明P3—2具有孤雌生殖遗传特性。用P3—2与高芥酸、矮杆油菜4247正反交（矮杆、高芥酸为显性性状），然后将杂交F₁代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为Y3560。

参见图2、图3、图5、图12、图13、图14，由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系P3—2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F₁代出现分离，且这3个组合F₂代出现稳定株系，说明P3—2具有孤雌生殖遗传特性。用P3—2与四倍体甘蓝型矮杆油菜D3—5正反交（矮杆为显性性状），然后将杂交F₁代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为Y3380。

参见图2、图3、图6、图12、图13、图16，由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系P3—2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F₁代出现分离，且这3个组合F₂代出现稳定株系，说明P3—2具有孤雌生殖遗传特性。用P3—2与白菜型花叶油菜08nl杂交（花叶为显性性状），然后将杂交F₁代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆六倍体植株，该植株定名为Y4958。

本实施例中将P3—2与矮杆油菜D3—5杂交F₁、P3—2与矮杆、高芥酸油菜4247杂交F₁以及P3—2与白菜型花叶油菜08nl杂交F₁种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度250C，白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，晚上暗培养8小时,待长到1—2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度250C，相对湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6—苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 50mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第一培养基的pH=5.8—6.0。

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6—苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 30mg

蔗糖 30g

琼脂 8g，

第二培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α—萘乙酸 0.03mg

秋水仙素 20mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第三培养基的pH=5.8—6.0。

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6g

α— 萘乙酸 0.5mg。

参见图2、图5、图14，用Y3380作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0464A）测交，测交后代50株，全为高杆,且全为四倍体油菜，其中49株为全不育，1株半不育，且形态特征与0464A完全相同。同时用P3—2与矮杆油菜D3—5杂交F₁（非加倍株）做父本与0464A测交作为对照验证，测交后代102株，出现矮杆62株、高杆40株、且育性分离较大，出现全可育73株、半不育20株、全不育9株。说明Y3380中的基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来，诱导率98%。用Y3380做父本与甘蓝型油菜3954去雄聚合杂交（3954为F₁，由中双11与CAX杂交而来），聚合杂交后代F₁分离，每个F₁自交，收获F₁自交株45个。种植F₂代株系45个，出现稳定株系45个，稳定株系出现比列100%，诱导率100%。

用Y3380做父本与甘蓝型油菜3968去雄聚合杂交（3968为F₁，由中双11与1365杂交而来），聚合杂交后代F₁分离，每个F₁自交，收获F₁自交株52个。种植F₂代株系52个，出现稳定株系28个，稳定株系出现比例53.85%，诱导率53.85%。

用Y3380做父本与甘蓝型油菜中双11（常规品种，纯合系）去雄杂交，获得杂交F₁植株70株，70株F₁形态与中双11完全相同，且每个单株自交后F₂代未发生分离，为稳定株系，与中双11形态也完全相同，说明F₁代就为纯系。即Y3380与中双11杂交过程，诱导中双11发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，是纯合系，因此F₁稳定、F₂也稳定，且与中双11形态完全相同，该诱导率100%。

同样用Y3380做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH（二倍体油菜，2ｎ＝20）去雄杂交，获得杂交F₁植株98株，97株F₁形态与YH完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为二倍体、外形与YH一致，说明Y3380与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，该诱导率98．9％。最终，显性矮杆八倍体植株Y3380确定为油菜双单倍体诱导系。

参见图2、图4、图15，用Y3560作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0464A）测交，测交后代80株，全为高杆,且76为四倍体油菜、2株为二倍体、2株为八倍体；其中76株四倍体植株为全不育，4株半不育，且形态特征与0464A完全相同。同时用P3—2与矮杆、高芥酸油菜4247杂交F₁（非加倍株）做父本与0464A测交作为对照验证，测交后代153株，出现矮杆102株、高杆51株、且育性分离较大，出现全可育65株、半不育35株、全不育53株。说明Y3560中的基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来，诱导率95%。

用Y3560做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH（二倍体油菜，2ｎ＝20）去雄杂交，获得杂交F₁植株145株，143株F₁形态与YH完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为二倍体、外形与YH一致，说明Y3560与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，该诱导率98．6％。

同样用Y3560做父本与芥菜型油菜GW（四倍体油菜，2ｎ＝36）去雄杂交，获得杂交F₁植株124株，123株F₁形态与GW完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为四倍体、外形与YH一致，说明Y3560与GW杂交过程，诱导GW发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与GW形态完全相同，该诱导率99．2％。最终，显性矮杆八倍体植株Y3560确定为油菜双单倍体诱导系。

参加图2、图6、图16，用Y4958作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0068A）测交，测交后代112株，全为高杆,且全为四倍体油菜，其中108株为全不育，4株半不育，且形态特征与0068A完全相同。同时用P3—2与白菜型花叶油菜08nl杂交F₁（非加倍株）做父本与0068A测交作为对照验证，测交后代89株，出现常叶植株59株、花叶植株30株、且育性分离较大，出现全可育45株、半不育20株、全不育24株。说明Y4958中的基因并未进入测交株，测交后代为0068A孤雌生殖而来，诱导率96．4%。

用Y4958做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH（二倍体油菜，2ｎ＝20）去雄杂交，获得杂交F₁植株88株，88株F₁形态与YH完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为二倍体、外形与YH一致，说明Y4959与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，该诱导率100％。

用Y4958做父本与芥菜型油菜GW（四倍体油菜，2ｎ＝36）去雄杂交，获得杂交F₁植株75株，75株F₁形态与GW完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为四倍体、外形与GW一致，说明Y4958与GW杂交过程，诱导GW发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与GW形态完全相同，该诱导率100％。

同样Y4958做父本与核不育GMS不育系3306测交，测交后代159株，且全为四倍体油菜，其中108株为全不育，4株半不育，且形态特征与0068A完全相同。同时用P3—2与白菜型花叶油菜08nl杂交F₁（非加倍株）做父本与0068A测交作为对照验证，测交后代89株，出现常叶植株59株、花叶植株30株、且育性分离较大，出现全可育45株、半不育20株、全不育24株。说明Y4958中的基因并未进入测交株，测交后代为0068A孤雌生殖而来，诱导率96．4%。

最终，显性花叶六倍体植株Y4958确定为油菜双单倍体诱导系。

参见图3、图7、图12、图13，获得早代稳定系P3—2方法如下：

甘蓝型油菜F009（四倍体，染色体2n=38）与白菜型油菜YH（二倍体，雅安黄油菜，染色体2n=20）剥蕾进行人工去雄杂交获得F₁代杂交种子。F₁代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍。对加倍后的F₁代植株进行自交（或强制自交）获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上）。对F₂代正常可育单株进行自交获得F₃代。对F₃代进行纯合度鉴定，种植F₃代单株株系，32%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致（38条），染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是F009与YH的杂交后代，且每个单株DNA扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。将其中1个叶片较大、无裂叶、叶片着生紧凑、含油率55%的甘蓝型（染色体38条）油菜早代稳定系定名为P3—2。

本实施例中将F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度250C，白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，晚上暗培养8小时,待长到1—2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度250C，相对湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6—苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 30mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第一培养基的pH=5.8—6.0。

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6—苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 20mg

蔗糖 30g

琼脂 8g，

第二培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α—萘乙酸 0.03mg

秋水仙素 5mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第三培养基的pH=5.8—6.0。

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6g

α— 萘乙酸 0.5mg。

附表1 MS培养基成分配方

实施例2：

参见图1、图2、图6、图9，甘蓝型油菜与芥菜型油菜杂交转育优良基因到甘蓝型油菜中扩大甘蓝型油菜的基因资源也是甘蓝型油菜资源创新、新材料创制的主要途径之一。用甘蓝型油菜蓉B0464作母本，紫色芥菜型油菜ＺＪ作父本进行杂交获得杂交F₁，F₁代花期剥蕾去雄，用本申请人获得的油菜双单倍体诱导系Y4958作父本进行授粉诱导，F₂代（诱导后代）单株种植，并进行流式细胞检测、选育性正常、倍性（四倍体）正常、无诱导系显性性状（花叶）植株套袋自交，F₃代按株系种植，鉴定株系内性状一致性和稳定性，选育出一个株系内遗传稳定的种间杂交后代新品系XJ—3(四倍体，2n=38)，该品系紫色叶片、含油率高（45％）、褐黄籽、熟期较蓉B0464相当、抗倒性、抗病性好，芥酸含量较高，还需要与双低甘蓝型油菜进行新一轮杂交选育才能在双低油菜品种选育中运用，但该品系为紫色叶片可以与绿色叶片油菜一起种植，在田间形成图案，便于拓展油菜的旅游观光功能，促进乡村旅游。

实施例3：

参见图1、图2、图5、图10，甘蓝型油菜与诸葛菜杂交转育优良基因到甘蓝型油菜中扩大甘蓝型油菜的基因资源是甘蓝型油菜资源创新、新材料创制的主要途径。甘蓝型油菜蓉B0068与诸葛菜远缘杂交，期望将诸葛菜中的早熟、高亚油酸、亚麻酸、紫花性状导入甘蓝型油菜中。由于甘蓝型油菜染色体2n=38条，诸葛菜染色体2n=24，因此用甘蓝型油菜B0068作母本更容易获得杂交F₁种子。对杂交后获得F₁代，初花期剥蕾去雄，用本申请人获得的油菜双单倍体诱导系Y3380作父本进行授粉诱导，F₂代（诱导后代）单株种植，并进行流式细胞检测、选育性正常、倍性正常、无诱导系显性性状（矮秆）植株套袋自交，F₃代按株系种植，鉴定株系内性状一致性和稳定性，选育出一个株系内遗传稳定的远缘杂交后代新品系GZG—6(四倍体，2n=38)，该品系含油率高（45％）、褐黄籽、熟期较蓉B0068提早3天，亚油酸、亚麻酸含量提高8%，花色仍为黄花。

实施例4：

参见图1、图2、图4、图11，甘蓝型油菜与萝卜甘蓝杂交转育，抗根肿病基因到甘蓝型油菜中，提高甘蓝型油菜的抗根肿病能力。甘蓝型油菜蓉C4809与萝卜甘蓝远缘杂交，期望将萝卜甘蓝的白花、抗根肿病基因转移到甘蓝型油菜中。由于甘蓝型油菜染色体2n=38条，萝卜甘蓝染色体2n=28，因此用甘蓝型油菜C4809作母本更容易获得杂交F₁种子。用萝卜甘蓝与甘蓝型油菜C4809授粉，授粉后15天取子房回实验室进行胚挽救处理，将子房消毒处理，接种在含有B5培养基+6BA（1mg/L）+NAA（0.2mg/L）的培养基中培养20—40天。待小苗长出后，在生根培养基（MS+NAA（0.005mg/L）上生根，后移栽到大田中。对胚挽救获得的杂交F₁代植株，初花期剥蕾去雄，用本申请人获得的油菜双单倍体诱导系Y3560作父本进行授粉诱导，F₂代（诱导后代）单株种植，并进行流式细胞检测、选育性正常、倍性正常、无诱导系显性性状（矮秆）植株套袋自交，F₃代按株系种植，鉴定株系内性状一致性和稳定性，选育出一个株系内遗传稳定的远缘杂交后代新品系GLG—11(2n=38)，该品系含油率高（41％）、黑籽、纯白花、抗根肿病能力较蓉C4809强70%以上，抗性还需进一步提高。

本实施例2、实施例3、实施例4中的油菜双单倍体诱导系的选育方法同实施例1。

上述实施例是对本发明的上述内容作进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法，包括以下步骤

1)对油菜种间及远缘材料通过植物根尖染色体观察，进行染色体数目调查或通过流式细胞仪确定基因组大小；

2）将具有目标性状的甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜或油菜近缘、远缘材料两两杂交、聚合杂交或回交；

根据上述步骤1）确定杂交过程中基因组小的材料作父本，基因组大的材料作母本；

3）上述步骤2）中确定的母本材料在花期进行人工去雄，并套袋隔离，人工去雄2-4天后，取上述步骤2）中确定的父本给去雄母本进行人工授粉，授粉后套袋隔离，对远缘杂交采取授粉后10—20天进行实验室胚挽救处理，保证获得远缘杂交F₁植株；

4)对上述步骤3）中杂交后代、聚合杂交后代、回交后代以及胚挽救材料，在初花期对花蕾进行人工去雄，为保证获得诱导后代，去雄数目在100个花蕾以上，并套袋隔离；

5)用油菜双单倍体诱导系花粉对上述步骤4）中去雄后2—4天植株进行人工授粉，并套袋隔离，收获其授粉后结实种子；

6)对上述步骤5）获得种子进行种植，苗期利用流式细胞仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体或具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，选择正常育性、二倍体或四倍体植株，单株套袋自交；

7）上述步骤6）为获得单株自交种子，在不清楚染色体数目及油菜类型的情况下，采用蕾期剥蕾强制自交的方式获得自交种子；

8)上述步骤7）中单株自交种子即二倍体或四倍体种子进行株系种植，调查株系形态一致性、结实性，并通过分子标记鉴定株系一致性及稳定性；

9)上述步骤8）中稳定株系观察染色体数目及染色体行为是否出现异常，获得的稳定遗传及结实性好的种间、远缘杂交植株，根据目标性状进入新一轮材料选择或直接形成油菜杂交育种亲本材料或品系；

10）上述步骤9）稳定株系根据染色体数目和外型判断为甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜，这些稳定株系直接与之对应的油菜类型的不育类型进行测交，选育恢复系、保持系；

11）上述步骤10）中获得的稳定的白菜型油菜品系需要株系内群体授粉的方式获得；

上述油菜双单倍体诱导系选育方法，包括如下步骤：

（1）选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：

①将两个油菜亲本材料杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍获得加倍后的F₁代植株；

②加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代，对F₃代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系——早代稳定系；

③获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，F₁代、F₂代鉴定早代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F₁分离，F₂代出现部分稳定株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系；

（2）选育携带显性遗传性状、具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜：

①具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交，得到杂交F₁代种子，杂交F₁种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F₁植株；

②对加倍的带显性性状的F₁植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株，带显性性状的多倍体的植株，主要是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株；

油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：

①倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株；

②上述单株测交后代如果出现全不育、为正常倍性即二倍体或四倍体油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系。

2.如权利要求1所述的油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法，其特征在于关键在于油菜双单倍体诱导系选育是将两个亲本材料杂交F₁代种子或具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，具体方法如下：

1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12—17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基上；

2）让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度23—25⁰C，白天光照12—16小时，光照强度2000—3000勒克斯，夜晚暗培养8—12小时，待植株长到1—2片真叶时，从下胚轴处剪下植株继续在第二培养基上生长；

3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养；

4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3—7天，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15—30分钟后移栽到温室中，温室温度16⁰C—25⁰C，相对湿度60—80%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6—苄基腺嘌呤 0.5—1.5mg

染色体加倍诱导剂 30—70mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第一培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6—苄基腺嘌呤 0.5—1mg

染色体加倍诱导剂 20—40mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第二培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α—萘乙酸 0.03—0.5mg

染色体加倍诱导剂 5—20mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第三培养基的pH=5.8—6.0，

上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6—1.2g

α—萘乙酸 0.5—1mg

3.如权利要求1或2所述的油菜双单倍体诱导系选育油菜种间及远缘杂交材料的方法，其特征在于染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。