CN105918107A - 利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法，属于玉米育种方法领域。本发明方法公开了组建优良基础群体，然后用诱导系产生单倍体，加倍获得DH系；再选择性状互补、散粉能力强的DH系杂交组配成新一轮群体，通过轮回选择不断提高单倍体雄花自然加倍率的育种方法。本发明方法可使玉米单倍体雄花自然加倍率显著提高，第4轮自然加倍率最高可达90％以上；其次，本发明方法克服了单倍体育种技术瓶颈，可使DH系的选育效率比现在提升百倍以上；本发明方法还具有无毒、快捷、高效、环保等优点，完全摆脱现有的剧毒、繁琐、低效的人工加倍方法；此外，本发明方法中每轮所选出的优良DH系中还可直接进入商业化育种程序。

Description

利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法

技术领域

本发明属于玉米育种方法领域，具体涉及到一种利用轮回选择方法遗传修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法

背景技术

二十一世纪初，单倍体快速纯合、分子标记辅助选择、转基因三大育种技术逐步得到世界各国玉米育种家的公认，并迅速得到全面应用。尤其双单倍体育种技术因具有耗时短、成本低、纯合程度高等常规系谱法无法比拟的突出优势，在我国发展最为迅速，并广泛应用于商业化育种，促进了我国玉米育种的跨越式发展。

目前,通过规模化诱导批量获得十万玉米诱导单倍体籽粒已非难事，技术上已经相当成熟。但是，对获得的诱导单倍体籽粒实施规模化加倍，批量获得双单倍体系(Double Haploid，简称为DH)则是最大的技术“瓶颈”，还没有很好的解决方法。

单倍体加倍方法主要有自然加倍和人工加倍两种途径。利用秋水仙素等化学药剂处理根或芽(分生组织)等人工加倍方法，即使技术熟练者对个别容易加倍的玉米单倍体材料进行加倍，获得的加倍率也仅达30％左右。但是人工加倍方法存在以下问题：首先是没有理想的加倍药剂，低毒化学药剂作用效果差，难以达到理想的加倍效果；秋水仙素加倍效果虽好，但属于剧毒严控药剂，对人畜毒性大，人体接触易引起细胞恶变，且对环境污染大，处理过程造成的幼苗死亡率很高；其次，方法复杂，操作水平要求极高；此外，人工加倍成本高。自然加倍方法是依靠单倍体本身的遗传调节能力，在自然条件下恢复雄花育性，自然状态下大多材料雄花自然加倍率极低，雄花自然加倍率在1％～10％之间，加倍率主要受基因型和环境影响(Chase,Proc IowaAcad Sci.1949.56:113-115；Beckert,in Biotechnology in Agriculture andForestry，1994,pp.201-213.Springer)。

玉米单倍体因为仅具有单套染色体，不能完成减数分裂过程而导致不育，但玉米具有非常强的自然适应能力与遗传调整修复能力，表现在孕性上则是一定比例的雌穗可结实能力与雄穗可散正常花粉能力。通常雌穗结实比例可达80％以上，但雄穗可散正常花粉率极低，不同遗传材料在0～10％之间，如果雄穗加倍率是零(该类材料通常约占30％的比例)，那么,单倍体加倍环节以前两年的基础材料组建及杂交诱导工作将前功尽弃。因此，提高雄花自然加倍率是高效进行单倍体育种的技术关键。

经检索，没有发现无毒而又高效的提高玉米诱导单倍体雄花自然加倍率的方法。

发明内容

本发明人在研究诱导玉米单倍体加倍的过程中意外发现通过轮回选择可以遗传修复并提高诱导单倍体的雄花自然加倍率，本发明是在上述发现的基础上完成的。本发明目的在于提供利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法。利用本发明方法可打破目前玉米单倍体加倍的技术瓶颈，省去最繁琐、最耗资、最耗时的人工加倍环节，依靠简捷高效的田间自然加倍就可跨越式的提高单倍体技术选育自交系的效率，从而通过提高单倍体雄花自然加倍率来提高选育双单倍体系的效率，即本发明方法可高效、无毒、快速地进行玉米DH系的选育。

本发明另一目的在于提供利用上述方法获得的玉米DH系提高其他玉米材料的单倍体雄花自然加倍率的方法。

实现本发明的技术方案如下：

本发明利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法，该方法以先提高单倍体雄花自然加倍率为中心，通过先创制出高自然加倍特性DH育种材料，然后以其为亲本杂交组群，再经DH技术轮回选择(可连续多轮进行)育成农艺性状优异和雄花自然加倍率高的DH自交系；具体步骤如下：

(1)以优良基础材料A为母本，以单倍体诱导系B为父本进行杂交，收获F₁代籽粒；在F₁代籽粒中，通过标记性状选择准单倍体籽粒，剔除非单倍体籽粒；所述的标记性状是指籽粒的胚乳糊粉层紫色、胚芽无色；

(2)在田间播种步骤(1)所得的准单倍体籽粒或移栽已进行过加倍处理的准单倍体幼苗于田间；在抽穗期前，根据形态特征剔除杂株、劣株；在开花散粉期选择农艺性状好、且具有较多花药散粉的的单株自交，收获得第一轮DH系(Double Haploid，双单倍体，简称为DH)种子；

(3)种植步骤(2)所得的DH系，根据田间性状综合表现选择2个或2个以上农艺性状优良、且优缺点性状互补的DH系进行杂交，获得的杂交组合即为组建的第二轮群体C；

(4)种植群体C，重复步骤(1)～(3)1-n次，逐轮提升单倍体雄花自然加倍率，获得相应的雄花自然加倍率高的二轮DH系(DH²)、三轮DH系(DH³)、或n轮DH系(DHⁿ)等。

利用上述方法中所得的DH系作为亲本之一，组配杂交种。

上述方法步骤(1)中所述的优良基础材料A是指农艺性状好的杂合材料，如单交种、三交种、双交种、顶交种、农家种及人工综合种等。

上述方法步骤(1)中所述的单倍体诱导系B是指具有杂交诱导母本孤雌生殖的玉米材料。如吉高诱系列的吉高诱系3号、吉高诱系31号、RWS、农大高诱系列的农大高诱1号、农大高诱5号或其他诱导系等。

所述的吉高诱系3号已在专利申请《一种利用杂交诱导单性结实材料选育玉米新品种的方法》(申请号为：2006100808324)和在《玉米高频率单倍生殖诱导系吉高诱系3号的选育》(才卓等.玉米科学2007，15(1)：1-4)中公开。吉林省农业科学院承诺自本申请之日起20年内向公众提供吉高诱系3号(Zea mays L.)材料。

所述的吉高诱系31号已于2010年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.P201008。

所述的农大高诱1号、农大高诱5号等可由中国农业大学获得。

所述的RWS可自霍恩海姆大学获得。

上述方法步骤(1)中所述的标记性状是指Navajo标记，所述的Navajo标记是指胚乳糊粉层为紫色、胚芽无色的即为单倍体籽粒。糊粉层与胚芽均为紫色或无色的为杂交二倍体籽粒。应用紫色茎秆诱导系时，紫色茎秆标记是作为苗期单倍体植株鉴别的重要依据，凡紫色茎秆株砍除。

上述方法步骤(2)中所述的形态特征是指叶片较少、狭窄、直立，偶尔出现白斑；植株瘦弱，生长缓慢，镜检细胞较小的植株均为单倍体。玉米单倍体是二倍体植株高度的70％，株高鉴定是鉴定单倍体植株最快速的方法，但植株生长势介于单倍体植株和杂交植株之间、叶片叶鞘绿色是单倍体自然加倍形成的二倍体植株(EDH系)，自交后即可成自交系。叶片叶鞘紫色、植株瘦弱则是来自诱导系的单倍体植株。凡幼苗叶鞘、叶片为紫色(来源紫色植株诱导系)，植株粗大高壮者均不是单倍体,予以田间淘汰；还需要根据幼苗的生长发育速度、株高、叶片长度、叶色以及叶片夹角等判断。

上述方法步骤(2)或步骤(4)及后续各轮中均可获得DH系，所得的DH系中可直接选择综合性状优异、一般配合力高的DH系作为商业自交系应用于育种。

上述方法步骤(3)中所述的群体C可以是不同组合组成的多个不同的群；如群体C₁、群体C₂、群体C₃、―――或群体C_n等。所述的群体C尽可能聚留群体A的所有优良性状，淘汰劣性基因。

上述方法中步骤(2)中所述的单倍体诱导系B在各轮诱导中均作为工具材料(父本)，群体A、群体C(C1、C2、---、Cn)或群体D(D1、D2、---、Dn)分别作为选系基础群体(母本)。

上述方法步骤(3)中所述的杂交的方法为人工辅助授粉，或采用隔离区自然授粉等。

所述的人工辅助授粉包括将父本和母本分别种植成小区，在母本抽丝前将雌穗套袋；在父本散粉期，取父本花粉为母本授粉；

所述的自然授粉包括选择合适的隔离区，4～6行母本相间种植1行父本，在母本散粉前，将母本植株全部人工去雄，借助自然力完成授粉；其中所述的隔离区为试验地周围200米以内无其他玉米种植。

本发明还提供了利用上述方法获得的雄花自然加倍率高的玉米DH系改良同一杂种优势类群中雄花自然加倍率低的遗传材料的方法，包括将上述雄花自然加倍率高的DH系或DH系杂交组合作为亲本之一，与同一杂种优势类群的其它雄花自然加倍率低的遗传材料杂交，再以所得的杂交后代作为基础群体，利用上述方法步骤(1)～(4)逐轮提升单倍体雄花自然加倍率，育成雄花自然加倍率高，综合性状优异的杂种优势类群血缘纯合的DH系；所述的遗传材料是指自交系、杂交种、育种中间材料或综合群体等。

所述的杂种优势群是指本领域技术人员熟知的瑞德、BSS群、NSS群、塘群、旅群或衣阿华马齿群等。

本发明还提供了利用上述雄花自然加倍率高的DH系改良其它雄花自然加倍率低的玉米杂种优势群的方法，包括以上述方法中所得的雄花自然加倍率高的DH系或DH系组合为亲本(或选其高自然加倍率位目标性状,进行回交组建基础群体)，与其他杂种优势群的遗传材料杂交，再以所得杂交后代作为基础群体，利用上述方法步骤(1)～(4)，逐轮提高单倍体雄花自然加倍率，育成雄花自然加倍率高，综合性状优异的新DH系。通过此方法，将其高自然加倍特性回交导入到各遗传类群骨干自交系，形成不同杂尤类群核心商业化育种种质。

所述的其他玉米杂种优势群是指本领域技术人员熟知的瑞德、BSS群、NSS群、塘群、旅群或衣阿华马齿群等。

与现有技术相比，本发明方法具有的优点和有益效果为：(1)本发明方法可使玉米单倍体雄花自然加倍率显著提高，一般组合最初几轮雄花自然加倍率在原有基础群体基础上可提高1倍以上，第4轮自然加倍率最高可达90％以上，结实穗率可达70％以上。(2)随着DH轮选代数的增加，其雄花自然加倍率逐步得到改良，可形成基于自然加倍方法的单倍体规模化育种技术体系，选育DH系的效率比现有单倍体育种技术上提升百倍以上。(3)本发明方法具有无毒、快捷、高效、环保等优点，完全摆脱现有的剧毒、繁琐、低效的人工加倍方法，具有操作简单，无毒高效的优势，避免生产过程中发生人身伤害，可应用于规模化DH系创制，纳入商业化育种流程。(4)本发明方法中每轮所选出的优良DH系中均可选择部分综合性状优良、配合力高的优秀DH自交系直接进入商业化育种程序。(5)本发明方法的每轮选择过程中，可选用几个不同血缘类群的常用骨干高配合力自交系作为测验系，对每轮入选的综合性状突出DH自交系进行测交，可随时选出农艺性状好、配合力高的DH系和相应的测交组合，即杂交种。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明均为玉米育种领域所使用的常规技术。下述实施例中，基础群体A为先玉335，是生产上大面积推广品种，可从敦煌种业先锋良种有限公司等商业途径获得；所用的单倍体诱导系B为吉高诱系3号，由吉林省农业科学院选育，具有子粒Navajo标记性状明显、稳定,花粉量大、结实性好、抗病性强等优点，平均诱导率是10.4％。吉高诱系3号已在《玉米高频率单倍生殖诱导系吉高诱系3号的选育》(才卓等.玉米科学2007，15(1)：1-4)中公开，公众可从吉林省农业科学院获得(见有关提供生物材料声明)，吉高诱系3号的所有者吉林省农业科学院承诺自本申请之日起二十年内向公众提供吉高诱系3号(Zea mays L.)的生物材料。

实施例1、通过轮回选择方法选择雄花自然加倍率高的DH系的选育方法

按照如下方法进行：

(1)、玉米单倍体籽粒的诱导

2006年在吉林省公主岭市，以先玉335作为基础群体A(母本)；以作为单倍体诱导系B的吉高诱系3号(来自吉林省农业科学院)为父本杂交，收获得F₁代籽粒，根据navajo遗传标记逐粒挑选，选择具有胚芽无色、籽粒糊粉层顶端(籽粒冠顶)紫色、胚近三角形的为准单倍体籽粒。

(2)、在田间种植并根据形态特征对单倍体植株进行筛选

将步骤(1)所得的准单倍体籽粒种植于单倍体规模化育种圃场，种植密度为105000株/公顷，精细田间管理，确保幼苗健康生长。抽穗期前根据形态特征，及时去除具有植株高壮和诱导标记特征(叶鞘和叶片为紫色)的杂株。

(3)、单倍体植株的自然加倍与授粉

对于步骤(2)确定的单倍体植株，在散粉期前每个雌穗花丝抽出前套白色纸袋，并要每日观察其散粉情况，发现有明显花粉的花药外露植株，小心集取花粉，精细自交授粉，更换绿色纸袋。绿色纸袋与单倍体总株数百分比值用于计算加倍率指标1；

雄花加倍率％＝绿色纸袋数/单倍体总株数×100。

(4)、双单倍体籽粒(DH系)的收获与保存

自交果穗成熟或授粉35天左右，注意观察籽粒动态，及时收获，防止籽粒开裂或腐烂。小心单穗收获，避免籽粒丢失。干燥后仔细脱粒，妥善保管。收获时统计收获到种子的植株数，以收获到种子的植株与单倍体总株数的百分比值用来计算加倍率指标2；

果穗获得加倍率％＝收获穗数/单倍体总株数×100。

(5)、双单倍体植株的鉴定和繁殖

将获得的双单倍体籽粒按单穗分行种植，田间精细管理，确保植株长势整齐，在拔节期、开花期前根据植株形态特征判断剔除杂株、淘汰劣行和不纯合DH系。对选留的植株、穗行自交授粉，收获期再次根据果穗形态特征判断剔除杂株、淘汰劣行和不纯合DH系后按单行收获脱籽粒，即为第一轮DH系种子。

(6)、DH系的鉴选和杂交

将上季扩繁收获的DH系种子，种植于田间，每份材料种一行，观察其长势及有关农艺性状，开花期要及时套袋自交留种；同时，根据两年表现，有针对性地选择2个以上符合当地育种目标性状的优良DH系(缺点能够互相弥补)再杂交，组成群体C(群体C₁、C₂、C₃，---)；对非常优异的DH穗行，可选择合适的测验种杂交测配，进入组合育种程序。

(7)、二轮选择

将上季收获的DH姊妹系杂交群体种子(群体C₁、C₂、C₃，---)分别种植于田间，重复上述步骤(1)至步骤(5)，即可获得二轮DH系(或称DH²)。

(8)、三轮DH系选择、四轮DH系选择

将步骤(7)所得的DH系重复上述步骤(1)至步骤(5)，即可获得更新一轮的DH系，即三轮DH系(或称DH³)。

结果(见表1)最初两轮大部分重组群体的加倍率可以达到原基础群体的加倍率的2倍，三轮DH系优良组合可达到90％以上，自交结实率甚至超过65％，这些自然加倍率高的群体同时也因经过2轮全基因组配子体选择，淘汰了有害、劣性基因，聚合了较多优良基因，具有了较多的优良农艺性状和生态适应性。

由此可见，通过本发明方法获得的玉米群体的单倍体雄花自然加倍率大大提高，达到甚至超过化学加倍的效果(化学加倍方法的加倍率在10％～30％)。所以，此方法可为育种实践提供优良的高自然加倍率的基础群体，从而减少高毒低效的化学加倍方法的使用，实现单倍体育种的规模化工程化和简单化。

表1.本发明利用轮回选择提高单倍体雄花自然加倍率实验结果

注：X1132X为先玉335参加区试时的代号，即X1132X和先玉335是同一品种的两个不同名称

实施例2、雄花自然加倍率高的遗传材料(DH系)的应用试验

(一)、材料来源：选用雄花自然加倍率高的07先335-58-2*07先335-128与自然加倍率低的自交系四287为试验材料；07先335-58-2*07先335-128为利用本发明方法产出获得的DH²系，四287为吉林省农科院育成的自交系，全国主要育种单位均有。

(二)、试验设计：高雄花自然加倍率DH²与低自然加倍率自交系杂交，组建基础群体；次代用吉高诱3号诱导系进行杂交诱导，获得单倍体籽粒；再通过种植单倍体籽粒，开花期标记散粉株，自交授粉，获得单倍体自然加倍率数据，验证高自然加倍率材料改良低自然加倍率材料的效果。

(三)、试验方法：

(1)、基础群体的组建

2014年在公主岭以经过轮回遗传修复改良所获得的雄花自然加倍率高的二环DH系07先335-58-2*07先335-128为母本(自然加倍率果穗获得率31.26％)，以自然加倍率低的自交系四287为父本(两年平均自然加倍散粉株率4.67％、果穗获得率0.91％)，组配出F₁代杂交籽粒作为基础群体A1。

表2.不同雄花自然加倍率遗传材料杂交试验结果

(2)、玉米单倍体籽粒的获得

以由步骤(1)获得的基础群体A1为母本；按实施例1的步骤(1)～(5)操作，获得单倍体籽粒1437粒,花期标记散粉株333株,散粉率23.17％,经自然加倍DH系205穗，获得DH果穗率14.27％。结果(见表2)验证了以雄花自然加倍率高的材料作为亲本组群可以大幅度提高单倍体自然加倍率及DH系获得率。

对于从事本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，可以做出若干改进和润饰(包括基础材料的选择、操作步骤的优化等)，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)以优良基础材料A为母本，以单倍体诱导系B为父本进行杂交，收获F₁代籽粒；在F₁代籽粒中，通过标记性状选择准单倍体籽粒，剔除非单倍体籽粒；所述的标记性状是指籽粒的胚乳糊粉层紫色、胚芽无色；

(2)在田间播种步骤(1)所得的准单倍体籽粒或移栽已进行过加倍处理的准单倍体幼苗于田间；在抽穗期前，根据形态特征剔除杂株、劣株；在开花散粉期选择农艺性状好、且具有较多花药散粉的的单株自交，收获得第一轮DH系种子；

(3)种植步骤(2)所得的DH系，根据田间性状综合表现选择2个或2个以上农艺性状优良、且优缺点性状互补的DH系进行杂交，获得的杂交组合即为组建的第二轮群体C；

(4)种植群体C，重复步骤(1)～(3)1-n次，逐轮提升单倍体雄花自然加倍率，获得相应的雄花自然加倍率高的二轮DH系(DH²)、三轮DH系(DH³)、或n轮DH系(DHⁿ)。

2.利用权利要求1所述方法中所得的DH系作为亲本之一，组配杂交种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的优良基础材料A是指单交种、三交种、双交种、顶交种、农家种及人工综合种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的单倍体诱导系B是指吉高诱系3号、吉高诱系31号、RWS、农大高诱1号或农大高诱5号。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的标记性状是指Navajo标记，所述的Navajo标记是指胚乳糊粉层为紫色、胚芽无色的即为单倍体籽粒。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于其步骤(2)中所述的形态特征是指叶片较少、狭窄、直立，偶尔出现白斑；植株瘦弱，生长缓慢，镜检细胞较小的植株均为单倍体。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于其步骤(3)中所述的群体C是不同组合组成的多个不同的群。

8.利用权利要求1所述的方法获得的雄花自然加倍率高的玉米DH系改良同一杂种优势类群中雄花自然加倍率低的遗传材料的方法，其特征在于将权利要求1方法所得的雄花自然加倍率高的DH系或DH系杂交组合作为亲本之一，与同一杂种优势类群的其它雄花自然加倍率低的遗传材料杂交，再以所得的杂交后代作为基础群体，利用权利要求1所述方法步骤(1)～(4)逐轮提升单倍体雄花自然加倍率，育成雄花自然加倍率高，综合性状优异的杂种优势类群血缘纯合的DH系；所述的遗传材料是指自交系、杂交种、育种中间材料或综合群体等。

9.利用权利要求1所述的方法获得的雄花自然加倍率高的DH系改良雄花自然加倍率低的其他玉米杂种优势群的方法，其特征在于以权利要求1中所述的方法中所得的雄花自然加倍率高的DH系或DH系组合为亲本，与其他杂种优势群的遗传材料杂交，再以所得杂交后代作为基础群体，利用权利要求1所述方法步骤(1)～(4)，逐轮提高单倍体雄花自然加倍率，育成雄花自然加倍率高，综合性状优异的新DH系。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述的杂种优势群是指瑞德、BSS群、NSS群、塘群、旅群或衣阿华马齿群等。