CN110692511A - 依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其包括：S1.收集十字花科作物的种质资源，测定基因组大小E；S2.将基因组大小相对差值百分比T在2～20%的十字花科作物正反杂交获得F1代；S3.种植F1代并人工去雄；S4.用油菜双单倍诱导系对F1代诱导后获得Y1F2代；S5.种植Y1F2代，选择整齐且育性、倍性正常的单株自交获得Y1F3代；S6.种植Y1F3代，鉴定其稳定性，同时分析各Y1F3代基因组大小Eyx的正态分布情况；S7.调查Y1F3代的目的性状；S8.选择有目标性状且Eyx位于正态分布两端3～5%的株系，作为改良的育种新材料。本发明具有改良周期短、效率高、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于农作物育种技术领域，涉及一种依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法。
背景技术
十字花科作物包括大白菜、小白菜、菜心、薹菜、紫菜薹、乌塌菜、芜菁、小花菜、青菜、白菜型油菜、结球甘蓝(卷心菜)、羽衣甘蓝、灌木甘蓝、抱子甘蓝、苤蓝、芥蓝、花椰菜(花菜)、西兰花、大头菜、甘蓝型油菜、芥菜、榨菜、芥菜型油菜、萝卜等作物，是餐桌上常见的食材原料，因其具有较高的膳食纤维、低热量、营养成分丰富等特点，为人们提供优质的营养。同时，十字花科作物中的油菜也是主要的油料作物，其种子是食用油的重要来源，为人们提供了丰富的多不饱和脂肪酸。可见，十字花科作物具有重要的经济价值。
目前，基本实现了利用杂种优势选育具有优良性状的十字花科作物的杂交种，以供人们种植和食用。在杂种优势利用途径中，具有基因纯合、表型整齐、农艺性状优良等特点的多年自交的优良亲本是获得优质杂交种的关键所在，在优良亲本自交系的选育过程中，往往是通过连续多代自交的方式才能获得性状优良、表型整齐一致、遗传基础纯合的自交系。虽然连续多代自交的方式可以让基因组得到大量的重组和交换，但需要花费大量时间、人力、物力，同时自交衰退现象也会使得材料本身的某些抗性、长势等变弱。
因此，在优良亲本选育过程中对其进行遗传改良，使其保留大部分优良性状、改良优化个别有缺陷的不良性状，进而提高其利用价值，是目前杂交育种亲本选育的主要方向和策略。传统的改良方法是通过连续多代回交对自交系进行改良，最终选择目标性状达标的株系，与原始受体亲本进行基因位点比对，达到定向改良目标，此方法由于受到需改良性状的数量和遗传特性、供体材料的遗传背景、环境差异等因素，使得改良周期和效果存在诸多不确定性。另外，压力选择法也是改良亲本常见的一种方式，即在常规回交选育法基础上导入目标性状的发生环境，使得目标性状产生更强的环境耐受能力，进而选择抗性好、与受体目标性状相近的单株，继续回交选育，使得选择抗性单株更加准确，使抗性基因积累更加有效，此方法是在特定环境下使得目标性状具有较高的适应性，但同时也可能会使原本优良的性状遭到破坏，加之该方法主要是挖掘受体材料个体之间的微小差异，受体材料纯合度过高，反而不利于选择出抗性好的目标单株。
综上所述，传统的改良方法在运用操作时，普遍存在周期长、费工费时、改良结果的不确定性等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，以便于得到十字花科作物优良亲本，解决十字花科作物杂种优势利用过程中强优势组合亲本的选配及改良问题，不需要亲本连续自交多代，更无需让稳定的亲本连续回交多代，进而选育出符合具有较高优良性状的亲本。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，包括以下步骤：
S1.收集十字花科作物的种质资源并鉴定种质资源材料的特性，测定各种质资源材料的基因组大小E。十字花科作物主产的蔬菜和油料作物，优选的，所述的十字花科作物包括大白菜、小白菜、菜心、薹菜、紫菜薹、乌塌菜、芜菁、小花菜、青菜、白菜型油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、灌木甘蓝、抱子甘蓝、苤蓝、芥蓝、花椰菜、西兰花、大头菜、甘蓝型油菜、芥菜、榨菜、芥菜型油菜和萝卜。
上述鉴定的种质资源材料的特性包括株高、生育期、抗病性、抗倒性、抗寒性、开花期、种子产量、生物产量和品质。这里的种子产量主要指单株收获得到的种子的量；生物产量是指作物整个生育过程中通过光合作用生产和积累的有机物的总量；品质是指种植得到的产物的物理性状、化学特点及营养价值，如油料作物的含油量及脂肪酸组成、蔬菜的糖分及维生素含量等。
S2.将带有目标性状、遗传稳定且基因组大小相对差值百分比T在2～20％的两个相同倍性同一亚种的十字花科作物进行人工去雄后正反杂交，收获杂交F1代种子。
S3.对步骤S2收获的杂交F1代进行种植，并在初花期对F1代进行人工去雄或化学杀雄，并套袋或隔离网隔离。
S4.用油菜双单倍诱导系对步骤S3中人工去雄或化学杀雄后的F1代进行人工或壁蜂辅助授粉，收获得到Y1F2代。
S5.对步骤S4收获的Y1F2代进行种植，Y1F2代种植每行5～6株，株距18～25cm。选择苗期形态整齐一致且育性、倍性正常的单株套袋自交或剥蕾强制自交，自交数目在500株以上，收获得到Y1F3代。
S6.对步骤S5收获的Y1F3代进行种植，优选的，Y1F3代每个播种3～5行，每行5～6株，株距18～25cm。在苗期，各株系内选择至少3株通过形态学和分子标记鉴定其一致性和稳定性，淘汰杂株；测定各遗传稳定的Y1F3代株系的基因组大小Eyx，并分析各稳定株系间基Eyx的正态分布情况。其中，y表示经油菜诱导系诱导形成的Y1F3代，x表示测定Y1F3代基因组大小的株系数目，x＝1、2、3、……、n，n≥500，即各遗传稳定的Y1F3代株系的基因组大小表示为Ey1、Ey2、Ey3、……、Eyn，n≥500表示要测定的Y1F3代基因组大小的株系数目大于等于500。
S7.调查统计步骤S6中Eyx符合正态分布的各Y1F3代遗传稳定株系的目的性状。
S8.选择具有双亲目标性状且Eyx分布位于正态分布两端3～5％的株系，作为改良后的育种新材料。
进一步的，所述的基因组大小的测定采用流式细胞技术，
其中，L1为作物G1期荧光强度值，L0为参照作物G1期荧光强度值，E0为参照作物的基因组大小，所述参照作物为已知基因组大小的同种或同属植物。根据测定和计算结果，进一步计算两个相同倍性同一亚种的十字花科作物间的基因组大小相对差值百分比T，
其中，E1为两个十字花科作物中较小的基因组大小值，E2为两个十字花科作物中较大的基因组大小值。
按孟德尔遗传学规律，杂交F1代为杂合基因型，其自交形成的F2代会发生性状分离。利用亲本基因组大小差异杂交获得的杂交F1代在减数分裂中形成的配子体(卵细胞和精细胞、卵细胞和卵细胞、精细胞和精细胞)之间基因组的基因型和基因结构必然存在差异，而常规多代自交或回交中，基因的重组和交换会使得这种基因组差异被缩小或忽视，获得的自交系(或回交后代)之间基因组差异缩小，更接近正态分布的中亲值或回交父本。本发明利用油菜双单倍体诱导系，将每个母本卵细胞进行基因组加倍，使原本存在差异的基因组被固定，即每个经诱导的稳定后代不会因为自交或回交改变其自身的基因组。另外，基因组大小被认为是植物最基本和最重要的生物多样性参数，具有种的特征。而染色体空间结构和非编码的DNA重复序列数量等存在较大差异导致基因组大小呈现无规律差异，处在杂合状态F1代的每个卵细胞之间的基因型和基因结构均有不同，其基因组大小也必然存在差异，经诱导系诱导的F1代再自交得到的每个不同性状表现类型的Y1F3代的DH系，应该表现为株系内基因组大小表现一致、株系间基因组大小存在差异。这种基因组大小差异的固定与作物性状结合，可以更好地突出被改良材料的优势目标性状。
上述油菜双单倍诱导系的选育方法，包括如下步骤：
1)选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：
a.将两个油菜亲本材料杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行染色体人工加倍，获得加倍后的F1代植株。
b.将步骤a中加倍后的F1代植株进行自交或强制剥蕾自交获得F2代，对F2代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F3代。通过形态、细胞学以及分子标记对F3代进行纯合度鉴定，鉴定结果显示的各单株之间分子标记图谱一致且均为两个亲本的杂交后代的单株，为纯合的早代稳定系。
c.将步骤b获得的早代稳定系与10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，鉴定正反交杂交后代的F1代、F2代的早代稳定系的遗传特性，所述早代稳定系的遗传特性为孤雌生殖特性，当鉴定结果为F1代分离、F2代有稳定株系时，对应的早代稳定系为具有孤雌生殖遗传的早代稳定系。
2)选育携带显性遗传性状、具有孤雌生殖遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜：
a.具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交，得到杂交F1代种子，杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行染色体人工加倍，得到加倍后的带显性性状的F1植株。
b.对步骤a中加倍后的带显性性状的F1植株进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株以及不带显性性状加倍植株；显性性状的多倍体的植株是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株。
3)油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：
a.倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性基因能去除其对油菜测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株。
b.上述单株测交后代出现全不育、正常倍性(即二倍体或四倍体)、不带显性性状的油菜，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系。
油菜双单倍体诱导系的特点是具有孤雌生殖诱导基因，当诱导系作父本时，诱导系精细胞染色体没有与母本卵细胞染色体相融合，而是诱导母本卵细胞产生孤雌生殖且孤雌生殖卵细胞染色体会自然加班形成双单倍体。
上述油菜双单倍体诱导系的选育方法的步骤1)或2)的a中，杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行染色体人工加倍的具体方法如下：
1)用体积分数为75％的酒精对种子表面消毒25～40秒，用0.1％升汞消毒12～17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子的水分吸干；将种子接种在第一培养基上，培养条件为：温度23～25℃，白天光照12～16小时，光照强度2000～3000勒克斯，夜晚暗培养8～12小时。
2)种子在第一培养基内生长至1～2片真叶时，从下胚轴处剪下植株移至第二培养基上继续生长。
3)植株生长至有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养，生根培养两周，植株长出粗壮的根。
4)将植株在室温下炼苗3～7天，用自来水冲洗干净植物根部的培养基，并在浸泡缓冲液中浸泡15～30分钟后移栽到温室中，温室温度16～25℃，相对湿度60～80％，保证移栽成活率在95％以上。
所述第一培养基由以下配比的组分组成：1L的MS培养基，0.5～1.5mg的6-苄基腺嘌呤，30～70mg的染色体加倍诱导剂，20～30g的蔗糖，8～10g的琼脂，所述第一培养基的pH值为5.8～6。
所述第二培养基由以下配比的组分组成：1L的MS培养基，0.5～1mg的6-苄基腺嘌呤，20～40mg的染色体加倍诱导剂，20～30g的蔗糖，8～10g的琼脂，所述第二培养基的pH值为5.8～6。
所述第三培养基由以下配比的组分组成：1L的MS培养基，0.03～0.5mg的6-苄基腺嘌呤，5～20mg的染色体加倍诱导剂，20～30g的蔗糖，8～10g的琼脂，所述第三培养基的pH值为5.8～6。
所述浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：1L的水，0.6～1.2g的易保或克露，0.5～1mg的α-萘乙酸。
所述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。
本发明通过对两个基因组大小存在差异、农艺性状优良、结实率高、产量好、抗性强的十字花科作物杂交，使杂种F1代兼有双亲遗传特性，利用油菜双单倍体诱导系对F1代授粉，每个卵细胞孤雌生殖并染色体自然加倍后形成的株系(即Y1F2代)间，会出现兼有亲本优良性状且综合表现一般、兼有亲本优良性状且综合表现突出、兼有亲本优良性状且个别性状表现突出等不同类型基因型纯合的株系。将基因型纯合的若干不同类型的Y1F2代株系自交，即可获得不同性状表现的DH群体(即Y1F3代)。因此，这些Y1F3代的株系间基因组大小的差异与株系间不同类型的性状表现存一一对应关系。本发明通过使用油菜双单倍体诱导系使兼有亲本优良性状的十字花科作物的杂种F1代达到基因型快速纯合的目的，在结合每个诱导后代纯合群体的基因组大小差异，快速选择具有较多目标性状的株系，作为改良后可供利用的育种新材料，有利于显著提高育种效率。
本发明的有益效果是：
1)本发明的方法对十字花科作物在杂种优势利用途径中强优势组合亲本的选配及改良具有现实指导意义，从而解决了现有亲本改良的技术方法中存在的改良周期长、改良效果不确定性以及费时费工等问题。
2)本发明的方法操作方便、易于掌握，省去了亲本连续自交多代或稳定的亲本自交系连续回交多代的过程，即可选育出符合具有较高优良性状的亲本。
3)本发明利用油菜双单倍体诱导系直接诱导各类十字花科的杂交F1代，使其基因型快速纯合稳定，获得遗传稳定、目标性状优良的DH纯合群体，无需繁琐的小孢子离体培养技术。
4)本发明的方法能够快速获得符合目标性状且遗传稳定的群体，最快3代即可，有效降低了基础研究周期和人力物力的投入，大大提高了育种效率。
5)本发明的方法适用于十字花科包括大白菜、小白菜、菜心、薹菜、紫菜薹、乌塌菜、芜菁、小花菜、青菜、白菜型油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、灌木甘蓝、抱子甘蓝、苤蓝、芥蓝、花椰菜、西兰花、大头菜、甘蓝型油菜、芥菜、榨菜、芥菜型油菜、萝卜等作物，应用广泛。
6)本发明中对基因组大小的测定采用流式细胞技术，无需通过高通量基因组测序的方式，在普通实验室即可完成测定，方便高效。
附图说明
图1为本发明改良方法的流程示意图。
图2为本发明遗传稳定的Y1F3代株系基因组大小正态分布图。
图3为本发明实施例一改良甘蓝性状的流程示意图。
图4为本发明选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系P3-2的流程示意图。
图5为本发明油菜双单倍体诱导系Y3560(或Y3880)选育流程示意图。
图6为本发明实施例二改良油菜性状的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
参见图1和图3，本实施例提供一种依据基因组大小改良甘蓝性状的方法，改良目的为快速获得若干抗病性强、产量高、耐储运等综合性状或单一性状表现突出的甘蓝纯合品种作为亲本，来进一步提升甘蓝杂种优势的利用率。通过对甘蓝的种质资源材料进行收集、鉴定和基因组大小测定，选择基因组大小相对差值百分比T为8％的甘蓝抗病(抗黑腐病和抗软腐病)且高产的纯合品系蓉抗101与甘蓝耐储运纯合品系蓉储203去雄后杂交，得到F1代种子。
选择合适的播期播种F1代，使F1代与油菜双单倍体诱导系的花期相遇，在初花期对F1代进行人工去雄后，用油菜双单倍体诱导系Y3380授粉诱导，获得F2代(即Y1F2代)种子共683粒。
将683粒F2代种植在肥力梯度均匀的试验田中，每行6株，株距25cm，苗期对每株进行挂牌调查，其中，有649个单株为甘蓝外形、育性正常且流式测定结果为二倍体。将这649个单株套袋自交，获得F3代(即Y1F3代)。
将649个F2代株自交的F3代种子播种在肥力梯度均匀的试验田中，每个播种5行，每行6株，株距25cm，通过苗期的形态学观察鉴定，有632个F3代的株系内形态表现一致。在632个F3代单个株系内随机选取3株，利用多态性好的引物进行SSR分子标记鉴定，其中，有613个F3代在各自株系内扩增条带表现一致，说明这613个F3代群体，每个群体均为表型一致、基因纯合、遗传稳定的DH系。对这613个稳定遗传F3代的基因组大小Eyx(x＝1、2、3、……、613)进行测定(每个株系随机挑选3株，计算平均值)，绘制出基因组大小Eyx的正态分布图(参见图2)。
在成熟期对613个遗传稳定的F3代进行农艺性状调查(每个株系随机挑选5株，测定并计算其平均表现)。其中，有32个纯合株系具有耐储运、产量高、抗黑腐病和抗软腐病等综合性状表现突出，且有31个纯合株系的基因组大小主要集中在图2的H2区，1个纯合株系的基因组大小在图2的H0区；有18个纯合株系具有耐储运、产量高、抗黑腐病或抗软腐病等单一性状表现较为突出，且这些纯合株系的基因组大小主要集中在图2的H1区；其余563个纯合株系具有耐储运、产量高、抗黑腐病和抗软腐病等两种种或两种以上性状，但表现一般，其中547个纯合株系的基因组大小主要集中在图2的H0区，16个纯合株系的基因组大小集中在图2的H1区。最终，选择基因组大小分布在H2区的31个综合性状表现突出的纯合株系和分布在H1区的18个单一性状表现突出的纯合株系，作为改良后的甘蓝育种新材料，进一步配制甘蓝杂交种，以提高甘蓝杂种优势利用效率，选配出更高产、优质的杂交品种。
本实施例中采用的油菜双单倍体诱导系Y3380是通过以下方式选育得到的：
参见图4和图5，通过对甘蓝型油菜F009(染色体2n＝38)与白菜型油菜YH(雅安黄油菜，2n＝20)剥蕾进行人工去雄杂交获得F1代杂交种，F1代杂交种在培养基上用秋水仙素进行染色体人工加倍，对加倍后的F1代植株进行自交获得F2代，对F2代正常可育单株进行自交获得F3代。种植F3代单株株系，有32％的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致的株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致且形态未出现异常，为正常四倍体。SSR分子标记中每个亲本间特异引物扩增带型显示，每个单株都是F009与YH的杂交后代，且每个单株之间扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，定名为早代稳定系P3-2。将P3-2与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F1代出现分离，且这3个组合F2代出现稳定株系，说明P3-2具有孤雌生殖遗传特性。
用上述P3-2与四倍体高芥酸、矮杆甘蓝型油菜4247(高芥酸、矮杆为显性性状)和四倍体甘蓝型矮杆油菜D3-5(矮杆为显性性状)分别正反杂交，收获的F1代杂交种在培养基上用秋水仙素进行染色体人工加倍，并利用根尖显微镜观察技术鉴定倍性，分别得到两个矮杆八倍体植株，定名为Y3560和Y3380。
用Y3380作父本与甘蓝型油菜中双11(常规品种，纯合系)去雄杂交，获得F1代植株70株，70株F1代形态与中双11完全相同，且每个单株自交后F2代未发生分离，为稳定株系，与中双11形态也完全相同，说明F1代为纯系。即Y3380与中双11杂交过程中，诱导中双11发生了孤雌生殖，所产生的F1代为孤雌生殖自交，是纯合系，因此F1、F2均稳定，且与中双11形态完全相同，诱导率100％。
用Y3380作父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH(二倍体油菜，2n＝20)去雄杂交，获得杂交F1代植株98株，有97株F1代形态与YH完全相同，且每个单株自交后F2代形态都为二倍体，外形与YH一致。说明Y3380与YH杂交过程中，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F1代为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，诱导率98.9％。
用Y3560作父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH(二倍体油菜，2n＝20)去雄杂交，获得杂交F1代植株145株，有143株F1代形态与YH完全相同，且每个单株自交后F2代形态都为二倍体、外形与YH一致。说明Y3560与YH杂交过程中，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F1代为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，诱导率98.6％。
用Y3560作父本与芥菜型油菜GW(四倍体油菜，2n＝36)去雄杂交，获得杂交F1代植株124株，有123株F1代形态与GW完全相同，且每个单株自交后F2代形态都为四倍体、外形与GW一致。说明Y3560与GW杂交过程中，诱导GW发生了孤雌生殖，所产生的F1代为孤雌生殖自交，且与GW形态完全相同，诱导率99.2％。
最终，显性矮杆八倍体植株Y3560和Y3380确定为油菜双单倍体诱导系。
上述种子在培养基上利用秋水仙素进行染色体人工加倍，具体方法如下：
1)用75％的酒精对种子表面消毒25秒，用0.1％升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干。将消毒后的种子接种在第一培养基(本实施例的第一培养基组成为：1L的MS培养基，0.5mg的6-苄基腺嘌呤，50mg的秋水仙素，20g的蔗糖，8g的琼脂，pH＝5.8～6.0)，培养条件：温度25，℃白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，夜晚暗培养8小时。
2)待植株长到1～2片真叶时，从下胚轴处剪下植株在第二培养基(本实施例的第二培养基组成为：1L的MS培养基，0.5mg的6-苄基腺嘌呤，30mg的秋水仙素，30g的蔗糖，8g的琼脂，pH＝5.8～6.0)上继续生长，培养条件不变。
3)待植株生长至有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基(本实施例的第三培养基组成为：1L的MS培养基，0.03mg的6-苄基腺嘌呤，20mg的秋水仙素，20g的蔗糖，8g的琼脂，pH＝5.8～6.0)中进行生根培养，培养条件不变，待生根培养约二周后，植株会长出粗壮的根。
(4)将植株在室温下炼苗7天后，用自来水冲洗干净植株根部的培养基，并在浸泡缓冲液(本实施例的浸泡缓冲液组成为：1L的水，0.6g的易保或克露，0.5mg的α-萘乙酸)中浸泡30分钟后移栽到温室中，温室温度25，℃相对湿度60％，能保证移栽成活率在95％以上。
本实施例中，利用流式细胞仪对甘蓝基因组大小测定的具体操作如下：
利用改良的LB01流式细胞裂解液对每个遗传稳定F3代株系中随机3株叶片进行细胞裂解，改良的LB01流式细胞裂解液配方如下：15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，2mmol/L乙二胺四乙酸二钠，0.5mmol/L四盐酸精胺，80mmol/L氯化钾，20mmol/L氯化钠，10mmol/L硫酸镁，0.1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚，15mmol/Lβ-巯基乙醇，0.05％吐温20和0.1％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮，pH＝7.5。在裂解后的细胞悬浮液中加入碘化丙啶(PI)和RNA酶各0.5mg/mL的混合液，避光15min后利用流式细胞仪对每份材料G1期荧光强度值进行测定，以已知基因组大小的四倍体甘蓝型油菜中双11(ZS11)作为参照作物，计算各遗传稳定F3代的基因组大小。
实施例二
参见图6，本实施例提供一种依据基因组大小改良甘蓝型油菜性状的方法，改良目的为快速获得若干抗病、高产、抗倒伏、含油量高等综合性状或单一性状表现突出的纯合甘蓝型油菜品种，进一步提升甘蓝型油菜杂种优势的利用率。通过对甘蓝型油菜的种质资源材料进行收集、鉴定和基因组大小测定，选择基因组大小相对差值百分比T为10％的抗根肿病、高产的多年自交纯合品系ZH102与抗倒伏、含油量高的多年自交纯合品系3581(含油量>56％)去雄后杂交，得到F1代种子。
选择合适的播期播种F1代，使F1代与油菜双单倍体诱导系的花期相遇，在初花期对F1代进行化学杀雄后，用油菜双单倍体诱导系Y3560授粉诱导，获得F2代(即Y1F2代)种子共796粒。
将796粒F2代种植在肥力梯度均匀的试验田中，每行6株，株距25cm，苗期对每株进行挂牌调查，其中，有775个单株为正常可育、流式测定结果为四倍体、株型与母本相同。将这775个单株剥蕾自交，获得F3代(即Y1F3代)。
将775个F2代株自交的F3代种子播种在肥力梯度均匀的试验田中，每个播种3行，每行6株，株距25cm，通过苗期的形态学观察鉴定，有764个F3代的株系内形态表现一致。在764个F3代单个株系内随机选取3株，利用多态性好的引物进行SSR分子标记鉴定，其中，有759个F3代在各自株系内扩增条带表现一致，说明这759个F3代群体，每个群体均为表型一致、基因纯合、遗传稳定的DH系。对这759个稳定遗传F3代的基因组大小Eyx(x＝1、2、3、……、759)进行测定(每个株系随机挑选3株，计算平均值)，绘制出基因组大小Eyx正态分布图(参见图2)。
在成熟期对759个遗传稳定的F3代进行农艺性状调查(每个株系随机挑选5株，测定并计算其平均表现)。其中，有46个纯合株系具有抗根肿病、产量高、抗倒伏和含油量高等综合性状表现突出，且这些纯合株系的基因组大小主要集中在图2的H2区；有27个纯合株系具有抗根肿病、产量高、抗倒伏或含油量高等单一性状表现较为突出，且这些纯合株系的基因组大小主要集中在图2的H1区；其余686个纯合株系具有抗根肿病、产量高、抗倒伏和含油量高等两种或两种以上性状，但表现一般，其中673个纯合株系的基因组大小主要集中在图2的H0区，13个纯合株系的基因组大小集中在图2的H1区。最终，选择基因组大小分布在H2区的46个综合性状表现突出的纯合株系和分布在H1区的27个单一性状表现突出的纯合株系，作为改良后的油菜育种新材料，进一步配制杂交种，以提高油菜杂种优势利用效率，选配出更高产、优质的杂交品种。
本实施例中采用的油菜双单倍体诱导系Y3560的选育方法和采用流式细胞仪对油菜基因组大小进行测定的具体操作同实施例一。
在其他实施例中，还可采用其他十字花科的作物，如大白菜、小白菜、菜心、薹菜、紫菜薹、乌塌菜、芜菁、小花菜、青菜、白菜型油菜、结球甘蓝(卷心菜)、羽衣甘蓝、灌木甘蓝、抱子甘蓝、苤蓝、芥蓝、花椰菜(菜花)、西兰花、大头菜、甘蓝型油菜、芥菜、榨菜、芥菜型油菜、萝卜等，其改良方法均与上述实施例类似，此处不进行一一罗列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.收集十字花科作物的种质资源，鉴定种质资源材料的特性，测定各种质资源材料的基因组大小E；
S2.将带有目标性状、遗传稳定且基因组大小相对差值百分比T在2～20％的两个相同倍性同一亚种的十字花科作物进行人工去雄后正反杂交，收获杂交F1代种子；
S3.对步骤S2收获的杂交F1代进行种植，并在初花期对F1代进行人工去雄或化学杀雄，并套袋或隔离网隔离；
S4.用油菜双单倍诱导系对步骤S3中人工去雄或化学杀雄后的F1代进行人工或壁蜂辅助授粉，收获得到Y1F2代；
S5.对步骤S4收获的Y1F2代进行种植，选择苗期形态整齐一致且育性、倍性正常的单株套袋自交或剥蕾强制自交，自交数目在500株以上，收获得到Y1F3代；
S6.对步骤S5收获的Y1F3代进行种植，在苗期，各株系内选择至少3株通过形态学和分子标记鉴定其一致性和稳定性，淘汰杂株；测定各遗传稳定的Y1F3代株系的基因组大小Eyx，并分析各稳定株系间Eyx的正态分布情况；其中，y表示经油菜诱导系诱导形成的Y1F3代，x表示测定Y1F3代基因组大小的株系数目，x＝1、2、3、……、n，n≥500；
S7.调查统计步骤S6中Eyx符合正态分布的各遗传稳定株系的目的性状；
S8.选择Y1F3代中具有双亲目标性状且Eyx分布位于正态分布两端3～5％的株系，作为改良后的育种新材料。
2.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S1中，十字花科作物包括大白菜、小白菜、菜心、薹菜、紫菜薹、乌塌菜、芜菁、小花菜、青菜、白菜型油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、灌木甘蓝、抱子甘蓝、苤蓝、芥蓝、花椰菜、西兰花、大头菜、甘蓝型油菜、芥菜、榨菜、芥菜型油菜和萝卜。
3.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S1中，种质资源材料的特性包括株高、生育期、抗病性、抗倒性、抗寒性、开花期、种子产量、生物产量和品质。
4.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S1和S6中，基因组大小的测定采用流式细胞技术，
其中，L1为作物G1期荧光强度值，L0为参照作物G1期荧光强度值，E0为参照作物的基因组大小，所述参照作物为已知基因组大小的同种或同属植物。
5.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S2中，两个相同倍性同一亚种的十字花科作物间的基因组大小的相对差值百分比T，
其中，E1为两个十字花科作物中较小的基因组大小值，E2为两个十字花科作物中较大的基因组大小值。
6.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S4中，油菜双单倍诱导系的选育方法，包括如下步骤：
1)选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：
a.将两个油菜亲本材料杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行染色体人工加倍，获得加倍后的F1代植株；
b.将步骤a中加倍后的F1代植株进行自交或强制剥蕾自交获得F2代，对F2代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F3代；通过形态、细胞学以及分子标记对F3代进行纯合度鉴定，鉴定结果显示的各单株之间分子标记图谱一致且均为两个亲本的杂交后代的单株，为纯合的早代稳定系；
c.将步骤b获得的早代稳定系与10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，鉴定正反交杂交后代的F1代、F2代的早代稳定系的遗传特性，所述早代稳定系的遗传特性为孤雌生殖特性，当鉴定结果为F1代分离、F2代有稳定株系时，对应的早代稳定系为具有孤雌生殖遗传的早代稳定系；
2)选育携带显性遗传性状、具有孤雌生殖遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜：
a.具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交，得到杂交F1代种子，杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行染色体人工加倍，得到加倍后的带显性性状的F1植株；
b.对步骤a中加倍后的带显性性状的F1植株进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株以及不带显性性状加倍植株；显性性状的多倍体的植株是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株；
3)油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：
a.倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性基因能去除其对油菜测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株；
b.上述单株对油菜进行测交，后代出现全不育、正常倍性、不带显性性状的油菜，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系；所述正常倍性为二倍体或四倍体。
7.根据权利要求6所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述油菜双单倍体诱导系的选育方法的步骤1)或2)的a中，杂交F1代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行染色体人工加倍的具体方法如下：
1)用体积分数为75％的酒精对种子表面消毒25～40秒，用0.1％升汞消毒12～17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子的水分吸干；将种子接种在第一培养基上，培养条件为：温度23～25℃，白天光照12～16小时，光照强度2000～3000勒克斯，夜晚暗培养8～12小时；
2)种子在第一培养基内生长至1～2片真叶时，从下胚轴处剪下植株移至第二培养基上继续生长；
3)植株生长至有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养，生根培养两周，植株长出粗壮的根；
4)将植株在室温下炼苗3～7天，用自来水冲洗干净植物根部的培养基，并在浸泡缓冲液中浸泡15～30分钟后移栽到温室中，温室温度16～25℃，相对湿度60～80％，保证移栽成活率在95％以上；
所述第一培养基由以下配比的组分组成：1L的MS培养基，0.5～1.5mg的6-苄基腺嘌呤，30～70mg的染色体加倍诱导剂，20～30g的蔗糖，8～10g的琼脂，所述第一培养基的pH值为5.8～6；
所述第二培养基由以下配比的组分组成：1L的MS培养基，0.5～1mg的6-苄基腺嘌呤，20～40mg的染色体加倍诱导剂，20～30g的蔗糖，8～10g的琼脂，所述第二培养基的pH值为5.8～6；
所述第三培养基由以下配比的组分组成：1L的MS培养基，0.03～0.5mg的6-苄基腺嘌呤，5～20mg的染色体加倍诱导剂，20～30g的蔗糖，8～10g的琼脂，所述第三培养基的pH值为5.8～6；
所述浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：1L的水，0.6～1.2g的易保或克露，0.5～1mg的α-萘乙酸。
8.根据权利要求6或7所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S5中，Y1F2代种植每行5～6株，株距18～25cm。
10.根据权利要求1所述的依据基因组大小改良十字花科作物性状的方法，其特征在于：所述的步骤S6中，Y1F3代每个播种3～5行，每行5～6株，株距18～25cm。
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