CN104521738B - 京农科728三系配套杂交种制种方法 - Google Patents
京农科728三系配套杂交种制种方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104521738B CN104521738B CN201410743766.9A CN201410743766A CN104521738B CN 104521738 B CN104521738 B CN 104521738B CN 201410743766 A CN201410743766 A CN 201410743766A CN 104521738 B CN104521738 B CN 104521738B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- capital
- male sterility
- sequence
- individual plant
- single strand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000013011 mating Effects 0.000 title claims abstract 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims abstract 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims abstract 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 113
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 61
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims description 44
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 44
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 33
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 17
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 3
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 claims 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 claims 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 claims 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000209149 Zea Species 0.000 abstract 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 abstract 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 29
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 22
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 22
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 20
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 14
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 13
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 13
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 13
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 11
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 241000037488 Coccoloba pubescens Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009405 line breeding Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种京农科728三系配套杂交种制种方法，本发明提供了一种杂交制种的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京MC01为不育系，玉米自交系京MC01为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种京农科728。本发明的实验证明，本发明利用育成的不育系S京MC01、保持系京MC01和恢复系京2416进行京农科728三系配套杂交种制种，配制的不育化杂交种京农科728种子在产量、抗性及其他农艺性状上与常规制种方法生产的京农科728种子基本相同。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种京农科728三系配套杂交种制种方法。
背景技术
强优势杂交种的选育和推广是提高玉米产量的重要途径。利用常规的制种方法配制杂交种需要对母本进行人工去雄，不仅耗费大量的劳动力，增加种子生产成本，且存在由于去雄不及时、不彻底影响种子质量的潜在风险。利用雄性不育系制种是保证种子纯度提高玉米产量的一种有效方法。
早在上世纪五六十年代，国内外就开始了对玉米不育化制种的研究。细胞质雄性不育由于容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是玉米育种中利用的主要类型。细胞质雄性不育系可划分为T、S和C型。60年代初，T型不育系引入我国。由于对玉米小斑病“T小种”专化性侵染，T型不育系的应用受到严重限制。70年代，我国育种工作者从国外引进C型、S型不育系。C型不育系虽然不育性较稳定、彻底，但其恢复系通常需要重新转育，周期长且步骤繁琐，导致该型不育系在实践中难以普及应用。S型不育系是3种类型中最大的一个组，已有研究证明昌7-2等黄改系材料是其天然强恢复系。但S型不育系的育性因基因型背景的不同而有较大差异，在特定的遗传背景下育性高度稳定。国内优良玉米杂交种的父本多属黄改种质，因此充分利用S型不育系可以节省恢复系的转育工作，是实现快速不育化制种研究和应用的有效途径。
实现玉米细胞质雄性不育化制种的关键是不育系、保持系和恢复系的选育。选育不育系最常用的方法是回交转育法，即用稳定的不育系作非轮回亲本，选择优良自交系作轮回亲本，进行多代回交，育成不育性稳定的优良不育自交系，而原轮回亲本便是该不育系的保持系。但仅仅利用传统的回交转育方法，一般需回交5-6代，转育周期较长，延缓了不育化制种技术在玉米杂交种上的应用。利用回交转育方法进行恢复系的选育比不育系更为复杂，在回交的同时要进行测交，以测交结果作为恢复系的选择标准；或在回交转育中利用不育细胞质提供育性的指标性状。由于选育过程相对繁琐，在恢复系尚未育成或只有部分恢复性的情况下，须将不育化的杂交种子与正常杂交种种子按适当比例掺合使用，这就给种子生产在技术和管理上提出了更高的要求。因此，如何加快不育系的选育速度、简化恢复系的选育过程，是目前雄性不育化制种技术亟需解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种杂交制种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京MC01为不育系，玉米自交系京MC01为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种京农科728。
上述方法中，所述不育系S京MC01为按照包括如下步骤的方法转育：
a)玉米不育系S京724做母本，京MC01做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F1；
b)以所述雄性不育杂交子代F1为母本、与京MC01回交，得到雄性不育BC1代群体；
c)以所述雄性不育BC1代单株为母本、与京MC01继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
d)以所述雄性不育BC2代单株为母本、与京MC01继续回交，得到京MC01的雄性不育系。
上述方法中，在步骤b)和c)之间，还包括BC1代分子鉴定的步骤，所述BC1代分子鉴定为利用40对SSR核心引物中在S京724和京MC01间存在差异的11对引物umc2105k3、phi053k2、bnlg2291k4、bnlg2305k4、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、umc2160k3、umc1936k4、umc1231k4和phi041y6分别对所述雄性不育BC1代群体单株进行PCR扩增，选择与京MC01遗传相似度在96-97.5％的BC1代单株；
所述选择与京MC01遗传相似度在96-97.5％的BC1代单株的方法包括如下步骤：比对BC1代单株的SSR图谱和采用同样的引物扩增京MC01的SSR图谱，计算遗传相似度；
所述遗传相似度计算公式：[1-差异等位基因数/(2×比较总位点数)]×100％
所述差异等位基因数为用SSR核心引物扩增得到的所述雄性不育BC1代单株SSR谱带带型与所述京MC01的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；所述比较总位点数为40。
在步骤c)和d)之间，还包括BC2代分子鉴定的步骤，所述BC2代分子鉴定为用引物A对所述雄性不育BC2代群体单株进行PCR扩增，选择扩增图谱与用同样引物A对所述京MC01进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC2代单株；
所述引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京MC01相比扩增带型不同的SSR引物；
所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物phi053k2是由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物bnlg2291k4是由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物bnlg2305k4是由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1545y2是由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1125y3是由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物bnlg240k1是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc2160k3是由序列表中序列65所示的单链DNA分子和序列表中序列66所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1936k4是由序列表中序列67所示的单链DNA分子和序列表中序列68所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列76所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物phi041y6是由序列表中序列77所示的单链DNA分子和序列表中序列78所示的单链DNA分子组成。
上述方法中，为了减少工作量，在步骤b)和c)之间的BC1代分子鉴定前还包括BC1代表型鉴定的步骤，所述BC1代表型鉴定为选取所述雄性不育BC1代群体中表型与京MC01一致的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间的BC2代分子鉴定前还包括BC2代表型鉴定的步骤，所述BC2代表型鉴定为选取所述雄性不育BC2代群体中表型与京MC01一致的BC2代单株。
上述表型与所述玉米京MC01一致为表型与玉米京MC01完全相同或接近；表型具体为株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和/或果穗性状等。
上述方法中，所述不育系S京724为按照包括如下步骤的方法选育：以玉米S型细胞质雄性不育系MD32 CGMCC No.8657为供体、玉米自交系京724为受体，进行回交转育，得到京724的雄性不育系S京724。
上述方法中，所述回交次数为3次。
上述方法中，所述回交转育包括如下步骤：
1)以玉米雄性不育系MD32 CGMCC No.8657为供体、玉米自交系京724为受体，杂交，得到雄性不育杂交子代F1；
2)以雄性不育杂交子代F1为母本与京724回交，得到雄性不育BC1代群体；
3)以雄性不育BC1代单株为母本与京724继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
4)以雄性不育BC2代单株为母本与京724继续回交，得到京724的雄性不育系S京724。
上述方法中，在步骤2)和步骤3)之间，还包括如下分子鉴定A的步骤：从所述雄性不育BC1代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在92.5-95％的雄性不育BC1代单株。
上述方法中，所述从所述雄性不育BC1代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在92.5-95％的雄性不育BC1代单株的方法包括如下步骤：用40对SSR核心引物分别对雄性不育BC1代单株和玉米自交系京724进行PCR扩增，得到SSR谱带，通过比较BC1代单株和玉米自交系京724的SSR图谱，计算遗传相似度；
所述遗传相似度计算公式：[1-差异等位基因数/(2×比较总位点数)]×100％
所述差异等位基因数为用SSR核心引物扩增得到的所述雄性不育BC1代单株SSR谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；所述比较总位点数为40。
上述40对SSR核心引物中各个引物的序列分别为序列表中序列1-80所示，具体见实施例的表1。
上述方法中，为了减少工作量，在所述分子鉴定A前还包括如下步骤：从所述雄性不育BC1代群体中选取表型与所述玉米京724一致的雄性不育BC1代单株。
上述方法中，在步骤3)和步骤4)之间，还具体包括如下分子鉴定B的步骤：从所述雄性不育BC2代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在98.75％-100％的雄性不育BC2代单株。
所述从所述雄性不育BC2代群体中选取与所述玉米自交系京724遗传相似度在98.75％-100％的雄性不育BC2代单株的方法包括如下步骤：用引物A分别对雄性不育BC2代单株和玉米自交系京724进行PCR扩增，得到SSR谱带，通过比较BC2代单株和玉米自交系京724的SSR图谱，计算遗传相似度；
所述引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京724相比扩增带型不同的SSR引物；
所述遗传相似度计算公式：[1-差异等位基因数/(2×比较总位点数)]×100％
所述差异等位基因数为用引物A扩增得到的所述雄性不育BC2代单株SSR谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；
所述比较总位点数为40。
上述方法中，在所述分子鉴定B前还具体包括如下步骤：从所述雄性不育BC2代群体中选取表型与所述玉米京724一致的雄性不育BC2代单株。
上述表型与所述玉米京724一致为表型与玉米京724完全相同或接近；表型具体为株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和/或果穗性状等。
本发明的另一个目的是提供培育不育系S京MC01的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
a)玉米不育系S京724做母本，京MC01做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F1；
b)以所述雄性不育杂交子代F1为母本与京MC01回交，得到雄性不育BC1代群体；
c)以所述雄性不育BC1代单株为母本与京MC01继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
d)以所述雄性不育BC2代单株为母本与京MC01继续回交，得到京MC01的雄性不育系；
在步骤b)和c)之间，还包括BC1代分子鉴定的步骤，所述BC1代分子鉴定为用上述SSR核心引物umc2105k3、phi053k2、bnlg2291k4、bnlg2305k4、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、umc2160k3、umc1936k4、umc1231k4和phi041y6分别对所述雄性不育BC1代群体单株进行PCR扩增，选择与京MC01遗传相似度在96-97.5％的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间，还包括BC2代分子鉴定的步骤，所述BC2代分子鉴定为用引物A对所述雄性不育BC2代群体单株进行PCR扩增，选择扩增图谱与用同样引物A对所述京MC01进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC2代单株；
所述引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京MC01相比扩增带型不同的SSR引物；
在步骤b)和c)之间的BC1代分子鉴定前还具体包括BC1代表型鉴定的步骤，所述BC1代表型鉴定为选取所述雄性不育BC1代群体中表型与京MC01一致的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间的BC2代分子鉴定前还具体包括BC2代表型鉴定的步骤，所述BC2代表型鉴定为选取所述雄性不育BC2代群体中表型与京MC01一致的BC2代单株。
上述玉米不育系S京MC01在杂交制种中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明具体有如下优势：
1、由于昌7-2等黄改材料是S型细胞质雄性不育系的强恢复系，京农科728父本京2416为黄改种质，因此选择京2416具有强恢复性的S型不育系作为母本京MC01不育系转育的供体，节省了选育父本恢复系的繁琐工作；
2、选用已获得的与母本京MC01系谱来源相同的不育系S京724为供体，结合分子标记辅助选择技术实现快速转育，仅回交三代即可获得玉米不育系S京MC01，具有配合力高、脱水速度快、抗倒性好、耐密植等优点；
3、选用的S型不育系MD32不育性稳定、花粉败育彻底，在已报道的玉米杂交种雄性不育化制种研究中未见使用；
总之，本发明利用育成的不育系S京MC01、保持系京MC01和恢复系京2416进行京农科728三系配套杂交种制种，配制的不育化杂交种京农科728种子在产量、抗性及其他农艺性状上与常规制种方法生产的京农科728种子基本相同，且节省了常规制种中母本人工去雄的时间和成本，消除了由于去雄不及时、影响种子质量的潜在风险。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、雄性不育系S京724的选育
一、不育系供体MD32细胞质雄性不育类型的确定
1、玉米不育系MD32
玉米不育系MD32选育过程：利用构建的X系群体(以X1132为基础)进行“高大严”选系，从中选择优良S5高代系与外引杂交种构建新的选系基础群体。在自交后代中发现不育株，雄穗花药不外露，选择同穗行表型相近的姊妹株对其进行成对授粉。杂交后代全部表现彻底不育，植株表型也趋向基本一致。遂将该材料命名为玉米雄性不育系MD32。
玉米不育系MD32不育性彻底：花药不外露；
玉米不育系MD32不育性稳定：在多种遗传背景下，不育性表现彻底；
玉米不育系MD32综合性状优良：种子芽势旺盛，出苗力强，幼苗叶鞘色紫色，叶片宽大，叶色浓绿，株型半紧凑，果穗筒型，粒型半硬粒型，综合抗性好。
玉米不育系MD32于2013年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8657，该植株分类命名为玉米(Zea mays)。
2、不育系MD32细胞质雄性不育类型的确定
提取玉米不育系MD32幼苗的DNA作为模板，用如下表1的引物进行PCR扩增，得到扩增产物在Agarose凝胶上，90V电泳1小时30分钟。根据扩增片段图谱鉴别玉米MD32胞质不育类型。
结果，利用C、T型引物对MD32的DNA进行PCR扩增时，均未检测到扩增产物；利用S型引物对其进行检测时，PCR产物片段大小为885bp。因此确定MD32为S型细胞质雄性不育系。
表1为鉴定胞质类型的引物
| 胞质类型 | 引物序列 |
| C-1 | TGAAAGGGTGGTGGAATA |
| C-2 | GAGCCAAAGTAATGAGAAAA |
| S-1 | GATGCTATGCTAAGCGAGAT |
| S-2 | CCGCTAACCCACTCTTCT |
| T-1 | GTCGTGTCCTGGTAGCCT |
| T-2 | CCTCCTTCATTCCGTTGT |
二、玉米雄性不育系S京724的选育
1、雄性不育杂交子代F1代的获得
第一年夏，以玉米雄性不育系MD32(非轮回亲本)做供体、京724(北京市农林科学院玉米研究中心，品种权申请公告号为CNA007811E)(轮回亲本)做受体杂交组配F1代，收获F1代的种子。
同年冬海南第一代，种植F1代的种子，得到127株F1代玉米植株。
127株F1代玉米植株花药均不外露，不育性表现彻底。
2、回交一次BC1代的获得
1)回交
以F1代植株做母本，继续与轮回亲本京724回交，收获BC1代群体的种子。
同年冬海南第二代，种植BC1代群体的种子，得到BC1代群体。
BC1代群体花药均不外露，不育性表现彻底。
2)分子鉴定
从种植的2000株BC1代群体中选择雄花完全不育、植株性状(株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和果穗性状等)与京724接近的616个BC1代单株挂牌标记；提取616个BC1代单株叶片的DNA作为模板，利用40对SSR核心引物(表2)分别对每一株进行PCR扩增；以京724为对照。每对SSR核心引物对应一个位点；每个位点有2个等位基因。
表2为40对SSR核心引物
每个BC1代单株得到40个位点对应的PCR扩增图谱，与京724得到的40个位点对应的PCR扩增图谱进行比较，PCR扩增图谱谱带不一致的等位基因数目为差异等位基因数；比较总位点数为40。
遗传相似度计算公式：[1-差异等位基因数/(2×比较总位点数)]×100％
根据扩增结果，选取与京724差异等位基因数最少的前30个单株作为下一轮回交的母本，且经过遗传相似度计算，前30个单株与京724间的遗传相似度均在92.5-95％之间。
3、回交二次BC2代的获得
1)回交
以上述2选取的与京724遗传相似度在92.5-95％之间的BC1代单株做母本，继续与轮回亲本京724回交，收获BC2代群体的种子。
次年夏，种植BC2代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株，共计1500株。
2)分子鉴定
选择雄花完全不育、植株性状与京724接近的300个BC2代单株挂牌标记，分别提取300个BC2代单株叶片的DNA作为模板，利用BC2代单株对应的母本BC1代与京724扩增带型不同的SSR引物对其进行PCR扩增；以京724为对照。
按照上述方法，计算遗传相似度，其中，差异等位基因数为雄性不育BC2代单株SSR谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目，BC2代群体的单株SSR谱带为用BC2代单株对应的母本BC1代与京724相比扩增带型不一致的SSR引物进行扩增得到的谱带；比较总位点数为40。
选取遗传相似度为98.75％-100％(与京724差异等位基因数最少的前30个单株)作为下一轮回交的母本。
4、回交3次不育系S京724的获得
以上述3选取的与京724遗传相似度在98.75％-100％之间的BC2代单株做母本，继续与轮回亲本京724回交，收获BC3代群体，即为不育系S京724。
不育系S京724花药不外露，不育性表现彻底。
三、常规转育与本发明方法的比较
常规转育与上述二的方法基本相同，不同的是不进行分子鉴定，结果回交6代，才能获得遗传背景回复到轮回亲本的不育系(遗传背景回复率见表3所示)。
计算遗传背景回复率G(g)＝[L+X(g)]/2L；其中，g指回交世代数，G(g)指在g代的遗传背景回复率；X(g)指在回交g代表现为受体亲本带型的分子标记数量；L指所参与分析的分子标记数量。
表3为本发明方法与常规育种的背景回复率
从上述看出，本发明的方法利用分子标记辅助背景选择与回交转育相结合，只需要回交3代即获得了遗传背景回复到轮回亲本的不育系。
实施例2、母本京MC01不育系S京MC01的转育
由于京MC01(记载在如下文献中：《种子世界》2014年4期夏玉米京农科728基本特性及高产栽培技术，公众可从北京市农林科学院获得)和京724均为国外新种质X群体二环系选系，因此选用不育系S京724作为京MC01不育系转育的供体材料。
以S京724做母本，京MC01做父本杂交组配F1代，F1代田间表现完全不育；
再以F1代做母本，继续与京MC01回交得到BC1代群体。
从种植的1200株BC1代群体中选择雄花完全不育、植株性状(株高、穗位高、轴色、雄穗分枝数、果穗性状和生育期等)与京MC01接近的360个单株挂牌标记；提取BC1代单株叶片的DNA作为模板，利用40对SSR核心引物中在S京724和京MC01间存在差异的11对引物(表2中的umc2105k3、phi053k2、bnlg2291k4、bnlg2305k4、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、umc2160k3、umc1936k4、umc1231k4、phi041y6)分别对每一株进行PCR扩增；以京MC01为对照。选择与京MC01遗传相似度在96-97.5％的BC1代单株，记作BC1-A；
比对BC1代单株的SSR图谱和采用同样的引物扩增京MC01的SSR图谱，计算遗传相似度；
遗传相似度计算公式：[1-差异等位基因数/(2×比较总位点数)]×100％
差异等位基因数为用SSR核心引物扩增得到的所述雄性不育BC1代单株SSR谱带带型与所述京MC01的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；所述比较总位点数为40。
将BC1-A与京MC01继续回交得到BC2代群体。
BC2代按穗行田间种植，每个穗行种植50株，共计300株。从中选择雄花完全不育、植株性状(株高、穗位高、轴色、雄穗分枝数、果穗性状和生育期等)与京MC01接近的80个单株挂牌标记，田间取叶片提取DNA。利用BC2代单株对应的母本BC1代与京MC01相比扩增带型不同的SSR引物A对其进行PCR扩增，选择扩增图谱与用同样引物A对京MC01进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC2代单株，与京MC01继续回交，即母本京MC01的不育系S京MC01。
引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京MC01相比扩增带型不同的SSR引物。
观察育性，不育系S京MC01花药不外露，不育性表现彻底。
实施例3、京2416对不育系S京MC01的恢复性鉴定
以由实施例2创制的不育系S京MC01做母本，京2416(北京市农林科学院玉米研究中心，品种权授权公告号为CNA004319G)做父本，杂交组配F1代，收获F1代的种子。次年，分别在北京、海南、吉林等多点田间种植F1代，得到F1代植株。观察鉴定F1代植株雄穗的育性恢复情况，均表现为育性恢复正常。
说明京2416是不育系S京MC01的强恢复系，具有完全恢复能力。
实施例4、京农科728三系配套制种
利用育成的不育系S京MC01、保持系京MC01和恢复系京2416进行京农科728三系配套杂交种制种。配制的不育化杂交种京农科728种子在产量、抗性及其他农艺性状上与常规制种方法生产的京农科728种子基本相同。
一、三系的繁殖
1、不育系繁殖
用由实施例2制备的不育系S京MC01进行不育系繁殖：
母本雄性不育系S京MC01在甘肃扩繁时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于500米。不育系S京MC01与保持系京MC01按照8:2行比种植，种植密度为5000株/亩，授粉结束后砍除母本保持系，避免不育系中混入保持系种子。不育系繁殖产量一般在每亩450千克以上。
2、保持系繁殖
母本保持系京MC01的繁殖与常规亲本繁殖方法相同。在甘肃扩繁时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于500米。保持系京MC01种植密度为5000株/亩，繁殖产量一般在每亩500千克以上。
3、恢复系繁殖
恢复系京2416的繁殖与常规亲本繁殖方法相同。在甘肃扩繁时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于500米。恢复系京2416种植密度为6000株/亩，繁殖产量一般在每亩500千克以上。
二、不育化杂交种制种：
以不育系S京MC01为母本，京2416为父本，进行京农科728杂交种不育化制种，具体如下：
在甘肃制种时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于300米。将母本不育系S京MC01与父本京2416按照5:1行比种植，种植密度为5000株/亩，母本不育系比父本提前7天种植，授粉结束后砍除父本行，避免杂交种中混入父本种子。其中行比及父母本播种时间可根据制种实际情况做适当调整。
得到不育化杂交种京农科728种子。
按照国家普通玉米品种区试项目的调查标准，检测不育化杂交种京农科728产量、抗性及株型、株高、穗位高、穗型、穗长、穗行数、轴色、千粒重等农艺性状，具体测量方法如下：
1、产量：小区果穗风干后脱粒，称量籽粒干重，按标准水份(14％)折算，即为小区产量，再由小区产量折成亩产。
2、抗性：按照中华人民共和国农业行业标准《玉米抗病虫性鉴定技术规范》进行玉米螟、大斑病和丝黑穗病等玉米主要病虫害田间接种抗性鉴定，调查记录抗感情况。
3、农艺性状
1)株型：根据植株叶片的夹角大小，分紧凑、半紧凑、平展三种。
2)株高：在乳熟期连续取生育正常的植株10株(定义为取样株)，测量地面至雄穗顶端的高度，求其平均数。
3)穗位高：测量取样株由地面至第一果穗着生节位的高度，求其平均数。
4)穗型：根据果穗形状，分筒型、锥型两种。
5)穗长：测量取样株果穗从穗基部到顶端的长度，求其平均数。
6)穗行数：计数取样株果穗中部的籽粒行数。
7)轴色：分红、白两种。
8)千粒重：将取样株果穗脱粒后，籽粒充分混合，从中随机取500粒称重、重复取样3次，将两个相近数相加，即为千粒重。
结果不育化杂交种京农科728的产量(籽粒重)为每亩723千克；
经田间抗性接种鉴定，中抗大斑病、小斑病等；
株高273厘米，穗位高93厘米，筒型穗，穗长17.7厘米，穗行数16行，穗轴红色，千粒重372克。
采用常规制种(以京MC01为母本，以京2416为父本杂交得到京农科728)的方法生产的京农科728种子在产量、抗性及其他农艺性状上，与上述三系配套产生的京农科728无显著差异，但是需要母本人工去雄的步骤，增加了制种成本。
因此说明制种成功。
Claims (9)
1.一种杂交制种的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京MC01为不育系，玉米自交系京MC01为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种京农科728；
所述不育系S京MC01为按照包括如下步骤的方法转育：
a)玉米不育系S京724做母本，京MC01做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F1；
b)以所述雄性不育杂交子代F1为母本、与京MC01回交，得到雄性不育BC1代群体；
c)以所述雄性不育BC1代单株为母本、与京MC01继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
d)以所述雄性不育BC2代单株为母本、与京MC01继续回交，得到京MC01的雄性不育系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
在步骤b)和c)之间，还包括BC1代分子鉴定的步骤，所述BC1代分子鉴定为利用40对SSR核心引物中在S京724和京MC01间存在差异的11对引物umc2105k3、phi053k2、bnlg2291k4、bnlg2305k4、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、umc2160k3、umc1936k4、umc1231k4和phi041y6分别对所述雄性不育BC1代群体单株进行PCR扩增，选择与京MC01遗传相似度在96-97.5％的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间，还包括BC2代分子鉴定的步骤，所述BC2代分子鉴定为用引物A对所述雄性不育BC2代群体单株进行PCR扩增，选择扩增图谱与用所述引物A对所述京MC01进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC2代单株；
所述引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京MC01相比扩增带型不同的SSR引物；
所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物phi053k2是由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物bnlg2291k4是由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物bnlg2305k4是由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1545y2是由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1125y3是由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物bnlg240k1是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc2160k3是由序列表中序列65所示的单链DNA分子和序列表中序列66所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1936k4是由序列表中序列67所示的单链DNA分子和序列表中序列68所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物umc1231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列76所示的单链DNA分子组成；
所述核心引物phi041y6是由序列表中序列77所示的单链DNA分子和序列表中序列78所示的单链DNA分子组成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
在步骤b)和c)之间的BC1代分子鉴定前还包括BC1代表型鉴定的步骤，所述BC1代表型鉴定为选取所述雄性不育BC1代群体中表型与京MC01一致的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间的BC2代分子鉴定前还包括BC2代表型鉴定的步骤，所述BC2代表型鉴定为选取所述雄性不育BC2代群体中表型与京MC01一致的BC2代单株。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述不育系S京724为按照包括如下步骤的方法选育：以保藏号为CGMCC NO.8657的玉米不育系MD32为供体、玉米自交系京724为受体，进行回交转育，得到京724的雄性不育系S京724。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述回交次数为3次；
所述回交转育包括如下步骤：
1)以保藏号为CGMCC NO.8657的玉米不育系MD32为供体、玉米自交系京724为受体，杂交，得到雄性不育杂交子代F1；
2)以雄性不育杂交子代F1为母本与京724回交，得到雄性不育BC1代群体；
3)以雄性不育BC1代单株为母本与京724继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
4)以雄性不育BC2代单株为母本与京724继续回交，得到京724的雄性不育系S京724。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在步骤2)和步骤3)之间，还包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC1代群体中选取与所述京724遗传相似度在92.5-95％的雄性不育BC1代单株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在所述分子鉴定前还包括如下步骤：从所述雄性不育BC1代群体中选取表型与所述京724一致的雄性不育BC1代单株；
在步骤3)和步骤4)之间，还具体包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC2代群体中选取与所述京724遗传相似度在98.75％-100％的雄性不育BC2代单株；
在所述分子鉴定前还具体包括如下步骤：从所述雄性不育BC2代群体中选取表型与所述京724一致的雄性不育BC2代单株。
8.一种培育不育系S京MC01的方法，包括如下步骤：
a)玉米不育系S京724做母本，京MC01做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F1；
b)以所述雄性不育杂交子代F1为母本与京MC01回交，得到雄性不育BC1代群体；
c)以所述雄性不育BC1代单株为母本与京MC01继续回交，得到雄性不育BC2代群体；
d)以所述雄性不育BC2代单株为母本与京MC01继续回交，得到京MC01的雄性不育系；
在步骤b)和c)之间，还包括BC1代分子鉴定的步骤，所述BC1代分子鉴定为用权利要求3中的SSR核心引物umc2105k3、phi053k2、bnlg2291k4、bnlg2305k4、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、umc2160k3、umc1936k4、umc1231k4和phi041y6分别对所述雄性不育BC1代群体单株进行PCR扩增，选择与京MC01遗传相似度在96-97.5％的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间，还包括BC2代分子鉴定的步骤，所述BC2代分子鉴定为用引物A对所述雄性不育BC2代群体单株进行PCR扩增，选择扩增图谱与用同样引物A对所述京MC01进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC2代单株；
所述引物A为BC2代单株对应的母本BC1代与京MC01相比扩增带型不同的SSR引物；
在步骤b)和c)之间的BC1代分子鉴定前还具体包括BC1代表型鉴定的步骤，所述BC1代表型鉴定为选取所述雄性不育BC1代群体中表型与京MC01一致的BC1代单株；
在步骤c)和d)之间的BC2代分子鉴定前还具体包括BC2代表型鉴定的步骤，所述BC2代表型鉴定为选取所述雄性不育BC2代群体中表型与京MC01一致的BC2代单株。
9.权利要求1-8任一所述方法中的所述玉米不育系S京MC01在杂交制种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410743766.9A CN104521738B (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 京农科728三系配套杂交种制种方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410743766.9A CN104521738B (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 京农科728三系配套杂交种制种方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104521738A CN104521738A (zh) | 2015-04-22 |
| CN104521738B true CN104521738B (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=52837522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410743766.9A Active CN104521738B (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 京农科728三系配套杂交种制种方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104521738B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106319037A (zh) * | 2015-07-10 | 2017-01-11 | 沈阳化工大学 | 一种检测玉米品种良玉88号纯度的ssr分子标记试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103430826A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-12-11 | 北京市农林科学院 | 五位一体品种选育方法 |
-
2014
- 2014-12-08 CN CN201410743766.9A patent/CN104521738B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103430826A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-12-11 | 北京市农林科学院 | 五位一体品种选育方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 夏玉米京农科728基本特性及高产栽培技术;冯建军等;《种子世界》;20140430(第4期);第54页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104521738A (zh) | 2015-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101138313B (zh) | 利用分子标记选育抗粗缩病的玉米自交系 | |
| CN104285776B (zh) | 玉米雄性不育系的选育方法 | |
| US20190191645A1 (en) | Method for cultivating perennial rice using asexual propagation characteristic of oryza longistaminata | |
| Dweikat | A diploid, interspecific, fertile hybrid from cultivated sorghum, Sorghum bicolor, and the common Johnsongrass weed Sorghum halepense | |
| CN106613985A (zh) | 一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法 | |
| CN107041299A (zh) | 一种快速钝化热带/亚热带玉米种质光敏性的方法 | |
| Cremona et al. | Production of embryo rescued hybrids between the landrace “Friariello”(Capsicum annuum var. annuum) and C. baccatum var. pendulum: phenotypic and cytological characterization | |
| Jones et al. | Genealogy and fine mapping of obscuravenosa, a gene affecting the distribution of chloroplasts in leaf veins, and evidence of selection during breeding of tomatoes (Lycopersicon esculentum; Solanaceae) | |
| CN104351037B (zh) | Nk718三系配套杂交种制种方法 | |
| CN110463599B (zh) | 一种直播稻选育方法 | |
| CN101176425B (zh) | 一种分子标记辅助选择培育抗穗发芽杂交稻不育系的方法 | |
| CN105918107B (zh) | 利用轮选修复提高玉米单倍体雄花自然加倍率的育种方法 | |
| CN104351036B (zh) | 京科968三系配套杂交种制种方法 | |
| CN104521738B (zh) | 京农科728三系配套杂交种制种方法 | |
| CN104351038B (zh) | 京科665三系配套杂交种制种方法 | |
| CN106148530A (zh) | 与辣椒花药黄色基因紧密连锁的分子标记gssr187及其应用 | |
| CN104488700A (zh) | 紫叶直立穗长穗颈糯三系不育系的选育方法 | |
| CN104521737B (zh) | Nk971三系配套杂交种制种方法 | |
| CN115537426A (zh) | 一种培育水稻两系不育系的育种方法 | |
| CN104396732B (zh) | 京科528三系配套杂交种制种方法 | |
| CN110679474B (zh) | 一种利用x群和黄瑞群杂优模式选育玉米新品种的方法 | |
| CN101982063A (zh) | 一种创制梨100%自花结实性种质的方法 | |
| CN104351039B (zh) | 京单38三系配套杂交种制种方法 | |
| CN106035069A (zh) | 一种穗部颖壳白化的杂交水稻两系不育系的选育方法 | |
| CN108243949B (zh) | 一种轻简型温敏核不育系的选育方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |