CN106069718B

CN106069718B - 油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法

Info

Publication number: CN106069718B
Application number: CN201610458225.0A
Authority: CN
Inventors: 付绍红; 杨进; 王继胜; 李云; 邹琼; 陶兰蓉; 康泽明; 唐蓉
Original assignee: Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: CN106069718A

Abstract

本发明油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法，包括1）确定稳定株系的恢保关系；2）根据测交后代性状特征，将临时保持系与稳定不育系回交或多代回交；3）用油菜双单倍体诱导系对回交后代授粉；4）诱导后代育性鉴定；5）选择优良不育单株，继续用油菜双单倍体诱导系与之授粉；6）二次诱导授粉后代形成不育株系，鉴定株系的遗传稳定性和不育度；7）用油菜双单倍体诱导系授粉保持选育出具有保持系特性的稳定新不育系。本发明能快速选育甘蓝型油菜细胞质不育系，最快4代（2年），获得遗传稳定的甘蓝型油菜细胞质不育系，大大提高甘蓝型油菜细胞质不育系选育速度，加快甘蓝型油菜杂交品种选育速度和效率，降低人力物力。

Description

油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法

技术领域：

本发明与农业有关，特别与油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法有关。

背景技术：

油菜是我国主要的油料作物，其中甘蓝型油菜占油菜栽培品种的90％以上。甘蓝型油菜（Brassica napus，芸苔（aa，n=10）与甘蓝（cc，n=9）通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，根据染色体来源判断为四倍体，2n=38）。目前，甘蓝型油菜栽培品种中90％以上是杂交品种。甘蓝型油菜的杂种优势利用，源于华中农业大学傅廷栋院士发现玻里马polima CMS细胞质不育系开始。从上世纪90年代开始，细胞质不育占甘蓝型油菜杂种优势利用90％以上。近年来，细胞核不育快速发展，目前细胞质不育系统占甘蓝型油菜杂种优势利用50％以上，细胞质不育系统，除了玻里马polima CMS不育还发现和创新了萝卜细胞质不育ogura CMS、芥菜型油胞质不育 Hau CMS、JA胞质不育 JACMS等细胞质不育类型。

甘蓝型油菜杂种优势利用，要实现“三系”配套，不育系、保持系、恢复系，最为困难的是不育系，其选育周期长，一般需要用保持系与不育株回交6－8代，才能形成稳定的不育系。传统的甘蓝型油菜不育系的选育是从甘蓝型油菜优良单株的选择开始到遗传基本稳定，需要6代左右的时间，再与不育系测交，测交后代高度不育，该测交父本即为保持系，然后该保持系一边自交提纯，一边与不育系成对回交，而且每成对交一次，选育样本数目就放大一次，一般选育一个类型的新不育系需要10亩以上的试验田，且选育出的一批新不育系，其遗传来源基本相同，其工作量可想而知。且周期很长，保持系提纯与不育系选育同时进行，回交6－8代后，保持系自交12－14代，基本形成稳定的保持系与不育系，然后新的不育系跟多个恢复系测配选育优良的杂交新组合。因此，不育系选育尤为关键，不育系配合力特别是普通配合力好，选育强优势杂交组合的几率就高，如果不育系配合力差，几十年的工夫就白费。因此，是否能选育出好的甘蓝型油菜新组合（新品种），不育系选育很关键。以1年1代计算从不育系选育到最后形成杂交组合需要至少12－15年左右的时间，育种效率很低。

目前，在油菜中还未有诱导系或双单倍体诱导系的报道。所谓“诱导系”是指，用该植物作为父本用其花粉对同类植株授粉，能诱导同类植株（母本）产生相应的效应，如产生单倍体、双单倍体（DH系）等。在植物中运用诱导系进行新品种选育最多的是玉米，但玉米中的诱导系也只是单倍体诱导系。最早出现的玉米单倍体诱导系为stock6，该诱导系只能诱导玉米产生单倍体，然后单倍体植株再进行人工染色体加倍形成纯合二倍体（双单倍体），且诱导效率较低，一般诱导效率在10%以下（以收获种子中获得单倍体数计算）。

发明内容：

本发明的目的为了提供一种能快速、有效，最快只需4代（2年）获得稳定遗传的细胞质不育系，提高油菜选育育种材料，特别是杂交育种不育系的选育速度和效率，极大提高甘蓝型油菜杂交育种的效率，极大地降低不育系选育的人力、物力和选育周期的油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法。

本发明的目的是这样来实现的：

本发明油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型细胞质不育系的方法，包括以下步骤：

1）将遗传稳定的、具有目标性状（高含油、高配合力、丰产、稳产、低芥酸、低硫苷、早熟、抗病、抗倒伏等性状）的甘蓝型油菜株系与稳定的细胞质不育系测交,确定稳定株系的恢保关系；稳定的细胞质不育系可以是玻里马细胞质不育polima CMS、萝卜细胞质不育ogura CMS、芥菜型油胞质不育 Hau CMS、JA胞质不育 JACMS等甘蓝型油菜细胞质不育类型；

2）上述步骤1）中，测交后代全为不育，说明对应的测交父本为临时保持系，并根据测交后代性状特征，不完全具备遗传该临时保持系的优良目标性状，将临时保持系与测交后代不育株继续回交或多代回交；

3）上述步骤2）中，测交后代为具有临时保持系的优良目标性状，直接用油菜双单倍体诱导系对测交F₁不育单株授粉；临时保持系与测交后代不育株回交或多代回交后，具有该临时保持系的优良目标性状，用油菜双单倍体诱导系对回交后代或多代回交后代不育单株授粉，获得第一次授粉诱导后代；

4）上述步骤3）中，油菜双单倍体诱导系第一次授粉诱导后代，在苗期利用流式细胞仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体，淘汰可育株和具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，选择正常四倍体、高度不育、具有临时保持系优良性状的单株继续用油菜双单倍体诱导系进行第二次授粉，可诱导获得多个第二次授粉诱导单株后代；

5）上述步骤4）中获得的多个第二次授粉诱导单株后代，按株系种植，苗期利用流式细胞仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体，淘汰可育株和具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，对正常四倍体、高度不育、具有临时保持系优良性状的植株不育株系，用分子标记（SSR或SRAP）鉴定株系的遗传稳定性一致性，并调查不育株系的不育度；形成一个或多个稳定的新细胞质不育系。

6）上述步骤5）中鉴定的一个或多个新稳定不育系用油菜双单倍体诱导系进行第三次诱导授粉，鉴定诱导系对这些不育系的诱导能力，第三次诱导后代株系内农艺性状、不育度高度一致、且诱导能力，即株系内农艺性状一致，且高度不育度植株占总诱导后代的比例超过98%，最终用油菜双单倍体诱导系保持一个或多个不育系遗传特性和不育状态；

7）上述步骤6）中用油菜双单倍体诱导系授粉保持其不育状态，稳定的新不育系的遗传特性与油菜双单倍体诱导系无关；稳定的新不育系具有上述步骤1)中临时保持系的性状特性，与该临时保持系具有一定的遗传差异或含有50%—99%的临时保持系核基因，含有临时保持系核基因的多少取决于临时保持系与不育单株的回交代数，除含有不同程度临时保持系的核基因外，还含有步骤1）中用于测交的稳定细胞质不育的核基因；

8）上述步骤5）中形成的一个或多个稳定的新细胞质不育系，根据油菜双单倍体诱导系对细胞质不育系大于98%的诱导能力(株系内农艺性状一致，且高度不育度植株占总诱导后代的比例超过98%)，用同一个保持系即油菜双单倍体诱导系进行保持，油菜双单倍体诱导系成为新细胞质不育系的万能保持系，同时用一个保持系，保持多个遗传稳定的细胞质不育系；上述步骤5）新形成的稳定细胞质不育系与上述步骤1）中的稳定细胞质不育系具有明显的遗传差异，引入临时保持系的部分基因资源并含有上述步骤1）中的稳定细胞质不育系的基因资源，与油菜双单倍体诱导系即万能保持系无遗传背景上的联系，且遗传稳定、高度不育，是一个或多个新细胞质不育系；

上述油菜双单倍体诱导系的选育方法，包括如下步骤：

（1）选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：

①将两个油菜亲本材料杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍获得加倍后的F₁代植株；

②加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代，对F₃代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系---早代稳定系;

③获得的早代稳定系与至少10个油菜常规纯合稳定系进行正反交，F₁代、F₂代鉴定早代稳定系的遗传特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F₁分离，F₂代出现部分稳定株系，对应的早代稳定系是具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系；

（2）选育携带显性遗传性状、具有孤雌遗传特性且倍性遗传稳定的多倍体油菜：

①具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交（如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶、高芥酸等性状），得到杂交F₁代种子，杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F₁植株；

②对加倍的带显性性状的F₁植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株；带显性性状的多倍体的植株主要是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状（如显性矮杆、紫叶、花叶、黄叶、高芥酸等性状）的六倍体或八倍体油菜植株；

（2）油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：

①倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，如果测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株；

②上述单株测交后代如果出现全不育、为正常倍性（二倍体或四倍体）油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系。

采用本发明获得甘蓝型油菜细胞质不育系借助了油菜双单倍体诱导系能诱导母体植株在测交1代发生孤雌生殖，在测交2代形成稳定的双单倍体个体，测交3代进行稳定性、一致性鉴定，获得稳定遗传后代。

上述获得油菜双单倍体诱导系是将两个亲本材料杂交F₁代种子或具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，具体方法如下：

1)用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基上；

2）让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度23-25⁰C，白天光照12-16小时，光照强度2000-3000勒克斯，夜晚暗培养8-12小时，待植株长到1—2片真叶时，从下胚轴处剪下植株继续在第二培养基上生长；

3)将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养；

4)生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3-7天，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15—30分钟后移栽到温室中，温室温度16⁰C—25⁰C，相对湿度60-80%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6-苄基腺嘌呤 0.5—1.5mg

染色体加倍诱导剂 30—70mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第一培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6-苄基腺嘌呤 0.5—1mg

染色体加倍诱导剂 20—40mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第二培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α-萘乙酸 0.03—0.5mg

染色体加倍诱导剂 5—20mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第三培养基的pH=5.8-6.0，

上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6-1.2g

α-萘乙酸 0.5—1mg。

上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。

以上描述的方法可以快速用于甘蓝型油菜细胞质不育系的快速选育。可以在2年或4代的时间内获得新的细胞质不育系，大大节约甘蓝型油菜的育种时间，提高育种效率。

油菜双单倍体诱导系能直接诱导油菜产生双单倍体后代，无需进行人工染色体加倍来获得纯合系；且诱导效率高，最高可达100%，一般的诱导效率都在50%以上。双单倍体诱导系诱导母体植株产生双单倍体的主要原理是：诱导系能诱导母体植株，大孢子生殖细胞（卵细胞）产生孤雌生殖效应，且卵细胞能进行染色体加倍，即卵细胞孤雌生殖产生的后代就双单倍体，产生该现象的机理目前尚不明确。本发明是油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法，该方法可以快速（4代）、高效选育甘蓝型油菜育种中具有应用价值的不育系育种亲本材料，该专利技术应用范围广，适应于甘蓝型油菜细胞质不育系统的多种类型，为油菜遗传育种、杂交油菜新品种选育提供高效、便捷的技术支撑。

本发明具有以下优点：

1、该方法可快速（2年或3代）选育甘蓝型油菜杂交种亲本材料（不育系），大大节约甘蓝型油菜中不育系的选育周期,提高选育效率。

2、该方法可运用于目前甘蓝型油菜细胞质不育的多种途径，特别是细胞质不育系统的不同杂种优势利用途径。包括甘蓝型油菜细胞质不育系统（玻里马细胞质不育polimaCMS、萝卜细胞质不育ogura CMS、芥菜型油胞质不育 Hau CMS、JA胞质不育 JA CMS）。

3、油菜双单倍体诱导系直接诱导母体植株产生双单倍体，无需进行人工染色体加倍，可一步形成稳定后代。

4、油菜双单倍体诱导系可以是多个甘蓝型细胞质不育系的“万能保持系”，可大大节约不育系的制种难度，同时对多个不育系进行制种，提高了优势甘蓝型油菜细胞质不育系，特别是高配合力不育系的选育效率。

附图说明：

图1为油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型细胞质不育系的方法流程图。

图2为油菜双单倍体诱导系选育流程图。

图3为获得油菜早代稳定系的方法流程图。

图4为油菜双单倍体诱导系Y3560选育流程图。

图5为油菜双单倍体诱导系Y3380选育流程图。

图6为油菜早代稳定系P3-2选育流程图。

图7为甘蓝型油菜玻里马细胞质不育系蓉A0051系列不育系的选育图。

图8为甘蓝型油菜萝卜胞质不育系蓉萝A0034系列不育系的选育图。

图9为P3-2四倍体油菜根尖染色体倍性鉴定图。

图10为P3-2四倍体油菜倍性流式细胞鉴定图。

图11为Y3380流式细胞倍性鉴定图。

图12为Y3560流式细胞倍性鉴定图。

具体实施方式：

实施例1：

参见图1、图2、图4、图5、图7，甘蓝型油菜小孢子离体培养后代DH0051 与玻里马细胞质不育系蓉A0068测交，对测交后代鉴定，测交后代高度不育，该小孢子纯合株系DH0051为玻里马细胞质不育系的保持系。用油菜双单倍体诱导系Y3560花粉给测交后代不育单株授粉，并套袋隔离，收获诱导后代种子。对诱导后代进行种植，并在苗期用流氏细胞仪鉴定诱导后代单株的倍性，淘汰多倍体、单倍体、非整倍体植株。在花期，淘汰具有油菜双单倍体诱导系Y3560显性性状（矮秆性状）的不育植株选择完全不育，植株长势较好的15株不育单株，第二次用油菜双单倍体诱导系Y3380给不育单株授粉，并套袋隔离。对二次诱导后代分株系种植，在苗期及蕾苔期鉴定株系内的整齐度，用SSR分子标记鉴定株系内的遗传一致性及稳定性，发现有12个株系,其株系内，外形特征及分子水平高度一致，且12株系都高度不育，12株系彼此外观特性差异较大，熟期不一致。对12个稳定株系继续用油菜双单倍体诱导系Y3560和Y3380花粉进行第三次诱导，每个诱导系株系内授粉5株，共10株，并套袋隔离，每个诱导系授粉后5个单株混合收种后混合种植，鉴定其诱导效率。通过诱导效率鉴定发现Y3560对12株系的诱导效率从90-99.5%不等，Y3380对12株系的诱导效率从90-97.1%不等，由于Y3380对这些不育系的诱导效率不高，因此，不能作为该不育系列的万能保持系；其中有Y3560诱导后代有5个株系诱导效率在98%以上，且株系内植株稳定一致，且高度不育，农艺性状存在较大差异，熟期不一致，但具有DH0051和蓉A0068的部分遗传特性，因此通过诱导系一次性选育出5个具有DH0051遗传特性和蓉A0068特性的新不育系蓉A0051-1、蓉A0051-2、蓉A0051-3、蓉A0051-4、蓉A0051-5系列细胞质不育系，这部分相同来源，不同遗传背景的不育系可以采用Y3560作为万能保持系进行混合授粉，一次性繁殖5个不育系。

以上实施例中，油菜双单倍体诱导系是通过以下方法获得的：

参见图2、图3、图4、图9、图10、图12，由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系P3—2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F₁代出现分离，且这3个组合F₂代出现稳定株系，说明P3—2具有孤雌生殖遗传特性。用P3—2与高芥酸、矮杆油菜4247正反交（矮杆、高芥酸为显性性状），然后将杂交F₁代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为Y3560。

参见图2、图3、图5、图9、图10、图11，由本申请人获得的甘蓝型油菜四倍体早代稳定系P3—2，与20个纯合甘蓝型四倍体油菜正反交，3个正反交F₁代出现分离，且这3个组合F₂代出现稳定株系，说明P3—2具有孤雌生殖遗传特性。用P3—2与四倍体甘蓝型矮杆油菜D3—5正反交（矮杆为显性性状），然后将杂交F₁代种子进行染色体加倍，加倍后代用流式细胞仪鉴定或根尖显微镜观察鉴定为显示矮杆八倍体植株，该植株定名为Y3380。

本实施例中将P3-2与矮杆油菜D3—5杂交F₁、P3-2与矮杆、高芥酸油菜4247杂交F₁种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度250C，白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，晚上暗培养8小时,待长到1—2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度250C，相对湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6-苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 50mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第一培养基的pH=5.8—6.0；

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1，

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6-苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 30mg

蔗糖 30g

琼脂 8g。

第二培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α-萘乙酸 0.03mg

秋水仙素 20mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第三培养基的pH=5.8-6.0；

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6g

α— 萘乙酸 0.5mg。

参见图3、图6、图11，用Y3380作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0464A）测交，测交后代50株，全为高杆,且全为四倍体油菜，其中49株为全不育，1株半不育，且形态特征与0464A完全相同。同时用P3-2与矮杆油菜D3-5杂交F₁（非加倍株）做父本与0464A测交作为对照验证，测交后代102株，出现矮杆62株、高杆40株、且育性分离较大，出现全可育73株、半不育20株、全不育9株。说明Y3380中的基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来，诱导率98%。用Y3380做父本与甘蓝型油菜3954去雄聚合杂交（3954为F₁，由中双11与CAX杂交而来），聚合杂交后代F₁分离，每个F₁自交，收获F₁自交株45个。种植F₂代株系45个，出现稳定株系45个，稳定株系出现比列100%，诱导率100%。

用Y3380做父本与甘蓝型油菜3968去雄聚合杂交（3968为F₁，由中双11与1365杂交而来），聚合杂交后代F₁分离，每个F₁自交，收获F₁自交株52个。种植F₂代株系52个，出现稳定株系28个，稳定株系出现比例53.85%，诱导率53.85%。

用Y3380做父本与甘蓝型油菜中双11（常规品种，纯合系）去雄杂交，获得杂交F₁植株70株，70株F₁形态与中双11完全相同，且每个单株自交后F₂代未发生分离，为稳定株系，与中双11形态也完全相同，说明F₁代就为纯系。即Y3380与中双11杂交过程，诱导中双11发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，是纯合系，因此F₁稳定、F₂也稳定，且与中双11形态完全相同，该诱导率100%。

同样用Y3380做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH（二倍体油菜，2ｎ＝20）去雄杂交，获得杂交F₁植株98株，97株F₁形态与YH完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为二倍体、外形与YH一致，说明Y3380与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，该诱导率98．9％。最终，显性矮杆八倍体植株Y3380确定为油菜双单倍体诱导系。

参见图3、图6、图12，用Y3560作父本，与甘蓝型油菜细胞质不育系（0464A）测交，测交后代80株，全为高杆,且76为四倍体油菜、2株为二倍体、2株为八倍体；其中76株四倍体植株为全不育，4株半不育，且形态特征与0464A完全相同。同时用P3-2与矮杆、高芥酸油菜4247杂交F₁（非加倍株）做父本与0464A测交作为对照验证，测交后代153株，出现矮杆102株、高杆51株、且育性分离较大，出现全可育65株、半不育35株、全不育53株。说明Y3560中的基因并未进入测交株，测交后代为0464A孤雌生殖而来，诱导率95%。

用Y3560做父本与白菜型油菜雅安黄油菜YH（二倍体油菜，2ｎ＝20）去雄杂交，获得杂交F₁植株145株，143株F₁形态与YH完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为二倍体、外形与YH一致，说明Y3560与YH杂交过程，诱导YH发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与YH形态完全相同，该诱导率98．6％。

同样用Y3560做父本与芥菜型油菜GW（四倍体油菜，2ｎ＝36）去雄杂交，获得杂交F₁植株124株，123株F₁形态与GW完全相同，且每个单株自交后F₂代形态都为四倍体、外形与YH一致，说明Y3560与GW杂交过程，诱导GW发生了孤雌生殖，所产生的F₁为孤雌生殖自交，且与GW形态完全相同，该诱导率99．2％。最终，显性矮杆八倍体植株Y3560确定为油菜双单倍体诱导系。

参见图3、图6、图9、图10，获得早代稳定系P3-2方法如下：

甘蓝型油菜F009（四倍体，染色体2n=38）与白菜型油菜YH（二倍体，雅安黄油菜，染色体2n=20）剥蕾进行人工去雄杂交获得F₁代杂交种子。F₁代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍。对加倍后的F₁代植株进行自交（或强制自交）获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上）。对F₂代正常可育单株进行自交获得F₃代。对F₃代进行纯合度鉴定，种植F₃代单株株系，32%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致（38条），染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是F009与YH的杂交后代，且每个单株DNA扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。将其中1个叶片较大、无裂叶、叶片着生紧凑、含油率55%的甘蓝型（染色体38条）油菜早代稳定系定名为P3-2。

本实施例中将F1代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下：

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6-苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 30mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第一培养基的pH=5.8—6.0；

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，其配方参见附表1。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6-苄基腺嘌呤（6BA） 0.5mg

秋水仙素 20mg

蔗糖 30g

琼脂 8g，

第二培养基的pH=5.8—6.0；

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α-萘乙酸 0.03mg

秋水仙素 5mg

蔗糖 20g

琼脂 8g，

第三培养基的pH=5.8-6.0；

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6g

α— 萘乙酸 0.5mg。

附表1 MS培养基成分配方：

实施例 2：

参见图1、图2、图4、图5、图8，甘蓝型油菜小孢子离体培养后代DH0034 与萝卜胞质不育系蓉萝A100测交，对测交后代鉴定，测交后代高度不育，该小孢子纯合株系DH0034为萝卜胞质不育系的保持系。用油菜双单倍体诱导系Y3380花粉给测交后代不育单株授粉，并套袋隔离，收获诱导后代种子。对诱导后代进行种植，并在苗期用流氏细胞仪鉴定诱导后代单株的倍性，淘汰多倍体、单倍体、非整倍体植株。在花期，淘汰具有油菜双单倍体诱导系Y3380显性性状（矮秆性状）不育植株。选择完全不育，植株长势较好的20株不育单株，第二次用油菜双单倍体诱导系Y3560给不育单株授粉，并套袋隔离。对二次诱导后代分株系种植，在苗期及蕾苔期鉴定株系内的整齐度，用SSR分子标记鉴定株系内的遗传一致性及稳定性，发现有17个株系株系内外形特征及分子水平高度一致，且17株系都高度不育，17株系彼此外观特性差异较大，熟期不一致。对17个稳定株系继续用油菜双单倍体诱导系Y3560和Y3380花粉进行第三次诱导，每个诱导系株系内授粉5株，共10株，并套袋隔离，每个诱导系授粉后5个单株混合收种后混合种植，鉴定其诱导效率。通过诱导效率鉴定发现Y3560对17株系的诱导效率从90-96.8%不等，Y3380对17株系的诱导效率从90-100%不等，由于Y3560对这些不育系的诱导效率不高，因此，不能作为该不育系列的万能保持系；其中Y3380诱导后代有8个株系诱导效率在98%以上，且株系内植株稳定一致，且高度不育，农艺性状存在较大差异，熟期不一致，含油率也从43-48%不等，但具有DH0034和蓉萝A100的部分遗传特性，因此通过诱导系一次性选育出8个具有DH0034遗传特性和蓉萝A100特性的新不育系蓉萝A0034-1、蓉萝A0034-2、蓉萝A0034-3、蓉萝A0034-4、蓉萝A0035-5、蓉萝A0035-6、蓉萝A0035-7、蓉萝A0035-8系列萝卜胞质不育系，这部分相同来源，不同遗传背景的不育系可以采用Y3380作为万能保持系进行混合授粉，一次性繁殖8个不育系，后期对8个不育系进行配合力测定再淘汰部分株系，选择具有高配合力、高含油、多抗、早熟的萝卜胞质新不育系。

本实施例2中油菜双单倍体诱导系的选育方法同实施例1。

本发明适用于甘蓝型油菜所有细胞质不育类型，包括玻里马细胞质不育polimaCMS、萝卜细胞质不育ogura CMS、芥菜型油胞质不育 Hau CMS、JA胞质不育 JACMS等。

上述实施例是对本发明的上述内容作进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的额范围。

Claims

1.油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法，包括以下步骤：

1）将遗传稳定的、具有目标性状的甘蓝型油菜株系与稳定的细胞质不育系测交,判断遗传稳定株系的恢保关系；

2）上述步骤1）中，测交后代为全不育，对应的测交父本为临时保持系，并根据测交后代性状特征，将临时保持系与测交后代不育株继续回交或多代回交；

3）上述步骤2）中，测交后代具有临时保持系的优良目标性状，直接用油菜双单倍体诱导系对测交F₁不育单株授粉；临时保持系与测交后代不育株回交或多代回交后具有该临时保持系的优良目标性状，用油菜双单倍体诱导系对回交后代或多代回交后代不育单株授粉；获得第一次授粉诱导后代；

5）上述步骤4）中获得的多个第二次授粉诱导单株后代，按株系种植，苗期利用流式细胞仪鉴定倍性，淘汰多倍体、单倍体，淘汰可育株和具有油菜双单倍体诱导系显性性状特征植株，对正常四倍体、高度不育、具有临时保持系优良性状的植株不育株系，用分子标记鉴定株系的遗传稳定性一致性，并调查不育株系的不育度；形成一个或多个稳定的新细胞质不育系；

8）上述步骤5）中形成的一个或多个稳定的新细胞质不育系，根据油菜双单倍体诱导系对细胞质不育系大于98%的诱导能力，用同一个保持系即油菜双单倍体诱导系进行保持，油菜双单倍体诱导系成为新细胞质不育系的万能保持系，同时用一个保持系，保持多个遗传稳定的细胞质不育系；上述步骤5）新形成的稳定细胞质不育系与上述步骤1）中的稳定细胞质不育系具有明显的遗传差异，引入临时保持系的部分基因资源并含有上述步骤1）中的稳定细胞质不育系的基因资源，与油菜双单倍体诱导系即万能保持系无遗传背景上的联系，且遗传稳定、高度不育，是一个或多个新细胞质不育系；

上述油菜双单倍体诱导系的选育方法，包括如下步骤：

（1）选育具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系：

②加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代，对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代，对F₃代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系---早代稳定系；

①具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到杂交F₁代种子，杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，得到加倍后的带显性性状的F₁植株；

②对加倍的带显性性状的F₁植株，通过显微观察或流式细胞仪进行染色体倍性鉴定，选择带显性性状的多倍体的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍体植株、以及不带显性性状加倍植株带显性性状的，带显性性状的多倍体的植株是倍性遗传稳定、结实性好、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的六倍体或八倍体油菜植株；

油菜双单倍体诱导系鉴定及诱导能力测定：

①倍性遗传稳定、具有孤雌生殖遗传特性、带显性性状的多倍体植株中的显性性状能去除测交后代中产生的杂交株，测交后代中出现显性性状植株、或非整倍体植株，说明该植株是多倍体植株和母本杂交产生的，去除该植株；

②上述单株测交后代出现全不育、为正常倍性即二倍体或四倍体油菜、且不带显性性状，说明该测交后代对应的父本基因未进入测交后代中，显性多倍体植株为油菜双单倍体诱导系。

2.如权利要求1所述的油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜品种细胞质不育的方法，其特征在于油菜双单倍体诱导系选育是将两个亲本材料杂交F₁代种子或具有孤雌生殖遗传特性的早代稳定系与具有显性性状油菜杂交得到的杂交F₁代种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，具体方法如下：

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

6-苄基腺嘌呤 0.5—1.5mg

染色体加倍诱导剂 30—70mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第一培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基 1L

6-苄基腺嘌呤 0.5—1mg

染色体加倍诱导剂 20—40mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第二培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基 1L

α-萘乙酸 0.03—0.5mg

染色体加倍诱导剂 5—20mg

蔗糖 20—30g

琼脂 8—10g，

第三培养基的pH=5.8-6.0，

上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成：

水 1L

易保或克露 0.6-1.2g

α-萘乙酸 0.5—1mg。

3.如权利要求1或2所述的油菜双单倍体诱导系选育甘蓝型油菜细胞质不育系的方法，其特征在于染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。