CN102428869B - 获得油菜早代稳定系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明获得油菜早代稳定系的方法，包括1）将两个遗传背景不同的油菜材料进行人工去雄杂交获得F₁代杂交种子；2）将F₁代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍；3）对加倍后的F₁代单株进行染色体鉴定；4）加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代；5）F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代；6）对F₃代进行纯合度鉴定，说明这些株系是纯合系；通过以上方式可以在F₂代获得稳定的纯合系----早代稳定系。本发明方法能提高油菜新品系或新品种纯合的速度，提高育种效率，快速选育优良保持系、恢复系及常规油菜品种。

Description

获得油菜早代稳定系的方法

技术领域：

本发明与农业有关，特别与获得油菜早代稳定系的方法有关。

背景技术：

油菜新品种选育时间较长，正常情况下通过常规的人工杂交选育一个常规油菜品种需要6—7代的时间，选育杂交品种时间更长。常规油菜新品系选育是通过两个遗传背景不同的品系杂交形成F₁代， F₁代自交形成F₂代，F₂代再选择优良单株自交形成F₃代，F₃代再选单株自交，一直到F₆-—F₇代才能获得稳定的油菜新品系，以1年1代计算，所花时间大概在7—8年的时间，通过异地加代也需要4年左右的时间。另外，可以在F₁代对油菜花粉进行小孢子离体培养，然后对培养后代进行人工染色体加倍获得稳定的单双倍体（doubled haploid ,DH系）——纯合系。该方法能有效缩短纯合系选育的时间，但该方法对易于小孢子离体培养的材料很有效，对于其他的不易于小孢子培养的材料而言只能通过常规自交的方式来获得稳定的纯合系，并且该方法投入的人力物力较大。对于远缘杂交或种间杂交，由于染色体数目不同，获得稳定的纯合系，难度较大，不管是通过常规杂交的形式还是小孢子离体培养的方式都难以获得稳定的纯合系。

目前，在油菜中还未出现过早代稳定系的报道。所谓早代稳定是指：两个不同遗传背景的植株杂交后在F₂或F₃代获得稳定纯合的株系，该株系遗传背景一致，能稳定遗传，即植株在杂交后代的前两代就遗传稳定，不再发生性状分离。目前，水稻中有过早代稳定系的报道，主要是通过二倍体植株与三倍体植株杂交，在杂交后代中自交选育而来的，其遗传及生物学机理还不明确。但该方法获得早代稳定系的效率较低，首先三倍体水稻不易获得，其次三倍体与二倍体不易获得杂交后代种子。

发明目的： 

本发明的目的是为了克服以上不足，提供一种能提高油菜新品系或新品种纯合的速度，提高育种效率，选育优良保持系、恢复系及常规油菜品种，获得油菜早代稳定系的方法。

本发明的目的是这样来实现的：

本发明获得油菜早代稳定系的方法，该方法包括以下步骤：

1）、将两个遗传背景不同的油菜材料（可以是常规油菜品系、油菜近缘属种、油菜种间材料）进行人工去雄杂交获得F₁代杂交种子，获得的杂交种子的数目要比较多；

2）、将F₁代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，必须确保加倍成功，加倍可以是部分或全部染色体加倍（如甘蓝型油菜染色体38条，加倍后染色体为60—76条），但不能是嵌合体（嵌合体是指：部分细胞染色体加倍，其余细胞染色体未加倍）；

3）、对加倍后的F₁代单株进行染色体鉴定，通过染色体数目（根尖或幼嫩的花药，在显微镜下观察染色体数目，染色体数目较正常植株多，多一倍或多10条以上）、株叶形态鉴定加倍结果（叶片较正常植株更厚、花器官更大、植株整体较正常植株大等）；

4）、加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代；

5）、对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性（通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性）选择可育后代自交获得F₃代；

6）、对F₃代株系进行纯合度鉴定，通过形态（每个单株的生长发育的整齐度，叶色、叶型、植株高度、花器官大小、育性等）、细胞学（染色体的形态、染色体的数目）以及分子标记进行鉴定（用两个杂交亲本材料的特异SSR(simple sequence repeat,即简单重复序列,微卫星标记)引物或其他特异分子标记引物，对后代进行聚合酶链反应（或PCR反应，Polymerase chain reaction），电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA的带型及条带数目），显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系-——早代稳定系；

通过以上方式可以在F ₂ 代获得稳定的纯合系-——早代稳定系。

上述的方法中将F₁代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12—17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度23—25℃，白天光照12—16小时，光照强度2000—3000勒克斯，夜间暗培养8—12小时，待长到1—2片真叶时，从下胚轴将植株剪下继续在第二培养基（分化培养基）上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根，将植株在室温炼苗3—7天后，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15—30分钟后移栽到温室中，温室温度16℃—25℃，相对湿度60—80%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基                1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）   0.5—1.5mg

染色体加倍诱导剂        30—70mg

蔗糖                          20—30g

琼脂                          8—10g，

第一培养基的pH=5.8—6.0，

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，MS培养基可在市场上买到。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基                    1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）     0.5—1mg

染色体加倍诱导剂          20—40mg

蔗糖                            20—30g

琼脂                            8—10g

第二培养基的pH=5.8—6.0

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基                    1L

α-萘乙酸                     0.03—0.5mg

染色体加倍诱导剂          5—20mg

蔗糖                            20—30g

琼脂                            8—10g，

第三培养基的pH=5.8-6.0，

上述的浸泡冲液由以及下配比的组分组成：

水                              1L

易保或克露                  0.6—1.2g

α-萘乙酸                  0.5—1mg

易保或克露是由美国杜邦公司生产。

上述的染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。

本发明具有以下优点：

1、可以在较短时间内（F₂代）获得稳定的纯合系（早代稳定系）。

2、纯合系（早代稳定系）能稳定遗传，遗传特性明显。

3、种子加倍的概率30%以上，从加倍后代中获得稳定纯合系（早代稳定系）的概率30%左右。

4、本发明可以用在油菜保持系、恢复系，以及常规油菜品种的选育上，可以在F₂代内获得稳定的油菜新品系或新品种。对油菜品质育种、抗性育种、高油分育种、常规育种及杂交育种具有明显的优势，提高育种效率，降低育种成本和风险。 

5、该方法与常规油菜品系或品种选育方法比较可以提高效率50%以上，缩短品种选育时间4—5年。

附图说明：

图1为获得油菜早代稳定系的方法流程图。

图2为采用F009和YH获得油菜早代稳定系的方法流程图。

图3为采用1325和白菜菜心获得油菜早代稳定系的方法流程图。

图4为采用P3和诸葛菜获得油菜早代稳定系的方法流程图。

图5为采用1365和中双11获得油菜早代稳定系的方法流程图。

具体实施方式：

实施例1： 

参见图1、图2，甘蓝型油菜F009（染色体2n=38）与白菜型油菜YH（雅安黄油菜，染色体2n=20）剥蕾进行人工去雄杂交获得F ₁ 代杂交种子。F₁代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍。对加倍后的F ₁ 代植株进行染色体及形态学鉴定，正常情况下F009与YH杂交后代染色体数目为29条，加倍后染色体数目为48—58℃条不等，判断染色体加倍成功。对F₁代植株进行自交（或强制自交）获得F ₂ 代，对F2代进行田间种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上）。对F ₂ 代正常可育单株进行自交获得F ₃ 代。对F ₃ 代进行纯合度鉴定，种植F ₃ 代单株株系，32%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致，染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是F009与YH的杂交后代，且每个单株DNA PCR扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。 

    本实施例1中将F₁代杂交种子在培养基上用秋水仙素进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度25，白天光照16小时，光照强度2000勒克斯，晚上暗培养8小时，待长到1—2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15分钟后移栽到温室中，温室温度25℃，相对湿度60%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基              1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）  0.5mg

秋水仙素                   30mg

蔗糖                         20g

琼脂                         8g。

第一培养基的pH=5.8—6.0。

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，MS培养基可在市场上买到。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基                  1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）  0.5mg

秋水仙素                    20mg

蔗糖                          30g

琼脂                          8g。

第二培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基                  1L

α-萘乙酸                   0.03mg

秋水仙素                    5mg

蔗糖                          20g

琼脂                          8g。

第三培养基的pH=5.8-6.0。

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水                             1L

易保或克露                 0.6g

α-萘乙酸               0.5mg。

实施例2：

参见图1、图3，甘蓝型油菜1325（染色体2n=38）与白菜菜心（染色体2n=20）剥蕾进行人工去雄杂交获得F ₁ 代杂交种子。F₁代杂交种子在培养基上用氟乐灵进行人工染色体加倍。对加倍后的F ₁ 代植株进行染色体及形态学鉴定，正常情况下1325与白菜菜心杂交后代染色体数目为29条，加倍后染色体数目为48-58条不等，判断染色体加倍成功。对F₁代植株进行自交（或强制自交）获得F ₂ 代。对F ₂ 代进行田间种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上）。对F ₂ 代正常可育单株进行自交获得F ₃ 代。对F ₃ 代进行纯合度鉴定，种植F ₃ 代单株株系，30%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致，染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是1325与白菜菜心的杂交后代，且每个单株DNA PCR扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。 

    本实施例2中的将F₁代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒30秒，用0.1%升汞消毒15分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度23⁰C，白天光照14小时，光照强度2500勒克斯，晚上暗培养10小时，待长到1—2片真叶时，将植株从下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗5天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡20分钟后移栽到温室中，温室温度20℃，相对湿度70%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基              1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）  1mg

氟乐灵                       50mg

蔗糖                          25g

琼脂                          9g。

第一培养基的pH=5.8—6.0。

MS培养基由Murashige和Skoog发明，简写为MS，MS培养基可在市场上买到。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基                    1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）     0.8mg

氟乐灵                         40mg

蔗糖                            25g

琼脂                            9g。

第二培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基                    1L

α-萘乙酸                     0.3mg

氟乐灵                         13mg

蔗糖                            25g

琼脂                            9g。

第三培养基的pH=5.8—6.0。

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水                               1L

易保或克露                   0.9g

α-萘乙酸                 0.8mg。

实施例3：

参见图1、图4，甘蓝型油菜P3（染色体2n=38）与诸葛菜（又名二月兰，染色体2n=24）剥蕾进行人工去雄杂交获得F ₁ 代杂交种子。F₁代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵进行人工染色体加倍。对加倍后的F ₁ 代植株进行染色体及形态学鉴定，正常情况下P3与诸葛菜杂交后代染色体数目为31条，加倍后染色体数目为52—62条不等，判断染色体加倍成功。对F₁代植株进行自交（或强制自交）获得F ₂ 代。对F2代进行田间种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性95%以上）。对F ₂ 代正常可育单株进行自交获得F ₃ 代。对F ₃ 代进行纯合度鉴定，种植F ₃ 代单株株系，35%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致，染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是P₃与诸葛菜的杂交后代，且每个单株DNA PCR扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。 

    本实施例3中的将F₁代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒40秒，用0.1%升汞消毒17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基（染色体加倍诱导培养基）上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度25℃，白天光照12小时，光照强度3000勒克斯，晚上暗培养12小时,待长到1—2片真叶时，将下胚轴剪下继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基（生根培养基）中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出较粗壮的根后，将植株在室温炼苗7天后，取出植株将植株上的培养基冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡30分钟后移栽到温室中，温室温度16℃，相对湿度80%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基                 1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）    1.5mg

氨磺乐灵                      70mg

蔗糖                            30g

琼脂                            10g。

第一培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基                    1L

6-苄基腺嘌呤（6BA）    1mg

氨磺乐灵                      40mg

蔗糖                            30g

琼脂                            10g。

第二培养基的pH=5.8—6.0。

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基                    1L

α-萘乙酸                    0.5mg

氨磺乐灵                     20mg

蔗糖                           30g

琼脂                           10g。

第三培养基的pH=5.8-—6.0。

上述的浸泡缓冲液由以下配比的组分组成：

水                                1L

易保或克露                  1.2g

α-萘乙酸                  0.5mg。

实施例4：

参见图1、图5，甘蓝型油菜1365（染色体2n=38）与甘蓝型油菜中双11（染色体2n=38）剥蕾进行人工去雄杂交获得F ₁ 代杂交种子。F₁代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵进行人工染色体加倍。对加倍后的F ₁ 代植株进行染色体及形态学鉴定，正常情况下1365与中双11杂交后代染色体数目为38条，加倍后染色体数目为66—76条不等，判断染色体加倍成功。对F₁代植株进行自交（或强制自交）获得F ₂ 代。对F ₂ 代进行田间种植观察、育性鉴定即通过醋酸洋红对花粉染色，判断花粉育性，出现三种情况（1、单倍体植株，花粉极少，且育性极低；2、多倍体植株完全不育，花器官发育受阻，不能正常的开花，无花粉；3、正常可育的植株，花粉量多，花粉育性98%以上）。对F ₂ 代正常可育单株进行自交获得F ₃ 代。对F ₃ 代进行纯合度鉴定，种植F ₃ 代单株株系，28%的可育株系单株植株整齐一致，开花结实正常。对整齐一致株系进行细胞学鉴定，染色体条数一致，染色体形态未出现异常。SSR分子标记，通过DNA聚合酶链反应，电泳观察每个特异引物扩增下单株DNA带型，显示每个单株都是1365与中双11的杂交后代，且每个单株DNA PCR扩增条带数目及带型一致，可以判断这些株系为纯合系，即早代稳定系。 

本实施例4中的将F₁代杂交种子在培养基上用氨磺乐灵进行人工染色体加倍的具体方法同实施例3。

上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims (2)

1.获得油菜早代稳定系的方法，该方法包括以下步骤：

1）将两个遗传背景不同的油菜材料进行人工去雄杂交获得F₁代杂交种子； 

2）将F₁代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍，必须确保加倍成功，加倍是部分或全部染色体加倍，即对加倍后的F₁代单株进行染色体鉴定，通过染色体数目、形态鉴定加倍效果；

3）加倍后的F₁代植株进行自交或强制自交获得F₂代；

4）对F₂代进行田间种植观察，并鉴定每个单株的育性，选择可育后代自交获得F₃代；

5）对F₃代进行纯合度鉴定，通过形态、细胞学以及分子标记鉴定，对后代DNA进行聚合酶链反应扩增，电泳观察每个特异引物扩增下单株的DNA带型及条带数目，显示每个单株都是两个亲本的杂交后代，每个单株之间分子标记图谱一致，说明这些单株是纯合系——早代稳定系；

通过以上方式可以在F₂代获得稳定的纯合系——早代稳定系，

上述的将F₁代杂交种子在培养基上用染色体加倍诱导剂进行人工染色体加倍的具体方法如下：

1）用纯度为75%酒精进行种子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12—17分钟，然后用无菌水将种子表面的升汞冲洗干净，用无菌纸将种子表面的水分吸干，然后将种子接种在第一培养基上；

2)让种子在第一培养基上生根发芽，培养条件：温度23—25℃，白天光照12—16小时，光照强度2000—3000勒克斯，夜晚暗培养8—12小时，待植株长到1—2片真叶时，从下胚轴处剪下植株继续在第二培养基上生长；

3）将剪下的植株继续插入第二培养基上继续培养，待有侧芽分化后，将侧芽及植株转入第三培养基中进行生根培养；

4）生根培养二周后，植株长出粗壮的根后，将植株在室温炼苗3—7天，取出植株将植株上的培养基用自来水冲洗干净，并在浸泡缓冲液中浸泡15—30分钟后移栽到温室中，温室温度16℃—25℃，相对湿度60—80%，能保证移栽成活率在95%以上；

上述的第一培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基              1L

6-苄基腺嘌呤           0.5—1.5mg

染色体加倍诱导剂       30—70mg

蔗糖                   20—30g

琼脂                   8—10g，

第一培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第二培养基由以下配比的组分组成：

MS培养基              1L

6-苄基腺嘌呤           0.5—1mg

染色体加倍诱导剂       20—40mg

蔗糖                   20—30g

琼脂                   8—10g，

第二培养基的pH=5.8—6.0，

上述的第三培养基由以下配比的组分组成：

MS 培养基               1L

α-萘乙酸               0.03—0.5mg

染色体加倍诱导剂        5—20mg

蔗糖                    20—30g

琼脂                    8—10g，

第三培养基的pH=5.8—6.0，

上述的浸泡缓冲液由以及下配比的组分组成：

水                       1L

易保或克露               0.6—1.2g

α-萘乙酸              0.5—1mg。

2.如权利要求1所述的获得油菜早代稳定系的方法，其特征在于染色体加倍诱导剂采用秋水仙素、氟乐灵、氨磺乐灵中的至少一种。

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