CN1884518A - 甘蓝型油菜c染色体组定向转基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法，其步骤是：A.甘蓝农杆菌介导的遗传转化，首先是农杆菌菌液制备，其次是外植体制备，第三是将外植体置于农杆菌液中进行遗传转化，第四是除草剂抗性检测，第五是PCR分子检测；B.转基因甘蓝型油菜的人工合成，首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，最后是对人工合成的单倍体油菜进行染色体加倍；C.转基因油菜的鉴定。本发明操作简单，外源目的基因可准确无误地转到甘蓝型油菜C染色体上，所获得的转基因油菜，环境释放时外源转基因扩散的生态风险小。

Description

甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法

                                 技术领域

本发明涉及转基因植物生态安全研究领域，具体地说，本发明涉及基因定向转化方法，应用该方法获得的转基因油菜，环境释放时外源转基因扩散的生态风险小。

                                 背景技术

油菜是以收获种子榨油为目的的栽培十字花科芸薹属植物的统称，主要包括：甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、白菜型油菜(B.campestris L.)和芥菜型油菜(B.juncea Czern.et Coss.)。当今世界各国种植的油菜主要是甘蓝型油菜，其它类型油菜种植面积很小。现在所说的油菜如不特别说明，均指甘蓝型油菜。

油菜是重要的油料作物，在世界油料作物生产中，仅次于大豆，居第二位。中国、印度、加拿大、澳大利亚、欧洲是世界主要油菜生产国。自1999年以来，中国油菜播种面积一直在1亿亩以上，总产量在1100万吨左右，中国是世界油菜第一生产大国，油菜种植面积和总产量均居世界第一位。

1996年全球第一次大面积种植转基因抗除草剂作物，其后持续扩大，转基因作物迅速发展，到2004年全球转基因作物的种植面积达8,100万公顷，比9年前增加了47倍。2004年全球转基因作物种植面积的增长率为20％，连续9年增长率达两位数。2004年全球共17个国家(11个发展中国家及6个发达国家)825万农民种植8,100万公顷的转基因作物。

转基因油菜的种植面积则由2002年的300万公顷增长至2005年的360万公顷，占全球转基因作物总种植面积的5％，主要集中在加拿大和美国。

国内外大量的研究已证实：在人工授粉和自然生态条件下，转基因油菜中的外源基因能够通过花粉传给其它有亲缘关系的芸苔属植物，如：白菜类(小白菜、大白菜、菜薹、白菜型油菜等)(Brassica rapa或B.campestris)、芥菜类(芥菜、榨菜、芥菜型油菜等)(B.juncea)，且能在该物种种群中生存下来(刘后利，油菜的遗传和育种.上海：上海科学技术出版社，1985：9～63；Scheffler JA，Dale PJ.Opportunities for gene transfer andorigin of crop Brassicas，a review.Opera Bot，1994a，55：3-57；Scheffler JA，DalePJ.Opportunities for gene transfer from transgenic oilseed rape(Brassica napus)to related species.Transgenic Res，1994b，3：263-278)。在加拿大和欧洲许多国家，野生白菜类植物(B.rapa)还是农田优势种群杂草。在我国冬油菜产区和春油菜产区野生芥菜类(B.juncea)和白菜类(B.rapa)植物也是农田优势种群杂草。转基因甘蓝型油菜中的抗除草剂、抗虫、抗病等外源基因如果扩散到这类野生植物中，可能形成超级杂草，将会给生态环境带来不可预测的可怕后果，也会给农业生产带来不可估量的损失。

由于转基因甘蓝型油菜的环境释放和商业化应用，转基因油菜中的外源目的基因(如：抗除草剂、抗病、抗虫等外源基因)通过花粉扩散到自然界油菜野生近缘物种中形成“超级杂草”，造成生态平衡的破坏，引发生态灾难，引起人们广泛关注，也给转基因油菜推广应用带来很大阻力。因此，世界上除加拿大和美国已商业化种植转基因油菜多年，其他国家还没有转基因油菜商业化种植。

甘蓝型油菜(B.napus，AACC，2n＝38)属于异源多倍体作物，是由白菜(B.rapa，AA，2n＝20)与甘蓝(B.oleracea，CC，2n＝18)自然杂交，染色体加倍，经过长期的自然进化和人工选择而形成现在人们广泛种植的栽培甘蓝型油菜(刘后利，油菜的遗传和育种.上海：上海科学技术出版社，1985：9～63)。

前人大量研究表明：芸苔属AA染色体组白菜类物种与AC染色体组的甘蓝型油菜杂交较容易获得杂种，但杂交后代的自然结实率很低；AB染色体组的芥菜类植物与甘蓝型油菜杂交也比较容易，但杂种F₁代不育或部分可育；甘蓝型油菜与C染色体组的甘蓝类植物杂交极为困难，自然条件下很难获得杂种(刘后利，油菜的遗传和育种.上海：上海科学技术出版社，1985：9～63)。

对于异源多倍体作物来说，只有某一套染色体和其近缘种具有杂交亲和性。比如，甘蓝型油菜的A染色体组和白菜类植物(B.rapa)、芥菜类植物(B.juncea)的A染色体组具有杂交亲和性，因而转基因甘蓝型油菜中的外源转基因很容易通过A染色体组转移到这一类植物中；但在自然条件下位于甘蓝型油菜C染色体组上的基因极少会转移到其相应的近缘物种中。因此，通过染色体定位转基因获得那些转基因插入到安全性较高染色体组的转基因作物进行产业化，可以在很大程度上降低产生超级杂草的生态风险。

Metz等(1997)将转基因抗除草剂甘蓝型油菜作父本与芜菁(B.rapa)杂交，然后研究回交后代不同世代的外源基因消失速度，2个转bar基因甘蓝型油菜品系研究结果明显不同，1个品系回交后代的抗除草剂植株减少快，表示外源bar基因快速丢失，难以整合到芜菁(B.rapa)基因组中(Metz PLJ，Jacobsen E，Nap JP，Pereira A，et al..The impacton biosafety of the phosphinothricin-tolerance transgene in inter-specific B.rapa×B.napus hybrids and their successive backcrosses.TheorAppl Genet，1997，95：442-450)；Zhu等(2004)研究9个转GFP-Bt基因甘蓝型油菜品系与三个野生白菜材料杂交、回交后代转基因遗传行为，也发现有2个转基因品系的外源基因在甘白杂种的回交后代中快速丢失(Zhu B，John R.LAWRENCE，Suzanne I.WARWICK et al..Inheritance of GFP-Bttransgenes from Brassica napus in backcrosses with three wild B.rapa accessions.Environ.Biosafety Res.2004，3：45-54)。上述研究结果都推测是由于外源基因插入甘蓝型油菜C染色体上所形成，表明甘蓝型油菜C染色体转基因品系基因扩散的生态风险小。

目前，所有的转基因方法(如：基因枪介导法、农杆菌介导法、花粉管通道法等)都不能准确地将外源目标基因转到甘蓝型油菜特定染色体上，现有的转基因方法转基因时，外源基因向受体油菜基因组(染色体组)整合是随机的，目前还没有快速有效的方法鉴定外源基因是转到A染色体上还是转到C染色体上。应用现有的转基因方法，要想获得目标基因准确插入C染色体上的转基因甘蓝型油菜难度很大。

                                 发明内容

本发明目的在于提供一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法，以便外源基因准确无误地定向插入甘蓝型油菜C染色体，获得C染色体转基因甘蓝型油菜。该方法解决如何将外源基因准确插入甘蓝型油菜特定染色体组上的技术难题，可使100％的转基因油菜株系的目标基因插在特定的C染色体组上。

根据本发明提供的转基因方法并使用本发明提供的方法可以实现上述目的。

甘蓝型油菜C染色体组定向转基因方法，该方法包括以下步骤：

1、甘蓝农杆菌介导的遗传转化：

1)、农杆菌菌液制备：将含有bar基因表达载体pCAMBIA3300质粒(购自澳大利亚CAMBIA，地址：Vectors，CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，Australia)的农杆菌菌株LBA4404(购自澳大利亚CAMBIA，地址：Vectors，CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，Australia)划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养基[Beef extract(牛肉浸膏)5g/L，Yeast extract(酵母膏)1g/L，Peptone(蛋白胨)5g/L，Sucrose(蔗糖)5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.4g/100ml，Agar(琼脂)1.5g/100ml，pH7.4]上，在28℃温度下倒置培养2-3天。待菌落长出后，从YEB平板上挑取一个单菌落，接种于5ml YEB(内含50mg/L卡那霉素)液体培养基中，置摇床上200rpm，28℃下培养过夜。取菌液划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃下倒置培养2天，见菌落长出后，将培养皿至于4℃冰箱备用。每次实验时，取一个单菌落接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养基上，28℃培养1-2天，用1/2浓度的MS液体培养基(pH5.4)洗下菌体，并将菌液稀释至OD600＝0.08，作为侵染用菌液。

2)、外植体制备：选择籽粒饱满的甘蓝种子消毒[70％酒精5-10秒、1％二氯异氰尿酸(Dichloroisocyanuric acid，DICA)消毒8-15分钟、无菌水洗3-4次]，植入1/2浓度的MS培养基上生长4-5天(25℃、光16小时/暗8小时)，切下叶柄长约1-2mm的子叶和长约的0.5-0.7cm的下胚轴分别作为具柄子叶和下胚轴外植体。

3)、遗传转化：将外植体置于农杆菌菌株LBA4404菌液中，22℃侵染5-10分钟，其间轻轻摇动。在无菌吸水纸上吸干菌液，转至共培培养基[MS培养基+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)]上，22℃暗培养2-3天，然后转到分化培养基[MS培养基+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO₃+500mg/L羧苄青霉素(Cb)]上延迟培养5-7天，再转到筛选培养基[MS培养基+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO₃+500mg/L Cb+10mg/L草胺膦(PPT)]上培养3-4周，每2周转接一次。待再生绿苗长至1-2cm时，切下小绿苗，植入生根培养基[MS培养基+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+10mg/LPPT]上，待形成完整植株时，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养。转基因结果见表1。

         表1农杆菌介导的子叶与下胚轴遗传转化结果

批次	外植体	外植体数	产绿芽外植体数	转化率(％)
					IIIIII	子叶下胚轴子叶下胚轴子叶下胚轴	165187241279231254	141320201716	8.486.958.297.177.366.30

4)、除草剂抗性检测：T₀代转基因植株5-6片真叶期用13.5％的Basta^(德国拜耳公司生产的草胺膦注册商标)1∶200倍稀释液喷施。转基因阳性植株对该除草剂没有反应，表现除草剂抗性；转基因阴性植株在喷药5天后死亡。

5)、PCR分子检测：为尽量避免T₀代转基因植株的假阳性和农杆菌菌株LBA4404污染，选取用草胺膦筛选呈阳性的T₀代株系植株进行剥蕾自交，获得T₁代种子。将T₁代种子种在网室，苗期用13.5％的Basta^1∶200倍稀释液喷施。取抗性转基因甘蓝和非转基因甘蓝植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取植物基因组DNA(Doyle JJ，Doyle JL.A rapid DNA isolationprocedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，19：11-15)。采用20ul反应体系对目的基因进行PCR扩增，设阴性对照(以非转基因甘蓝植株总DNA为模板)和阳性对照(以pCAMBIA3300质粒DNA为模板)。反应程序为：95℃，2分钟；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；35cycles；72℃，5分钟。PCR产物用l％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

检测bar基因所用的正向引物为5′-GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA-3′，反向引物为5′-GGC GGT CTG CAC CAT CGT CAA-3′，由上海博亚生物技术有限公司合成。

2、转基因甘蓝型油菜的人工合成：

1)、白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成：以白菜作母本、转bar基因甘蓝作父本进行种间杂交。取授粉7天后的子房，消毒(70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分钟、无菌水洗3～4次)后进行培养，培养基为附加500mg/L水解酪蛋白的MS培养基(琼脂浓度0.8％，蔗糖浓度3.0％)。待子房培养约35～40天后，剥出子房中的种子，将剥出的瘪小种子接种在MS培养基上萌发，直到长成正常小苗。然后转接到生根培养基(MS培养基+0.2mg/L NAA)上生根和扩繁植株，每株系至少扩繁3株以上。待健壮根系形成后，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养。结果见表2。

                      表2白菜×芥蓝子房培养杂种获得率a)

杂交组合	培养子房数	获得种子数	杂种苗数	结实率(％)	杂种获得率(％)
						QF01×JQF04×JQF05×JQF06×JQF08×JQF10×JQF11×JQF15×J合计	7664933785253994624834863992	9191511783811154	517305903592	1.173.853.972.1019.550.621.662.263.86	0.653.450.79014.800.621.032.30

注：结实率＝获得种子数/子房数×100％；杂种获得率＝杂种苗数/子房数×100％。

黑叶白(编号：QF01)、蓉优矮抗青(QF04)、特早50白菜苔(QF05)、黄金地小白菜(QF06)、黄金小白菜(QF08)、九月鲜红菜薹(QF10)、潮汕甜白菜(QF11)和一个双低白菜型油菜品种(QF15)，转基因芥蓝(编号：J)

2)、甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成：以转bar基因甘蓝蓝作母本、白菜作父本进行种间杂交。取授粉17～20天的子房，消毒(70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分钟、无菌水洗3～4次)后，剥出荚中的胚进行离体培养，培养基为附加500mg/L水解酪蛋白的MS培养基(琼脂浓度0.8％，蔗糖浓度3.0％)，直到长成正常小苗。转接到生根培养基(MS培养基+0.2mg/L NAA)上生根和扩繁，每株系至少扩繁3株以上。待健壮根系形成后，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养。结果见表3。

                表3芥蓝×白菜组合胚培养杂种获得率

组合	培养胚数	成苗数	杂种获得率(％)
				J×QF01J×QF04J×QF05J×QF06J×QF08J×QF10J×QF11J×QF15合计	78150186156682282822342750	2622432132	2.564.01.081.285.881.320.710.431.16

注：杂种获得率＝成苗数/培养胚数×100％。黑叶白(编号：QF01)、蓉优矮抗青(QF04)、特早50白菜苔(QF05)、黄金地小白菜(QF06)、黄金小白菜(QF08)、九月鲜红菜薹(QF10)、潮汕甜白菜(QF11)、一个双低白菜型油菜品种(QF15)和转基因芥蓝(编号：J)

3)、染色体加倍：对人工合成的单倍体油菜采取如下方法进行染色体加倍处理：①切下幼苗移植于含0.01％秋水仙碱的MS培养基上处理7～10天，取出幼苗，切去粘有0.01％秋水仙碱的MS培养基的茎基部，转到生根培养基(MS培养基+0.2mg/L NAA)上生根和扩繁，每株系至少扩繁3株以上。待健壮根系形成后，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养；②秋水仙碱溶液浸根处理。将现蕾的植株从土壤中挖出来，洗净根部泥土，将根浸泡在800mg/L的秋水仙碱水溶液中。4小时之后，用自来水冲洗根部2分钟，移栽到田间。移栽成活后，剪掉现蕾的主花序和分枝，使其产生更多的新枝；③油菜植株现蕾时，将蘸有0.3％秋水仙碱的棉球置于植株的叶腋处，每天处理2次，连续处理3天。结果见表4。

                      表4人工合成油菜的花粉育性

杂交组合	株系编号	观察株数	观察花粉数(平均)	花粉育性平均值(％)
					QF01×JQF01×JQF01×JQF05×JQF08×JQF08×JQF08×JQF08×JQF08×JQF08×JQF11×JJ×QF15J×QF04J×QF04	1341522343941513114	26211222412154	6716357775977087238059938567857877441028830	71.27±0.9788.95±33.3075.30±26.8079.0687.5786.72±1.3676.90±7.4458.64±20.8258.61±15.1073.8982.13±1.0883.4750.13±12.2747.55±25.95

注：观察花粉数(平均)＝同一株系各株观察的花粉数之和/观察株数。黑叶白(编号：QF01)、特早50白菜苔(QF05)、黄金小白菜(QF08)、潮汕甜白菜(QF11)和转基因芥蓝(编号：J)。

3、转基因油菜的鉴定

1)、植株染色体数目观察：种子萌发植株根尖观察法：将种子在10-15℃冷水浸泡2-4小时，置湿润滤纸上于25℃下萌发，待根长至1～1.5cm时，取根尖在22℃下、0.002mol/L8-羟基喹啉中处理3小时，用卡诺液固定24小时，然后置于70％乙醇中4℃下保存。

幼小雌蕊观察法：剥取幼小花蕾中的雌蕊，用0.002mol/L 8-羟基喹啉处理5小时。经卡诺液固定24小时后，然后置于70％乙醇中4℃下保存。

幼小花蕾观察法：将幼小花蕾用0.002mol/L 8-羟基喹啉处理4小时后，转到卡诺液中固定，24小时后转到70％乙醇中保存。

观察时，取上述固定保存的根尖、幼小雌蕊和幼小花蕾材料，在60℃下用1mol/L的盐酸水解10分钟，移至载玻片上，加一滴改良的卡宝品红染液，压片镜检。甘蓝型油菜的染色体数为38条。

2)、转基因油菜的除草剂抗性检测：人工合成油菜植株5-6叶期，喷施13.5％的Basta^1∶200倍稀释液，5天后调查叶片药害表现，设非转基因油菜喷施对照。抗除草剂油菜没有反应，非转基因抗除草剂油菜枯死。

3)、转基因油菜基因组Southern blotting分子检测：采用CTAB法提取植物基因组DNA(Doyle JJ，Doyle JL.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of freshleaf tissue.Phytochemical Bulletin，1987，19：11-15)。取人工合成的C染色体组转基因甘蓝行油菜、转基因甘蓝、非转基因油菜、非转基因甘蓝等材料基因组总DNA和pCAMBIA3300质粒DNA各约20μg，分别用内切酶EcoR I将其完全消化后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离。预杂交、杂交和洗膜的程序按Sharpe等(1995)报道的方法(Sharpe AG，ParkinIA，Keith DJ.Frequent nonreciprocal translocations in the amphidiploid genome ofoilseed rape(Brassica napus).Genome，1995，38：1112-1121)进行。所用探针为pCAMBIA3300质粒PCR扩增bar基因的0.5kb片段，检测使用地高辛标记试剂盒进行(购自Roche Diagnostics，Swiss)。pCAMBIA3300质粒、转基因油菜、转基因甘蓝有特异带出现，并且，转基因油菜与转基因甘蓝带型一致；非转基因油菜和甘蓝没有特异带出现。

4)、外源基因位于甘蓝型油菜C染色体上的细胞遗传学验证：以转基因油菜作父本或母本与白菜杂交，甘白杂种与白菜回交，获得回交一代种子。苗期对回交一代植株进行抗除草剂涂叶鉴定，不抗除草剂植株出现症状时将涂药叶片摘除，并对所有植株进行PCR分子检测。根据抗除草剂表型和分子检测结果给每株挂抗、感牌。花期取每株幼小花蕾用2mM 8-羟基喹啉处理4小时，转到卡诺固定液中固定，24小时后转到70％乙醇中保存备用。

观察时，将花药挑出在60℃下、1M盐酸中解离5分钟，然后在改良卡宝品红中进行染色、压片，在显微镜下观察、照相。

所有20条染色体(AA)的植株都是不抗除草剂，并且PCR检测为阴性；染色体在20-28条之间的植株出现抗、感除草剂分离；染色体数为29的植株抗除草剂，PCR分子检测阳性。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点：

1、外源目的基因可以准确无误地转到甘蓝型油菜C染色体组上，获得C染色体组转基因甘蓝型油菜概率是100％。传统方法则不能确定可以将外源目的基因定向转到甘蓝型油菜C染色体组上，即使能实现，转到C染色体组的概率最高只有47.4％(甘蓝型油菜有38条染色体，C染色体18条，18/38＝0.474)。

2、操作简单，只需按传统转基因方法先将外源目的基因转到甘蓝中，再人工合成甘蓝型油菜即可。

3、应用本发明的方法获得的转基因甘蓝型油菜，可以不作任何鉴定就可以确定外源目的基因是插在甘蓝型油菜的C染色体组上。传统转基因方法获得的转基因油菜必须经过一系列鉴定才能从中找出很少一些外源基因插在C染色体组上的株系，但目前还没有切实可行的鉴定方法。

4、应用本发明的方法获得的转基因甘蓝型油菜，释放到环境中，其外源转基因向甘蓝型油菜近缘物种(如：白菜类植物、芥菜类植物、甘蓝类植物等)扩散的概率极低。可以解决人们对转基因油菜环境释放引起的基因扩散所造成的生态环境风险的关切。

为了叙述方便，在本发明中转基因方法仅使用农杆菌介导法，其它能将外源基因导入受体细胞并整合到基因组中的各种转基因方法都适用，包括直接转化法(PEG介导法、脂质体介导法、电激法、微注射法、基因枪介导法、超声波介导法、脉冲电泳法、激光微束法、碳硅纤维导入法、离子束介导法等)、间接转化法(农杆菌介导法、病毒介导法、染色体介导的直接转化等)和生殖细胞转化法(花粉管通道法、花粉管介导法、种胚浸泡法等)等。MS培养基是指Murashige T和Skoog F 1962年发明的培养基(Murashige T，Skoog F.A revisedmedium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15：473-497.)，1/2MS培养基是将MS培养基的营养成分稀释一倍。卡宝品红染色液配制方法：1)原液A：称取3g碱性品红(Basic fuchsin)溶于100ml 70％乙醇中；2)原液B：取10ml原液A加入90ml 5％的苯酚水溶液，在37℃下温浴2～4小时(2～4周内使用)；3)原液C：取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混匀；4)卡宝品红染液：取10～20ml原液C加入约80ml 45％的冰乙酸和1g山梨醇(配制两周后使用)。卡诺固定液是3份甲醇和1份冰醋酸配成，现配现用。

本发明中的甘蓝是指任一甘蓝(B.oleracea)品种，白菜是指任一白菜(B.rapa)品种。

                                 附图说明

图1十字花科芸薹属基本物种与复合物种间亲缘关系禹氏三角图，本图说明甘蓝型油菜(B.napus)是由白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)杂交、染色体加倍形成的异源多倍体新物种，以及甘蓝型油菜与芸薹属内其它物种的亲缘关系。

图2pCAMBIA3300质粒图谱，该质粒可整合到植物基因组中的T-DNA由CaMV35S启动子、草胺膦除草剂抗性bar基因和CaMV35S polyA终止子组成，农杆菌中表达的卡那霉素(kanamycin)抗性基因是细菌筛选标记基因。

图3转bar基因芥蓝抗除草剂Basta^鉴定抗、感植株症状图。抗性植株叶片绿色，没有任何症状；不抗除草剂植株叶片变黄、卷曲、整株枯死。

图4人工合成转基因甘蓝型油菜花期图片，具有典型的栽培甘蓝型油菜植物学特征，下部叶大头羽裂，叶缘具钝齿，总状花序，花乳白色。抗除草剂草胺膦。

图5人工合成油菜染色体图，白菜和甘蓝分别有20条和18条染色体，由白菜和甘蓝人工合成的甘蓝型油菜具有38条染色体，是白菜和甘蓝染色体总和。

图6人工合成转基因油菜的基因组southern blot分析。图中M带是DNA分子量marker带；1号是具有bar基因的pCAMBIA3300质粒阳性杂交带；2号是非转基因油菜，没有杂交带；3号是转基因甘蓝，具有阳性杂交带；4-6号是人工合成的C染色体组转基因甘蓝型油菜，具有阳性杂交带。转基因甘蓝与人工合成油菜带型一致，表明合成油菜中的外源基因所在的染色体和在该染色体上的位点与甘蓝一样，证明外源基因在合成油菜C染色体上。

                                 具体实施方式

以下是本发明的实施例，这些实施例不以任何方式对本发明的范围构成限制。

实施例1：

转bar基因芥蓝(B.oleracea var.alboglabra)

1芥蓝的遗传转化

1.1农杆菌准备

将含有bar基因表达载体pCAMBIA3300质粒的农杆菌菌株LBA4404划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养基上，在28℃下倒置培养2-3天。待菌落长出后，从YEB平板上挑取一个单菌落，接种于5ml YEB(内含50mg/L卡那霉素)液体培养基中，置摇床上200rpm，28℃下培养过夜。取菌液划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃下倒置培养2天，见菌落长出后，将培养皿至于4℃冰箱备用。每次实验时，取一个单菌落接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养基上，28℃培养1-2天，用1/2MS液体培养基(pH5.4)洗下菌体，并将菌液稀释至OD600＝0.08，作为侵染用菌液。

1.2具柄子叶的遗传转化

外植体准备：选择籽粒饱满的香港尖叶中花芥蓝种子消毒(70％酒精5-10秒、1％DICA消毒8-15分钟、无菌水洗3-4次)，植入1/2MS培养基上生长3-4天(25℃、光16小时/暗8小时)，从子叶节上1mm处切下具柄子叶作为外植体。

二步组培再生方法：将具柄子叶接至MS+1mg/L2，4-D+0.2mg/L6-BA培养基上，22℃暗培养2-3天，然后转移到MS+4.5mg/L6-BA+5mg/LAgNO3上继续培养2-3周，待再生绿苗长至1-2cm大时，切下，植入生根培养基MS+0.2mg/L NAA上，待根系发达成为完整植株时，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养。

遗传转化：采用二步法组培方法，将具柄子叶置入农杆菌菌液中，22℃侵染5-10分钟，其间轻轻摇动。捞出后在无菌吸水纸上吸干菌液，将子叶转至MS+1mg/L 2.4-D+0.2mg/L6-BA培养基上，22℃暗培养2-3天，然后转移到MS+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO₃+500mg/LCb(羧苄)上延迟培养5-7天，再转至筛选培养基MS+4.5mg/L6-BA+5mg/L AgNO₃+500mg/LCb+10mg/L草胺膦(PPT)上培养3-4周，待再生绿苗长至1-2cm大时，切下，植入生根培养基MS+0.2mg/L NAA+10mg/L PPT上，待根系发达成为完整植株时，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养。

1.3转基因芥蓝的PCR检测

取F₁代抗性转基因芥蓝和非转基因芥蓝植株的幼嫩叶片各1-2g，采用CTAB法提取植物基因组DNA。

检测Bar基因所用的引物为：5′端引物：5′GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA3′，3′端引物：5′GGC GGT CTG CAC CAT CGT CAA3′。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

转基因植株的PCR检测：以上制备的基因组DNA为模板，采用25ul反应体系对目的基因进行PCR扩增，设阴性对照(以非转基因芥蓝植物总DNA为模板)和阳性对照(以质粒DNA为模板)。反应程序为：95℃，2分钟；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；35cycles；72℃，5分钟。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

转bar基因阳性的植株PCR扩增出500bp特异性条带。

实施例2：

C染色体转bar基因甘蓝型油菜的人工合成

1.1白菜类植物作母本的甘蓝型油菜人工合成

以黑叶白、蓉优矮抗青、特早50白菜苔、黄金小白菜、红菜薹、潮汕甜白菜和双低白菜型油菜等7个白菜类品种作母本、转bar基因芥蓝作父本进行种间杂交。授粉后4-7天，取受精子房消毒，进行子房培养，培养基为含500mg/L水解酪蛋白的MS培养基。子房培养40天后，从成熟的荚果中剥出种子，转入MS培养基中萌发。当种子萌发出幼苗时，切下幼苗移植于含0.01％秋水仙碱的MS培养基上处理7-10天，进行染色体加倍。然后，将小苗转入MS加0.2％NAA的培养基中生根，待根系发达时，移栽花盆中遮荫保湿培养，开花结果，收获种子。

1.2甘蓝类植物作母本的甘蓝型油菜人工合成

以转bar基因芥蓝作母本，黑叶白、蓉优矮抗青、特早50白菜苔、黄金小白菜、红菜薹、潮汕甜白菜和双低白菜型油菜等7个白菜类品种作父本进行种间杂交。授粉后20天，取子房消毒，剥出杂种胚，进行胚拯救培养，培养基为含6-BA(0.5mg/L)的MS培养基。当胚上长出幼芽时，切下幼芽移于含0.01％秋水仙碱的MS培养基上，进行7-10天的染色体加倍。然后，将小苗转入MS加0.2％NAA的培养基中生根，待根系发达时，移栽花盆中遮荫保湿培养，开花结果，收获种子。

1.3人工合成的转基因甘蓝型油菜的PCR检测、除草剂抗性检测及细胞学检测

人工合成的转基因甘蓝型油菜的PCR分子检测方法参照转基因芥蓝的方法进行。

除草剂抗性检测；油菜苗4-5叶期，用13.5％的Basta^1∶200倍稀释液喷洒植株叶片，5天后开始调查植株是否死亡，设非转基因对照。PCR检测是阳性的植株抗除草剂，植株不死亡，阴性的植株和非转基因对照植株死亡。

细胞学检测：在合成油菜花期，每个杂交组合取3个株系，剥取幼小花蕾中的雌蕊，用0.002mol/L8-羟基喹啉处理4小时，经卡诺液固定24小时后，4℃保存于70％乙醇中，观察时取出材料，在60℃下，用1mol/L盐酸水解10分钟，移至玻片上，加一滴改良的卡宝品红染液，压片镜检。花粉育性正常的植株，观察到细胞的染色体是38条，植株能正常结实；花粉育性不正常的植株，观察到细胞的染色体是19条，植株不能正常结实。

实施例3：

bar基因位于甘蓝型油菜C染色体上的分子验证

基因组Southern blotting分析：取转bar基因芥蓝、C染色体转bar基因甘蓝型油菜和非转基因油菜基因组总DNA约20μg，分别用内切酶EcoR I将其完全消化后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，以质粒pCAMBIA3300的DNA作为阳性对照。预杂交、杂交和洗膜的程序按Sharpe等(1995)报道的方法进行。所用探针为质粒PCR扩增bar基因的0.5kb片段，检测使用地高辛标记试剂盒进行(Roche Diagnostics，Swiss)。

随机抽取三个PCR及Basta^检测为阳性人工合成油菜株系(同一转基因芥蓝父本)及其父本芥蓝进行基因组Southern blot分析结果显示外源bar基因已经整合到了人工合成甘蓝型油菜的基因组中，父本芥蓝与三个人工合成甘蓝型油菜株系的Southern blot随机酶切的杂交带型一致，表明人工合成转基因油菜中的bar基因位点与转bar基因芥蓝中的bar基因位点一致，即在人工合成的转bar基因甘蓝型油菜中，外源bar基因位于C染色体上。

实施例4：

bar基因位于甘蓝型油菜C染色体上的细胞遗传学验证

以转基因油菜作父本或母本与白菜杂交，甘白杂种与白菜回交，获得回交一代种子。苗期对回交—代植株进行抗除草剂涂叶鉴定，不抗除草剂植株出现症状时将涂药叶片摘除，并对所有植株进行PCR分子检测(方法同上)。根据抗除草剂表型和分子检测结果给每株挂抗、感牌。花期取每株幼小花蕾用2mM 8-羟基喹啉处理4小时，转到卡诺固定液中固定，24小时后转到70％乙醇中保存备用。

观察时，将花药挑出在60℃下、1M盐酸中解离5分钟，然后在改良卡宝品红中进行染色、压片，在显微镜下观察、照相。

所有20条染色体(AA)的植株都是不抗除草剂，并且PCR检测为阴性；染色体数大于20的植株出现抗、感除草剂分离；染色体数为29的植株抗除草剂，PCR分子检测阳性。

Claims (1)

1、一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法，该方法包括下列步骤：

A、甘蓝农杆菌介导的遗传转化：首先是农杆菌菌液制备，将含有bar基因表达载体pCAMBIA3300质粒的农杆菌菌株LBA4404划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养基上，在28℃培养箱中倒置培养2-3天，待菌落长出后，从YEB平板上挑取一个单菌落，接种于5ml YEB液体培养基中，置摇床上，培养过夜，取菌液划线接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板上，在28℃培养箱中倒置培养2天，见菌落长出后，将培养皿至于4℃冰箱备用，在甘蓝转基因实验时，取一个单菌落接种于附加50mg/L卡那霉素的YEB平板培养基上，28℃培养1-2天，用1/2浓度的MS液体培养基洗下菌体，并将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.08；其次是外植体制备，将甘蓝种子消毒，植入1/2浓度MS培养基上生长4-5天，25℃、光16小时/暗8小时，切下叶柄长1-2mm的子叶和长0.5-0.7cm的下胚轴分别作为具柄子叶和下胚轴外植体；第三是遗传转化，将外植体置于农杆菌菌液中，22℃侵染5-10分钟，其间摇动，在无菌吸水纸上吸干菌液，转至培养基MS+1mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤上，22℃暗培养2-3天，然后转到培养基MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO₃+500mg/L羧苄青霉素上延迟培养5-7天，再转到筛选培养基MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO₃+500mg/L Cb+10mg/L草胺膦上培养3-4周，每2周转接一次，待再生绿苗长至1-2cm时，切下绿苗，植入生根培养基上，待形成植株时，经炼茁移栽花盆中遮荫保湿培养；第四是除草剂抗性检测，T₀代转基因植株5-6片真叶期用13.5％的Basta^1∶200倍稀释液喷施，转基因阳性植株对该除草剂没有反应，表现除草剂抗性，转基因阴性植株在喷药5天后死亡；第五是PCR分子检测，为避免T₀代转基因植株的假阳性和农杆菌LBA4404污染，选取用草胺膦筛选呈阳性的T₀代株系植株进行剥蕾自交，获得T₁代种子，将T₁代种子种在网室，苗期用13.5％的Basta^1∶200倍稀释液喷施，取抗性转基因甘蓝和非转基因甘蓝植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取植物基因组DNA，然后用20ul反应体系对目的基因进行PCR扩增，设阴性对照以非转基因甘蓝植株总DNA为模板和阳性对照以pCAMBIA3300质粒DNA为模板，反应程序为：95℃，2分钟；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟，35cycles，72℃，5分钟，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，转基因阳性植株与阳性对照均扩增出500bp的条带，检测bar基因所用的正向引物为：5′-GAT CTC GGT GAC GGG CAG GA-3′，反向引物为：5′-GGC GGTCTG CAC CAT CGT CAA-3′；

B、转基因甘蓝型油菜的人工合成，首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，以白菜作母本、转bar基因甘蓝作父本进行种间杂交，取授粉7天后的子房，消毒用70％酒精5～10秒、1％DICA消毒8～10分钟、无菌水洗3～4次后进行培养，培养基为MS培养基+500mg/L水解酪蛋白，待子房培养35～40天后，剥出子房中的种子，将剥出的种子接种在MS培养基上萌发，直到长成苗，然后转接到生根培养基上生根和扩繁植株，待根系形成后，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养；其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，以转bar基因甘蓝作母本、白菜作父本进行种间杂交，取授粉17～20天的子房，消毒后，剥出杂种胚，进行胚拯救培养，培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-BA，当胚上长出芽时，切下芽移植到含0.01％秋水仙碱的MS培养基上，进行7-10天的培养，然后，将苗转入生根培养基中生根，待根系发达时，移栽花盆中遮荫保湿培养，开花结果，收获种子；第三是染色体加倍，对人工合成的单倍体油菜采取如下方法进行染色体加倍处理：a、切下幼苗移植于含0.01％秋水仙碱的MS培养基上处理7～10天，取出苗，切去粘有0.01％秋水仙碱的MS培养基的茎基部，转到生根培养基上生根和扩繁，每株系至少扩繁3株，待根系形成后，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养；b、秋水仙碱溶液浸根处理，将现蕾的植株从土壤中挖出来，洗净根部泥土，将根浸泡在800mg/L的秋水仙碱水溶液中，4小时之后，用自来水冲洗根部2分钟，移栽到田间，移栽成活后，剪掉已现蕾的主花序和分枝，使其产生新枝；c、油菜植株现蕾时，将蘸有0.3％秋水仙碱的棉球置于植株的叶腋处，每天处理2次，连续处理3天；

C、转基因油菜的鉴定：

a、植株染色体数目观察，首先是种子萌发植株根尖观察法，将种子在10-15℃冷水浸泡2-4小时，置湿润滤纸上于25℃下萌发，待根长至1～1.5cm时，取根尖在22℃下、0.002mol/L8-羟基喹啉中处理3小时，用卡诺液固定24小时，然后置于70％乙醇中4℃下保存；其次是幼小雌蕊观察法：剥取幼小花蕾中的雌蕊，用0.002mol/L 8-羟基喹啉处理5小时，用卡诺液固定24小时，然后置于70％乙醇中4℃下保存；第三是幼小花蕾观察法：将幼小花蕾用0.002mol/L 8-羟基喹啉处理4小时后，转到卡诺液中固定，24小时后转到70％乙醇中4℃下保存；

b、转基因油菜的除草剂抗性检测，人工合成油菜植株5-6叶期，喷施13.5％的Basta^1∶200倍稀释液，5天后调查叶片药害表现，设非转基因油菜喷施对照，转基因油菜没有反应，非转基因油菜枯死；

c、转基因油菜基因组Southern blotting分子检测，采用CTAB法提取植物基因组DNA，取人工合成的C染色体组转基因甘蓝行油菜、转基因甘蓝、非转基因油菜、非转基因甘蓝材料基因组总DNA和转基因pCAMBIA3300质粒DNA各20μg，分别用内切酶EcoR I将其消化后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，进行预杂交、杂交和洗膜的程序，所用探针为pCAMBIA3300质粒PCR扩增bar基因的0.5kb片段，检测使用地高辛标记试剂盒进行，质粒、转基因油菜、转基因甘蓝有特异带出现，转基因油菜与转基因甘蓝带型一致，非转基因油菜和甘蓝没有特异带出现；

d、外源基因位于甘蓝型油菜C染色体上的细胞遗传学验证，以转基因油菜作父本或母本与白菜杂交，甘白杂种与白菜回交，获得回交一代种子，苗期对回交一代植株进行抗除草剂涂叶鉴定，不抗除草剂植株叶片出现枯死症状时，将该叶片摘除，并对植株进行PCR分子检测，根据抗除草剂表型和分子检测结果给每株挂抗、感牌，花期取每株幼小花蕾用0.002mol/L 8-羟基喹啉处理4小时，转到卡诺固定液中固定，24小时后转到70％乙醇中保存备用，将幼小花蕾中的花药挑出，在60℃下、1M盐酸中解离5分钟，然后在改良卡宝品红中进行染色、压片，在显微镜下观察、照相，观察到20条染色体的植株都是不抗除草剂，并且PCR检测为阴性；染色体在21-28条之间的植株出现抗、感除草剂分离；染色体数为29的植株抗除草剂，PCR分子检测阳性。

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