CN101942458A - 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝aha10基因家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族及其应用，其中白菜AHA10基因家族包括BrAHA10-1基因(SEQ ID No.1～2)和BrAHA10-2基因(SEQ ID No.3～4)，甘蓝AHA10基因家族包括BoAHA10-1基因(SEQ ID No.5～6)和BoAHA10-2基因(SEQ IDNo.7～8)，甘蓝型油菜AHA10基因家族包括BnAHA10-1基因(SEQ ID No.9～10)和BnAHA10-2基因(SEQ ID No.11～12)；上述基因家族可应用于芸薹属作物种子性状的分子育种。

Description

甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)AHA10(autoinhibited H⁺-ATPase 10，自抑制H⁺-ATP酶10)基因家族及其应用。

背景技术

十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。

籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。

芸薹属和拟南芥(Arabidopsis thaliana)同属十字花科，具有较近的亲缘关系。原花青素(proanthocyanidin，PA)是形成甘蓝型油菜黑籽颜色的基础，在黄籽种皮中明显降低。拟南芥AHA10(AtAHA10)基因参与了种皮中原花青素的聚合，也影响着早期种皮细胞中液泡的发育。在拟南芥aha10突变体中，虽然花青素(anthocyanidin)能在种皮中正常的积累，但原花青素的积累量只有非突变体的百分之一，这表明质膜H⁺-ATPase参与了原花青素在种皮细胞中的代谢，特别是在原花青素的聚合过程中起着重要的调控作用。AtAHA10基因的突变同样使得突变体种子的种皮呈现出透明种皮的特性。在正常的拟南芥种子发育早期，种皮内层细胞中能观察到较大的液泡，而在拟南芥aha10突变体中只能看到一些较小的液泡，但随着种皮的逐渐成熟，这些差别会随之消失，表明该基因的突变导致了液泡发育的延迟。因此，在芸薹属中对AHA10基因进行同源克隆和功能鉴定，将有助于揭示甘蓝型油菜种皮色素和早期种皮细胞中液泡发育的分子机理，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。

芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700～1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种：白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp)和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因组的6倍，也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，除AtAHA10基因外，尚无其它植物的AHA10基因被克隆，对AHA10基因的研究报道较少，而AHA10基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性及与黄籽性状的关系、转基因分子育种等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族。

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统分析。结果显示：

所述白菜AHA10(BrAHA10)基因家族包括以下2个成员：BrAHA10-1基因和BrAHA10-2基因；所述BrAHA10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrAHA10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示；

所述甘蓝AHA10(BoAHA10)基因家族包括以下2个成员：BoAHA10-1基因和BoAHA10-2基因；所述BoAHA10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示，BoAHA10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示；

所述甘蓝型油菜AHA10(BnAHA10)基因家族包括以下2个成员：BnAHA10-1基因和BnAHA10-2基因；所述BnAHA10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示，BnAHA10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示。

进一步，所述BrAHA10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，BrAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示；所述BoAHA10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示，BoAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示；所述BnAHA10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.9所示，BnAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.11所示。

上述3个物种的6条AHA10基因与AtAHA10基因具有较高的同源性，基因组序列一致性为72.4～74.1％，编码区序列一致性为89.6～90.6％；6条AHA10基因之间也具有很高的同源性，基因组序列一致性为85.0～99.8％，编码区序列一致性为95.7～99.9％。核酸水平和氨基酸水平的序列比对、系统发生聚类等表明，6条AHA10基因都是AtAHA10基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征；其中BnAHA10-1基因起源于BoAHA10-1基因，BnAHA10-2基因起源于BrAHA10-2基因。半定量RT-PCR检测表明，BnAHA10、BrAHA10、BoAHA10基因家族具有类似AtAHA10基因的转录特征，都是在早期发育中的种子中表达丰度最高；此外，AHA10基因在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽与黄籽材料的生殖器官中的表达存在着较明显的差异，AHA10基因表达显著下调是芸薹属黄籽性状的重要成因。

基于上述结果，利用本发明的BnAHA10、BrAHA10、BoAHA10基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建AHA10基因重组表达载体和转化体，用于AHA10基因的正义表达、反义抑制、RNA干扰等。

本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。

进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。

为达到上述目的，本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族特异保守片段BAHA10I(核苷酸序列如SEQ ID No.10中第2768～3028位碱基所示)为RNA干扰片段，以基于pFGC5941改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架，将BAHA10I片段分别以反义和正义方式同时插入pFGC5941M的CaMV35S启动子和OCS终止子之间形成反向重复序列，构建了芸薹属AHA10基因家族RNA干扰载体pFGC5941M-BAHA10I，并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转化了甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号，所得阳性转基因植株和种子的性状调查发现，通过RNA干扰沉默BnAHA10基因家族后，转基因种子多数呈黄棕色和紫黄色，少数呈金黄色，与非转基因种子的典型黑籽形成鲜明对比。转基因后代植株的主体形态特征与非转基因的对照植株无明显差异，但是转基因种子普遍偏小，饱满度偏低。说明在甘蓝型油菜等植物中，AHA10基因除了参与调控种皮色素合成以外，还参与调控了一些其它种子性状如种子大小，可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种，尤其是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种，利于创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料，也可以超量表达后用于增加种子的大小，提高种子千粒重。

本发明的有益效果在于：本发明提供了AHA10基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了AHA10基因表达显著下调是芸薹属黄籽性状的重要成因，由此本发明提供了AHA10基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族5’cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。

图2为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族3’cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。

图3为BrAHA10基因家族全长cDNA和基因组DNA的扩增结果，其中A为BrAHA10-1mRNA，B为BrAHA10-1(1)和BrAHA10-2(2)gDNA。

图4为BoAHA10基因家族全长cDNA和基因组DNA的扩增结果，其中A为BoAHA10-1mRNA，B为BoAHA10-2mRNA，C为BoAHA10-1(1)和BoAHA10-2(2)gDNA。

图5为BnAHA10基因家族全长cDNA和基因组DNA的扩增结果，其中A为BnAHA10-1mRNA，B为BnAHA10-2mRNA，C为BnAHA10-1(1)和BnAHA10-2(2)gDNA。

图6为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族及AtAHA10基因mRNA的序列比对。

图7为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族与拟南芥AHA基因家族mRNA的聚类分析。

图8为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白及AtAHA10蛋白的氨基酸序列比对。

图9为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白与拟南芥AHA家族蛋白的聚类分析。

图10为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白的三级结构预测。

图11为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族成员的Southern杂交鉴定，其中M为地高辛标记的分子量标准。

图12为BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族总体和成员组织器官特异性表达检测。

图13为白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽、黄籽材料主要生殖器官中AHA10基因家族总体和各成员的表达。

图14为RNA干扰载体pFGC5941M-BAHA10I的元件图。

图15为RNA干扰片段BAHA10I的PCR扩增。

图16为涉及反义片段插入的酶切和中间载体单克隆的PCR检测，其中，1为pMD19-T-BAHA10I的NcoI+AatII双酶切；2为pFGC5941M的NcoI+AatII双酶切，3、4为pFGC5941M-BAHA10IA单克隆用引物组合F35S3N+FBnAHA10I、RBnAHA10I+RBnPAP2I2检测，M为Marker(1、3、4为DL2000plus，2为λ-HindIII与DL2000plus的混合物)，CK为未酶切的质粒。

图17为涉及正义片段插入的酶切和RNA干扰载体单克隆的PCR检测，其中，1为pMD19-T-BAHA10I的BamHI+XbaI双酶切；2为pFGC5941M-BAHA10IA的BamHI+XbaI双酶切，3、4、5、6为pFGC5941M-BAHA10IA单克隆用引物组合FBnPAP2I2+RBAHA10I、ROCST5N+FBAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2、FBnPAP2I2+ROCST5N检测，M为Marker，CK为未酶切的质粒。

图18为再生植株的Basta复检鉴定，其中A为阴性植株对照，B为阳性植株。

图19为RNA干扰载体pFGC5941M-BAHA10I转基因油菜的PCR扩增结果，其中1为阳性菌液对照，2为阴性植株对照，3～10为转基因植株。

图20为非转基因植株(A)和转基因植株(B)的种皮颜色比较。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例采用的植物材料：白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.oleifera)，包括黑籽系09L597和黄籽系09L600；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种(B.oleracea var.acephala)，包括黑籽系09L598和黄籽系09L599；甘蓝型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黄籽系09L587)，均由重庆市油菜工程技术研究中心选育，大田常规种植，并经过了10代以上的单花序套袋自交；甘蓝型油菜黑籽品种中双10号由中国农业科学院油料作物研究所选育，种子由重庆市油菜工程技术研究中心提供。

优选实施例采用的主要试剂及试剂盒：Easy-Taq DNA聚合酶(5U/μl)购自北京全式金生物技术有限公司，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl)、λ-HindIII DNA marker、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自宝生物工程(大连)有限公司，DraI(40U/μl)、EcoRI、EcoRV、HindIII、XbaI(10U/μl)、尼龙膜、地高辛标记的DNA marker、pMD19-T载体连接试剂盒、PCR DIG Probe Synthesis Kit、DIG Easy Hyb、DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit购自德国Roche公司，MS (Murashige and Skoog medium)培养基购自荷兰Duchefa公司，结冷胶购自浙江中肯生物科技有限公司，小量植物组织RNA抽提试剂盒(W7021)购自上海华舜生物工程有限公司，小量胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自杭州博日生物工程有限公司，pGEM-T easy载体连接试剂盒购自美国Promega公司，GeneRacer Kit购自美国Invitrogen公司。改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M是在pFGC5941的基础上改进而成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子(BnPAP2I2)替换了pFGC5941上过长的PhChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加了一个AatII切点。

一、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族的克隆

1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA的提取

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化彻底，纯度较高，可以用于PCR扩增和Southern杂交。

2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝各器官总RNA的提取

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾(Bu)、花(Fl)以及4个发育阶段的种子[甘蓝型油菜和甘蓝取开花后15天(15D)、30天(30D)、45天(45D)和55天(55D)的种子；白菜取开花后10天(10D)、25天(25D)、40天(40D)和45天(45D)的种子]；以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜09L587和09L588、白菜09L597和09L600、甘蓝09L598和09L599的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St)、叶(Le)、蕾、花、荚果皮(SP)以及4个发育阶段的种子(甘蓝型油菜和甘蓝取15D、30D、45D和55D的种子；白菜取10D、25D、40D和45D的种子)共12个器官；采用小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0％琼脂糖凝胶电泳显示，获得的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。

3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝RACE第一链cDNA的获得

分别取甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾、花和4个发育阶段的种子的总RNA混合成总量为5μg的RNA样品，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的RACE操作，最终反转录获得在3’端和5’端同时锚定有人工接头序列的第一链cDNA，PCR放大后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，反转录比较完全，三个物种均得到了较高质量的总cDNA，可用于克隆甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族完整的cDNA末端。

4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族5’cDNA末端的克隆

根据AtAHA10序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的反向引物RAHA105-1(5-ccagttacatctgtactgtccac-3’)和RAHA105-2(5’-cccttcttcttggtcacaggtag-3’)。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引物5’P(5’-cgactggagcacgaggacac-tga-3’)与RAHA105-1配对，进行5’cDNA末端的RACE一扩。50μl标准Taq PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5.0μl，25mmol/L的MgCl₂3.0μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，10μmol/L的正向引物1.0μl，10μmol/L的反向引物1.0μl，5U/μl的Taq酶0.5μl，模板0.5μl，加无菌水至总体积为50μl。PCR扩增循环参数为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

以一扩产物为模板，用GeneRacer Kit提供的引物5’NP(5’-ggacactgacatggactgaagg-agta-3’)与RAHA105-2配对，进行5’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和扩增循环参数与一扩相同，但模板改为0.1μl，退火温度改为56℃。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与pGEM-T easy载体连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR鉴定，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，各挑选10个具有代表性的阳性克隆子委托上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。测序结果表明：BrAHA10基因的5’cDNA末端介于691～906bp之间，BoAHA10基因的5’cDNA末端介于723～856bp之间，BnAHA10基因的5’cDNA末端介于730～800bp之间。NCBI BLASTn表明，这些5’cDNA末端与AtAHA10基因(NM 101587.2)具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属AHA10基因家族的5’cDNA末端。

5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族3’cDNA末端的克隆

根据AtAHA10序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的正向引物FAHA103-1(5’-gtaacacgtagtcgaagctggtc-3’)和FAHA103-2(5’-aacgtcccgggactctcctgat-3’)。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’P(5’-gctgtcaacgatacgctacgt-aacg-3’)与FAHA103-1配对，进行3’cDNA末端的RACE一扩。PCR扩增体系和扩增循环参数与5’cDNA末端的RACE一扩相同。

以一扩产物为模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’NP(5’-cgctacgtaacggcatgacagtg-3’)与FAHA103-2配对，进行3’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和扩增循环参数与5’cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物如前法所述进行电泳检测(图2)、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。测序结果表明：BrAHA10基因的3’cDNA末端介于661～697bp之间，BoAHA10基因的3’cDNA末端介于625～686bp之间，BnAHA10基因的3’cDNA末端介于650～704bp之间[均不包括poly(A)]。NCBI BLASTn表明，这些3’cDNA末端与AtAHA10基因具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属AHA10基因家族的3’cDNA末端。

6、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族成员全长cDNA及基因组DNA的克隆

根据所获得的甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族5’cDNA和3’cDNA末端序列，设计了7条正向引物和6条反向引物(表1)，将其两两组合共得到42对引物组合；分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，采用上述引物组合和50μl标准Taq PCR扩增体系，扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族各成员的全长cDNA，PCR扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸4分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝基因组总DNA为模板，采用上述引物组合和50μl标准Taq PCR扩增体系进行相同PCR，扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族各成员的基因组DNA；再如前法所述进行电泳检测、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。

表1BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族成员全长cDNA及基因组DNA的扩增引物

以白菜第一链cDNA为模板，引物组合为FBNA10-6+RBRA10-10，扩增得到1条长度为3264bp[不包括poly(A)]的全长cDNA，命名为BrAHA10-1mRNA(图3A)。以白菜基因组总DNA为模板，引物组合分别为FBNA10-6+RBRA10-10和FBRA10-1+RBNA10-C02，扩增得到2条长度分别为5323bp和5077bp的基因组DNA，分别命名为BrAHA10-1gDNA和BrAHA10-2gDNA(图3B)。

以甘蓝第一链cDNA为模板，引物组合分别为FBRA10-16+RBOA10-1和FBNA10-6+RBOA10-12，扩增得到2条长度均为3322bp[不包括poly(A)]的全长cDNA，命名为BoAHA10-1mRNA和BoAHA10-2mRNA(图4A、B)。以甘蓝基因组总DNA为模板，利用上述引物组合，扩增得到2条长度均为5143bp的基因组DNA，命名为BoAHA10-1gDNA和BoAHA10-2gDNA(图4C)。

以甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，引物组合分别为FBRA10-16+RBOA10-1和FBNA10-6+RBOA10-12，扩增得到2条长度分别为3266bp和3215bp的全长cDNA，分别命名为BnAHA10-1mRNA和BnAHA10-2mRNA(图5A、B)。以甘蓝型油菜5B基因组总DNA为模板，利用上述引物组合，扩增得到2条长度分别为5413bp和5096bp的基因组DNA，分别命名为BnAHA10-1gDNA和BnAHA10-2gDNA(图5C)。

除了用上述引物组合扩增得到的全长cDNA和基因组DNA外，利用表1中的其它一些引物组合也扩增出了DNA片段，但从序列上看，这些DNA片段均属于上述全长cDNA或基因组DNA的一部分，代表了一些可变性转录起始位点和可变性加尾位点。

二、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族的分析

在Vector NTI Advance 9.0软件上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和http://www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学在线分析软件上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。

1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族的核酸序列分析

BrAHA10-1基因(SEQ ID No.1)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于427～496、617～719、818～890、1031～1117、1251～1316、1503～1576、1779～1868、1990～2057、2177～2266、2392～2467、2571～2677、2824～2914、3078～3171、3413～3697、3729～3822、3906～3987、4148～4217、4393～4467、4650～4745、4890～4998bp处；BrAHA10-1mRNA(SEQID No.2)在201～3035bp处(对应于BrAHA10-1基因的360～5094bp处)有一个2835bp的ORF，在ORF的上游和下游分别有200bp的5’非翻译区(UTR)和229bp的3’UTR，5’UTR区中存在4处可变转录起始位点(G₁、A₂₁、A₈₂、A₁₁₃)和三个小ORF(42～62、82～105、95～130bp)，3’UTR区中存在5处可变poly(A)加尾位点(T₃₂₀₂、C₃₂₁₁、T₃₂₁₈、G₃₂₅₄、T₃₂₆₄)，最末poly(A)加尾位点上游间隔185bp处的AAATAAA为典型poly(A)加尾信号。

BrAHA10-2基因(SEQ ID No.3)由21个内含子和22个外显子组成，21个内含子分别位于47～284、421～506、627～720、820～892、1031～1117、1253～1319、1500～1573、1781～1871、1992～2075、2196～2278、2402～2477、2583～2689、2835～2905、3071～3164、3404～3476、3510～3582、3665～3741、3903～3972、4147～4231、4415～4505、4649～4739bp处；BrAHA10-2mRNA(SEQ ID No.4)在117～2951bp处(对应于BrAHA10-2基因的355～4836bp处)有一个2835bp的ORF，在ORF的上游和下游分别有116bp的5’UTR和241bp的3’UTR，5’UTR和3’UTR区中没有发现可变转录起始位点和可变poly(A)加尾位点，poly(A)加尾位点上游间隔197bp处的AAATAAA为典型poly(A)加尾信号。BrAHA10-2基因第6内含子左边界由GT突变为GC，导致该内含子不能正确剪接，不能有效翻译形成功能蛋白，因此该基因的表达丰度极低，本实验没有扩增出其对应的cDNA。

BoAHA10-1基因(SEQ ID No.5)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于423～511、632～731、831～913、1052～1137、1273～1333、1514～1593、1801～1890、2011～2130、2251～2330、2454～2531、2637～2738、2884～2954、3120～3215、3455～3527、3561～3656、3739～3817、3979～4048、4223～4303、4487～4577、4721～4812bp处；BoAHA10-1mRNA(SEQID No.6)在254～3088bp处(对应于BoAHA10-1基因的357～4909bp处)有一个2835bp的ORF，在ORF的上游和下游分别有253bp的5’UTR和234bp的3’UTR，5’UTR区中存在7处可变转录起始位点(A₁、G₅₄、G₅₇、A₆₀、A₇₆、A₁₀₆、A₁₂₉)和4个小ORF(52～84、136～158、148～183、188～223bp)，3’UTR区中存在4处可变poly(A)加尾位点(C₃₂₁₇、C₃₂₇₆、C₃₃₀₄、G₃₃₂₂)，最末poly(A)加尾位点上游间隔190bp处的AAATAAA为典型poly(A)加尾信号。

BoAHA10-2基因(SEQ ID No.7)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于423～511、632～731、831～913、1052～1137、1273～1333、1514～1593、1801～1890、2011～2130、2251～2330、2454～2531、2637～2738、2884～2954、3120～3215、3455～3527、3561～3654、3737～3815、3977～4046、4221～4301、4485～4575、4719～4812bp处；BoAHA10-2mRNA (SEQID No.8)在254～3088bp处(对应于BoAHA10-2基因的357～4909bp处)有一个2835bp的ORF，在ORF的上游和下游分别有253bp的5’UTR和234bp的3’UTR，5’UTR区中存在2处可变转录起始位点(A₁、G₅₇)和4个小ORF(52～84、134～158、148～183、188～223bp)，3’UTR区中存在6处可变poly(A)加尾位点(T₃₂₄₂、T₃₂₆₇、T₃₂₈₃、C₃₃₀₁、C₃₃₀₅、G₃₃₂₂)，最末poly(A)加尾位点上游间隔190bp处的AAATAAA为典型poly(A)加尾信号。

BnAHA10-1基因(SEQ ID No.9)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于423～511、632～731、831～913、1052～1137、1273～1333、1514～1593、1801～1890、2011～2130、2251～2330、2454～2531、2637～2738、2884～2954、3120～3215、3455～3527、3561～3656、3739～3817、3979～4048、4223～4303、4487～4577、4721～4812bp处；BnAHA10-1mRNA (SEQID No.10)在198～3032bp处(对应于BnAHA10-1基因的357～4909bp处)有一个2835bp的ORF，在ORF的上游和下游分别有197bp的5’UTR和234bp的3’UTR，5’UTR区中存在7处可变转录起始位点(G₁、A₄、A₁₈、A₂₀、A₂₃、A₂₇、A₇₁)和3个小ORF(79～102、92～127、133～167bp)，3’UTR区中存在11处可变poly(A)加尾位点(T₃₁₀₅、C₃₁₁₁、C₃₁₆₁、T₃₁₇₃、T₃₁₈₆、T₃₂₁₁、G₃₂₁₆、C₃₂₂₀、G₃₂₄₄、G₃₂₆₃、G₃₂₆₆)，最末poly(A)加尾位点上游间隔190bp处的AAATAAA为典型poly(A)加尾信号。

BnAHA10-2基因(SEQ ID No.11)由21个内含子和22个外显子组成，21个内含子分别位于47～284、421～506、627～7205、820～892、1031～1117、1253～1318、1499～1579、1787～1877、1998～2065、2186～2268、2392～2469、2572～2674、2820～2902、3068～3165、3405～3481、3515～3605、3688～3751、3913～3982、4157～4242、4426～4512、4656～4734bp处；BnAHA10-2mRNA(SEQ ID No.12)在116～2950bp处(对应于BnAHA10-2基因的350～1991bp处)有一个2834bp的ORF，在ORF的上游和下游分别有116bp的5’UTR和265bp的3’UTR，5’UTR区中有两个可变转录起始位点(A₁、A₆)和1个小ORF(34～54bp)，3’UTR区中没有发现可变poly(A)加尾位点，poly(A)加尾位点上游间隔209bp处的AATAAA为典型poly(A)加尾信号。与同源基因比较，BnAHA10-2基因在第2532bp(mRNA第1489bp)后缺失了一个碱基T，导致在ORF的中部发生移码突变，理论上是一个假基因。

BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族及AtAHA10基因的核苷酸序列比对结果如图6所示，3个物种的6条AHA10基因之间具有较高的同源性，基因组序列的一致性为85.0～99.8％，编码区序列的一致性为95.7～99.9％；它们与AtAHA10基因也具有很高的同源性，基因组序列的一致性为72.4～74.1％，编码区序列的一致性为89.6～90.2％；BnAHA10-1与BoAHA10-1基因组序列的一致性高达99.8％，编码区序列的一致性高达99.9％；BnAHA10-2与BrAHA10-2基因组序列的一致性高达92.1％，编码区序列的一致性高达96.9％。

BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族与拟南芥AHA基因家族mRNA的聚类分析如图7所示，BnAHA10-1mRNA先与BoAHA10-1mRNA聚在一起形成一个小类，再与BoAHA10-2聚在一起形成一个大类；BnAHA10-2mRNA先与BrAHA10-2mRNA聚在一起形成一个小组，再与AtAHA10聚在一起形成一个大类；BrAHA10-1mRNA单独成一类，但与BnAHA10-1、BoAHA10-1和BoAHA10-2mRNA聚成的大类关系较近。聚类分析结果表明，BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族6个基因成员均是拟南芥AtAHA10基因的垂直同源基因；BnAHA10-1基因起源于BoAHA10-1基因，BnAHA10-2基因起源于BrAHA10-2基因。

2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族的编码蛋白序列分析

BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族成员所编码蛋白的基本参数见表2。由于BnAHA10-2基因的编码区中间发生了移码突变，导致其编码蛋白C-端缺失，为了从蛋白水平研究各个基因间的系统进化关系，本实验将C-端缺失的氨基酸部分添加在BnAHA10-2之后以表示BnAHA10-2基因未移码突变前编码蛋白的状况，称为BnAHA10-2ori。

表2BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白的基本参数

BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白与AtAHA10蛋白的氨基酸序列比对结果如图8所示，3个物种的6个AHA10蛋白之间具有很高的同源性，一致性为97.4～99.8％，相似性为98.1～99.9％；它们与AtAHA10也具有很高的同源性，一致性为91.6～92.0％，相似性为95.6～96.0％；BnAHA10-1与BoAHA10-1的相似性和一致性分别高达99.8％和99.9％；BnAHA10-2ori与BrAHA10-2的相似性和一致性分别高达98.0％和99.0％。

BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白与拟南芥AHA家族蛋白的聚类分析如图9所示，3个物种的6个AHA10蛋白的确与拟南芥AHA10具有垂直同源关系，它们组成了十字花科AHA10家族，该家族与拟南芥其它AHA蛋白的距离较远。从系统发生关系上看，BnAHA10-1与BoAHA10-1几乎没有距离，BnAHA10-2ori与BrAHA10-2的距离相对较近，进一步的证明了3个物种AHA10基因的进化关系，即BnAHA10-1基因起源于BoAHA10-1基因，BnAHA10-2基因起源于BrAHA10-2基因，白菜和甘蓝是甘蓝型油菜的亲本物种。

NetNGlyc 1.0预测，BrAHA10-1、BoAHA10-1、BoAHA10-2和BnAHA10-1的第114、652、819和878位天冬酰氨残基上存在着N-糖基化位点；BrAHA10-2和BnAHA10-2ori的第114、652、756、819和878位天冬酰氨残基上存在着N-糖基化位点。

NetPhos 2.0预测，BrAHA10-1有24个丝氨酸、12个苏氨酸、4个酪氨酸共40个潜在的磷酸化位点；BrAHA10-2有23个丝氨酸、11个苏氨酸、4个酪氨酸共38个潜在的磷酸化位点；BoAHA10-1有21个丝氨酸、11个苏氨酸、4个酪氨酸共36个潜在的磷酸化位点；BoAHA10-2有22个丝氨酸、11个苏氨酸、4个酪氨酸共37个潜在的磷酸化位点；BnAHA10-1有20个丝氨酸、12个苏氨酸、4个酪氨酸共36个潜在的磷酸化位点；BnAHA10-2ori有21个丝氨酸、10个苏氨酸、4个酪氨酸共35个潜在的磷酸化位点。

TMpred预测，BrAHA10-1和BrAHA10-2均在66～92、101～120、247～269、285～307、626～648、653～675、679～697、716～740、764～780、794～813、820～838处存在11个跨膜结构域；BoAHA10-1、BoAHA10-2、BnAHA10-1和BnAHA10-2ori均在66～92、101～120、247～269、285～307、626～648、653～675、679～697、717～740、764～780、794～813、820～838处存在11个跨膜结构域。

SignalP 3.0预测，BrAHA10-1、BrAHA10-2、BoAHA10-1、BoAHA10-2、BnAHA10-1和BnAHA10-2ori均没有信号肽。

WOLFPSORT预测，BrAHA10-1、BrAHA10-2、BoAHA10-1、BoAHA10-2、BnAHA10-1和BnAHA10-2ori均定位于细胞膜上，定位于叶绿体、线粒体、细胞核和胞外分泌物的可能性很小。

PredictNLS(http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl)预测，在BrAHA10-1、BrAHA10-2、BoAHA10-1、BoAHA10-2、BnAHA10-1和BnAHA10-2ori中均不存在核定位信号。

利用SOPMA对BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白的二级结构进行预测，结果如表3所示，它们的二级结构非常相似，主要有α-螺旋、随机卷曲、延伸链和β-转角，其中α-螺旋所占比例最大，主要由随机卷曲和少量的β-转角相连；其次为随机卷曲；再次为延伸链，均匀地分布在整个蛋白中；β-转角的比例最小。

表3BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白的二级结构预测

在http://swissmodel.expasy.org/网站采用First Approach mode对BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10家族蛋白的三级结构进行预测，结果如图10所示，除了BnAHA10-2外，其他5个蛋白的三级结构非常相似。

3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族的成员数检测

分别采用限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII和XbaI酶切白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组总DNA，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳、碱变性和中和，用毛细管法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上。设计正向引物FAHA10A(5’-gagctcgaatctcgtattggaccgtaag-3’)和反向引物RBRA10-1(5’-ccttgagaatcattagttgt-gtgg-3’)用于扩增BnAHA10-1mRNA 3’端的678bp片段；PCR扩增采用PCR DIG Probe Synthesis Kit进行，将目标片段标记上地高辛(digoxigenin，DIG)-dUTP后作为杂交探针；PCR扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。采用此探针在39.25℃进行20小时的Southern杂交(DIG Easy Hyb)，中等严谨洗涤后进行免疫检测(DIG Wash andBlock Buffer Set和DIG Nucleic Acid Detection Kit)，并对杂交显色条带拍照。

Southern杂交结果如图11所示，白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组DNA经DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII或XbaI限制性内切酶酶切后，均产生2条杂交条带。因此，白菜、甘蓝、甘蓝型油菜AHA10基因家族成员数均为2个。

4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族的组织器官特异性表达检测

分别取黑籽材料：白菜黑籽系09L597、甘蓝黑籽系09L598、甘蓝型油菜粒色近等基因系黑籽系09L588各12个器官的总RNA，采用半定量RT-PCR检测BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族在不同组织器官中的表达。通过对BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族全长序列的多重比对分析，设计正向引物FBA10GW3和反向引物RBA10GW2(表4)用于检测BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族在12个器官中的总体表达水平，采用50μl标准TaqPCR扩增体系，扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、62℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。分别设计特异性引物(表4)检测BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族各成员在12个器官中的表达水平：FAHA103-1和RBAHA10S3用于检测BrAHA10-1基因，FAHA103-1和RBAHA10S1用于检测BrAHA10-2基因，FAHA103-1和RBAHA10S2用于检测BoAHA10-1基因，FAHA103-1和RBAHA10S1用于检测BoAHA10-2基因，FBAHA10S2和RAHA105-1用于检测BnAHA10-1基因、FBAHA10S1和RAHA105-1用于检测BnAHA10-2基因；采用50μl标准Taq PCR扩增体系，扩增BrAHA10-1、BrAHA10-2基因的循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、61℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；扩增BoAHA10-1、BoAHA10-2、BnAHA10-1、BnAHA10-2基因的循环参数除退火温度改为63℃外，其它参数与BrAHA10-1、BrAHA10-2基因相同。

表4检测BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族的组织器官特异性表达的引物

检测结果如图12所示，BrAHA10基因家族在白菜开花后10天和25天的种子中表达量最高，其次为开花后40天的种子，在蕾和花中有极微量的表达，在其他器官中检测不到；BrAHA10基因家族成员具有相似的组织特异性，但成员之间具有一定差异：BrAHA10-1基因在开花后10天和25天的种子中表达丰度最高，而BrAHA10-2基因仅在开花后10天的种子和蕾中有微弱表达，这与克隆所得的结果相吻合，由于BrAHA10-2基因发生移码突变不能有效翻译形成功能蛋白，因此该基因的表达丰度极低。BoAHA10基因家族只在甘蓝种子中表达，且表达丰度随着种子的成熟而降低，开花后10天的种子表达量最高，在其他器官中检测不到；BoAHA10基因家族成员的表达也呈同样的趋势，但BoAHA10-1基因的表达水平明显高于BoAHA10-2基因。BnAHA10基因家族在甘蓝型油菜开花后10天、30天的种子中表达量最高，其次为开花后45天的种子，在花中有微量表达，在其他器官中检测不到；BnAHA10基因家族成员的表达趋势基本一致，但BnAHA10-2基因的表达丰度明显低于BnAHA10-1基因，其原因在于BnAHA10-2基因发生碱基缺失导致无法有效翻译。

5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族在黑籽、黄籽材料间的表达差异性检测

分别取黄籽材料：白菜黄籽系09L600、甘蓝黄籽系09L599、甘蓝型油菜粒色近等基因系黄籽系09L587主要生殖器官的总RNA，采用半定量RT-PCR检测BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族总体与各成员在不同组织器官中的表达，并与前述黑籽材料的检测结果进行比较。PCR扩增引物和扩增循环参数与黑籽材料相同。

检测结果如图13所示，20个循环的RT-PCR在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽、黄籽材料主要生殖器官中均扩增出了亮度较为一致的内标基因26SrRNA的条带，说明各生殖器官的起始总RNA量、反转录效率、PCR效率等是较为一致的，在此基础上进行的黑籽和黄籽材料主要生殖器官间的AHA10基因表达的比较结果是可信的。由图13可知，AHA10基因在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽、黄籽材料主要生殖器官中的表达存在着较明显的差异：BrAHA10基因家族在白菜黄籽系09L600中的总体表达较黑籽系09L597明显下调，只在开花后10天的种子中有微量表达；BrAHA10-1和BrAHA10-2基因在黄籽材料中都没有检测到明显表达。BoAHA10基因家族在甘蓝黑籽系09L598中是开花后10天的种子表达量最高，随着种子的成熟表达量逐渐减弱，在开花后50天的种子中只有微量表达，而在黄籽系09L599中只在开花后10天和30天的种子中有微弱表达；BoAHA10-1和BoAHA10-2基因在黑籽材料中均表达正常，但在黄籽材料中BoAHA10-1基因无表达，BoAHA10-2基因只在开花后10天的种子中有微量表达；BnAHA10基因家族在甘蓝型油菜粒色近等基因系黑籽系09L588开花后10、30、45天的种子和花中都有不同程度的表达，开花后30天的种子表达量最高，而在黄籽系09L587开花后10天、30天的种子中仅有微量表达；BnAHA10-1和BnAHA10-2基因在黑籽材料中均表达正常，但在黄籽材料中BnAHA10-1基因仅在开花后10天的种子有微量表达，在花中有极微量表达，BnAHA10-2基因只在开花后10天的种子中有极微量表达。上述结果说明AHA10基因表达显著下调是芸薹属黄籽性状的重要成因。

三、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族的应用

1、芸薹属AHA10基因家族RNA干扰载体的构建

将BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族和拟南芥AHA基因家族各成员的mRNA进行多重比对，选择BrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族特异保守区段为RNA干扰的靶标，以BnAHA10-1mRNA的对应区段BAHA10I(SEQ ID No.102768～3028bp)作为RNA干扰载体构建的模板序列，设计正向引物FBAHA10I和反向引物RBAHA10I(表5)。以pMD19-T-BnAHA10-1质粒0.1μl为模板，采用上述引物和标准50μl Taq PCR扩增体系进行PCR扩增，扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(图14)、胶回收目标片段后与pMD19-T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，用含有Amp、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，增菌培养后，取菌液进行PCR检测，挑选2个阳性克隆子委托上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序验证，得重组载体pMD19-T-BAHA10I。

用NcoI和AatII从pMD19-T-BAHA10I中双酶切出反义片段BAHA10IA，再与经同样双酶切后开环的pFGC5941M载体进行连接(即将反义片段插入到pFGC5941M的CaMV35S启动子与间隔区之间)，连接产物转化DH5α感受态细胞，用含有100mg/L的卡那霉素(Kan)的LB平板筛选培养，挑取单菌落，用含有Kan的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行复合PCR检测(引物组合为F35S3N+FBAHA10I和RBAHA10I+RBnPAP2I2，序列见表5，检测结果见图15)，选取全阳性的克隆子提取质粒，得中间载体pFGC5941M-BAHA10IA。

用BamHI和XbaI从pMD19-T-BAHA10I中双酶切出正义片段BAHA10IS，再与经同样双酶切后开环的pFGC5941M-BAHA10IA进行连接(即将正义片段插入到中间载体的间隔区与OCS终止子之间)，连接产物转化DH5α感受态细胞，用含有100mg/L Kan的LB平板筛选培养，挑取单菌落，增菌培养后，取菌液进行复合PCR检测(引物组合为FBnPAP2I2+RBAHA10I、ROCST5N+FAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2、FBnPAP2I2+ROCST5N，序列见表5，检测结果见图16)，选取全阳性的克隆子提取质粒，得RNA干扰载体pFGC5941M-BAHA10I(结构见图17)。

表5AHA10基因家族RNA干扰载体构建和转基因检测所用引物

2、RNA干扰载体转化根癌农杆菌

将pBAHA10I采用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于含有100mg/L Kan、40mg/L利福平(Rif)和20mg/L链霉素(Str)的YEB平板上，28℃倒置培养2天，挑取抗性菌落，接种于含有前述相同抗生素的YEB液体培养基中培养，取菌液进行复合PCR检测，检测结果正确的菌液用甘油于-80℃保存，即得农杆菌工程菌株。

3、农杆菌介导的RNA干扰载体转化黑籽甘蓝型油菜

将冻存的农杆菌工程菌株解冻活化后培养至对数生长期，5000rpm离心10分钟收集菌体，用MSm液体培养基[MS+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS)，pH5.8]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.3，供浸染用。选取饱满的甘蓝型油菜黑籽品种中双10号的种子，用清水浸泡1～2小时，再用95％乙醇浸泡1分钟，无菌水冲洗3次，再用0.1％的升汞溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗干净，再接种于MS固体培养基上，26℃暗培养2天，再在光照强度为2000Lux、每天光照16小时的条件下进行光周期培养，切取苗龄7天的无菌苗的下胚轴作为转基因的外植体；将下胚轴切段，接入预培培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4-D)中预培养3天；预培养后的下胚轴浸入前述备好的农杆菌工程菌液中浸染10分钟，用无菌吸水纸吸去多余菌液，再接入共培培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+50μMAS)中23℃暗培养2天；共培养后的下胚轴浸入MSk液体培养基[MS+1.0mg/L2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef)]中振荡洗涤30分钟，重复一次，用灭菌滤纸吸干表面水分；再接入愈伤诱导培养基[MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L Cef+10ppm草丁膦(Basta)]中光照培养，约2周继代1次，至长出绿色愈伤；再接入分化培养基[MS+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+10ppm Basta]中继续培养，诱导愈伤分化；再接入茎分化培养基(MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+10ppm Basta)中光照培养至长出小茎；再接入茎伸长培养基(MS+0.05mg/L 6-BA+500mg/LCef+10ppm Basta)中光照培养至长出茎和叶片；再接入生根培养基(MS+0.5mg/L吲哚乙酸+500mg/L Cef+10ppm Basta)中光照培养至长出发达根系；生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩-蛭石-草炭土(质量比为1∶1∶1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最后得到21株移栽成活的再生植株。

4、转基因植株的鉴定

(1)转基因植株的Basta复检鉴定

在再生苗的嫩叶片上滴1滴浓度为50ppm的Basta溶液，3天后观察叶片有无变化。结果如图18所示，21株再生苗中有4株的叶肉组织出现变黄、变脆直至死亡，其余17株则没有明显反应，初步确定这17株为抗Basta的再生植株。

(2)转基因植株的PCR鉴定

采用CTAB法提取再生植株的基因组总DNA，再以该总DNA为模板进行PCR扩增，引物组合FPbarT+RPbarT，检测pBAHA10I是否成功整合到黑籽甘蓝型油菜的基因组中，扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。结果如图19所示，泳道3～10均检测出一条与预期1224bp大小一致的条带，与阳性菌液对照大小一致，说明21株再生苗中至少有8株被成功转化了pBAHA10I。

5、转基因植株性状的调查

在转基因植株生长发育的过程中，对转基因植株与非转基因植株的长势、株型、花、蕾、叶、荚果等形态特征进行了比较观察，结果发现，两者并无明显差异，长势基本一致，株型也没有明显变化，花色均为鲜黄色，叶片均为钝尖型，结荚也正常，说明通过RNA干扰使黑籽甘蓝型油菜中的BnAHA10基因家族沉默后，包括基本生长发育在内的背景性状没有明显改变。同时，对转基因植株与非转基因植株的种皮颜色进行了比较。结果如图20所示，转基因种子多数呈黄棕色和紫黄色，少数呈金黄色，这与非转基因种子的典型黑色种皮形成了鲜明对比。将种子扫描成彩色图片，进行软件分析，结果显示转基因种子比非转基因种子的R值(红色色度)升高了36.84％以上。上述研究结果表明，通过RNA干扰使黑籽甘蓝型油菜中的BnAHA10基因家族沉默后，达到了抑制种皮色素积累的效果。研究还发现，虽然转基因在主要背景性状上没有明显变化，但转基因种子略偏小，饱满度略偏低，千粒重由3.15g下降为2.21g，因此在抑制种皮色素积累的同时也要注意可能产生的粒重下降等副效应。

需要说明的是，本发明所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族，除了上述采用RNA干扰技术应用于甘蓝型油菜种子性状的分子育种外，也可以采用反义抑制等其它技术介导内源AHA10基因或基因家族的表达下调以降低种皮色素积累，也可以通过正义转基因进行超量表达以增加原花青素的积累甚至增加种子大小，也可以应用于除甘蓝型油菜以外的其它芸薹属作物种子性状的分子育种。即使是采用RNA干扰技术，除优选实施例中所用的pFGC5941M载体以外，也可以采用其它载体来构建RNA干扰载体；所得RNA干扰载体除了采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。而且，除了优选实施例中公开的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜(来自于白菜型油菜亚种)和甘蓝(来自于羽衣甘蓝变种)AHA10基因家族的6个成员以外，根据优选实施例所提供的研究方法和研究结果，来自于甘蓝型油菜、白菜和甘蓝的其它AHA10等位基因序列，或者来自于这3个物种的其它亚种、生态型或品种的AHA10基因序列，或者与上述6个成员的基因序列在连续80bp以上有至少98％一致性的任意核苷酸序列，都可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种中，实现本发明所述用途或效果。

总之，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，而并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族，其特征在于：

所述白菜(Brassica rapa)AHA10基因家族包括以下2个成员：BrAHA10-1基因和BrAHA10-2基因；所述BrAHA10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrAHA10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示；

所述甘蓝(Brassica oleracea)AHA10基因家族包括以下2个成员：BoAHA10-1基因和BoAHA10-2基因；所述BoAHA10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示，BoAHA10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示；

所述甘蓝型油菜(Brassica napus)AHA10基因家族包括以下2个成员：BnAHA10-1基因和BnAHA10-2基因；所述BnAHA10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示，BnAHA10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示。

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族，其特征在于：所述BrAHA10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，BrAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示；所述BoAHA10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示，BoAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示；所述BnAHA10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.9所示，BnAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.11所示。

3.含有权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族中任一种或多种基因或基因截短片段的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族特异保守片段BAHA10I的RNA干扰载体，所述BAHA10I片段的核苷酸序列如SEQ ID No.10中第2768～3028位碱基所示。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述RNA干扰载体是将BAHA10I片段分别以反义和正义方式同时插入改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的CaMV35S启动子和OCS终止子之间形成反向重复序列而得到。

6.含有权利要求3或4或5所述重组表达载体的转化体。

7.权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。

8.根据权利要求7所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHA10基因家族的应用，其特征在于：所述芸薹属作物种子性状的分子育种为甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种。

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