CN101942457B - 甘蓝型油菜tt8基因家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族及其应用，其中白菜TT8基因家族包括BrTT8-1基因(SEQ ID No.1～2)和BrTT8-2基因(SEQ ID No.3～4)，甘蓝TT8基因家族包括BoTT8-1基因(SEQ ID No.5～6)和BoTT8-2基因(SEQ ID No.7～8)，甘蓝型油菜TT8基因家族包括BnTT8-1基因(SEQ ID No.9～10)和BnTT8-2基因(SEQ ID No.11～12)；上述基因家族可应用于芸薹属作物种子性状的分子育种。

Description

甘蓝型油菜TT8基因家族及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)TT8(TRANSPARENT TESTA8，透明种皮8；又称bHLH42，BASIC HELIX-LOOP-HELIX42，碱性螺旋-环-螺旋42)基因家族及其应用。 

背景技术

十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。 

籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。 

类黄酮是植物的重要次生代谢物质，具有多种生物学功能，其中花青素苷(anthocyanin，AN)、原花青素(proanthocyanidin，PA)和黄酮醇是十字花科等植物器官表面着色的重要成分。芸薹属和拟南芥(Arabidopsis thaliana)同属十字花科，具有较近的亲缘关系。在拟南芥种皮中，原花青素主要积累在内种皮和有颜色的合点区域，是种皮色素的核心成分。拟南芥TT8(AtTT8)基因编码一个bHLH型正调控转录因子(AtbHLH42)，在积累有花青素苷和原花青素的细胞中被诱导表达，TT2、TT8和TTG1形成一个转录因子复合物，调控黄酮合成途径的“晚期”结构基因如DFR、BAN等的表达，从而调控原花青素、花青素苷、种皮粘液的积累。拟南芥tt8突变体的种子显示透明种皮即黄籽性状。因此，在芸薹属中对TT8基因进行同源克隆和功能鉴定，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径，也可用于芸薹属物种中与原花青素、花青素苷、种皮粘液相关性状的分子育种。 

芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700～1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种：白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp)和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因组的6倍， 也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，TT8基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、黄籽等性状的关系以及转基因分子育种等都未见报道。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族。 

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并对其进行了系统分析。结果显示： 

所述白菜TT8(BrTT8)基因家族包括以下2个成员：BrTT8-1基因和BrTT8-2基因；所述BrTT8-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrTT8-2基因的全长cDNA序列如SEQID No.4所示； 

所述甘蓝TT8(BoTT8)基因家族包括以下2个成员：BoTT8-1基因和BoTT8-2基因；所述BoTT8-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示，BoTT8-2基因的全长cDNA序列如SEQID No.8所示； 

所述甘蓝型油菜TT8(BnTT8)基因家族包括以下2个成员：BnTT8-1基因和BnTT8-2基因；所述BnTT8-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示，BnTT8-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示。 

进一步，所述BrTT8-1基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，BrTT8-2基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示；所述BoTT8-1基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示，BoTT8-2基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示；所述BnTT8-1基因的基因组序列如SEQ ID No.9所示，BnTT8-2基因的基因组序列如SEQ ID No.11所示。 

上述3个物种的6条TT8基因之间具有很高的同源性，基因组序列的一致性为69.7～99.9％，mRNA一致性为85.8％～99.8％，编码区的一致性为93.2％～99.9％，其中BnTT8-1基因与BoTT8-1基因的一致性高达99.9％，BnTT8-2基因与BrTT8-1基因的一致性高达99.1％。它们与AtTT8基因也具有很高的同源性，基因组序列的一致性为44.2～52.4％，mRNA的一致性为78.0％～82.1％，编码区的一致性为80.1％～83.6％。6个TT8基因编码的蛋白之间具有很高的同源性，一致性为89.6％～100％，相似性为90.6％～100％，其中BnTT8-1蛋白与BoTT8-1蛋白的相似性和一致性均为99.6％，BnTT8-2蛋白与BrTT8-1蛋白的相似性和一致性均为100％。它们与AtTT8蛋白也具有很高的同源性，一致性为71.5％～77.2％，相似性为77.4％～84.1％。系统进化分析表明，AtTT8先与BrTT8-2聚在一起，BnTT8-2先与BrTT8-1聚在一起，然后这两个小类聚在一起；BnTT8-1与BoTT8-1聚在一起，BoTT8-2虽然单独，但与BnTT8-1与BoTT8-1也很近。从基因结构、蛋白结构、核酸序列同源性、氨基酸序列同源性、系统进化等方面均表明，BnTT8-1基因起源于BoTT8-1基因，BnTT8-2基因起源于BrTT8-1基因，且这6个TT8基因都是AtTT8基因的垂直同源基因。TT8基因家族主要在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的生殖器官中表达，以发育中的种子表达最高，并随着种子的发育进程而逐渐下降。此外，TT8基因家族在白菜和甘蓝型油菜的黑、黄籽材料间的总体表达存在着较明显的差异，且不同的基因成员表现出不同的黑、黄籽差异表达模式，而TT8基因家族总体及其成员在甘 蓝黑、黄籽材料中的表达无明显差异，说明TT8基因家族表达下调与白菜和甘蓝型油菜的黄籽性状有关，而TT8基因家族不是甘蓝黄籽性状的重要原因。 

基于上述结果，利用本发明的BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建TT8基因重组表达载体和转化体，用于TT8基因的正义表达、反义抑制、RNA干扰等。 

本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。 

进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。 

为达到上述目的，本发明将BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成员的全长cDNA序列分别插入pCAMBIA2301G载体中(插入片段由CaMV35S启动子驱动，由Nos终止子终止转录)，构建了正义植物表达载体pBrTT8-1、pBrTT8-2、pBoTT8-2和pBnTT8-1，用Flower Dip法将它们转化拟南芥tt8突变体(种子为透明种皮)，通过卡那霉素(Kan)抗性筛选得到了BnTT8-1转基因植株，该转基因植株T₂代种子的种皮颜色恢复了野生型的深褐色，证明甘蓝型油菜等芸薹属的TT8基因具有与AtTT8基因对应的功能。因此，本发明的TT8基因家族在种子性状的分子育种中具有应用价值。当然，将甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族中任一种基因的基因组序列或全长cDNA序列正义插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子与Nos终止子之间，都可以构建正义植物表达载体。 

同时，本发明还选取BnTT8-1基因的部分编码序列(如SEQ ID No.10中第837～1653位碱基所示)，将其反义片段插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子和Nos终止子之间，构建了反义植物表达载体pBnTT8A，并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转入甘蓝型油菜典型黑籽品种湘油15号，得到了抑制内源BnTT8基因表达的转基因株系。研究发现，GUS染色检测呈阳性的反义转基因植株收获种子的颜色与对照相比有明显变浅，虽然没有达到标准的金黄色性状，但已比较接近黄籽。反义BnTT8转基因后代植株的主体形态特征与非转基因的对照植株无明显差异，但是转基因种子普遍饱满度下降，粒形偏离球形，千粒重由对照的3.15g下降到2.54g。说明BnTT8基因除了参与调控种皮色素合成以外，还参与调控了一些其它种子性状如种子大小，可用于芸薹属作物种皮颜色、种子大小等种子性状的分子育种。当然，将甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族中任一种基因的全部或部分编码序列反义插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子与Nos终止子之间，都可以构建反义植物表达载体。 

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT8基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了TT8基因家族表达下调与白菜和甘蓝型油菜的黄籽性状有关，由此本发明提供了TT8基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中： 

图1为BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族5’cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。 

图2为BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族3’cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。 

图3为BrTT8、BoTT8和BnTT8基因家族成员全长cDNA的扩增，其中A和B分别为FBnTT816+RBrTT819、FBnTT816+RBrTT821扩增BrTT8基因家族全长cDNA；C和D分别为FBoTT8+RBoTT8-1、FBoTT8+RBoTT8-2扩增BoTT8基因家族全长cDNA；E和F分别为FBoTT8+RBoTT8-1、FBrTT8+RBrTT8-1扩增BnTT8基因家族全长cDNA。 

图4为BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员及AtTT8基因mRNA的核苷酸序列比对。 

图5为BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员及AtTT8基因的聚类分析。 

图6为BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族成员的Southern杂交鉴定。 

图7为BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族蛋白及AtTT8蛋白的氨基酸序列比对。 

图8为BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族编码蛋白与其它植物TT8蛋白的聚类分析。 

图9为RT-PCR检测BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族总体和各成员在不同组织器官中的表达。 

图10为RT-PCR检测BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族总体和各成员在黑、黄籽近等基因系生殖器官中的表达。 

图11为pCAMBIA2301G正义植物表达载体中T-DNA区域中的表达元件。 

图12为pBnTT8-1载体转化拟南芥tt8突变体T₁代转化子的筛选，其中A为T₁代植株的Kan抗性筛选，B为Kan抗性的T₁代植株苗期，C为Kan抗性的T₁代植株初花期。 

图13为Kan抗性的拟南芥T₁代植株的GUS染色鉴定。 

图14为拟南芥野生型种子(A)、BnTT8-1转化拟南芥tt8突变体后的T₂代种子(B)、拟南芥tt8突变体种子(C)。 

图15为反义植物表达载体pBnTT8A构建过程中的电泳检测，其中A为从pMD18-T上酶切BnTT8A，B为从pCAMBIA2301G上切下1.9kb的GUS基因，C为pBnTT8A的检测。 

图16为反义植物表达载体pBnTT8A的T-DNA区段图。 

图17为pBnTT8A转化湘油15后的部分再生抗Kan植株。 

图18为pBnTT8A转化湘油15后(右)与对照(左)的叶片GUS染色。 

图19为pBnTT8A转化湘油15后各T₃株系的种子(CK为非转基因对照)。 

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

优选实施例采用的植物材料：白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.oleifera)，包括典型黑籽系06K130和黄籽系06K124；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种(B.oleracea var.acephala)，包括典型黑籽系06K158和黄籽系06K165；甘蓝型油菜材料包括典型黑籽系5B、黑籽品种湘油15号、籽色近等基因系黑籽系L1和黄籽系L2，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，大田常规种植。 

优选实施例采用的主要试剂及试剂盒：Taq DNA聚合酶(5U/μl)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；DNA分子量标准λ-HindIII digest DNA Marker和DL-2000plus Marker、LA TaqDNA聚合酶(5U/μl)、pMD18-T载体试剂盒、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶EcoRI、EcoRV等购自美国New England Biolabs公司；限制性内切酶SacI等、T₄DNA连接酶(10U/μl)购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS基本培养基(Murashige& Skoog medium，including vitamins)购自荷兰Duchefa Biochemie公司；柱式小量植物组织RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit购自美国Invitrogen公司，Southern杂交与检测的试剂(盒)、尼龙膜购自德国Roche公司。 

优选实施例采用的主要仪器：PTC-200Programmable Thermal Controller PCR仪购自美国MJ Research公司，UVP HL-2000杂交紫外交链仪购自美国UVP公司，其它均为分子生物与学基因工程常用仪器。 

一、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的克隆 

1、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组总DNA的提取 

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化比较完全，经分光光度法检测纯度较高，可以直接用于PCR扩增及Southern杂交。 

2、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜各器官总RNA的提取 

取大田常规条件下栽培的白菜06K130、甘蓝06K158、甘蓝型油菜5B的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、开花后10天的种子(10D)、开花后20天的种子(20D)、开花后30天的种子(30D)和荚果皮(SP)共11个器官；以及大田常规条件下栽培的白菜06K124、甘蓝06K165，甘蓝型油菜L1和L2的蕾、花以及发育不同阶段的种子(甘蓝型油菜取10D、20D和30D的种子；白菜和甘蓝取10D和30D的种子)等主要生殖器官；采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。 

3、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜RACE第一链cDNA的获得 

分别取白菜06K130、甘蓝06K158、甘蓝型油菜5B的蕾、花、10D、20D、30D种子的总RNA混合，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的RACE操作，分别获得白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA(3’端和5’端同时锚定有人工接头序列)，PCR放大后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，3个物种的总cDNA呈现出大小在200bp～10kb的拖带，重心区域在500bp～4kb之间，最核心区在1.5kb左右，说明反转录完全，得到了高质量的RACE总cDNA，可用于克隆白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族完整的cDNA末端。 

4、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族5’cDNA末端的克隆 

采用Vector NTI Suite 9.0对来自拟南芥(NM_117050.2，AJ277509)、牵牛花(Ipomoea tricolor)(AB154370)、百合(Lilium)(AB222076)、紫花牵牛(Ipomoea purpurea)(AB154369)、矮牵牛(Ipomoeanil)(AB232775)的TT8或编码bHLH转录因子的核酸序列进行多重比对，针对5’和3’末端的最保守区域设计了2个正向引物(FTT8-3和FTT8-3N)和2个反向引物(RTT8-5和RTT8-5N)(表1)作为扩增白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族成员cDNA末端的特异引物。 

分别以白菜、甘蓝和甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用引物组合5’P+RTT8-5进行5’cDNA末端的RACE一扩。50μl标准Taq PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μl，25mmol/L的MgCl₂3μl，10mmol/L的dNTPs 1μl，10μmol/L的正向引物1μl，10μmol/L的反向引物1μl， 5U/μl的Taq酶0.5μl，模板2μl，加双蒸水至总体积为50μl。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。再以一扩产物为模板，用引物组合5’NP+RTT8-5N进行5’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系与一扩相同但模板改为0.1μl，PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共28个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，BrTT8获得了一条600bp左右的宽带，BoTT8获得了一条550bp的条带，BnTT8获得了一条350-550左右的很亮的宽带(图1)。采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与pMD18-T载体连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR鉴定，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，每个物种挑选多个代表性单克隆子委托上海英竣生物工程技术有限公司进行测序。 

表15’和3’RACE中的基因特异引物(GSP)和GeneRacer试剂盒引物 

测序结果表明：BrTT8基因家族获得1个长度为633bp[不包括poly(A)，下同]的5’cDNA末端；BoTT8基因家族获得2个长度分别为455、532bp的5’cDNA末端，均与AtTT8mRNA具有很高的同源性；BnTT8基因家族获得20个5’cDNA末端克隆子序列，均与AtTT8mRNA具有很高的同源性，但实际可能只代表2条独立基因，片段长度的差异是由可变性转录位点引起的。NCBI BLASTn分析表明它们与AtTT8mRNA(NM_117050.2)具有很高的同源性，确为芸薹属TT8基因家族的5’cDNA末端。 

5、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族3’cDNA末端的克隆 

分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用引物组合FTT8-3+3’P进行3’cDNA末端的RACE一扩。PCR扩增体系和程序与5’cDNA末端的RACE一扩相同。再以一扩产物为模板，用引物组合FTT8-3N+3’NP进行3’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和程序与5’cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，BrTT8获得了一条500～550bp左右的宽带，BoTT8获得了一条500bp的条带，BnTT8获得了一条450-550左右的很亮的宽带(图2)。胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、Amp抗性和蓝白斑筛选、白斑单克隆菌液PCR鉴定和测序。 

测序结果表明：BrTT8基因家族获得10个长度分别为545、489、488、430(4个)、428、392和382bp的3’cDNA末端，实际可能代表2条独立基因，片段长度差异是由可变性poly(A)加尾位点引起的；BoTT8基因家族获得8个长度分别为455、450、428(3个)、406、377和320bp的3’cDNA末端，实际可能代表2条独立基因，片段长度差异是由可变性poly(A)加尾位点引起的；BnTT8基因家族获得15个3’cDNA末端，实际可能代表2条独立基因，片段长度差异 是由可变性poly(A)加尾位点引起的。NCBI BLASTn分析表明这些3’cDNA末端均与AtTT8mRNA具有很高的同源性，确为芸薹属TT8基因家族的3’cDNA末端。 

6、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族成员全长cDNA的克隆 

根据所获得的BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族5’和3’cDNA末端序列，设计了正向引物FBrTT8分别与2条反向引物(RBrTT8-1和RBrTT8-2)组合，用于扩增BrTT8基因家族成员的全长cDNA；设计了正向引物FBoTT8分别与2条反向引物(RBoTT8-1、RBoTT8-2)组合，用于扩增BoTT8基因家族成员的全长cDNA；前面这4个引物组合共同用于扩增BnTT8基因家族成员的全长cDNA(表2)。以白菜、甘蓝和甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，采用上述引物组合和50μl标准Taq PCR扩增体系，扩增白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族各成员的全长cDNA；PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸3分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，BrTT8的引物组合FBrTT8+RBrTT8-1、FBrTT8+RBrTT8-2均获得了条约1.9kb的条带(图3A、B)；BoTT8的引物组合FBoTT8+RBoTT8-1、FBoTT8+RBoTT8-2也均获得了条约1.9kb的条带(图3C、D)；BnTT8的引物组合FBoTT8+RBoTT8-1、FBrTT8+RBrTT8-1均获得了一条约1.9kb的条带(图3E、F)，但引物组合FBrTT8+RBrTT8-2、FBoTT8+RBoTT8-2没有获得足够清晰的条带。胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、Amp抗性和蓝白斑筛选、白斑单克隆菌液PCR鉴定和测序。 

结果：采用引物组合FBrTT8+RBrTT8-1、FBrTT8+RBrTT8-2分别得到BrTT8基因家族2条全长cDNA序列，长度分别为1932、1861bp[不包括poly(A)，下同]，多重比对分析表明它们与AtTT8mRNA有很高的同源性，且存在与它们对应的5’和3’RACE末端，将其分别命名为BrTT8-1mRNA和BrTT8-2mRNA；采用引物组合FBoTT8+RBoTT8-1、FBoTT8+RBoTT8-2分别得到BoTT8基因家族2条全长cDNA序列，长度分别为1795、1798bp，多重比对分析表明它们与AtTT8mRNA有很高的同源性，且存在与它们对应的5’和3’RACE末端，将其分别命名为BoTT8-1mRNA和BoTT8-2mRNA；采用引物组合FBoTT8+RBoTT8-1、FBrTT8+RBrTT8-1分别得到BnTT8基因家族2条全长cDNA序列，长度分别为1793、1932bp，多重比对分析表明它们与AtTT8mRNA有很高的同源性，且存在与它们对应的5’和3’RACE末端，将其分别命名为BnTT8-1mRNA和BnTT8-2mRNA。 

表2BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成员全长cDNA和基因组序列扩增引物 

7、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族成员基因组序列的克隆 

以白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组总DNA为模板，采用能扩增出BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族各成员全长cDNA的引物组合，分别扩增BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族各成员的对应基因组序列，扩增程序与全长cDNA的扩增相同。另外，考虑到BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族各成员的基因组序列中可能存在一些特殊的结构，有的成员不能直接扩出基因组全长，需要分段扩增后再拼接，本研究根据BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族各成员的全长cDNA序列，设计了特异引物(FBrTT8S、RBrTT8S1、RBrTT8S2、FBoTT8S、FBoTT8S1、FBoTT8S)和正向公用引物FTT8I5(表2)，将其分别与能扩增出全长cDNA的正、反向引物配对，分别扩增BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族各成员的5’和3’端序列片段，再利用两片段的共有序列进行拼接，从而得到完整的基因组序列。 

结果：分别采用引物组合FBrTT8+RBrTT8S1、FBrTT8+RBrTT8S2扩增出BrTT8-1和BrTT8-2的上游片段，FTT8I5+RBrTT8-1、FTT8I5+RBrTT8-2扩增出BrTT8-1和BrTT8-2的下游片段，再将上、下游片段序列在软件VectorNTI 9.0上进行拼接，得到长度分别为3903、3838bp的BrTT8-1和BrTT8-2基因组序列。分别采用引物组合FBoTT8+RBoTT8-1、FBoTT8+RBoTT8-2进行扩增，得到长度分别为2974、2972bp的BoTT8-1和BoTT8-2基因组序列。采用引物组合FBoTT8+RBoTT8-1进行扩增，得到长度为2972bp的BnTT8-1基因组序列；分别采用引物组合FBrTT8+RBrTT8S1和FTT8I5+RBrTT8-1扩增BnTT8-2的上、下游片段，再将上、下游片段序列在软件VectorNTI 9.0上进行拼接，得到长度为3914bp的BnTT8-2基因组序列。 

二、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族的分析 

序列比对、开放阅读框(ORF)查找和翻译在Vector NTI Advance 9.0软件上进行。核酸和蛋白质序列的BLAST分析、蛋白序列的保守结构域搜索在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站上进行，蛋白质结构分析在http://bip.weizmann.ac.il/和http://www.expasy.org网站提供链接的生物信息学在线分析软件上进行。 

1、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族的核酸序列分析 

通过序列比较发现，BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族6个成员与AtTT8基因的结构相似，都是由6个内含子和7个外显子组成，其内含子剪切位点均具有保守序列AG|GT…AG|GT的特征，这些成员的核苷酸序列结构特征见表3-1、3-2和3-3。 

利用Vector NTI 9.0对BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成员以及AtTT8基因的核苷酸一致性进行了两两比对(表4，图4)。结果表明，BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族的6个成员之间具有较高的同源性，基因组序列的一致性为69.7～99.9％，mRNA一致性为85.8％～99.8％，编码区的一致性为93.2％～99.9％；它们与AtTT8基因也具有很高的同源性，基因组序列的一致性为44.2～52.4％，mRNA的一致性为78.0％～82.1％，编码区的一致性为80.1％～83.6％；同时，BnTT8-1与BoTT8-1的一致性高达99.9％，BnTT8-2与BrTT8-1的mRNA序列的一致性高达99.1％。因此BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族6个成员均是AtTT8的垂直同源基因，并且是在与拟南芥分开后由一个共同的原始祖先基因通过加倍而产生的。 

系统进化关系图(图5)表明，AtTT8先与BrTT8-2聚在一起，BnTT8-2先与BrTT8-1聚在一起，然后这两个小类又聚在一起形成一个大类；BnTT8-1与BoTT8-1聚在一起形成一类， BoTT8-2单独成一类，但进化关系与BnTT8-1/BoTT8-1很近。BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族6个成员的核苷酸序列比对和进化关系分析表明，BnTT8-1基因起源于BoTT8-1基因，BnTT8-2基因起源于BrTT8-1基因。 

表3-1BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员核苷酸序列的基本结构 

表3-2BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员核苷酸序列的基本结构 

表3-3BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员核苷酸序列的基本结构 

表4芸薹属6个TT8基因及AtTT8基因的基因组序列一致性(上排正体)、mRNA一致性(下排正体)和编码区一致性(斜体)(％) 

2、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族的成员数检测 

根据克隆的BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成员序列的多重比对，设计正向引物FTT8A(5’-gagctcagaagaagaaatgacaatgtcaga-3’)和反向引物RTT8A(5’-tctagatttcttccctctcactttcgccct-3’)，以BnTT8-1全长cDNA为模板，扩增BnTT8-1中间部位的947bp片段作为Southern杂交探针序列，并用PCR法(PCR DIG Probe Synthesis Kit)对探针进行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP)标记；探针标记的PCR程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。选取探针序列中不具有识别位点的限制性内切酶EcoRI、EcoRV、HindIII、XbaI分别酶切白菜和甘蓝基因组总DNA，选取EcoRI、EcoRV、SacI、XbaI分别酶切甘蓝型油菜基因组总DNA，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳、碱变性和中和，用毛细管法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上。将已标记好的探针与尼龙膜在40.9℃进行16小时的Southern杂交(DIG Easy Hyb)，中等严谨洗涤后进行免疫检测(DIG Wash and Block Buffer Set和DIG Nucleic Acid Detection Kit)，并对杂交显色条带拍照。 

Southern杂交结果如图6所示，白菜基因组总DNA经EcoRI、EcoRV、XbaI酶切均产生2条浓带和1条暗带，HindIII酶切产生1条暗带；甘蓝基因组总DNA经EcoRI、XbaI酶切产生2条浓带和1条暗带，EcoRV酶切产生2条浓带，HindIII酶切产生1条浓带和2条暗带；甘蓝型油菜基因组总DNA经EcoRI、EcoRV酶切产生2条浓带和1条暗带，SacI酶切没有产生明显条带，XbaI酶切产生1条浓带。Southern杂交结果显示BrTT8和BoTT8基因家族成员可能均为2个，与本研究克隆结果一致；虽然Southern杂交结果显示BnTT8基因家族成员可能为2-3个，但本研究对甘蓝型油菜的基因组序列和cDNA进行了反复克隆，最终只获得了BnTT8-1和BnTT8-2这两条基因，而没有获得与BrTT8-2和BoTT8-2相对应的基因，由此推断甘蓝型油菜BnTT8家族即使存在第3个BnTT8基因，也可能没有表达或已发生了一些结构缺失。 

3、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族编码蛋白分析 

通过序列比较发现，BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成员编码蛋白的基本参数及理化性质相似(表5)。 

采用Vector NTI Suite 9.0对BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员编码蛋白及AtTT8蛋白进行了两两比对(图7)，结果表明，BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族编码的6个TT8蛋白之间具有很高的同源性，一致性为89.6％～100％，相似性为90.6％～100％；它们与AtTT8蛋白也具有很高的同源性，一致性为71.5％～77.2％，相似性为77.4％～84.1％；同时，BnTT8-1与BoTT8-1的相似性和一致性均高达99.6％，BnTT8-2与BrTT8-1的相似性和一致性均高达100％(表6)。表明BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族6个成员均是AtTT8的垂直同源基因。 

表5BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员编码蛋白的基本性质 

表6芸薹属6个TT8蛋白及AtTT8蛋白的一致性(左)和相似性(右)(％) 

BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族成员编码蛋白与其它植物TT8蛋白的聚类分析结果显示(图8)，BnTT8-1与BoTT8-1聚在一起形成一类，BoTT8-2单独为一类，BnTT8-2和BrTT8-1聚为一类后再和BrTT8-2聚在一起，最后和AtTT8蛋白聚在一起形成一个大类。BnTT8、BrTT8和BoTT8蛋白的氨基酸序列与十字花科的萝卜、拟南芥的TT8蛋白的同源性最高，与其它植物如牵牛花、百合、紫花牵牛、矮牵牛的bHLH转录因子有比较高的同源性，还与包括拟南芥在内的许多植物的其它bHLH蛋白的氨基酸序列在bHLH保守域上有着相当高的同源性。蛋白的聚类分析进一步证明了芸薹属3个物种TT8基因的进化关系，即BnTT8-1基因起源于BoTT8-1基因，BnTT8-2基因起源于BrTT8-1基因，白菜和甘蓝是甘蓝型油菜的亲本物种。 

NetPhos 2.0预测BnTT8、BrTT8和BoTT8家族6个蛋白都存在较多的潜在磷酸化位点，其中BrTT8-1和BrTT8-2各有33个，BoTT8-1和BoTT8-2分别有34个和33个，BnTT8-1和BnTT8-1分别有34个和33个。NetNGlyc1.0预测这6个TT8蛋白的第282位天冬酰氨残基上都存在着N-糖基化位点。这6个TT8蛋白的氨基酸序列中均没有预测到信号肽和跨膜结构域。但WoLFPSORT预测它们都定位于细胞核内。SOPMA预测表明，这6个TT8蛋白的二级结构非常相似，α-螺旋占45.87％～52.21％，尤其是在蛋白的近C-末端有一个大螺旋，随机卷曲占30.90％～38.58％，延伸链占11.52％～13.63％且主要分布在蛋白的N-端域，β-转角占3.75％～4.41％，α-螺旋主要由随机卷曲和少量的β-转角相连。 

4、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族的组织器官特异性表达检测 

采用半定量RT-PCR检测白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族在不同组织器官中的总体表达及各个成员的特异表达。分别取白菜06K130、甘蓝06K158、甘蓝型油菜中油821的的根、下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花、荚果皮和10D、20D、30D的种子共11个器官的总RNA，采用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0将各器官的总RNA反转录为总cDNA，作为PCR扩增的模板。根据拟南芥26S rRNA的序列，设计引物F26S和R26S(表7)以扩增白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的看家基因Bn26S基因534bp的保守片段，用于检测和调节反转录的cDNA浓度；PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共21个循环，最后72℃延伸10分钟。通过对已克隆的白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族成员序列的多重比对分析，设计如下引物组合：FTT8I1+RTT8-5用于检测BrTT8基因家族的总体表达水平，FBrTT8S+RBrTT8S1、FBrTT8S+RBrTT8S2分别用于检测BrTT8-1、BrTT8-2的特异表达；FTT8I5+RTT8A用于检测BoTT8基因家族的总体表达水平，FBoTT8S+RBoTT8S2、FBoTT8S+RBoTT8S1分别用于检测BoTT8-1、BoTT8-2的特异表达；FTT8I5+RTT8A用于检测BnTT8基因家族的总体表达水平，FBoTT8S+RBoTT8S2、FBrTT8S+RBrTT8S1分别用于检测BnTT8-1、BnTT8-2的特异表达(表7)。基因家族成员特异检测时为了避免高度同源的成员间的交叉扩增，采用含有各个成员基因组序列的克隆子为模板，进行梯度PCR，筛选出只能扩增 出对应基因的最低退火温度。同时，用总cDNA为模板，以上述各引物组合进行55～65℃的梯度PCR，摸索出各引物组合扩增效率较为一致的退火温度。结果通过以单克隆子和总cDNA为模板的梯度PCR，得到扩增BrTT8-1、BrTT8-2基因特异检测引物的最高退火温度分别为58℃和56℃；扩增BoTT8-1、BoTT8-2基因特异检测引物的最高退火温度分别为60℃和61℃；扩增BnTT8-1、BnTT8-2基因特异检测引物的最高退火温度分别为59℃和60℃；PCR循环数均为35。 

表7白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族RT-PCR的内标和特异检测引物 

检测结果如图9所示，内标26SrRNA经20个循环的PCR扩增后，在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的10～11个组织器官中均扩增出亮度较一致的条带，说明各器官的起始总RNA量、反转录效率、PCR效率等是较为一致的，在此基础上进行的组织器官特异性表达比较结果是可信的。由图可知，BnTT8基因家族在开花后10天、20天和30天的种子中的总体表达量最高，其次是蕾和荚果皮，接着是根和叶，在下胚轴、子叶、茎中也有较弱的表达。BnTT8-1基因在花后10天、20天的种子中的表达量最高，其次是蕾和花，接着是根、下胚轴、茎、叶和荚果皮，在子叶和花后30天的种子中只有微量表达；BnTT8-2基因同样在花后10天、20天的种子中的表达量最高，其次是花，在茎、叶、蕾和荚果皮中有极弱的表达，在其它器官中未检测到表达。BrTT8基因家族在开花后10天、30天的种子中的总体表达量最高，在下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花中有微量的表达，在根和荚果皮中未检测到表达。BrTT8-1基因在开花后10天、30天的种子中的表达量最高，在根、下胚轴、子叶、蕾、花中有微量的表达，在茎、叶和荚果皮中没有检测到表达；BrTT8-2基因同样在开花后10天、30天的种子中的表达量最高，在蕾和花中有微量的表达，在其它器官中没有检测到表达。BoTT8基因家族的总体表达没有组织特异性，在叶、蕾、花，花后10天、30天的种子和荚果皮中都有高丰度的表达，在根、下胚轴、子叶和茎中也有相当量的表达水平。BoTT8-1基因在10个组织器官中均有表达，但是在开花后10天的种子中的表达量最高，在其它9个组织器官中的表达水平相当。BoTT8-2基因也在10个组织器官中均有表达，但在叶、蕾、花和荚果皮中的表达量要高于在其它组织器官中的表达量，其它组织器官中的表达大致相当。 

5、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族在黑、黄籽近等基因系间的差异表达检测 

采用半定量RT-PCR检测白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族在黄籽材料主要生殖器官中的总体表达及各个成员的特异表达，并与前述黑籽材料的检测结果进行比较。分别取白菜06K124、甘蓝06K165，甘蓝型油菜L1和L2的蕾、花以及发育不同阶段的种子(甘蓝型油菜取10D、20D和30D的种子；白菜和甘蓝取10D和30D的种子)等主要生殖器官的总RNA，采用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反转录为总cDNA，作为PCR扩增的模板。引物和扩增程序同前述黑籽材料。 

检测结果如图10所示，BnTT8基因家族的总体表达在甘蓝型油菜黑籽系和黄籽系中存在 着明显的差异：在黑籽系的5个组织器官中都有表达，在开花后20天的种子中的表达量最高，在其它4个组织器官中的表达量相当；但在黄籽系中，仅在蕾和花中表达，在发育不同阶段的种子中没有检测到表达。BrTT8基因家族的总体表达在白菜黑籽系和黄籽系中的表达趋势是一致的，都是在开花后30天的种子中的表达最高，其次是较早发育时期的种子；但是，无论是总体表达，还是各成员表达，黄籽系均比黑籽系有明显的下调，但两个成员间的参与度有差异，BrTT8-1完全关闭，而BrTT8-2仅仅是适当的下调。BoTT8基因家族在甘蓝黑籽系和黄籽系中的总体表达没有差异，在4个组织器官中都有较高丰度的表达；BoTT8基因家族的两个成员在黑籽系和黄籽系中的表达也没有本质的差异，只是在表达丰度上存在有限的差异。上述结果表明，TT8基因家族表达下调与白菜和甘蓝型油菜的黄籽性状有关，而TT8基因家族不是甘蓝黄籽性状的重要原因。 

三、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族的应用 

1、BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族正义植物表达载体及农杆菌工程菌株的构建 

分别将BrTT8-1、BrTT8-2、BoTT8-2和BnTT8-1基因的全长cDNA序列插入pCAMBIA2301G载体的多克隆位点BamHI和SacI之间，构建了正义植物表达载体pBrTT8-1、pBrTT8-2、pBoTT8-2和pBnTT8-1，插入片段由CaMV35S启动子驱动，由Nos终止子终止转录。pCAMBIA2301G载体由柴友荣构建(植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达.西南农业大学，2003)，其含有三个由CaMV 35S启动的植物表达盒，一个为NPTII基因表达盒，另外两个为GUS基因表达盒，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选，其中与NPTII基因表达盒同向的GUS基因表达盒中的GUS基因可被替换为外源目标基因(图11)。 

分别将所构建的4个正义植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于含有100mg/L Kan、40mg/L利福平(Rif)和20mg/L链霉素(Str)的YEB平板上，28℃倒置培养2天，挑取抗性菌落，接种于含有前述相同抗生素的YEB液体培养基中培养，取菌液进行PCR检测，检测结果正确的菌液用甘油于-80℃保存，即得分别含有pBrTT8-1、pBrTT8-2、pBoTT8-2和pBnTT8-1的农杆菌工程菌株。 

2、农杆菌介导的正义转化拟南芥tt8突变体的功能互补 

将拟南芥tt8突变体(购自美国俄亥俄州立大学的国际拟南芥生物资源中心)的种子用次氯酸钠溶液(1∶8稀释)消毒浸泡10分钟，用双蒸水洗4～5次后，平铺于MS平板上，4℃春化2天，再于21℃、16h光照/8h黑暗条件下培养10天左右，待小苗长出真叶后移入营养钵(将营养土和蛭石按体积比为1∶1混匀，用Hoagland营养液拌匀后装入小钵中即得)中，待初级花序长到5cm左右，剪除初级花序顶端第一个腋芽以上的花序，诱导次级花序的生长。 

将分别含有pBrTT8-1、pBrTT8-2、pBoTT8-2和pBnTT8-1的农杆菌工程菌株接种到在2mL含有抗生素(Kan 100mg/L+Str 20mg/L+Rif40mg/L)的YEB液体培养基中，28℃振摇培养过夜，再取200μL培养物，加至20mL含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃振摇培养约9小时，再加入200mL渗透液(含有20g蔗糖和100μL Silwet L-77)混匀，将盛花期的拟南芥tt8突变体植株花序浸泡在此混合液中，浸染30～60秒，用吸水纸吸去叶片上残留的液体，用保鲜膜包住保湿，暗培养24小时，一周后再次浸染，约一个月后收集T1代种子。 

将获得的T₁代种子播种在湿润的沙土上并在沙土表面覆盖一层透明薄膜以保持沙土水分，置4℃春化2天，再放入温室中培养，待植株长至2～3片真叶时，将浓度为500mg/L的Kan溶液(含有质量分数为0.1％的吐温20)喷洒在叶片上并盖上一层塑料薄膜保湿1天，以后 每隔5天喷洒1次，共喷洒3～4次，观察叶片颜色变化，叶片变白并逐渐死亡的为非转基因植株(不具有Kan抗性)，叶片仍然为绿色的为转基因植株(具有Kan抗性)，将其转移到营养土中栽培。由于拟南芥tt8突变体植株长势较弱，影响了转化效率，经过Kan抗性筛选以后，首批获得了BnTT8-1转基因植株(图12)。 

将获得的Kan抗性拟南芥T₁代植株进一步做GUS染色鉴定：将T₁代植株的叶片浸泡在GUS染液(50mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液中含有：0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.1mol/LK₄[Fe(CN)6]，10mmol/L Na₂EDTA，0.001％(v/v)Triton X-100，0.5mg/ml X-Gluc)中，37℃保温过夜，再用体积分数为75％的乙醇脱色2～3次至阴性对照叶片呈现白色，在叶片上能够观察到蓝色GUS表达位点的即为转基因植株。结果抗性植株均有蓝色出现(图13)，说明所筛选出的抗性植株均为转基因植株，同时说明外源基因已成功地在转基因植株中得到表达。 

以拟南芥野生型和tt8突变体分别做阳性和阴性对照，对转基因阳性T₁代植株的形态、长势等表观性状进行调查。结果表明，转基因阳性T₁代植株在生长势、植株叶片性状、大小、叶片颜色上基本没有差异。 

以拟南芥野生型和tt8突变体分别做阳性和阴性对照，对转基因阳性T₁代植株产生的T₂代种子的种皮颜色恢复情况进行调查。结果发现大部分转基因阳性T₁代植株产生的T₂代种子的种皮颜色恢复成深褐色，少部分恢复为浅褐色，与野生型相似(图14)，证明甘蓝型油菜等芸薹属的TT8基因具有与拟南芥TT8基因对应的功能。 

3、BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族反义植物表达载体及农杆菌工程菌株的构建 

根据所克隆的BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族全长cDNA和基因组序列的比对，选取BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族成员相对保守区段作为共抑制的反义片段。以甘蓝型油菜5B第一链总cDNA为模板，用引物组合FTT8A+RTT8A扩增BnTT8A片段(核苷酸序列如SEQID No.10中第837～1653位碱基所示)，PCR产物如前法所述进行电泳检测、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序，得重组载体pMD 18-T-BnTT8A。采用XbaI+SacI自pMD 18-T-BnTT8A中双酶切出829bp的BnTT8A片段(图15a)并回收，同时采用XbaI+SacI双酶切从pCAMBIA2301G载体中切除约1.9kb的GUS基因，回收约12kb的载体骨架(图15b)。将所得BnTT8A片段和载体骨架进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行Kan抗性筛选，阳性克隆子通过引物组合FTT8A+RTT8A进行PCR鉴定(图15c)，获得反义植物表达载体pBnTT8A，反向插入的片段由CaMV 35S启动子驱动，由Nos终止子终止转录，同时在T-DNA边界内分别连锁有报告基因GUS和筛选标记基因nptII的表达盒(图16)。 

将反义植物表达载体pBnTT8A采用液氮冷冻法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于含有75mg/L Kan、40mg/L利福平(Rif)和20mg/L链霉素(Str)的YEB平板上，28℃倒置培养2天，挑取抗性菌落，接种于含有前述相同抗生素的YEB液体培养基中培养，取菌液进行复合PCR检测，检测结果正确的菌液用甘油于-80℃保存，即得农杆菌工程菌株。 

4、农杆菌介导的反义植物表达载体转化黑籽甘蓝型油菜 

将冻存的农杆菌工程菌株解冻活化后培养至对数生长期，5000rpm离心10分钟收集菌体，用MS液体培养基(pH5.4)调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.3，供浸染用。选取饱满的甘蓝型油菜典型黑籽品种湘油15的种子，用75％乙醇表面消毒1分钟后，无菌水冲洗3次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡20分钟，无菌水冲洗干净，再接种于MS固体培养基上，26℃暗培养2天，再在光照强度为2000Lux、每天光照16小时的条件下进行光周期培养，切取苗龄5天的无菌 苗的下胚轴作为转基因的外植体；将下胚轴切段，接入预培培养基[MS+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)]中预培养2天；预培养后的下胚轴浸入前述备好的农杆菌工程菌液中浸染10分钟，用无菌吸水纸吸去多余菌液，再接入共培培养基[MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L萘乙酸(NAA)]中23℃暗培养3天；共培养后的下胚轴用含有500mg/L头孢霉素(Cef)的无菌水浸泡30分钟，用灭菌滤纸吸干表面水分；再接入含有7.5mg/LKan的筛选培养基[MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7.5mg/L Kan+300mg/L羧苄青霉素(Carb)+5mg/L AgNO₃]中光照培养，约2周继代1次，待有绿色再生芽长出后，再接入含有12.5mg/L Kan的筛选培养基中继续培养；获得的再生苗接入生根培养基(MS+0.1mg/L吲哚乙酸+300mg/L Carb+7.5mg/LAgNO₃)中光照培养至长出发达根系。 

切取转化绿苗的叶片用于GUS组织化学染色，鉴定转化苗外源基因的稳定表达情况。GUS组织化学染色方法：将待测的湘油15转基因幼苗和对照(未转化幼苗)的叶片切成小片装入1.5ml的Eppendorf管，加入适当的GUS染液，37℃保温过夜，70％的酒精脱色后观察。实验共转化582个下胚轴外植体，最后得到24棵抗性小苗(图17)，GUS染色有13株幼苗的叶片能产生蓝色反应，而对照没有产生蓝色反应，表明至少有13株转化成功并且报告基因能够表达(图18)。 

转基因当代和后代的植株性状一致，说明转基因性状可以稳定遗传。转基因植株种子的颜色与对照相比明显变浅(图19)，虽然没有达到标准的金黄色性状，但已比较接近黄籽。所得到的反义BnTT8转基因后代植株的主体形态特征与非转基因的对照植株无明显差异，但是转基因种子普遍饱满度下降，粒形偏离球形，千粒重由对照的3.15克下降到2.54克。说明芸薹属TT8基因除了参与调控种皮色素合成以外，可能还参与调控了一些其它种子性状如种子大小，对它进行基因工程操作可以修饰种皮颜色、种子大小等性状。 

需要说明的是，本发明所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族，除了上述采用反义抑制技术应用于甘蓝型油菜种子性状的分子育种外，也可以采用RNA干扰等其它技术介导内源TT8基因或基因家族的表达下调以降低种皮色素积累，也可以通过正义转基因进行超量表达以增加原花青素的积累甚至增加种子大小，也可以应用于除甘蓝型油菜以外的其它芸薹属作物种子性状的分子育种。即使是采用反义抑制技术，除优选实施例中所用的pCambia2301G载体以外，也可以采用其它载体来构建反义抑制表达载体；所得反义抑制表达载体除了采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。而且，除了优选实施例中公开的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜(来自于白菜型油菜亚种)和甘蓝(来自于羽衣甘蓝变种)TT8基因家族的6个成员以外，根据优选实施例所提供的研究方法和研究结果，来自于甘蓝型油菜、白菜和甘蓝的其它TT8等位基因序列，或者来自于这3个物种的其它亚种、生态型或品种的TT8基因序列，或者与上述6个成员的基因序列在连续80bp以上有至少98％一致性的任意核苷酸序列，都可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种中，实现本发明所述用途或效果。此外，本发明所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族还可以应用于茎叶彩色等花青素苷性状的调控。 

总之，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，而并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

Claims (3)

1.甘蓝型油菜BnTT8-1基因在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用，所述种子性状为种皮颜色和种子大小，所述BnTT8-1基因的全长cDNA序列如SEQ IDNo.10所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BnTT8-1基因的基因组序列如SEQ IDNo.9所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芸薹属作物为甘蓝型油菜。

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