CN101942455B - 甘蓝型油菜tt16基因家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族及其应用，其中白菜TT16基因家族包括BrTT16-1基因、BrTT16-2基因和BrTT16-2基因，甘蓝TT16基因家族包括BoTT16-1基因、BoTT16-2基因和BoTT16-3基因，甘蓝型油菜TT16基因家族包括BnTT16-1基因、BnTT16-2基因、BnTT16-3基因、BnTT16-4基因、BnTT16-5基因和BnTT16-6基因；上述基因家族可应用于芸薹属作物种子性状的分子育种。

Description

甘蓝型油菜TT16基因家族及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)TT16(TRANSPARENT TESTA 16，透明种皮16；又称ABS，ARABIDOPSIS BSISTER；或AGL32，AGAMOUS-LIKE 32)基因家族及其应用。 

背景技术

十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。 

籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。 

类黄酮物质是广泛存在于植物界的次生代谢物质，是植物组织中红色、蓝色和紫色等花青素苷色素的呈色物质。拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物种皮色素的主要成分为原花青素(proanthocyanidin，PA)单体的聚合物，其是经公共苯丙烷途径-类黄酮途径-原花青素途径合成的。目前的研究表明，类黄酮生物合成的调控是由转录因子的协同作用来完成的，而这些转录因子表达的时空特性受到精密调控。已知WD40、MYB、bHLH、MADS-box、WRKY和bZIP转录因子都参与了类黄酮途径的调控，其中MADS-box(TT16)、WRKY(TTG2)和bZIP(TT1)转录因子在此途径中的作用还没有彻底明确。芸薹属和拟南芥同属十字花科，具有较近的亲缘关系。拟南芥TT16(AtTT16)基因编码MADS-box转录因子，研究发现其对于BAN基因的表达和原花青素在内种皮中的积累是必需的。拟南芥tt16突变体表现为透明种皮即黄籽性状，且内种皮细胞变得不规则，推测该基因可能还参与调控内种皮细胞分化和发育，但具体作用和机制尚不清楚。因此，在芸薹属中对TT16基因进行同源克隆和功能鉴定，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。 

芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700～1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种：白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp)和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因组的6倍，也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前对TT16基因的研究报道较少，而TT16基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性及与黄籽性状的关系等都未见报道。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族。 

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统分析。结果显示： 

所述白菜TT16(BrTT16)基因家族包括以下3个成员：BrTT16-1基因、BrTT16-2基因和BrTT16-3基因；所述BrTT16-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrTT16-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示，BrTT16-3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示； 

所述甘蓝TT16(BoTT16)基因家族包括以下3个成员：BoTT16-1基因、BoTT16-2基因和BoTT16-3基因；所述BoTT16-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示，BoTT16-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示，BoTT16-3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示； 

所述甘蓝型油菜TT16(BnTT16)基因家族包括以下6个成员：BnTT16-1基因、BnTT16-2基因、BnTT16-3基因、BnTT16-4基因、BnTT16-5基因和BnTT16-6基因；所述BnTT16-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示，BnTT16-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.16所示，BnTT16-3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.18所示，BnTT16-4基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.20所示，BnTT16-5基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.22所示，BnTT16-6基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.24所示。 

进一步，所述BrTT16-1基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，BrTT16-2基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示，BrTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示； 

所述BoTT16-1基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示，BoTT16-2基因的基因组序列如SEQ ID No.9所示，BoTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No.11所示； 

所述BnTT16-1基因的基因组序列如SEQ ID No.13所示，BnTT16-2基因的基因组序列如SEQ ID No.15所示，BnTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No.17所示，BnTT16-4基因的基因组序列如SEQ ID No.19所示，BnTT16-5基因的基因组序列如SEQ ID No.21所示，BnTT16-6基因的基因组序列如SEQ ID No.23所示。 

上述3个物种的12条TT16基因与AtTT16基因具有较高的同源性，基因组序列一致性为67.1～70.3％，编码区序列一致性为82.9～87.0％，编码蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分别为73.0～78.2％和78.2～85.7％，核酸水平和氨基酸水平的序列比对、系统发生聚类等方面都表明，它们是AtTT16基因的垂直同源基因。这3个物种的12条TT16基因之间也具有很高的同源性，基因组序列一致性为69.4～100.0％，编码区序列一致性为85.2～100.0％，编码蛋白的 氨基酸序列的一致性和相似性分别为75.1～100％和80.4～100％；其中，甘蓝型油菜的BnTT16-1、BnTT16-4、BnTT16-6基因分别来源于白菜的BrTT16-1、BrTT16-2、BrTT16-3基因，而甘蓝型油菜的BnTT16-2、BnTT16-3、BnTT16-5基因分别来源于甘蓝的BoTT16-1、BoTT16-2、BoTT16-3基因。BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族保持了与AtTT16基因类似的器官特异性，主要在生殖器官中表达，以花和发育中的种子表达最高，并随着种子的发育进程而逐渐下降。此外，TT16基因在甘蓝型油菜和白菜的黑籽与黄籽材料中的表达存在着较明显的差异，而在甘蓝的黑籽与黄籽材料中无明显差异，说明甘蓝型油菜和白菜的黄籽性状与TT16基因表达下调有关，而甘蓝的黄籽性状与TT16基因几乎没有关系。 

基于上述结果，利用本发明的BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建TT16基因重组表达载体和转化体，用于TT16基因的正义表达、反义抑制、RNA干扰等。 

本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。 

进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。 

为达到上述目的，本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族特异保守保守区段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No.14中第353～966位碱基所示)为RNA干扰片段，以基于pFGC5941改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架，将BTT16I分别以反义和正义方式同时插入pFGC5941M的CaMV35S启动子和OCS终止子之间形成反向重复序列，构建了芸薹属TT16基因家族RNA干扰载体pFGC5941M-BTT16I，并通过农杆菌转化法转化了甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号，所得阳性转基因植株的性状调查发现，通过RNA干扰沉默BnTT16基因家族后，转基因植株的背景性状正常，转基因种子明显变小且种皮色素明显减少，多数呈黄褐色和黄棕色，与非转基因种子的典型黑籽形成鲜明对比。说明在甘蓝型油菜等植物中，TT16基因同时调控种子大小发育、种皮色素积累等性状的形成，可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种，尤其是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种，利于创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料，也可以超量表达后用于增加种子的大小，提高种子千粒重。 

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT16基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了TT16基因家族同时参与种子大小的发育和种皮色素的积累，由此本发明提供了TT16基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中： 

图1为BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族5’cDNA末端的扩增。 

图2为BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族3’cDNA末端的扩增。 

图3为BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族成员全长cDNA的扩增，其中1采用引物组合FBT16-1+RBT16-2，2采用引物组合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物组合FBT16-5+RBT16-6。 

图4为BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族成员基因组DNA的扩增，其中1采用引物组合FBT16-1+RBT16-2，2采用引物组合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物组合FBT16-5+RBT16-6。 

图5为BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员及AtTT16基因mRNA的序列比对。 

图6为BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白及AtTT16蛋白的氨基酸序列比对。 

图7为BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员与AtTT16基因mRNA的聚类分析。 

图8为BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白与AtTT16蛋白的聚类分析。 

图9为BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员的Southern杂交鉴定，其中M为地高辛标记的分子量标准。 

图10为BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族总体和成员的器官特异性表达检测。 

图11为白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的黑籽、黄籽材料主要生殖器官中TT16基因家族总体和成员的表达。 

图12为RNA干扰片段BTT16I的PCR扩增。 

图13为RNA干扰载体pFGC5941M-BTT16I的结构图。 

图14为RNA干扰载体pFGC5941M-BTT16I构建中的酶切和PCR鉴定，其中A为Swa I+AatII双酶切pMD19-T-BTT16I，M为DNA marker，CK代表酶切前的pMD19-T-BTT16I；B为Swa I+AatII双酶切pFGC5941M，M为DNA marker，CK代表酶切前的pFGC5941M；C为pFGC5941M-BTT16IA的克隆子菌液PCR检测；D为BamH I+Xba I双酶切pMD19-T-BTT16I，M为DNA marker，CK代表酶切前的pMD19-T-BTT16I；E为BamH I+Xba I双酶切pFGC5941M-BTT16IA；M为DNAmarker，CK代表酶切前的pFGC5941M-BTT16IA；F为pFGC5941M-BTT16I的克隆子菌液PCR检测，M为DNA marker。 

图15为再生植株的Basta复检鉴定，其中CK为非转基因植株，1-3为再生植株。 

图16为再生植株的PCR检测结果，其中M为DNA marker，CK为阳性对照，1为阴性对照，2-15为再生植株。 

图17为转基因种子(左)和非转基因种子(右)的比较。 

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

优选实施例采用的植物材料：白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.oleifera)，包括黑籽系09L597和黄籽系09L600；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种(B.oleracea var.acephala)，包括黑籽系09L598和黄籽系09L599；甘蓝型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黄籽系09L587)，均由重庆市油菜工程技术研究中心选育和大田常规种植，并经过了10代以上的单花序套袋自交；甘蓝型油菜黑籽品种中双10号由中国农业科学院油菜作物所选育，种子由重庆市油菜工程技术研究中心提供。 

优选实施例采用的试剂：Easy-Taq DNA聚合酶[5U/μl，附10×PCR Buffer(含Mg²⁺)]购自北京全式金生物技术有限公司；LA Taq DNA聚合酶[5U/μl，附10×LA PCR Buffer II(含Mg²⁺)]、λ-HindIII DNA marker等购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII、尼龙膜、地高辛标记的DNA marker等购自立陶宛MBI Fermentas公司； pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，MS(Murashige and Skoog medium)培养基购自荷兰Duchefa公司，结冷胶购自浙江中肯生物科技有限公司，其它分子、生化和植物组织培养试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司和上海稼丰园艺用品有限公司；改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M是在pFGC5941的基础上改进而成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子(BnPAP2I2)替换pFGC5941上过长的PhChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加一个AatII切点。 

优选实施例采用的试剂盒：小量植物组织RNA抽提试剂盒(W7021)购自上海华舜生物工程有限公司，小量胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自Omego公司，pMD19-T载体连接试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，GeneRacer Kit购自美国Invitrogen公司，PCR DIG ProbeSynthesis Kit、DIG Easy Hyb、DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit均购自德国Roche公司，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自宝生物工程(大连)有限公司。 

一、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的克隆 

1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA的提取 

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化比较完全，经分光光度法检测纯度较高，可以直接用于PCR扩增及Southern杂交。 

2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝各器官总RNA的提取 

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾(Bu)、花(Fl)以及4个发育阶段的种子[甘蓝型油菜和甘蓝取开花后15天(15D)、30天(30D)、45天(45D)和55天(55D)的种子；白菜取开花后10天(10D)、25天(25D)、40天(40D)和45天(45D)的种子]；以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜09L587和09L588、白菜09L597和09L600、甘蓝09L598和09L599的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St)、叶(Le)、蕾、花、荚果皮(SP)以及4个发育阶段的种子(甘蓝型油菜和甘蓝取15D、30D、45D和55D的种子；白菜取10D、25D、40D和45D的种子)共12个器官；采用小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。 

3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝RACE第一链cDNA的获得 

分别取甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾、花和4个发育阶段的种子的总RNA混合成总量为5μg的RNA样品，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的RACE操作，最终反转录获得在3’端和5’端同时锚定有人工接头序列的第一链cDNA，PCR放大后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，三个物种的第一链cDNA呈现出大小在200bp～10kb的拖带，重心区域在500bp～4kb，最核心区在1.5kb左右，说明反转录比较完全，得到了较高质量的总cDNA，可用于克隆甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族完整的cDNA末端。 

4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族5’cDNA末端的克隆 

根据AtTT16基因序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的反向引物RTT16-50(5’-ggatcgttttgaagattaggctgagcaag-3’)和RBT16RT(5’-gctcgtgtggaggaatggagg-3’)。分别以白菜、 甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引物5’P(5’-cgactggagcac-gaggacactga-3’)与RTT16-50配对，进行5’cDNA末端的RACE一扩。50μl标准Taq PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5.0μl，25mmol/L的MgCl₂3.0μl，10mmol/L的dNTPs 1.0μl，10μmol/L的正向引物1.0μl，10μmol/L的反向引物1.0μl，5U/μl的Taq酶0.5μl，模板0.5μl，加双蒸水至总体积为50μl。PCR扩增循环参数为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。 

以一扩产物为模板，用GeneRacer Kit提供的引物5’NP(5’-ggacactgacatggactga-aggagta-3’)与RBT16RT配对，进行5’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系与一扩相同但模板改为0.1μl，PCR扩增循环参数为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共25个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与pMD19-T载体连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR检测，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，各挑选10个具有代表性的阳性克隆子委托上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。测序结果表明：BrTT16基因家族的5’cDNA末端介于429～681bp之间，BoTT16基因家族的5’cDNA末端介于448～658bp之间，BnTT16基因家族的5’cDNA末端介于526～649bp之间。NCBI BLASTn表明，这些5’cDNA末端与AtTT16/ABS mRNA(AJ318098)具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属TT16基因家族的5’cDNA末端。 

5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族3’cDNA末端的克隆 

根据AtTT16基因序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的正向引物FTT16-30(5’-tgagctctct(g/a)ttctctg(c/t)gatgc-3’)和FTT16-3N(5’-ctcacatcggtctcatcgtcttctc-3’)。分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’P(5’-gctgtcaacga-tacgctacgtaacg-3’)与FTT16-30配对，进行3’cDNA末端的RACE一扩。PCR扩增体系和扩增循环参数与5’cDNA末端的RACE一扩相同。 

以一扩产物为模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’N P(5’-cgctacgtaacggcatgacagtg-3’)与FTT16-3N配对，进行3’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和扩增循环参数与5’cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物如前法所述进行电泳检测(图2)、胶回收、pMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。测序结果表明：BrTT16基因家族的3’cDNA末端介于778～853bp之间，BoTT16基因家族的3’cDNA末端介于733～936bp之间，BnTT16基因家族的3’cDNA末端介于687～820bp之间[均不包括poly(A)]。NCBI BLASTn表明，这些3’cDNA末端与AtTT16/ABS mRNA基因具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属TT16基因家族的3’cDNA末端。 

6、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族成员全长cDNA的克隆 

根据BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族5’和3’cDNA末端的测序结果，设计了3条正向引物和3条反向引物(表1)，得到3对引物组合：FBT16-1+RBT16-2、FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6；分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，采用上述引物组合和50μl标准Taq PCR扩增体系，扩增BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族各成员的全长cDNA，PCR扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、54～57℃退火1分钟、72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；再如前法所述进行电泳检测(图3)、胶回收、pMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定 和测序。 

表1BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员全长cDNA的扩增引物 

结果：以白菜第一链总cDNA为模板，引物组合分别为FBNA10-6+RBRA10-10、FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各扩增得到1条长度分别为1060bp、1242bp、1123bp的全长cDNA，分别命名为BrTT16-1mRNA、BrTT16-2mRNA和BrTT16-3mRNA。 

以甘蓝第一链总cDNA为模板，引物组合分别为FBNA10-6+RBRA10-10、FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各扩增得到1条长度分别为1087bp、1028bp、1134bp的全长cDNA，分别命名为BoTT16-1mRNA、BoTT16-2mRNA和BoTT16-3mRNA。 

以甘蓝型油菜第一链总cDNA为模板，引物组合为FBT16-1+RBT16-2，扩增得到2条长度分别为1060bp和1084bp的全长cDNA，分别命名为BnTT16-1mRNA和BnTT16-2mRNA；引物组合为FBT16-3+RBT16-4，扩增得到2条长度分别为1214bp和1243bp的全长cDNA，分别命名为BnTT16-3mRNA和BnTT16-4mRNA；引物组合为FBT16-5+RBT16-6，扩增得到2条长度分别为1128bp和1123bp的全长cDNA，分别命名为BnTT16-5mRNA和BnTT16-6mRNA。 

VectorNTI Advance 9.0多重比对表明，所得的BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族的全长cDNA均有相应的RACE末端克隆子序列与之对应，说明它们均是可转录表达的基因。多重比对还表明，3个物种中RACE末端所指示的各独立基因均已获得了对应的全长cDNA。 

7、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族成员基因组DNA的克隆 

根据BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员全长cDNA的序列多重比对结果，设计检测各成员的特异引物组合：FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-2S+RBT16-12S、FBT16-34S+RBT16-3S、FBT16-34S+RBT16-4S、FBT16-56S+RBT16-5S、FBT16-56S+RBT16-6S(表2)；根据BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族RACE末端和全长cDNA的克隆结果，分别以白菜09L597、甘蓝09L598、甘蓝型油菜5B的基因组总DNA为模板，采用上述全长cDNA的扩增引物组合和50μl标准Taq PCR扩增体系进行相同PCR，扩增BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族各成员的基因组DNA，再如前法所述进行电泳检测(图4)、胶回收、pMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和特异引物鉴定(用上述特异引物组合进行梯度PCR)，最后测序。 

表2检测BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员的特异引物 

结果：以白菜基因组总DNA为模板，扩增引物组合为FBT16-1+RBT16-2，特异引物组合为FBT16-1S+RBT16-12S，得到1条长度为2615bp的基因组DNA，其外显子区与BrTT16-1cDNA完全一致，命名为BrTT16-1gene；扩增引物组合为FBT16-3+RBT16-4，特异引物组合为FBT16-34S+RBT16-4S，得到1条长度为2730bp的基因组DNA，其外显子区与BrTT16-2cDNA完全一致，命名为BrTT16-2gene；扩增引物组合为FBT16-5+RBT16-6，特异引物组合为FBT16-56S+RBT16-6S，得到1条长度为2674bp的基因组DNA，其外显子区与BrTT16-3cDNA完全一致，命名为BrTT16-3gene。 

以甘蓝基因组总DNA为模板，扩增引物组合为FBT16-1+RBT16-2，特异引物组合为FBT16-2S+RBT16-12S，得到1条长度为2625bp的基因组DNA，其外显子区与BoTT16-1cDNA完全一致，命名为BoTT16-1gene；扩增引物组合为FBT16-3+RBT16-4，特异引物组合为FBT16-34S+RBT16-3S，得到1条长度为2632bp的基因组DNA，其外显子区与BoTT16-2cDNA完全一致，命名为BoTT16-2gene；扩增引物组合为FBT16-5+RBT16-6，特异引物组合为FBT16-56S+RBT16-5S，得到1条长度为2763bp的基因组DNA，其外显子区与BoTT16-3cDNA完全一致，命名为BoTT16-3gene。 

以甘蓝型油菜基因组总DNA为模板，扩增引物组合为FBT16-1+RBT16-2，特异引物组合分别为FBT16-1S+RBT16-12S和FBT16-2S+RBT16-12S，得到2条长度分别为2616bp和2622bp的基因组DNA，其外显子区分别与BnTT16-1cDNA和BnTT16-2cDNA完全一致，命名为BnTT16-1gene和BnTT16-2gene；扩增引物组合为FBT16-3+RBT16-4，特异引物组合分别为FBT16-34S+RBT16-3S和FBT16-34S+RBT16-4S，得到2条长度分别为2632bp和2729bp的基因组DNA，其外显子区分别与BnTT16-3cDNA和BnTT16-4cDNA完全一致，命名为BnTT16-3gene和BnTT16-4gene；扩增引物组合为FBT16-5+RBT16-6，特异引物组合分别为FBT16-56S+RBT16-5S和FBT16-56S+RBT16-6S，得到2条长度分别为2707bp和2678bp的基因组DNA，其外显子区分别与BnTT16-5cDNA和BnTT16-6cDNA完全一致，命名为BnTT16-5gene和BnTT16-6gene。 

二、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的分析 

在Vector NTI Advance 9.0软件上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和http://www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学在线分析软件上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。 

1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族的核酸序列分析 

BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员的基因组DNA基本参数如表3所示，全长cDNA基本参数如表4所示，G+C含量如表5所示。 

由表3～5可知，BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族12个成员的基因组DNA均由6个内含子和7个外显子组成，6个内含子的长度分别介于99～298bp、818～922bp、70～118bp、102～108bp、83～103bp和77～100bp，所有内含子剪接边界均符合标准的“GT...AG”规则。12个成员ORF介于723～738bp，G+C含量介于44.4～50.0％，明显高于非编码区。12个成员都具有丰富的转录起始位点多态性以及第1内含子可变性剪接，导致各成员的5’UTR长度和序列差异较大，长度介于121～321bp，G+C含量介于36.4～44.8％。由于加尾位点的多态性，各成员的3’UTR长度也存在着差异，介于189～206bp，G+C含量介于30.3～32.8％。12个成员中，BnTT16-3、BnTT16-4和BrTT16-2基因均存在典型加尾信号AAATAAA，BnTT16-1和BoTT16-1基因没有发现典型加尾信号，其它成员则发现了一个可能的非典型加尾信号AATGAATGAATGAA。 

NCBI BLASTn分析表明，BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族与拟南芥AtTT16/ABS mRNA(AJ318098)具有最高同源性，说明克隆得到的BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族12个成员为AtTT16的垂直同源基因，同一物种内的TT16基因成员构成水平同源基因。 

BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族成员以及AtTT16基因的核苷酸序列两两比对结果如表6和表7所示，mRNA多重比对结果如图5所示，mRNA的聚类分析如图7所示。 

表3BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族成员基因组DNA的基本参数 

表4BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族成员全长cDNA的基本参数 

由表6～7可知，3个物种的12条TT16基因之间具有较高的同源性，基因组序列的一致性为69.4～100.0％，编码区序列的一致性为85.2～100.0％；它们与AtTT16基因也具有很高的同源性，基因组序列的一致性为67.1～70.3％，编码区序列的一致性为82.9～87.0％。BrTT16-1和BnTT16-1基因组水平一致性为99.8％，编码区一致性为100.0％；BrTT16-2和BnTT16-4基因组水平一致性为99.7％，编码区一致性为99.9％；BrTT16-3和BnTT16-6基因组水平一致性为99.9％，编码区一致性为100.0％。BoTT16-1和BnTT16-2基因组水平一致性为99.7％，编码区一致性为99.6％；BoTT16-2和BnTT16-3基因组水平一致性为100.0％，编码区一致性为100％；BoTT16-3和BnTT16-5基因组水平一致性为97.4％，编码区一致性为99.2％。说明甘蓝型油菜的BnTT16-1、BnTT16-4、BnTT16-6基因分别来源于白菜的BrTT16-1、BrTT16-2、BrTT16-3基因，而BnTT16-2、BnTT16-3、BnTT16-5基因分别来源于甘蓝的BoTT16-1、BoTT16-2、BoTT16-3基因，甘蓝型油菜是白菜和甘蓝的异源四倍体物种，拥有白菜和甘蓝TT16基因的总和。从基因序列中的特征性变异碱基(图5)和系统发生关系(图7)来看，也支持以上结论。 

表5BnTT16、BrTT16、BoTT16基因的G+C含量(％) 

表6BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族成员以及AtTT16基因的基因组序列比对 

表7BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族成员以及AtTT16基因的编码区序列比对 

2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族的编码蛋白分析 

BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白的基本参数如表8所示。 

表8BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白的基本参数 

由表8可知，BrTT16、BoTT16、BnTT16家族12个蛋白大小介于240～256aa，分子量介于28.11～30.41kDa，等电点介于6.44～7.89；主要成员与AtTT16相似，为弱酸性蛋白，但BnTT16-4、BrTT16-2和BoTT16-2为碱性蛋白，各蛋白序列中极性氨基酸所占比例最高，其次是疏水性氨基酸。 

BnTT16、BrTT16、BoTT16家族蛋白以及AtTT16蛋白的氨基酸序列比对结果如表9和表10所示，多重比对结果如图6所示。 

由表9～10和图6可知，3个物种的12个TT16蛋白之间具有很高的同源性，一致性为75.1～100％，相似性为80.4～100％；它们与AtTT16也具有很高的同源性，一致性为73.0～78.2％，相似性为78.2～85.7％。同时，从蛋白水平的同源性仍然可以明确看出BnTT16家族的6个蛋白与BoTT16、BrTT16家族蛋白之间具有进化对应关系。 

表9BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白以及AtTT16蛋白序列的一致性(％) 

表10BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白以及AtTT16蛋白序列的相似性(％) 

BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白与AtTT16蛋白的聚类分析如图8所示，BnTT16-1与BrTT16-1首先相聚，BnTT16-2与BoTT16-1首先相聚，然后这4个聚为一组；BnTT16-3与BrTT16-2首先相聚，BnTT16-4与BoTT16-2首先相聚，然后这4个聚为一组；BnTT16-5与BrTT16-3首先相聚，BnTT16-6与BoTT16-3首先相聚，然后这4个聚为一组。再次证明了芸薹属3个物种TT16基因的进化关系。 

软件预测BrTT16、BoTT16、BnTT16家族12个蛋白没有信号肽、N-糖基化位点和跨膜螺旋。NetPhos 2.0预测表明它们普遍存在多个磷酸化位点，BnTT16-1、BnTT16-2、BrTT16-1和BrTT16-1各有11个，BnTT16-5、BnTT16-6、BrTT16-3和BoTT16-3各有9个，BnTT16-4和BrTT16-2各有6个，BnTT16-3和BoTT16-2各有5个，磷酸化可能参与它们的蛋白活性调节。WoLFPSORT预测表明这12个蛋白都定位于细胞核内，能与DNA结合。PredictNLS预测表明，BnTT16-1和BrTT16-1各有一个核定位信号RKVRERKKELLQQQLGNLSRKKR，BnTT16-1和BoTT16-1各有一个核定位信号RKKELLQQQLGNLSRKRRM，BoTT16-2有两个核定位信号KKKRR和SRKRRM，其它成员各有一个核定位信号SRKRRM。SOPMA预测表明，12个TT16蛋白的二级结构主体为随机卷曲和α螺旋，还有一定的延伸链，不含有β转角，大的α-螺旋主要集中在蛋白的中部，各成员的二级结构相似。SWISS-MODEL和ESyPred3D都未能预测出12个TT16蛋白的三级结构。 

3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族的成员数检测 

分别采用限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV和HindIII酶切白菜黑籽系09L597、羽衣甘蓝黑籽系09L598、甘蓝型油菜黑籽系5B的基因组总DNA，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳、碱变性和中和，用毛细管法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上。采用引物组合FTT16-32和RTT16-50扩增BoTT16-3mRNA编码区3’端的305bp片段，并采用PCR DIG Probe SynthesisKit将目标片段标记上地高辛(digoxigenin，DIG)-dUTP作为杂交探针；探针标记的PCR循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、52℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。采用此探针在43℃分别对上述3个物种基因组DNA进行16小时的Southern杂交(DIG Easy Hyb)，严谨洗涤后进行免疫检测(DIG Wash and Block BufferSet和DIG Nucleic Acid Detection Kit)，并对杂交显色条带拍照。 

Southern杂交结果如图9所示，甘蓝型油菜基因组DNA经DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII酶切分别产生了4、5、6、6条杂交条带，白菜和甘蓝基因组DNA经DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII均分别产生了3、4、4、3条杂交条带，与前面实际克隆得到的基因成员数基本一致，可以基本确定甘蓝型油菜、白菜、甘蓝TT16基因家族成员数分别为6、3、3个。 

4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族的组织器官特异性表达检测 

分别取白菜黑籽系09L597、甘蓝黑籽系09L598、甘蓝型油菜黑籽系5B各12个器官的总RNA，采用半定量RT-PCR检测BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族在不同组织器官中的总体 表达及各个成员的组织表达特异性。采用正向引物FBT16RT(5’-gatgctcacatcggtctcatcg-3’)和反向引物RBT16RT(5’-gctcgtgtggaggaatggagg-3’)检测BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族在12个器官中的总体表达。采用特异引物组合FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-34S+RBT16-4S、FBT16-56S+RBT16-6S、FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-2S+RBT16-12S、FBT16-34S+RBT16-3S、FBT16-56S+RBT16-5S、FBT16-2S+RBT16-12S、FBT16-34S+RBT16-3S、FBT16-34S+RBT16-4S、FBT16-56S+RBT16-5S、FBT16-56S+RBT16-6S分别检测BrTT16-1、BrTT16-2、BrTT16-3、BoTT16-1、BoTT16-2、BoTT16-3、BnTT16-1、BnTT16-2、BnTT16-3、BnTT16-4、BnTT16-5、BnTT16-6基因在12个器官中的表达。采用50μl标准Taq PCR扩增体系，扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、62～68℃(根据引物进行选择)退火1分钟、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。 

检测结果如图10所示，内标基因26S rRNA经20个循环的PCR在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽材料的12个器官中均扩增出了亮度较为一致的的条带，说明各器官的起始总RNA量、反转录效率、PCR效率等是较为一致的，在此基础上进行的组织器官特异性表达比较结果是可信的。BrTT16基因家族的总体表达在花和花后10天种子中最强，其次是花后25天、40天种子及蕾；各成员的表达特征与总体相似，在花和花后10天种子中表达最强，随着种子发育进程而逐渐降低，在根、下胚轴、子叶、茎、叶和荚果皮中不表达或只有微弱表达；在3个成员中，BrTT16-1基因的表达丰度最高，在蕾、花、花后10天、25天种子中优势表达，在下胚轴、子叶、茎、叶和荚果皮中也有弱表达，在根中无表达；BrTT16-3基因的器官特异性同BrTT16-1相似，只是表达丰度略低；BrTT16-2基因在生殖器官中的表达丰度与BrTT16-1和BrTT16-3相似，但在其它器官中的表达很弱或无。BoTT16基因家族总体在甘蓝主要的组织器官中都有表达，但丰度不同，花后15天种子最高，花、花后30天、45天种子、荚果皮、蕾、花后55天种子次之，叶、下胚轴、子叶、茎、根中也有弱或痕量表达；各成员的表达特征与总体相似，但BoTT16-1基因的器官特异性最强，只在生殖器官中表达，尤其是在花后15天种子中优势表达；BoTT16-2和BoTT16-3基因也主要在生殖器官中表达，但在营养器官中也有弱或痕量的表达。BnTT16基因家族的总体表达在花和花后15天种子中最强，其次是花后30天、45天、花后55天种子、蕾，在下胚轴、子叶、茎、叶、荚果皮、根中也有弱或极弱表达；各成员的器官特异性与总体相似，即主要在生殖器官中表达，在发育中的种子中表达最高，并随着种子发育进程而逐渐降低；但各成员间也有差异，在表达水平上，BnTT16-2和BnTT16-4基因最高，然后依次为BnTT16-5、BnTT16-6、BnTT16-3、BnTT16-1基因；在器官特异性上，BnTT16-5最差，除了在发育的种子中优势表达以外，在其它主要器官中也有一定表达；BnTT16-1最特异，只在花和花后15天、30天、45天的种子中有表达；其余成员居中，除具有BnTT16-1基因的表达特征外，多数还在蕾、花后55天种子甚至荚果皮中有一定表达。综上，芸薹属TT16基因家族保持了与拟南芥TT16基因类似的器官特异性，即主要在生殖器官中表达，以花和发育中的种子中表达最高，并随着种子的发育进程而逐渐下降，这与预测它们参与调节内种皮细胞发育和种皮色素积累的功能是一致的。但是，无论是芸薹属与拟南芥之间、芸薹属内种间还是种内的水平同源基因间，TT16的器官特异性均存在一定的歧化。 

5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族在黑籽、黄籽材料间的表达差异性检测 

分别取白菜黑籽系09L597和黄籽系09L600、甘蓝黑籽系09L598和黄籽系09L599、甘蓝型油菜籽色近等基因系黑籽系09L588和黄籽系09L587主要生殖器官的总RNA，采用半定 量RT-PCR检测BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族总体与各成员在不同组织器官中的表达。引物和扩增循环参数同前。 

检测结果如图11所示，BrTT16基因家族在白菜黄籽材料中的器官特异性与黑籽材料相似，但表达水平上BrTT16-1和BrTT16-3基因明显比黑籽材料下调，而BrTT16-2基因却比黑籽材料略高。BoTT16基因家族在甘蓝黄籽材料中的器官特异性与黑籽材料相似，且表达水平也没有明显差异。BnTT16基因家族在甘蓝型油菜黄籽材料中的器官特异性与黑籽材料相似，但表达水平上BnTT16-1、BnTT16-2、BnTT16-5和BnTT16-6基因明显比黑籽材料下调，BnTT16-3和BnTT16-4基因与黑籽材料无明显差异。上述结果说明，甘蓝型油菜和白菜的黄籽性状应当与TT16基因表达下调有关，而甘蓝的黄籽性状与TT16几乎没有关系；另外，不同的TT16基因家族成员参与黄籽性状的程度也不同。 

三、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的应用 

1、芸薹属TT16基因家族RNA干扰载体的构建 

将BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族和拟南芥MADS基因超家族各成员的mRNA进行多重比对，选择BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族特异保守区段为RNA干扰靶标。以甘蓝型油菜5B第一链cDNA为模板，采用引物组合FBTT16I+RBTT16I扩增RNA干扰片段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No.14中第353～966位碱基所示)，并在其5’端加上BamHI和AatII酶切位点、3’端加上XbaI和SwaI酶切位点；采用标准50μl Taq PCR扩增体系(模板0.5μl，Taq DNA聚合酶1.5U)，扩增循环参数为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物如前法所述进行电泳检测(图12)、胶回收、pMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序，得重组载体pMD19-T-BTT16I。 

用SwaI和AatII从pMD19-T-BTT16I中双酶切出反义片段BTT16IA，再与经同样双酶切后开环的pFGC5941M载体进行连接(即将反义片段插入到pFGC5941M的CaMV35S启动子与间隔区之间)，连接产物转化DH5α感受态细胞，用含有100mg/L的卡那霉素(Kan)的LB平板筛选培养，挑取单菌落，用含有Kan的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行复合PCR检测(引物组合为F35S3N+FBTT16I和RBTT16I+RBnPAP2I2，序列见表11，检测结果见图14)，选取全阳性的克隆子提取质粒，得中间载体pFGC5941M-BTT16IA。 

表11TT16基因家族RNA干扰载体构建和转基因检测所用引物 

用BamHI和XbaI从pMD19-T-BTT16I中双酶切出正义片段BTT16IS，再与经同样双酶切后开环的pFGC5941M-BTT16IA进行连接(即将正义片段插入到中间载体的间隔区与OCS终止 子之间)，连接产物转化DH5α感受态细胞，用含有100mg/L Kan的LB平板筛选培养，挑取单菌落，增菌培养后，取菌液进行复合PCR检测(引物组合为F35S3N+RBnPAP2I2、FBnPAP2I2+ROCST5N，序列见表11，检测结果见图14)，选取全阳性的克隆子提取质粒，得RNA干扰载体pFGC5941M-BTT16I(结构见图13)。 

2、RNA干扰载体转化根癌农杆菌 

将pFGC5941M-BTT16I采用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于含有75mg/L Kan、40mg/L利福平(Rif)和20mg/L链霉素(Str)的YEB平板上，28℃倒置培养2天，挑取抗性菌落，接种于含有前述相同抗生素的YEB液体培养基中培养，取菌液进行复合PCR检测，检测结果正确的菌液用甘油于-80℃保存，即得农杆菌工程菌株。 

3、RNA干扰载体转化黑籽甘蓝型油菜 

将冻存的农杆菌工程菌株解冻活化后培养至对数生长期，5000rpm离心10分钟收集菌体，用MSm液体培养基[MS+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS)，pH5.8]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.3，供浸染用。选取饱满的甘蓝型油菜黑籽品种中双10号的种子，用清水浸泡1～2小时，再用95％乙醇浸泡1分钟，无菌水冲洗3次，再用0.1％的升汞溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗干净，再接种于MS固体培养基，25℃光照培养7天，切取无菌苗的下胚轴作为转基因的外植体；将下胚轴切段，接入预培培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4-D，pH5.8)中预培养3天；预培养后的下胚轴浸入前述备好的农杆菌工程菌液中浸染10分钟，用无菌吸水纸吸去多余菌液，再接入共培培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+50μMAS，pH5.8)中23℃暗培养2天；共培养后的下胚轴浸入MSk液体培养基[MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef)]中振荡洗涤杀菌30分钟，重复二次，用无菌吸水纸吸干表面水分；再接入诱导愈伤培养基[MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L6-BA+500mg/L Cef+10mg/L草丁膦(Basta)，pH5.8]中光照培养14天以上，至长出肉眼可见的抗性愈伤；再接入分化培养基[MS+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+10mg/L Basta，pH5.8]中继续培养，诱导愈伤分化；再接入茎分化培养基(MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+10mg/L Basta，pH5.8)中光照培养至长出小茎；再接入长茎培养基(MS+0.005mg/L 6-BA+500mg/L Cef+10mg/L Basta，pH5.8)中光照培养至长出茎和叶片；再接入生根培养基(MS+0.5mg/L吲哚乙酸+500mg/L Cef，pH5.8)中光照培养至长出发达根系；生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩-蛭石-草炭土(质量比为1∶1∶1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得14株再生植株。 

4、转基因植株的鉴定 

(1)转基因植株的Basta复检鉴定 

在再生苗的嫩叶片上滴1滴浓度为50mg/L的Basta溶液，3天后观察叶片有无变化。结果如图15所示，反应不明显或只有微弱变化的植株可能为阳性植株，而滴有Basta溶液的区域变枯黄甚至出现坏死的植株可能为阴性植株。 

(2)转基因植株的PCR鉴定 

采用CTAB法提取再生植株的基因组总DNA，再以该总DNA为模板，分别采用引物组合F35S3N+FBTT16I和FPbarT+RPbarT进行PCR扩增，检测pFGC5941M-BTT16I是否成功整合到黑籽甘蓝型油菜的基因组中，以含有pFGC5941M-BTT16I的农杆菌工程菌液为阳性对照，以非转基因植株为阴性对照。结果如图16所示，在部分再生植株中扩增出与阳性对照一致的条带，在两种引物组合检测中均为阳性的植株可能为转基因植株。与Basta复检结果比 较，在Basta复检中表现为抗性的植株，其PCR检测大多数也呈现阳性。综合几方面的结果，14株再生植株中至少有7株可以确定为阳性的转基因植株。 

5、转基因植株性状的调查 

在转基因植株生长发育的过程中，对转基因植株与非转基因植株的长势、株型、花、蕾、叶、荚果等形态特征进行了比较观察，结果发现，两者并无明显差异，长势基本一致，株型也没有明显变化，花色均为鲜黄色，叶片均为钝尖型，结荚也正常，说明通过RNA干扰使黑籽甘蓝型油菜中的BnTT16基因家族沉默后，包括基本生长发育在内的背景性状没有明显改变。同时，对转基因种子与非转基因种子进行了比较。结果如图17所示，转基因种子与非转基因种子相比发生了2点明显的性状变化：一是转基因种子的种皮色素明显减少，种子外观呈黄褐色和黄棕色，与非转基因种子的典型黑色种皮形成了鲜明对比；二是转基因种子明显变小，非转基因种子的千粒重为4.64g，而转基因抑制最猛烈植株的种子千粒重为2.23g，下降了51.94％。上述结果表明，甘蓝型油菜等芸薹属植物TT16基因家族同时参与调控种皮色素的积累和种子大小的发育。同时说明，通过RNA干扰使黑籽甘蓝型油菜中的BnTT16基因家族沉默后，能够达到抑制种皮色素积累的效果，有利于创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料。 

需要说明的是，本发明所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族，除了上述采用RNA干扰技术应用于甘蓝型油菜种子性状的分子育种外，也可以采用反义抑制等其它技术介导内源TT16基因或基因家族的表达下调以降低种皮色素积累，也可以通过正义转基因进行超量表达以增加原花青素的积累甚至增加种子大小，也可以应用于除甘蓝型油菜以外的其它芸薹属作物种子性状的分子育种。即使是采用RNA干扰技术，除优选实施例中所用的pFGC5941M载体以外，也可以采用其它载体来构建RNA干扰载体；所得RNA干扰载体除了采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。而且，除了优选实施例中公开的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜(来自于白菜型油菜亚种)和甘蓝(来自于羽衣甘蓝变种)TT16基因家族的12个成员以外，根据优选实施例所提供的研究方法和研究结果，来自于甘蓝型油菜、白菜和甘蓝的其它TT16等位基因序列，或者来自于这3个物种的其它亚种、生态型或品种的TT16基因序列，或者与上述6个成员的基因序列在连续80bp以上有至少98％一致性的任意核苷酸序列，都可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种中，实现本发明所述用途或效果。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

Claims (8)

1.甘蓝型油菜BnTT16-1基因，其特征在于：全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示。

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜BnTT16-1基因，其特征在于：基因组序列如SEQID No.13所示。

3.含有权利要求1或2所述甘蓝型油菜BnTT16-1基因或基因截短片段的重组表达载体，所述基因截短片段为核苷酸序列如SEQ ID No.14中第353～966位碱基所示的BTT16I片段。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有甘蓝型油菜TT16基因家族特异保守片段BTT16I的RNA干扰载体，所述BTT16I片段的核苷酸序列如SEQ ID No.14中第353～966位碱基所示。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述RNA干扰载体是将BTT16I片段分别以反义和正义方式同时插入改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的CaMV35S启动子和OCS终止子之间形成反向重复序列而得到；所述改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M是在pFGC5941的基础上改进而成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子BnPAP2I2替换pFGC5941上的PhChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加一个AatII切点。

6.含有权利要求3或4或5所述重组表达载体的转化体，所述转化体为根癌农杆菌。

7.权利要求3或4或5所述重组表达载体在黑籽甘蓝型油菜种子性状的分子育种中的应用，所述种子性状为种子大小发育和种皮色素积累。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述黑籽甘蓝型油菜种子性状的分子育种为甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种。

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