CN101942454B - 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝tt2基因家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT2基因家族及其应用；所述白菜透明种皮2的基因家族包括2个成员：BrTT2-1基因和BrTT2-2基因，所述甘蓝TT2的基因家族的1个成员BoTT2基因，所述甘蓝型油菜TT2基因家族包括3个成员：BnTT2-1基因、BnTT2-2基因和BnTT2-3基因；芸薹属6个TT2基因之间具有很高的同源性；本发明还公开了上述基因家族在植物分子育种中的应用，通过反义抑制其在黑籽甘蓝型油菜中的表达后，转基因植株发生了种皮颜色变浅等性状变化，具有创造转基因黄籽材料的潜力。

Description

甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT2基因家族及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)TT2(TRANSPARENT TESTA 2，透明种皮2；又称MYB123)基因家族及其应用。

背景技术

芸薹属(Brassica)是十字花科(Brassicacease)300多个属中最重要的一个属，含有世界性的重要蔬菜、油料和观赏作物，如白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)和甘蓝型油菜(B.napus)，而且甘蓝型油菜是由白菜和甘蓝通过天然种间杂交并加倍而形成的异源四倍体。拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是来自十字花科的研究最深入的模式植物。染色体分子标记共线性研究发现，芸薹属植物之间以及芸薹属与拟南芥之间均存在基因组水平和基因水平的保守性。

甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、种皮色素极少、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然亲本物种白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但甘蓝型油菜中不存在天然的黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，但其存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止主要限于传统研究领域，对于黄籽性状形成的分子机理仍然不清楚，还没有任何通过转基因分子育种创造甘蓝型油菜黄籽材料的报道。

类黄酮化合物是广泛存在的植物次生代谢物，它是植物组织中红色、蓝色和紫色花青素色素呈色物质。拟南芥等植物中种皮色素的主要成分是原花青素(原花青素，proanthocyanidin，PA)单体的聚合物，是由公共苯丙烷-类黄酮-原花青素途径而合成的。

同为十字花科的模式植物拟南芥功能基因组学的研究成果，为推动芸薹属植物重要性状的分子机理研究和比较基因组学研究提供了重要参考。拟南芥透明种皮2(AtTT2)基因编码R2R3-MYB转录因子AtMYB123，在种皮色素生物合成与转运中具有重要的调控功能。TT2可与TT8、TTG1一起协同调节TT3、TT18、TT12、BAN等结构基因的表达，直接调节种皮色素——原花青素(即缩合单宁)及其前体物(如花青素)的合成和沉积。AtTT2功能失活性即单基因突变导致种皮由野生型的深褐色种子转变为透明种皮(黄籽)。但是，目前甘蓝型油菜、白菜和甘蓝等芸薹属植物TT2基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、与黄籽性状的关系和在基因工程中的应用等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT2基因家族。

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜、

白菜、甘蓝TT2基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统的生物信息学分析和功能比较基因组学研究。结果显示：

所述白菜TT2(BrTT2)基因家族包括2个成员：BrTT2-1基因和BrTT2-2基因；所述BrTT2-1基因如SEQ ID No.1所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示；所述BrTT2-2基因如SEQID No.3所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示；

所述甘蓝TT2家族包括甘蓝TT2(BoTT2)1个成员，所述BoTT2基因序列如SEQ ID No.5所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示；

所述甘蓝型油菜TT2(BnTT2)基因家族包括以下3个成员：BnTT2-1基因、BnTT2-2基因和BnTT2-3基因；所述BnTT2-1基因如SEQ ID No.7所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示；所述BnTT2-2基因如SEQ ID No.9所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示；所述BnTT2-3基因如SEQ ID No.11所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示。

芸薹属TT2基因家族6个成员的6条TT2基因之间具有较高的同源性，基因组序列一致率为91.8％～99.5％，编码区序列一致性为98.1％～100％，编码蛋白水平的一致性和相似性分别为96.5％～100％和96.9％～100％；芸薹属TT2基因家族6个TT2成员与与拟南芥TT2(AtTT2)基因间基因组序列一致率为69.8％～72.4％，编码区序列一致率为78.8％～79.4％，编码蛋白水平的一致率和相似率分别为71.1％～71.8％和77.1％～77.8％，其中在R2R3-MYB区域的相似性达到97.1％。核酸水平的序列比对、系统发生聚类、特征性变异碱基、特征性变异氨基酸等方面都表明，芸薹属6条TT2基因都是AtTT2基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征。

半定量RT-PCR检测表明，芸薹属3个物种间TT2总体表达是相似的，也与拟南芥TT2大体相似，均主要在发育的种子中表达，但物种间的垂直同源基因间和同一物种内的水平同源基因间在器官特异性上也存在一定的歧化；此外，TT2基因在白菜、甘蓝的黑籽与黄籽材料的生殖器官中的表达存在着较明显的差异，TT2基因在甘蓝型油菜的黑籽与黄籽材料的发育后期种子中的表达也存在一定的差异，TT2基因表达的下调是芸薹属黄籽性状的重要成因。

基于上述结果，利用本发明的BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建TT2基因重组表达载体和转化体，用于TT2基因的超量表达、反义抑制、RNA干扰等。

本发明的目的之二在于提供所述白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TT2基因家族在植物种皮颜色性状的分子育种中的应用。

为达到上述目的，本发明选取代表性成员BrTT2-2、BoTT2的全长cDNA，分别正义插入到改造的植物正义表达载体pCAMBIA2301G的CaMV35S启动子与Nos终止子之间，构建了芸薹属TT2基因家族正义表达载体pBrTT2-2和pBoTT2，采用Flower Dip法将BrTT2-2转化拟南芥tt2-1突变体，经过PCR和GUS鉴定表明BrTT2-2全长cDNA整合到tt2-1突变体中，T₂代转基因种子表型分析表明，转基因植株与野生型拟南芥以及tt2-1突变体相比，转基因拟南芥种皮由突变体原来的透明种皮(黄籽)恢复为深褐色，与野生型拟南芥相同，说明BrTT2-2基因具有与AtTT2基因相同的蛋白功能，即调控种皮色素合成等。

为达到上述目的，进一步，本发明选取BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族保守片段BTT2A(核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.10的第104～737位所示)作为反义片段，将其插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子和Nos终止子之间，构建了BnTT2、BrTT2和BoTT2基因家族共抑制的反义抑制表达载体pBTT2A，并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转入甘蓝型油菜典型品种中油821，得到了抑制内源TT2表达的转基因株系。反义BnTT2的转基因油菜中，种籽普遍失去光泽，有的外观上表现为褐籽、褐黄籽、红褐籽，有的种皮仍然在外观上呈黑籽或黑褐籽，种皮色素均有不同程度下降，最高的比对照下降66.2％。

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT2基因在白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了TT2基因表达显著下调是所检测的芸薹属黄籽性状的重要成因，采用转基因技术将其正义转化拟南芥tt2-1突变体能够完成功能互补而恢复种皮色素积累，反义抑制甘蓝型油菜内源TT2基因家族的表达后种皮色素明显减少，种皮颜色明显变浅，证明TT2基因对于甘蓝型油菜等植物的黄籽性状等的分子育种中具有重要意义，应用前景好。

附图说明

为了使本发明的目的、技本方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进步的详细描述，其中：

图1为电泳图，其中A为BrTT2和BoTT25’RACE末端扩增；B为BnTT25’RACE末端扩增。

图2为电泳图，其中A为BrTT2和BoTT23’RACE末端扩增；B为BnTT23’RACE末端扩增。

图3为电泳图，其中a为BrTT2全长cDNA的扩增，b为BrTT2基因组DNA的扩增，c为BoTT2全长cDNA(2)和基因组DNA(1)的扩增，d为BnTT2全长cDNA的扩增，e为BnTT2基因组DNA的扩增。

图4为芸薹属TT2家族成员及AtTT2核苷酸序列的比对图，其分别代表一致性、保守性、不相似的碱基。

图5为分析图，其中A为白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TT2基因ORF的聚类分析，B为推导的芸薹属6个TT2蛋白与其它的MYB蛋白的系统分析。

图6为BrTT2、BoTT2、BnTT2家族6个蛋白及AtTT2的氨基到序列多重比对图。黄、蓝、绿、白色背景分别代表一致性、保守性、块状相似、不相似的氨基酸，其中绿色前景的氨基酸与其它蛋白之间具有弱相似性。

图7为BrTT2、BoTT2、BnTT2家族6个蛋白的二级结构图。

图8为采用SWISS-MODEL预测的BrTT2、BoTT2、BnTT2家族6个蛋白的MYB域的三级结构。

图9为Southern杂交结果图，a为BoTT2，b为BrTT2家族，c为BnTT2家族。

图10为电泳图，其中A为BrTT2基因家族总体及分成员在白菜黑、黄籽各器官中转录水平的RT-PCR检测，B为BoTT2基因在甘蓝黑、黄籽各器官中转录水平的RT-PCR检测；Ro表示根，Hy表示下胚轴，Co表示子叶，St表示茎，Le表示叶，Fl表示花，Bu表示蕾，10D、25D、30D、分别表示开花后10、25、30天的种子，SP表示荚果皮。

图11为电泳图，其中I为BnTT2基因家族总体及分成员在甘蓝型油菜黑籽材料各器官中转录水平的RT-PCR检测，II为BnTT2基因家族总体表达在甘蓝型油菜黑、黄籽生殖器官中转录水平的RT-PCR检测的比较；图注同图10。

图12为正义植物表达载体用XmaI+SacI完全双酶切验证的电泳图，其中a为pBoTT2，b为pBrTT2-2；M为Marker，相邻M的泳道为酶切反应，远离M的泳道为未酶切的质粒。

图13为BrTT2-2和BoTT2正义转化拟南芥tt2-1突变体T₁代转化子的筛选照片，A为T₁代种子的筛选，B为Kan抗性的T₁代植株，C为T₁代抗性植株移栽。

图14为BrTT2-2和BoTT2正义转化拟南芥tt-1突变体以后Kan抗性拟南芥T₁代植株的GUS染色照片。

图15为照片图，a为拟南芥野生型Ler种子，b为BrTT2-2和BoTT2正义转化tt2-1的T₂代植株的种子，c为tt2-1突变体种子，其中标尺为600μm。

图16为芸薹属TT2基因家族反义表达植物载体的构建与鉴定，其中a为扩增反义片段BTT2A，b为用XmaI+SacI完全双酶切从pMD18-T-BTT2A上切下BTT2A，c为对pBTT2A进行XmaI+SacI完全双酶切鉴定；CK为对照质粒pCAMBIA2301G。

图17为照片图，pBTT2A转化甘蓝型油菜黑籽品种中油821的再生植株叶片的GUS染色。

图18为电泳图，pBTT2A转化中油821的再生植株采用引物组合F35S3N+FBTT2A进行PCR检测。

图19为照片图，pBTT2A转化中油821后T₂株系上T₃种籽的种皮颜色比非转基因对照(中)变浅。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例采用的植物材料：白菜的材料为白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.oleifera)的黑籽系06K130和黄籽系06K124，甘蓝的材料为羽衣甘蓝变种(B.oleracea var.acephala)的黑籽系06K158和黄籽系06K165，甘蓝型油菜的材料为典型黑籽保持系5B、中油821、黑/黄籽近等基因系(黑籽系L1、黄籽系L2)，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，常规大田试验条件种植。拟南芥tt-1突变体(资源号：CS83)，购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，野生型拟南芥Ler生态型由本实验室提供，均为室内常规培养。

优选实施例采用的试剂及试剂盒：RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、DNA Ligation Kit、pMD18-T、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、DNase I(RNase-free)及buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNAMarker购自大连宝生物(TaKaRa)生物工程有限公司；限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII、SacI、XmaI、XbaI等购自立陶宛MBI Fermentas公司；PCR DIG ProbeSynthesis Kit、DIG Easy Hyb、DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit、DIG-labeled DNA Molecular Weight Marker VII、尼龙膜等为德国Roche公司产品；X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid)和Silwet L-77购自Sigma公司；MS(Murashige&Skoog medium，including vitamins)培养基为荷兰Duchefa公司产品；DL-2000 plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购北京全式金(Transgen)生物技术有限公司；利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)、Tryptone、YeastExtract、X-gal、IPTG、CTAB等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

优选实施例采用的主要仪器：PTC-200 Programmable Thermal Controller PCR仪购自美国MJ Research公司，Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；UVP HL-2000杂交紫外交链仪购自美国UVP公司，以及分子生物学和基因工程的其它常规仪器和设备。

一、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TT2基因家族的克隆

1、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组总DNA和总RNA的提取

每个品系取典型植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。同时，以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜典型黑籽系的根、下胚轴、子叶、茎、真叶、花、蕾、荚果皮、和三个时期种子(10D、20D和30D)为材料，分别采用CTAB法提取总RNA，用DNase I去除总RNA中含有的DNA杂质，电泳检测总RNA的质量，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。

电泳结果表明，用CTAB法提取的白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组总DNA的完整性好，平均分子量略大于λHindIII DNAMarker的23kb条带，RNA消化完全，分光光度法检测的纯度也较高，可用于PCR扩增及Southern杂交实验。电泳分析表明，获得的总RNA特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足下游实验的要求。

2、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜生殖器官RACE总cDNA第一链的获得

针对白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的黑籽系，每个物种均取蕾、花、10天、20天、30天的总RNA的总RNA各1μg混合，采用GeneRacer试剂盒按照其说明书操作，得到在3’和5’同时锚定有人工接头序列的总cDNA第一链，并用于下一步的RACE锚定扩增。

放大扩增后的双链cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，三个物种的总cDNA呈现出大小在200bp～10kb的拖带(smear)，重心区域在1～4kb，最核心区在1.5kb左右，这说明反转录比较完全，得到了较高质量的cDNA。

3、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TT2基因家族5’cDNA末端和3’cDNA末端的扩增

通过Vector NTI Advance 9.0对AtTT2、水稻OsMYB3等基因进行多重比对，根据TT2保守点设计RACE的基因特异引物(GSP)：正向引物FTT2C和FTT2-3，反向引物RTT2C和RTT2-3(表1)。上述引物分别与GeneRacer kit提供的锚定引物(3’P、3’NP、5’P、5’NP)配对，用于扩增BtTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的3’和5’cDNA末端。3’RACE的初次扩增引物组合为FBTT2A+3’P，模板为总cDNA即RACE反转录产物2μL。5’RACE的初次扩增引物组合为5’P+RBTT2A，模板是总cDNA即RACE反转录产物2μL。PCR反应的程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。5’RACE的巢扩引物组合为5’NP+RTT2-5，反应体系中模板是初扩产物0.1μL。PCR反应的程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；72℃延伸10min。PCR反应的程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。3’RACE的巢扩引物组合为FTT2-3+3’NP，反应体系中模板是初扩产物0.1μL。PCR反应的程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；72℃延伸10min。

BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族5’RACE末端克隆的结果：图1显示，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族5’RACE巢式扩增在约360bp有宽带，这与根据AtTT2序列所预测的长度基本一致。回收宽带，与T载体连接后转化DH5α，对白斑单克隆子进行菌液PCR检测，电泳检测后发现插入片段具有丰富的长度多态性。挑选有多态性的一批代表性的阳性单克隆子，采用M13F引物进行测序。测序结果剪去GeneRacer^TMRNAOligo残留的30bp接头序列后：BrTT2的5’cDNA末端序列介于224～355bp(224、319、344和355bp)，BoTT2基因的5’cDNA末端序列介于227～423bp(227、243、349、355、360和423bp)，BnTT2基因的5’cDNA末端序列介于349～360bp(3个360bp克隆子、2个349bp克隆子)。NCBI核酸-核酸BLAST(BALSTn)表明这些片段与AtTT2具有最高的同源性，证明所得克隆子的序列为白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TT2基因家族的5’末端。VectorNTI Advance 9.0上进行的多重比对表明，尽管这些克隆子长度多态性丰富，但Br-TT2、BoTT2、BnTT2基因家族5’cDNA末端分别只代表了1、1、2条独立基因，但多数成员均存在可变转录起始位点，还发现BoTT25’cDNA末端的423bp克隆子保留着第2内含子未剪接。

表1本研究所用引物

BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族3’RACE末端克隆的结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，巢式扩增在600bp左右处均有条亮带，这与根据AtTT2基因家族所预测的长度基本一致，详见图2。胶回收，与TA克隆载体连接后转化DH5α，对白斑单克隆子进行菌液PCR检测，电泳检测后发现插入片段具有一定的长度多态性。挑选有多态性的一批代表性的阳性单克隆子，采用M13F引物进行测序。测序结果表明，BrTT2的3’cDNA末端序列介于524～618bp(524、569、575、584、594、594和618bp，不计polyA尾巴，下同)，BoTT2的3’cDNA末端序列介于472～675bp(472、514、579、584、604、649和675bp)，BnTT2的3’cDNA末端序列介于534～601bp(3个601bp克隆子、2个579bp克隆子、1个534bp克隆子)。NCBIBLASTn分析表明这些片段与AtTT2基因具有最高的同源性，证明所得克隆子的序列为BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的3’末端。VectorNTI Advance 9.0上进行的多重比对表明，BrTT2、BoTT2、BnTT2的3’RACE末端分别代表了1、2、2条独立基因，但每个独立基因均存在多个可变性的Poly(A)加尾位点。

4、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族全长cDNA和基因组DNA的克隆

根据BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的5’和3’cDNA末端测序结果，设计了正向引物FBrTT21、FBoTT21和反向引物RBrTT2、RBoTT2、RBnTT2，正向引物和反向引物组合后用于全长cDNA和基因组序列的扩增。

BrTT2基因家族全长cDNA和DNA序列克隆：

采用白菜RACE总cDNA为模板，用于组合FBrTT21+RBrTT2进行扩增，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。电泳结果显示扩增出了1kb左右的宽带，详见图3-a，与基于AtTT2的预测基本一致，胶回收、转化大肠杆菌后，菌液PCR检测中克隆子间在插入片段长度上出现多态性，多数略小于1kb，少数略大于1kb，分别送几个代表性克隆子测序，获得的长度分别为950bp和1025bp(不计人工酶切位点)。

将模板替换成白菜基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示在1.1～1.2kb处扩增出一条特异条带，详见图3-b，与基于AtTT2的预测基本一致，胶回收，亚克隆后进行菌液PCR以及特异检测，克隆子间没有插入片段的长度多态性，送几个代表性克隆子测序，长度均为1114bp。

对BrTT2的所有3’cDNA末端、5’cDNA末端、全长cDNA和全长基因组序列的测序结果进行多重比对，发现它们代表2条独立基因，此处分别命名为BrTT2-1和BrTT2-2。BrTT2-1和BrTT2-2基因组全长均为1114bp，最长标准型mRNA均为950bp。但BrTT2-1的全长cDNA中有少数为1025bp，内含子2保留未剪接，命名为BrTT2-1PMmRNA。

BoTT2基因全长cDNA和DNA序列克隆：

采用甘蓝RACE总cDNA为模板，用于组合FBoTT21+RBoTT2进行扩增，PCR条件同前，电泳结果显示扩增出了2条特异条带，一条略大于800bp，另一条约1kb且略偏宽，详见图3-c，与预测的基本一致。对2条带均切胶回收、转化大肠杆菌。菌液PCR检测发现略大于800bp的条带没有多态性，送2个克隆子测序，得到的长度为813bp(不计人工酶切位点)；约1kb条带的插入长度有多态性，多数为1kb左右，少数为1.1kb左右，均送代表性克隆子测序，获得的长度分别为1012bp和1087bp。

将模板替换成甘蓝基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示扩增了一条1.2kb左右的特异条带，详见图3-c，与预测结果一致，胶回收，亚克隆后进行菌液PCR以及特异检测引物的鉴定，克隆子间没有长度多态性。送几个阳性克隆子测序，获得的长度均为1176bp(不计人工酶切位点)。

对BoTT2的所有3’cDNA末端、5’cDNA末端、全长cDNA和全长基因组序列的测序结果进行多重比对，发现它们只代表1条独立基因，但mRNA水平存在内含子的可变性剪接现象，1012bp的全长cDNA对应于AtTT2的标准型即2内含子剪接型全长cDNA，此处命名为BoTT2mRNA；1087bp的全长cDNA对应于BnTT2家族已报道的保留第2内含子型即单内含子剪接型的全长cDNA，此处命名为BoTT2PMmRNA；813bp的全长cDNA中除剪接了2个标准的内含子外，还将标准第3外显子中的199bp作为第3内含子进行了剪接，即3内含子剪接型，此处命名为BoTT2I3 mRNA。

BnTT2基因家族全长cDNA和DNA序列克隆：

采用甘蓝型油菜RACE总cDNA为模板，用于组合FBoTT21+RBnTT2进行扩增，PCR条件同前，电泳结果扩增出了约950bp的条带，与预期大小相符(图3-d)，分别回收，亚克隆到T载体并转化大肠杆菌，菌液PCR检测存在少量的长度多态性，送批量单克隆菌液测序，得到4条不同的全长cDNA序列，3个为938bp，1个为1013bp(均不计poly(A))。

将模板替换成甘蓝型油菜基因组总DNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示扩增了一条1.1kb左右的特异条带，详见图3-e，与预测结果一致，胶回收，亚克隆后进行菌液PCR以及特异检测引物的鉴定，克隆子间没有长度多态性，送批量阳性克隆子测序，获得长度均为1102bp的3个高度相似但又不同的序列(不计人工酶切位点)。

对BnTT2的所有3’cDNA末端、5’cDNA末端、全长cDNA和全长基因组序列的测序结果进行多重比对，发现它们代表3条独立基因。938bp的全长cDNA对应于AtTT2的标准型全长cDNA，命名为BnTT2-1mRNA、BnTT2-2mRNA、BnTT2-3mRNABnTT2-1mRNA。但BnTT2-2mRNA存在第2内含子的可变性剪接现象，命名为BnTT2-2PMmRNA。NCBI BLASTn表明它们与AtTT2基因有最高的同源性。

二、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的生物信息学分析

在Vector NTI Advance 9.0上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学网站上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。

1、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族核酸水平的分析

1.1、BrTT2的基因结构和核酸特征：

BrTT2-1(SEQ ID No.1)和BrTT2-2(SEQ ID No.3)的基因组序列均为1114bp，最大标准型全长cDNA均为950bp(SEQ ID No.2、SEQ ID No.4)。都有2个内含子和3个外显子，内含子分别位于196-284bp和415-489bp处，符合GT……AG的内含子边界序列特征，与AtTT2和BnTT2基因家族一致。但BnTT2-1的少数mRNA保留第2内含子不剪接(BrTT2-1PM)，只剪接第1内含子。

BrTT2-1和BrTT2-2标准全长cDNA的54-836bp区段(对应于基因组序列的54-1000bp处)均有一个783bp的开放阅读框(ORF，包括终止密码子)，均编码一个由260个氨基酸(aa)组成的多肽链。BrTT2-1PM型cDNA由于在保留的第2内含子中发生了提前终止，仅编码113个氨基酸，对应于近乎全长的R2R3-MYB域，但缺失了完整的C-末端。

两个基因在ORF的上游各有一个53bp的5’UTR，在ORF的下游都有一个114bp的3’UTR。2个基因成员在3’UTR中均没有典型的poly(A)加尾信号AATAAA，但在最后一个外显子区的535-540bp和632-637bp处各有一个AATAAA，有可能充当加尾信号的作用。此外，这两个成员3’UTR中的C₁₀₀₈ATAAA₁₀₁₃和A₁₀₄₃ACAAA₁₀₄₈可能是非典型的加尾信号。

在BrTT2-1的5′UTR区中，A₁、A₁₂、A₃₇、A₁₃₂构成了可变转录起始位点；在BrTT2-2的5′UTR区中，A₁是一个转录起始位点。在3′UTR区，可变性加尾位点分别为于BrTT2-1的T₁₀₂₀、T₁₀₆₅、G₁₀₇₁、T₁₀₈₀、T₁₀₉₀和T₁₁₁₄处，以及BrTT2-2的T₁₀₆₅、T₁₀₉₀和T₁₁₁₄处。

BrTT2基因家族的G+C含量在不同区段变化颇大。在2个基因成员的5′UTR区，G+C含量均为39.62％；在3′UTR区G+C含量均为26.32％；在第2个内含子区G+C含量均为34.67％；在BrTT2-1和BrTT2-2的ORF区G+C含量分别为41.51％和41.25％；在第1个内含子区G+C含量分别为22.24％和23.6％。非编码区比编码区具有明显偏低的G+C含量，符合真核生物功能基因的典型特征。

1.2、BoTT2的基因结构和核酸特征

BoTT2(SEQ ID No.5)的基因组序列为1176bp，最大标准全长cDNA(SEQ ID No.6)为1012bp，有2个内含子和3个外显子，内含子分别位于201-289bp和420-494bp处，符合GT……AG的内含子边界序列特征，与AtTT2和BnTT2基因家族一致。

BoTT2除标准mRNA之外，还有2种可变剪接的mRNA。第1种(BoTT2PM)只在少数mRNA中出现，它的75bp的第2内含子没有剪掉，在mRNA的398-400bp处即位于未剪掉的第2内含子序列中(对应于基因组序列的487-489bp)有终止密码子TAA，提前终止编码。第2种类型(BoTT2I3)在mRNA中占有一定的比例(约1/3)，除两个正常内含子的剪接外，也把典型mRNA形式的771-969bp(对应于基因组序列的935-1133bp)处被剪掉，形成第3内含子。

在BoTT2标准全长cDNA的59-841bp区段(对应于基因组序列的59-1005bp处)为783bp的ORF，编码一个260个氨基酸(aa)的多肽链。受提前终止的影响，BoTT2PM仅编码113个氨基酸，对应于近乎全长的R2R3-MYB域，缺失了完整的C-端域。BoTT2I3由于缺失终止密码子而没有正常的ORF，只在175-285bp处有一个假ORF，既不在TT2的正常读框之内，也远离标准的前导序列，所以不能翻译出有意义的蛋白质。

2个基因在正常ORF的上游有一个58bp的5’UTR，在ORF的下游都有一个171bp的3’UTR。在3’UTR中没有典型的poly(A)加尾信号AATAAA，但在最后一个外显子区的540-545bp和637-642bp处各有一个AATAAA序列，有可能充当加尾信号的作用。此外，3’UTR中的A₁₀₄₈ACAAA₁₀₅₃可能是非典型的加尾信号。在5’UTR区中在A₁A₆、A₁₂、A₁₃、G₁₁₈和A₁₃₄存在6处可变的转录起始位点。在3′UTR区，可变的加尾位点位于T₁₀₁₅、G₁₀₈₀、T₁₀₈₅、C₁₁₀₅、C₁₁₅₀和T₁₁₇₆。

1.3、BnTT2的基因结构和核酸特征

BnTT2-1、BnTT2-2和BnTT2-3基因(SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11)均为1102bp，cDNA均为938bp(SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12，不计poly(A)尾巴)。它们都有2个内含子和3个外显子，这和拟南芥AtTT2一样，3个基因中内含子均分别位于201-289bp和420-494bp处，符合GT……AG的内含子边界序列特征，并且和AtTT2的内含子位置也相符合。

将内含子剔除后，在BnTT2-1、BnTT2-2和BnTT2-3cDNA序列的59-841bp区段(对应于基因组序列的59-1005bp处)为783bp的开放阅读框(ORF，包括终止密码子)，均编码一个由260个氨基酸(aa)组成的多肽链，在ORF的上游各有一个58bp的5’UTR，在ORF的下游都有一个97bp的3’UTR。3个基因成员在3’UTR中没有典型的poly(A)加尾信号AATAAA，但在最后一个外显子区的540-545bp和637-642bp处各有一个AATAAA序列，有可能充当加尾信号的作用。此外，BnTT2-1的C₁₀₁₃ATAAA₁₀₁₈和三个成员的A₁₀₄₈ACAAA₁₀₅₃可能是非典型的加尾信号。

在BnTT2-1和BnTT2-3的5′UTR区中，A₁₂是一个可变转录起始位点。在3′UTR区，可变的加尾位点分别为于BnTT2-1的C₁₀₃₅处、BnTT2-2和BnTT2-3的G₁₀₈₀处。

此外，BnTT2-2除剪掉全部2个内含子的正常mRNA形式之外，还有一个可变的mRNA形式，它的第2个75bp内含子没有剪切掉，在mRNA的398-400bp处即位于未剪掉的第2内含子序列中(对应于基因组序列的487-489bp)处，有终止密码子TAA，提前终止编码。

BnTT2基因家族各成员的核苷酸组成在不同区段变化颇大。在3个基因成员的5′UTR区，G+C含量均为39.7％；在ORF区G+C含量分别为41.3％、41.9％和41.6％；在3′UTR区G+C含量分别为26.8％、28.9％和28.9％；在第1个内含子区G+C含量分别为22.5％、23.6％和22.7％；在第2个内含子区G+C含量均为34.7％。可见，非编码区特别是第1个内含子区和3′UTR区，G+C含量明显低于编码区。因为当序列的G+C含量低时，它的替代速率就高，所以非编码区低G+C含量就使其具有高的替代速率，外显子区相对较高的G+C含量有利于基因抗阻进化压力，从而能保持其信息和功能的正确和完整。

1.4、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的同源性和进化关系

采用Vector NTI Advance 9.0对BnTT2、BrTT2、BoTT2基因家族6个基因成员以及AtTT2进行核酸水平多重比对结果见图4，系统发生关系见图5A。

首先，芸薹属3个物种的6条TT2基因之间具有很高的同源性，基因组序列的一致性为91.8％～99.5％，编码区序列的一致性为98.1％～100％。而且它们与AtTT2也具有较高的同源性，基因组序列的一致性达到69.8％～72.4％，编码区序列的一致性高达78.8％～79.4％。芸薹属属内TT2之间的一致率明显高于芸薹属TT2基因与拟南芥TT2同源基因之间的一致率。

其次，芸薹属3个物种及拟南芥的TT2基因之间在编码区的一致性远远高于基因组序列水平的一致性，说明编码区的保守性明显高于非编码区，这符合功能基因尤其是结构基因的典型特征。值得注意的是芸薹属3个物种的TT2基因中的内含子II核苷酸序列完全一致，说明该内含子具有保守性。

6个基因的5′UTR区和AtTT2的5′UTR区的一致性很高，其中有1个保守区

2、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族编码蛋白分析

采用VectorNTIAdvance 9.0对BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族编码蛋白序列进行分析，发现他们的标准mRNA均编码由260个氨基酸组成的多肽链，且他们的理化性质非常接近，详见表2。BrTT2-1PM、BoTT2PM、BnTT2-2PM均编码113个氨基酸的截短型多肽。

表2□BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的基本参数

2.1、BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的同源性和进化关系

采用Vector NTI Advance 9.0对BnTT2、BrTT2、BoTT2家族6个蛋白以及AtTT2的氨基酸序列进行了多重比对，结果见图6。BnTT2、BrTT2、BoTT2家族6个蛋白以之间具有很高的同源性，一致性为96.5％～100％，相似性为96.9％～100％。而且它们与AtTT2之间也具有很高的同源性，一致性为71.1％～71.8％，相似性为77.1％～77.8％。采用BnTT2、BrTT2、BoTT2家族6个蛋白、AtTT2以及来自植物的其它MYB同源蛋白一起构建了系统发生关系，见图5-B，进一步表明BnTT2、BrTT2、BoTT2是AtTT2的垂直同源基因。

2.2、BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的结构域和重要基序的预测

NetNGlyc 1.0预测表明BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的第72位天冬酰氨残基上存在预测显著的N-糖基化位点。NetPhos 2.0搜索则预测表明：BrTT2-1蛋白分子有10个潜在的丝氨酸、3个苏氨酸、1个酪氨酸共14个磷酸化位点；BrTT2-2蛋白分子有10个潜在的丝氨酸、3个苏氨酸、1个酪氨酸共14个磷酸化位点；BoTT2蛋白分子有12个潜在的丝氨酸、2个苏氨酸、1个酪氨酸共15个磷酸化位点；BnTT2-1蛋白分子有10个潜在的丝氨酸、3个苏氨酸、1个酪氨酸共14个磷酸化位点；BnTT2-2蛋白分子有11个潜在的丝氨酸、2个苏氨酸、1个酪氨酸共14个磷酸化位点；BnTT2-3蛋白分子有10个潜在的丝氨酸、2个苏氨酸、1个酪氨酸共13个磷酸化位点，磷酸化作用可能与它们的活性有关。

采用SignalP 3.0预测BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白均没有信号肽，是一个非分泌型蛋白。

WOLFPSORT预测表明，在BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白中均有一个核定位信号(NLS)，位于R₁₁₅～H₁₃₁，富含碱性氨基酸残基(R、K)，转录因子进入细胞核的过程受该区段控制，6个成员的NLS位置相同，氨基酸序列完全一致。

TMpred等预测表明，在BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白中存在1个可能的跨膜结构域，由201～220位的20个氨基酸残基组成，由膜内进入膜外。

保守域搜索(CDD)表明在BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白N端的R₁₇-L₆₄、R₇₀-L₁₁₅区域即MYB-R2和MYB-R3位置分别对应存在MYB-DNA结合结构域，在它们的N₁₆-P₆₆、K₆₉-K₁₁₇区域分别对应存在SANT蛋白结合结构域。SOPMA预测每个MYB结构域中都有3个α-螺旋，在R3结构域中的第3个α-螺旋结构较大，并且极端保守，见图7，研究证实AtTT2蛋白中该α螺旋与DNA结合。虽然MYB蛋白在C-末端氨基酸变异较大，但BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白与AtTT2一样，都有2个保守C-末端α螺旋，被认为和转录激活有关。

因此，预测BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白与AtTT2具有相同的DNA结合和转录激活功能，即参与调控原花青素合成途径的后期调控，控制种皮色素合成。

另外，BnTT2-2PM、BrTT2-1PM和BoTT2PM均是由113个氨基酸组成的多肽，对应于近乎全长的R2R3-MYB域，缺失了完整的C-端域，推测它们具有DNA结合功能，但不具有转录激活功能，甚至具有转录抑制功能。

2.3、BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的二级结构结构预测

利用SOPMA对BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的二级结构预测表明(图7)，它们的二级结构非常相似，随机卷曲占氨基酸总数的50.00％-55.38％，α螺旋占氨基酸总数的34.62％-37.69％，其它是一些延伸链和β转角。α螺旋主要位于R2R3-MYB结构域和C-末端，R2-MYB和R3-MYB域中各有3个α螺旋，C-末端各有2个α螺旋，这和AtTT2以及BnTT2相同。

2.4、BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白的三级结构结构预测

在http://swissmodel.expasy.org/网站采用First Approach mode对BrTT2、BoTT2、BnTT2家族蛋白进行了三级结构预测(图8)，都只显现出N-端的R2R3-MYB结构域(L₁₅-L₁₁₉)的蛋白模型，而C-端没有预测出来，这是因为目前数据库中还没有TT2及相近MYB蛋白的晶体三维模型，预测是根据其它进化关系很远的其它亚类的晶体结构模型预测出来的，MYB蛋白的C端极不保守。3个成员蛋白的MYB域的一级结构序列是完全一致的，所以预测出来的MYB域的三级结构也是一样的，均符合典型的R2R3-MYB结构域特征。

3、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的成员数检测

采用组合FTT2-3+RBrTT2，用于扩增BrTT2-1基因第3外显子中的618bp(不计SacI)片段，采用PCR法对探针进行地高辛-dUTP(PCR DIG Probe Synthesis Kit，Roche)标记，PCR反应程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，64℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。PCR结束后，每管取3μL PCR产物经1％琼脂糖/GoldView/1×TAE凝胶电泳和紫外检测，电泳条带比未标记的对照明显滞后，看起来接近900bp，表明探针标记的成功。

分别采用限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII和XbaI酶切白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的基因组总DNA，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳、碱变性和中和，用毛细管法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上。将已标记好的探针与尼龙膜在41.0℃进行16小时的Southern杂交(DIG Easy Hyb)，中等严谨洗涤后进行免疫检测(DIG Wash and Block Buffer Set和DIGNucleic Acid Detection Kit)，并对杂交显色条带拍照。甘蓝的Southern杂交结果中，五种酶切均产生了1条特异条带，结合实际克隆的基因数，推测在甘蓝基因组中保有1条TT2基因，即研究所克隆的BoTT2基因，详见图9-a。白菜的Southern杂交结果中，XbaI酶切产生了1条特异条带，其余4种酶切方式均产生2条带，结合实际克隆的基因数，推测在白菜基因组中可能存在2个成员，即本研究所克隆的BrTT2-1和BrTT2-2，详见图9-b。甘蓝型油菜的Southern杂交结果中，EcoRI、EcoRV酶切均产生了3条特异条带，HindIII和XbaI酶切只产生2条带(DraI酶切不理想，因此Southern电泳时舍弃了该酶)，结合实际克隆的基因数，推测在甘蓝型油菜基因组中可能存在3个成员，即本研究所克隆的BnTT2-1、BnTT2-2和BnTT2-3，详见图9-c。

4、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的组织器官特异性检测

选择白菜、甘蓝、甘蓝型油菜典型黑籽系材料的根、下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花、花后10d的种子、花后30d的种子和荚果皮10个组织器官的RNA样品作为模板，采用RNAPCR Kit(AMV)Ver.3.0反转录为总cDNA，用半定量RT-PCR分析TT2基因家族表达组织性特征。用引物组合FBTT2A+RBTT2A检测各物种中TT2基因的总体表达水平，退火温度分别为55℃，循环数为35。引物组合FTT2-3+RBRTT2-1S、FTT2-3+RBNTT2-1S、FTT2-3+RBNTT2-1S、FTT2-3+RBNTT2-2S、FTT2-3+RBNTT2-3S分别用于检测水平基因成员BrTT2-1、BrTT2-2、BnTT2-1、BnTT2-2、BnTT2-3的表达水平的检测，退火温度分别为64℃、62℃、62.8℃、64℃、60.2℃，循环数为35-40(视表达水平而定)。白菜和甘蓝的内标引物为F26S+R26S，扩增看家基因26S的652bp。甘蓝型油菜的内标引物为FATACT2+RATACT2，扩增看家基因ACT2的542bp。反应在50μl标准Taq-PCR体系中进行，PCR反应的程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，相应温度℃退火1min，72℃延伸1min，24个循环；72℃延伸10min。

BrTT2基因家族在白菜11个组织器官中的总体表达结果如图10-A所示，在花后10d、20d和30d的种子中表达量最大，其次是蕾中有少量表达，在根、下胚轴、子叶、茎、真叶、花、荚果皮中不表达。BrTT2基因家族2个成员组织表达特征性极不同，BrTT2-1基本不表达，只在蕾、花后20d种子和荚果皮中检测到痕量表达，而BrTT2-2在花后10d、20d、30d、花和根中表达。在表达上，BrTT2-1基本处于关闭状态，BrTT2-2占主导地位。

如图10-B所示，BoTT2基因在花后10d的种子和花后30d的种子中表达量最大，荚果皮次之，蕾中和茎中也有弱的表达，花中极弱，在根、下胚轴、子叶、真叶中不表达。BoTT2表达特征与甘蓝型油菜TT2基因家族和拟南芥TT2的表达特征总体上相似，但也存在分化。

如图11-I所示，甘蓝型油菜中TT2基因家族总体表达以花后20d的种子中表达量最大，花后10d的种子和花后30d的种子表达量次之，花及荚果皮中的表达量较少，蕾中极弱。营养器官中，下胚轴、茎、子叶、真叶中不表达，在根中有少量表达。BnTT2-1在花后20天的种子中表达量最高，其次是花、花后10天和种子、花后30天的种子，在荚果皮、蕾、叶、根、下胚轴中有很弱或极弱的表达，在子叶和茎中完全不表达。BnTT2-2在3个成员中具有最强的组织特异性，以花后20天的种子表达最高，其次是花后10天的种子和根，在蕾、花后30天的种子中有很弱的表达，在下胚轴等其它器官中表达极弱或无表达。BnTT2-3组织特异性不强，在各个器官的表达极弱或无表达。

拟南芥中TT2基因在幼嫩的角果中表达量最高，其次是花，在蕾和荚果皮中有少量表达，在根等营养器官中完全没有表达。由此可见，这三个物种TT2基因家族总体表达特征总体上相似，但物种间以及种内不同的水平同源基因间存在一定的分化。

5、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族在黑籽、黄籽材料间的表达差异性检测

采用半定量RT-PCR检测白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TT2基因家族在黄籽与黑籽材料生殖器官中的表达水平的差异性。白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的黄籽系分别为06K124、06K165、L2，它们分别与黑籽系06K130、06K158、L1相比较。引物和方法同前。

图10-A、图10-B、图11-II表明，在甘蓝和白菜型油菜黑、黄籽发育后期的种子中，TT2基因总体表达均存在明显差异，而且趋势一致。TT2在这两个物种的黑籽中表达丰度较高，而在黄籽中表达极弱。这可能是本研究所用的黄籽材料中TT2基因受其上游基因调控，使TT2表达下调，从而产生黄籽性状。

三、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的应用

1、BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族成员正义转化植物表达载体的构建

为了验证和分析芸薹属TT2家族成员的功能，本研究选择了BrTT2、BoTT2、BnTT2基因家族的代表性成员BrTT2-2和BoTT2的全长cDNA，构建了它们的正义植物表达载体。采用SacI+XmaI完全酶切方式，将它们从重组T-载体质粒上切下并回收。同时用SacI+XmaI完全酶切平台载体pCAMBIA2301G，回收开环的载体骨架。利用T₄DNA聚合酶，将目的基因分别与载体骨架进行粘性末端的标准连接，形成正义植物表达载体pBrTT2-2和pBoTT2，目标基因由CaMV 35S启动子驱动，后接Nos终止子，形成表达盒。将其转化DH5α，得到抗卡那老霉素的克隆子，分别经引物组合进行PCR检测，阳性克隆子提取质粒采用SacI+XmaI完全酶切进行验证(图12)，pBrTT2-2和pBoTT2质粒分别切下了1012bp和950bp的目的基因片段，说明载体构建成功。采用液氮冷激法将pBrTT2-2和pBoTT2质粒转化根癌农杆菌LBA4404，PCR阳性克隆子即为工程菌株。

2、BrTT2-2和BoTT2转化拟南芥tt2-1突变体的功能互补鉴定

采用Flower Dip法，将pBrTT2-2和pBoTT2的LBA4404菌液转化拟南芥tt2-1突变体的花序。采用含有80mg·L^-1Kan的MS平板筛选T₁代种子，从植物载体转化T₁代种子中筛选出12株抗Kan的T₁植株。在筛选中绝大部分T₁代种子在Kan平板上能萌发，但子叶为白色，只有少数株植株子叶为绿色。把抗性植株移栽到空白的MS培养基上[MS粉4.41g/L+Phytagel2.6g/L，pH5.8，灭菌锅温热灭菌]，见图13，当抗性植株长势好转后把抗性植株移栽到营养土中继续生长。

以抗性植株叶片为材料，提取基因组DNA，采用油菜特异引物FBrTT2+RBrTT2，进行PCR扩增，电泳检测在抗性植株中扩增出与菌液阳性对照一致的条带，而未转化的tt2-1突变体则没有条带，说明转化成功。取Kan的T₁代转化植株叶片进行GUS染色(50mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液中含有：0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.1mol/L K₄[Fe(CN)6]，10mmol/LNa₂EDTA，0.001％(v/v)Triton X-100，0.5mg/ml X-Gluc)8h后，见图14，抗性植株均有蓝色出现，说明所筛选出抗性植株均为转基因的且转基因能够表达。

拟南芥野生型种皮颜色为深褐色，tt2-1突变体种皮为透明种皮，颜色为淡黄色，BrTT2-2和BoTT2转tt2-1突变体后，从T₁代植株上获得的T₂代种子中，大部分种皮颜色恢复成深褐色，少部分恢复为浅褐色，与野生型相似(图15)。

3、BnTT2、BrTT2和BoTT2基因家族反义植物表达载体的构建

以甘蓝型油菜黑籽系5B的RACE总cDNA第一链为模板，用引物组合FBTT2A+RBTT2A进行Taq-PCR扩增，55℃退火，其它条件同前，回收条带(图16a)，连接到pMD18-T载体，转化DH5α后测序，序列为634bp(不包括12bp的人工酶切位点)，比对发现与BnTT2-2全长cDNA(SEQ ID No.10)和BoTT2全长cDNA(SEQ ID No.6)的104～737bp完全一致，并且与BrTT2-1全长cDNA(SEQ ID No.2)、BrTT2-2全长cDNA(SEQ ID No.4)、BnTT2-1全长cDNA(SEQ ID No.8)、BnTT2-3全长cDNA(SEQ ID No.12)分别仅相差9～13bp，可广泛用于芸薹属TT2基因家族的反义抑制，因此命名为BTT2A。

抽提含有BTT2A的重组pMD18-T质粒，用XmaI+SacI完全双酶切后，电泳表明切下646bp的反义片段条带并回收(图16b)。抽提平台载体pCAMBIA2301G的质粒，采用XmaI+SacI切下了约1.9kb的GUS基因，回收约12kb的载体骨架。将载体骨架与目的基因进行连接形成反义植物表达载体pBTT2A，转化大肠杆菌。对Kan抗性阳性克隆子进行了引物组合FTT2A+RTT2A的PCR扩增，获得了与预期片段大小一致的BTT2A条带；抽提质粒后采用XmaI+SacI完全双酶切验证，pBTT2A质粒切下了与预期646bp大小一致的反义片段条带，而pCAMBIA2301G的质粒则切下了1.9kb的GUS基因条带(图16c)，表明载体构建成功。

采用液氮冷冻法将大肠杆菌中抽提的含目的基因的植物表达载体质粒转化根癌农杆菌LBA4404，对表现为三重抗性(Kan+Str+Rif)的转化子单克隆进行了PCR检测，将检测结果为阳性的克隆子作为工程菌株保存，用于植物转化。反义片段BTT2A由CaMV 35S启动子驱动，由Nos终止子终止转录，同时在T-DNA边界内分别连锁有报告基因GUS和筛选标记基因nptII的表达盒。

4、农杆菌介导的反义植物表达载体pBTT2A转化黑籽甘蓝型油菜

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型黑籽品种中油菜821的种子用75％乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用5％次氯酸钠浸泡20min，无菌水多次冲洗干净，然后接种于MS固体培养基[MS粉4.41g/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0mg/L，pH5.8，灭菌锅温热灭菌；不加Phytagel即为液体培养基]上，25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8天左右无菌苗的下胚轴切成长约0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp[MS培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)]上预培养3天。

-80℃保存的工程菌株在加有50.0mg/L Kan+50.0mg/L Str+25mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2天，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基MSm[MS液体培养基+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS)]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，期间间歇性轻轻摇荡，然后将小胚轴段在灭菌纸上吸干多余的菌液，接种到共培培养基MSc[MS固体培养基+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L萘乙酸(NAA)]中，23.5℃暗培养48小时。用杀菌液体培养基MSk[MS液体培养基+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef)]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi[MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4-D+500mg/L Cef+100mg/L Kan+6mg/L AgNO₃]中培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd[MS固体培养基+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/LAgNO₃+500mg/L Cef+100mg/L Kan]中培养14天以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+100mg/L Kan)中培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(M固体培养基+0.05mg/L 6-BA+500mg/L Cef+100mg/L Kan)中培养至长完整的茎片，再转接到生根培养基MSr[MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA)]中培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土(质量比为1∶1∶1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得40株再生植株。

切取再生植株的叶片用于GUS组织化学染色，27株产生了典型的蓝色反应(图17)，其余没有。提取再生植株的叶片基因组总DNA，采用F35S3N+FBTT2A进行Taq-PCR扩增，55℃退火，其它条件同前，结果所有GUS阳性植株均扩增出了与菌液对照一致700bp左右的条带，而GUS阴性和对照植株则无(图18)。因此，有27株转化当代(T1代)植株，并且它们的外源表达盒能够表达。

转基因当代和后代的植株性状一致，说明转基因性状可以稳定遗传。转基因植株种籽的颜色与对照相比明显变浅，T2代纯合转基因株系所结的T3代种子比T1代植株所结T2种子的性状修饰更变出，虽然没有达到标准的金黄色性状，但最优株系已比较接近黄籽，种皮色素比对照下降66.2％(图19)。所得到的反义BTT2转基因后代植株的主体形态特征与非转基因的对照植株无明显差异，但是不同的转基因株系的修饰程度不同，证明不同转基因植株中外源基因表达的水平存在差异，对内源BnTT2基因家族抑制的程度存在差异。这说明，芸薹属中TT2基因的确参与调控种皮色素合成，对它进行基因工程操作可以修饰种皮颜色，创造转基因黄籽性状。

5、应用形式的其它说明

最后说明的是，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。这里特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括来自于这3个物种的其它TT2等位基因的序列，还包括来自于这3个物种的其它亚种、生态型或品种的TT2基因序列，尽管它们与序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括与它们在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的用于甘蓝型油菜以外，还可以应用于其它物种。

4、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的采用反义RNA技术以外，还可以采用RNA干扰等技术，来介导内源TT2基因或基因家族的表达下调。

5、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的采用pCAMBIA2301G进行载体构建以外，还以采用其它载体来进行载体构建；本发明中的载体构建物，除了象优先实施例中所举的采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。

Claims (3)

1.含有甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT2基因家族保守片段BTT2A的反义片段的植物表达载体，所述BTT2A片段的核苷酸序列如SEQ ID No：6的第104～737位碱基所示。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是将BTT2A片段反义插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子和Nos终止子之间而得到。

3.含有权利要求1或2所述植物表达载体的转化体，所述转化体为根瘤农杆菌。

Images