CN102533806B - 白菜tt10基因家族及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白菜TT10基因家族，包括BrTT10-1A基因(SEQ ID No.1～2)、BrTT10-1B基因(SEQ ID No.3～4)和BrTT10-2基因(SEQ ID No.5～6)三个成员，该基因家族可应用于芸薹属作物种子性状的分子育种。

Description

白菜TT10基因家族及其应用

本申请是申请号为201010281910.3，申请日为2010-09-15，发明创造名称为“甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)TT10(TRANSPARENT TESTA 10，透明种皮10；又称LAC15，即LACCASE 15，漆酶15)基因家族及其应用。

背景技术

十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。

籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)TT10(AtTT10，At5g48100)基因位于拟南芥的第5染色体上，是通过候选基因的方法从透明种皮(TRANSPARENT TESTA，TT)突变体tt10中鉴定出来的。tt10种子在收获时种皮呈浅褐色，在合点区呈深褐色，在贮藏6～12个月后，突变体的种皮逐渐恢复为野生型种皮的深褐色。与野生型种子相比，tt10突变体种子表现为发育过程中的褐变延迟。AtTT10基因编码漆酶15(AtLac15)，既参与种皮中原花青素(proanthocyanidin，PA)氧化聚合成褐色的种皮色素，也参与种皮中木质素(lignin)单体氧化聚合成木质素。芸薹属和拟南芥同属十字花科，可能具有相同的色素位点。原花青素是形成甘蓝型油菜黑籽颜色的基础，在黄籽种皮中明显降低。木质素含量也是甘蓝型油菜的重要性状之一，在十字花科的黄籽系中明显低于在褐籽或黑籽中的含量，与十字花科的黄籽表型密切相关。因此，在芸薹属中对TT10基因进行同源克隆和功能鉴定，将有助于揭示甘蓝型油菜种皮色素和木质素的分子机理，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。

芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700～1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种：白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp)和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，则约相当于拟南芥基因组的6倍。也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，TT10基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性及与黄籽性状的关系等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族。

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并对其进行了系统分析。结果显示：

所述白菜TT10(BrTT10)基因家族包括以下3个成员：BrTT10-1A基因、BrTT10-1B基因和BrTT10-2基因；所述BrTT10-1A基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrTT10-1B基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示，BrTT10-2基因的全长cDNA序列如SEQ IDNo.6所示；

所述甘蓝TT10(BoTT10)基因家族包括以下2个成员：BoTT10-1基因和BoTT10-1pse基因；所述BoTT10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示，BoTT10-1pse基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.9所示；

所述甘蓝型油菜TT10(BnTT10)基因家族包括以下3个成员：BnTT10-1基因、BnTT10-2基因和BnTT10-3基因；所述BnTT10-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.11所示，BnTT10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示，BnTT10-3基因的全长cDNA序列如SEQ IDNo.14所示。

进一步，所述BrTT10-1A基因的基因组序列如SEQ ID No.1所示，BrTT10-1B基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示，BrTT10-2基因的基因组序列如SEQ ID No.5所示；所述BoTT10-1基因的基因组序列如SEQ ID No.7所示；所述BnTT10-1基因的基因组序列如SEQID No.10所示，BnTT10-3基因的基因组序列如SEQ ID No.13所示。

BrTT10-1A基因与BrTT10-1B基因的序列极其相似，可能互为一对等位基因。BoTT10-1pse假基因与BoTT10-1基因的序列一致，但在编码区发生2处单碱基缺失，导致提前终止突变，二者可能互为一对等位基因。根据基因序列和表达模式的分析，BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族成员可分为两种类型：BnTT10-3和BrTT10-2基因为I型基因，它们与AtTT10的同源性更高，可能参与原花青素聚合物的进一步氧化以及木质素的聚合反应；其它基因为II型基因，各成员之间具有较高的序列同源性，可能参与原花青素的聚合反应。生物信息学预测表明，BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族的正常编码蛋白序列中存在多铜氧化酶家族的3个保守结构域和4个铜离子结合基序L1～L4，与其它高等植物漆酶蛋白之间具有很高的同源性，由此预测BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族编码漆酶。TT10基因主要在甘蓝型油菜、白菜和甘蓝发育的种子中表达，在黑、黄籽近等基因系发育阶段尤其是后期转色阶段的种子中有差异表达，不同的基因成员表现出不同的黑、黄籽差异表达模式。根据基因序列分析、组织特异性表达和在黑、黄籽近等基因系之间的表达差异，可以推断甘蓝型油菜的BnTT10-1、BnTT10-3基因分别来自于白菜的BrTT10-1A和BrTT10-2基因，而甘蓝型油菜的BnTT10-2基因则来自于甘蓝的BoTT10-1基因。

基于上述结果，利用本发明的BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建TT10基因重组表达载体和转化体，用于TT10基因的正义表达、反义抑制、RNA干扰等。

本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。

进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。

为达到上述目的，本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族特异保守片段BTT10A(核苷酸序列如SEQ ID No.11中第653～1604位碱基所示)作为反义片段，将其反义插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子和Nos终止子之间，构建了BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族共抑制的反义抑制表达载体，并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转入3个不同的甘蓝型油菜品种，得到了抑制内源TT10转录本效果为0～83％的转基因株系，且3个品种转基因材料的表型修饰效应一致。研究发现，在BnTT10基因家族表达受到抑制的转基因株系中，种子的着色明显晚于对照，表现为转色延迟，种皮中可溶性原花青素含量增加，而种皮木质素含量降低，证明BnTT10基因家族参与了甘蓝型油菜的种皮着色、种皮原花青素单体的聚合和种皮木质素的合成。发明人在前期研究中已发现TT12等多个基因家族在甘蓝型油菜黄籽材料中的表达均有下调，因此推测BnTT10基因的表达下调参与了黄籽性状的形成，但它本身不是最源头上的黄籽主要位点，而是受黄籽主效基因调控的效应基因之一。BnTT10基因家族在种皮成熟转色、种皮木质素含量等种子性状的分子育种中具有应用价值，但必须对包括BnTT10在内的多个位点同时进行操作。

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT10基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了TT10基因参与了种皮着色、种皮原花青素单体的聚合和种皮木质素的合成，为受黄籽主效基因调控的效应基因之一，由此本发明提供了TT10基因在芸薹属作物种皮成熟转色、种皮木质素含量等种子性状的分子育种特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为甘蓝型油菜、白菜和甘蓝第一链cDNA的获得，其中M为DNA marker，A、B、C分别为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝。

图2为BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族成员全长cDNA的扩增，其中a、b、c分别为甘蓝型油菜、白菜和甘蓝：M为DNA marker，1～9为分别采用9种引物组合扩增所得PCR产物，d为BrTT10-2和BnTT10-3基因全长cDNA。

图3为BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族成员的Southern杂交鉴定。

图4为BnTT10、BrTT10和BoTT10家族蛋白及AtTT10蛋白的氨基酸序列比对。

图5为BnTT10、BrTT10和BoTT10家族蛋白与其它植物漆酶的系统进化树，其中ApLAC1为山槭漆酶1(AAB09228)，AfLAC为黄曲霉漆酶(XP_002378028)，AtTT10为拟南芥TT10(NP_199621)，AtLAC12为拟南芥漆酶12(NP_196158)，AtLAC13为拟南芥漆酶13(NP_196330)，AtLAC14为拟南芥漆酶14(NP_196498)，CmLAC为板栗漆酶(ACI46953)，OsLAC2为水稻漆酶2(Q8RYM9)，OsLAC9为水稻漆酶9(Q6Z8L2)，PtLAC1为火炬松(AAK37823)，PtLAC2为火炬松(AAK37824)，RcLAC为蓖麻(XP_002527130)，S1AOX为番茄抗坏血酸氧化酶(AAY47050)，ZmLAC3为玉米漆酶3(NP_001105915)；进化树分支上的数字表示靴值检验的百分率(1000次重复)。

图6为RT-PCR检测BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族总体和各成员在不同组织器官中的表达。

图7为RT-PCR检测BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族总体和各成员在黑、黄籽近等基因系生殖器官中的表达。

图8为BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族反义抑制表达载体pBTT10A的元件图。

图9为转基因甘蓝型油菜植株的PCR鉴定，其中a为转基因Westar，b为转基因中油821，c为转基因中双10号；上排扩增引物为FGUS+RGUS，下排扩增引物为F35S3N+FTT10A。

图10为转基因和对照甘蓝型油菜种子中BnTT10基因家族及各成员的表达量检测，其中a为T₂代转基因和对照Westar种子中BnTT10基因的总体表达，b为T₂代转基因和对照中油821种子中BnTT10基因的总体表达，c为T₂代转基因和对照中双10号种子中BnTT10基因的总体表达，d为T₂代转基因和对照Westar种子中BnTT10基因家族各成员的表达。

图11为转基因和对照甘蓝型油菜种子的转色过程，其中a为转基因和对照(CK)中油821种子，b为转基因和对照(CK)中双10号种子。

图12为转基因和对照Westar T₃种皮的可溶性原花青素含量(a)和不可溶性原花青素含量(b)，其中V-10、V-12、V-13为转基因阳性株系，BnTT10基因表达受到抑制；V-22为转基因阳性株系，但BnTT10基因表达未收到抑制；V-24为对照株系，BnTT10基因表达正常；T₂-P为T₂代转基因阳性株系；T₂-C为T₁代转基因阳性株系的T₂代分离阴性株或反义片段丢失的株系。

图13为转基因和对照Westar种皮的可溶性木质素含量，其中V-10、V-12、V-13、V-22、V-24、T₂-P和T₂-C的含义同图12。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例采用的植物材料：白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp.oleifera)，包括典型黑籽品系06K130以及黄、黑籽近等基因系09L597(黑籽)和09L600(黄籽)；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种(B.oleracea var.acephala)，包括典型黑籽品系06K158以及黄、黑籽近等基因系09甘1(黑籽)和09甘4(黄籽)；甘蓝型油菜材料包括典型黑籽保持系5B以及黄、黑籽近等基因系09L588(黑籽)和09L587(黄籽)，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，大田常规种植；甘蓝型油菜黑籽模式材料Westar和黑籽商业品种中油821DH系由重庆市油菜工程技术研究中心提供，黑籽双低商业品种中双10号由中国农业科学院油料作物研究所提供。

优选实施例采用的主要试剂及试剂盒：Taq DNA聚合酶(5U/μl)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Easy-Taq DNA聚合酶(5U/μl)、DL-2000plus Marker、pEASY-T3载体购自北京全式金生物技术有限公司；DNA分子量标准DL-2000、λ-HindIII digest DNA Marker、rTaq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶(5U/μl)和Ex Taq^TM Hot Start DNA聚合酶(5U/μl)、pMD18-T和pMD19-T载体、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV、SacI(10U/μl)购自美国New England Biolabs公司；限制性内切酶BamHI和SacI(10U/μl)、T₄ DNA连接酶(10U/μl)购自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium，including vitamins)基本培养基购自荷兰Duchefa Biochemie公司；pGEM-T easy载体购自Promega公司；柱式小量植物组织RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit购自美国Invitrogen公司，Southern杂交试剂、检测试剂盒、尼龙膜、地高辛标记的DNA Marker购自德国Roche公司。

优选实施例采用的主要仪器：PTC-200Programmable Thermal Controller PCR仪购自美国MJ Research公司，Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；UVP HL-2000杂交紫外交链仪购自美国UVP公司，Bio-Rad Model 785真空转膜仪购自美国Bio-Rad公司，以及分子生物学和基因工程的其它常规仪器和设备。

一、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族的克隆

1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA的提取

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.2％琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化比较完全，经分光光度法检测纯度较高，可以直接用于PCR扩增及Southern杂交。

2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝各器官总RNA的提取

取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的蕾(Bu)、花(Fl)、开花后10天的种子(10D)、开花后20天的种子(20D)和开花后30天的种子(30D)；以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜09L587和09L588、白菜09L600和09L597、甘蓝09甘4和09甘1的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St)、叶(Le)、蕾、花、荚果皮(SP)以及发育不同阶段的种子(甘蓝型油菜和甘蓝取15D、30D、45D和55D的种子；白菜取10D、25D、40D和45D的种子)共12个器官；采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1.2％琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。

3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝RACE第一链cDNA的获得

分别取甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的蕾、花和3个发育时期的种子的总RNA混合成总量为5μg的RNA样品，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的RACE操作，最终反转录获得在3’端和5’端同时锚定有人工接头序列的第一链cDNA，PCR放大后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，三个物种的总cDNA呈现出大小在200bp～10kb的拖带，重心区域在1kb～4kb，说明反转录比较完全，得到了较高质量的cDNA，可用于克隆甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族完整的cDNA末端。

4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族5’cDNA末端的克隆

通过Vector NTI Advance 9.0对AtTT10/AtLac15基因以及其它16个漆酶(AtLac1-AtLac14、AtLac16和AtLac17)基因序列进行多重比对，选取AtTT10基因与其它拟南芥漆酶成员核酸序列中的差异位点设计了2条正向引物(FTT10-31和FTT10-32)和2条反向引物(RTT10-51和RTT10-52)(表1)作为扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族成员cDNA末端的基因特异引物(GSP)。

分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，用引物组合5’P+RTT10-51进行5’cDNA末端的RACE一扩。50μl标准Taq PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μl，25mmol/L的MgCl₂3μl，10mmol/L的dNTPs lμl，10μmol/L的正向引物1μl，10μmol/L的反向引物1μl，5U/μl的Taq酶0.5μl，模板0.5μl，加双蒸水至总体积为50μl。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共25个循环；最后72℃延伸10分钟。

表1 5’和3’RACE中的基因特异引物和GeneRacer试剂盒引物

以一扩产物为模板，用引物组合5’NP+RTT10-52进行5’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系与一扩相同但模板改为0.1μl，PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟；再94℃变性1分钟，43～48℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与T载体(pMD18-T或pMD19-T)连接，再转化大肠杆菌(DH5α或JM109)感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR鉴定，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，每个物种挑选8～9个代表性单克隆子委托上海英竣生物工程技术有限公司进行测序。测序结果表明：BnTT10基因家族得到长度分别为405(2种序列)、409、374和379bp[均不包括poly(A)，下同]的5个5’cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明它们与AtTT10基因(NM_124184)具有很高的同源性，可能分别代表2种不同的5’cDNA末端；BrTT10基因家族得到长度分别为346、357、374、379、405(2种序列)、406和409bp的8个5’cDNA末端，表现为差异明显的两种类型，但都与AtTT10基因具有较高的同源性；BoTT10基因家族得到长度分别为379(2种序列)、398、405、409和411bp的6个5’cDNA末端，均与AtTT10基因有较高的同源性，可能代表2种不同的5’cDNA末端。

5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族3’cDNA末端的克隆

分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用引物组合3’P+FTT10-31进行3’cDNA末端的RACE一扩。PCR扩增体系和程序与5’cDNA末端的RACE一扩相同。

以一扩产物为模板，用引物组合3’NP+FTT10-32进行3’cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和程序与5’cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物如前法所述进行电泳检测、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。测序结果表明：BnTT10基因家族得到长度分别为430(4个)、407和387bp的6个3’cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明这些3’cDNA末端与AtTT10基因具有很高的一致性，表明它们的确为BnTT10基因家族的3’cDNA末端，但这些不同长度的片段序列一致，可能代表同一种3’cDNA末端，片段长度差异是由可变poly(A)加尾位点所引起；BrTT10基因家族得到长度分别为448(2个)、449(2个)、403、390和377bp的7个3’cDNA末端，这些3’cDNA末端与AtTT10基因具有很高的一致性，可能代表2种3’cDNA末端；BoTT10基因家族得到长度分别为430、430、388和390bp的4个3’cDNA末端，均与AtTT10基因一致性较高，可能代表2种3’cDNA末端。

6、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族成员全长cDNA的克隆

根据所获得的BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族5’和3’cDNA末端序列，设计了3条正向引物(FBNTT10、FBRTT10、FBOTT10)和3条反向引物(RBNTT10、RBRTT10、RBOTT10)(表2)，将所有正向引物与反向引物两两配对，形成9种引物组合。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，采用上述引物组合和50μl标准Taq PCR扩增体系，扩增甘蓝型油菜、白菜、甘蓝TT10基因家族各成员的全长cDNA；PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、57℃退火1分钟、72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物如前法所述进行电泳检测(图2)、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。结果分别得到BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族的3条、3条和8条全长cDNA序列，合并相同的基因序列，并设计特异检测引物，经过筛选、验证及补充克隆后，将不同的独立基因(unigenes)分别命名为BnTT10-1、BnTT10-2、BrTT10-1A、BrTT10-1B、BoTT10-1和BoTT10-1pse。经过分析和比对，发现BrTT10基因家族获得的一个5’cDNA末端没有扩增获得相应的3’cDNA末端和全长cDNA序列，针对该末端设计实验方案：以白菜第一链cDNA为模板，以该5’cDNA末端的对应引物FBRTT10与GeneRacer 3’NP配对，用Ex Taq^TM Hot Start进行扩增，获得相应的全长cDNA，命名为BrTT10-2；再设计相应的3’cDNA末端引物RBRTT10-I与FBRTT10配对，扩增BnTT10、BoTT10基因家族的相应cDNA，获得BnTT10-3，而甘蓝中没有获得相应基因。由于BrTT10-2、BnTT10-3的基因序列与AtTT10基因序列具有更高的同源性，因此将此类基因定义为I型基因，其它基因则定义为II型基因。多重序列比对的分析结果表明这些基因的全长cDNA序列与AtTT10基因有很高的同源性，且都存在与它们对应的3’和5’RACE末端。

表2 BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族成员全长cDNA和基因组序列扩增引物

7、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族成员基因组序列的克隆

根据甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族的第五外显子，设计中间引物FTT10A和RTT10A(表2)，分别用FTT10A与反向引物(RBNTT10、RBRTT10、RBOTT10和RBRTT10-I)配对，RTT10A与正向引物(FBNTT10、FBRTT10、FBOTT10)配对，分别以甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA为模板，扩增BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族成员基因组DNA的3’和5’端序列片段，再利用第五外显子的共有序列进行拼接。PCR扩增采用Easy Taq DNA聚合酶；扩增程序为：95℃预变性3分钟，再95℃变性30秒、68℃退火1分钟、72℃延伸4～6分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物如前法所述进行电泳检测、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。最终获得除BnTT10-2和BoTT10-1pse以外的BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族成员的基因组序列。

二、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族的分析

序列比对、开放阅读框(ORF)查找和翻译、蛋白质基本参数等在Vector NTI Advance 9.0-10.3软件上进行。核酸序列的二级结构预测在DINAMelt Server(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/hybrid/quikfold.php)网站进行，microRNA结构预测在PMRD(http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/)网站进行。核酸和蛋白质序列的BLAST分析、蛋白序列的保守结构域搜索在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站进行，蛋白质的保守结构域、基序、转录后修饰预测、拓扑结构预测、二级结构预测和三级结构预测主要通过Expasy(http://www.expasy.org)网站提供的生物信息学在线分析软件进行。BnTT10、BrTT10和BoTT10与GeneBank上获取的其它植物漆酶的蛋白质序列的多重比对由Cluastal X 1.83执行，然后用MEGA 4.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining Method)构建系统发生树，树的可靠性通过1000次Bootstrap replicates检验。

1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族的核酸序列分析

甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族核酸序列的结构特点如表3所示。

表3BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族核酸序列的结构特点

I型基因成员(BnTT10-3和BrTT10-2)的全长cDNA均为1793bp，基因组序列均为2417bp，5’UTR、ORF和3’UTR均分别为42、1683和68bp；II型基因成员(BnTT10-1、BrTT10-1A、BrTT10-1B、BnTT10-2和BoTT10-1)的全长cDNA介于1889～1896bp，基因组序列由于第4内含子长度的差异而呈现3662～5475bp的较大跨度，5’UTR、ORF和3’UTR分别为46、1680～1692和151～170bp。所有内含子均遵循标准的GT-AG剪接边界特点。BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族基因组序列的显著特点是第4内含子的长度变异较大。I型基因成员的第4内含子长度仅为207bp，而II型基因成员的第4内含子不仅在长度上呈现出994～2807bp的较大跨度，而且具有复杂的核酸二级结构。测序结果表明BrTT10-2的全长cDNA存在2种内含子的不规则剪接形式，表现为第4外显子剪掉和第5内含子保留，将它们分别命名为BrTT10-2M1和BrTT10-2M2。BnTT10-2M1将第4外显子作为内含子，与第3内含子和第4内含子一同剪掉，ORF长度缩短为1554bp，编码只有517aa的BnTT10-2M1蛋白。BrTT10-2M2保留了第5内含子，导致ORF增长了18bp，编码566aa的BrTT10-2M2蛋白。

RACE末端测序结果表明，在BnTT10-2的T₁₈₈₉、T₁₈₆₆和G₁₈₄₅右侧存在3个可变的poly(A)加尾位点，在BrTT10-1A的C₁₈₂₄、T₁₈₃₈、G₁₈₅₁和T₁₈₉₆右侧也存在4个可变的poly(A)加尾位点。BnTT10-2、BrTT10-1A和BrTT10-1B都具有4个可变转录起始位点(G₃、A₇、A₃₃和A₃₈)，BoTT10-1也具有4个可变转录起始位点(C₁、G₃、A₇和A₃₃)，BrTT10-2具有3个可变转录起始位点(A₁、T₅₁和A₆₂)且2个可变转录起始位点(T₅₁和A₆₂)都在其起始密码子ATG之后。I型基因BnTT10-3和BrTT10-2在其序列的3’末端有正常的加尾信号A₁₇₇₇ATAAA₁₇₈₂，而在II型基因中都不存在正常的加尾信号。

利用Vector NTI 10.3.0对BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族成员以及AtTT10基因在mRNA、ORF、5’UTR、3’UTR和各内含子水平上的核苷酸一致性进行了两两比对。结果表明，BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族所有成员均与AtTT10基因具有较高的同源性，在全长mRNA水平上具有79.1～81.2％的一致性，在ORF水平达到82.5～83.6％的一致性；但在非编码区，II型基因成员与AtTT10基因的一致性仅为57.4％(5’UTR)和52.7～57.3％(3’UTR)，而I型基因成员与AtTT10基因的一致性为71.4％(5’UTR)和67.1～68.4％(3’UTR)，高于II型基因成员；编码区的一致性远远高于非编码区证明了编码区的保守性。BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族成员之间在全长mRNA水平上具有83.3～100.0％的一致性，明显高于它们与AtTT10基因的一致性，说明甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因之间的亲缘关系比它们与AtTT10基因的关系更为接近。I型基因成员(BnTT10-3和BrTT10-2)的全长mRNA序列具有99.7％的一致性，5’UTR序列完全相同，3’UTR序列具有98.5％的一致性，ORF序列具有99.8％的一致性，编码相同的蛋白序列，由此推断BnTT10-3来源于BrTT10-2。II型基因成员(BnTT10-1、BrTT10-1A、BrTT10-1B、BnTT10-2和BoTT10-1)都具有相同的5’UTR序列，但是由序列比对可以发现，根据其核苷酸序列的特点，II型基因成员又可以分为两组：BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B为一组，BnTT10-2和BoTT10-1为一组。BrTT10-1A和BrTT10-1B在全长mRNA、3’UTR和ORF的序列一致性分别为99.5％、98.8％和99.5％，编码蛋白序列的一致性为99.3％，属于高度同源的两个基因，只是在第4内含子区域具有一定的差异，由此推断BrTT10-1B是BrTT10-1A杂合等位基因。BnTT10-1与BrTT10-1A、BrTT10-1B的3’UTR序列分别具有98.8％和97.6％的一致性，全长mRNA序列分别具有99.8％和99.3％的一致性，ORF序列分别具有99.6％和99.2％的一致性，相对而言与BrTT10-1A的序列一致性和表达模式更近，由此推断BnTT10-1来源于BrTT10-1A。BnTT10-2和BoTT10-1具有完全相同的全长mRNA序列，编码区和非编码区序列完全一致，编码蛋白序列也完全相同，由于本研究采用PCR方法未得到BnTT10-2的基因组序列，因此目前并不清楚两个成员在内含子区域的差异，但从所得到的除第4内含子以外的基因组序列来看，两个成员在基因组水平也无明显差异，由此推断BnTT10-2来源于BoTT10-1。II型基因的两组成员之间在全长mRNA、3’UTR和ORF区域的序列一致性分别为94.6～94.7％、85.3～86.5％和94.1～94.5％。I型和II型基因成员之间表现出较为明显的差异。它们在全长mRNA和ORF区域的一致性较高，分别达到83.3～84.6％、83.8～85.5％，而在非编码区差异较大，在5’UTR和3’UTR的一致性分别为61.9％、55.9～63.2％。

2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族的成员数检测

根据克隆的甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族成员序列的多重比对，选取相对保守且长度适宜的第五外显子序列作为Southern杂交探针序列。以BnTT10-2全长cDNA为模板，采用引物组合FTT10-32和RTT10-50扩增目的片段(探针)，并用PCR法(PCR DIGProbe Synthesis Kit)对探针进行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP)标记；探针标记的PCR程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。选取探针序列中不具有识别位点的限制性内切酶DraI、EcoRI和EcoRV分别酶切甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳、碱变性和中和，用真空转印法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上。将已标记好的探针与尼龙膜在42.6℃进行16小时的Southern杂交(DIG Easy Hyb)，中等严谨洗涤后进行免疫检测(DIG Wash and Block Buffer Set和DIG Nucleic Acid Detection Kit)，并对杂交显色条带拍照。

Southern杂交结果如图3所示，白菜基因组总DNA经EcoRI和EcoRV酶切后的杂交条带均为2条，经DraI酶切、杂交后只显示1条较粗的杂交条带，因本研究已经从白菜中克隆到3个不同的BrTT10成员，据此推测BrTT10-1A和BrTT10-1B由于高度相似而具有重叠的Southern杂交条带，而BrTT10-2由于与它们具有显著的序列差异性而能够被Southern检测区分开。甘蓝基因组DNA经DraI、EcoRI和EcoRV酶切后的杂交条带均为1条，虽然已经从甘蓝中克隆到2个不同的BoTT10基因，但是这2个成员的序列高度相似，全长mRNA仅相差8个碱基(一致性99.6％)，应当具有重叠的Southern杂交条带(相应地，杂交条带也很浓)。甘蓝型油菜基因组总DNA经DraI酶切后的杂交条带明显有4条，而经EcoRI和EcoRV酶切、杂交后均出现2条明显的条带和2条不明显的暗带，由于在探针区域均没有这3种限制性内切酶的识别位点，表明在甘蓝型油菜的基因组中可能存在4个TT10基因，而本研究克隆到的3个不同BnTT10成员可能只代表Southern杂交图上的3条杂交带，另1条杂交带可能代表暂时未克隆到的另一个BnTT10成员。基因克隆与Southern杂交均证明了甘蓝型油菜的确是白菜和甘蓝的异源四倍体物种，其拥有白菜和甘蓝TT10基因的总和。

3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族推定蛋白分析

甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族推定蛋白的基本性质如表4所示。由于BoTT10-1pse的mRNA序列与BoTT10-1几乎相同，且其核酸序列中的2个碱基缺失导致不能有效编码功能蛋白，因此蛋白分析中不包含BoTT10-1pse。

表4甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族推定蛋白的基本性质

由表4可知，BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B蛋白大小为559aa，BnTT10-2和BoTT10-1蛋白大小为563aa，BnTT10-3和BrTT10-2(标准剪接)蛋白大小为560aa，均略小于AtTT10蛋白(565aa)。BnTT10、BrTT10、BoTT10家族蛋白分子量均在63.26～63.60kDa之间。与AtTT10蛋白偏向中性的性质不同，BnTT10、BrTT10、BoTT10家族蛋白的氨基酸序列中碱性氨基酸比例(8.75～9.12％)高于酸性氨基酸比例(6.79～7.16％)，因此其等电点为9.01～9.09，明显偏向碱性。而带电氨基酸、极性氨基酸和疏水氨基酸比例均与AtTT10蛋白差别较小，BnTT10、BrTT10、BoTT10家族蛋白相互之间也极为相似。氨基酸组成上，BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B蛋白均以脯氨酸(Pro)含量最高，此外丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)相对含量较高；BnTT10-3和BrTT10-2蛋白中同样以脯氨酸(Pro)含量最高，其次是苏氨酸(Thr)，丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)次之；BnTT10-2和BoTT10-1蛋白以丝氨酸(Ser)含量最高，其次是脯氨酸(Pro)和苏氨酸(Thr)，亮氨酸(Leu)次之。

NCBI BLASTp和Vector NTI 10.3.0比对分析表明，BnTT10、BrTT10、BoTT10家族蛋白与AtTT10蛋白具有较高的同源性，同时与许多其它植物的漆酶蛋白也有较高同源性。对BnTT10、BrTT10和BoTT10家族7个成员与AtTT10蛋白(NP_199621)进行氨基酸水平上的两两比对，结果如图4所示，BnTT10、BrTT10和BoTT10家族蛋白间的一致性为83.8～100.0％，相似性为88.4～100.0％，均明显高于它们与AtTT10蛋白间的一致性(80.4％～83.0％)和相似性(86.0％～87.4％)。BnTT10-1与BrTT10-1A、BrTT10-1B蛋白具有很高的同源性，它们之间的一致性达到99.3～99.8％，相似性达到99.5～99.8％；它们与AtTT10蛋白的一致性和相似性分别为80.9～81.1％和86.2～86.5％。BnTT10-2和BoTT10-1蛋白序列相同，它们与AtTT10蛋白的一致性和相似性分别为83.0％和87.4％，与同为II型基因编码蛋白的BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B的一致性和相似性分别为94.1～94.5％和95.2～95.6％。I型基因编码蛋白BnTT10-3和BrTT10-2(标准剪接)的氨基酸序列也完全相同，它们与AtTT10蛋白的一致性和相似性分别为80.4％和86.0％，其与II型基因编码蛋白BnTT10-2和BoTT10-1的一致性(85.5％)和相似性(89.0％)略高于其与II型基因编码蛋白BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B的一致性(83.8～83.9％)和相似性(88.4～88.8％)。

NCBI保守域搜索(NCBI Conserved Domain Search)发现，在BnTT10、BrTT10、BoTT10家族蛋白序列中的E₁₅₄-S₃₀₅、D₄₁₉-G₅₄₁(BnTT10-3和BrTT10-2蛋白为D₄₁₉-G₅₄₂，BnTT10-2和BoTT10-1蛋白为D₄₂₃-G₅₄₅)和V₂₈-R₁₄₁分别存在多铜氧化酶家族的保守结构域pfam00394、pfam0773和pfam07732。BrTT10-2的两种不规则剪接形式BrTT10-M1和BrTT10-M2的不规则剪接并未明显影响这些含铜氧化酶家族结构域的存在。

ScanProsite的预测表明，BnTT10、BrTT10和BoTT10家族蛋白序列中都含有由21个氨基酸残基组成的多铜氧化酶I型序列标签G-x-[FYW]-x-[LIVMFYW]-x-[CST]-x-[PR]-[K]-x₂-[S]-x-[LFH]-G-[LM]-x₃-[LIVMFYW]，在I型蛋白中为G₅₁₇VWFMHCHFDRHLTWGMNVVF₅₃₇，在II型蛋白中为GVWFMHCHFDRHLTWGMKVVF(BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B蛋白序列的G₅₁₆-F₅₃₆、BnTT10-2和BoTT10-1蛋白序列的G₅₂₀-F₅₄₀)，其中序列HCHFDRHLTWGM与所报道的II型标签序列H-C-H-x₃-H-x₃-[AG]-[LM]相吻合。Kumar等曾提出漆酶序列的四个标签L1-L4，在本研究所克隆的BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族编码的蛋白序列中，序列H₇₇WHGVEQPRNPWSDGPEYITQCPI₁₀₀完全符合L1的典型序列标签(真菌漆酶标签H-W-H-G-x₉-D-G-x₅-QCPI和植物漆酶标签H-W-H-G-x₉-D-G-P-x₃-T-Q-C-P-I)。BnTT10-1、BnTT10-3、BrTT10-1A、BrTT10-2和BrTT10-1B蛋白序列的H₄₅₉-F₄₆₆、BnTT10-2和BoTT10-1蛋白序列的H₄₆₃-F₄₇₀(HPMHLHGF)完全符合L3序列标签H-P-x-H-L-H-G-H。II型蛋白序列中T₁₁₇TVWWHAH₁₂₄和I型蛋白序列中A₁₁₇TVWWHAH₁₂₄部分符合L2序列标签(真菌漆酶标签G-T-x-W-Y-H-S-H-x₃-Q-Y-C-x-D-G-L-x-G-x-FLIM和植物漆酶标签G-T-L-x-W-H-A-H)。保守序列GVWFMHCHFDRHLTWGMNVVF和GVWFMHCHFDRHLTWGMKVVF部分符合L4序列标签(植物漆酶标签G-V-W-[FLI]-[FML]-H-C-H-[FMLI]-[DE]-X-H-X2-W-G-L-X-M-X-[WF])。因此，可以预测BnTT10、BrTT10、BoTT10基因家族编码漆酶。由于碱基突变导致BoTT10-1pse蛋白翻译提前终止，其序列中只包含L1序列标签，不具有完整的与铜离子结合的活性中心，因此其可能不具有完整的漆酶的功能。

BnTT10、BrTT10和BoTT10家族蛋白及其它植物漆酶的系统进化树如图5所示，BnTT10-1和BrTT10-1A聚集在一起，与BrTT10-1B一起构成了第一个分支；BnTT10-2和BoTT10-1构成了第二个分支；BnTT10-3和BrTT10-2构成了第三个分支；第一个分支和第二个分支之间的关系比它们与第三个分支的关系更为接近；然后，BnTT10、BrTT10、BoTT10家族蛋白(不包括BoTT10-1pse)与AtTT10蛋白聚类形成紧密联系的十字花科TT10蛋白类群。它们与同在拟南芥第4类群的AtLAC14关系较近；最后，它们再与其它同源性较高的植物漆酶如水稻OsLAC9、板栗CmLAC、蓖麻RcLAC等形成更大的类群。本研究中以真菌漆酶黄曲霉AfLAC和植物抗坏血酸氧化酶番茄SlAOX蛋白作为外群，TT10蛋白类群和其它植物漆酶显然与植物抗坏血酸氧化酶关系更为接近，验证了TT10是较早地由植物漆酶进化而来的，而且与真菌漆酶的关系较远。

4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族的组织器官特异性表达检测

采用半定量RT-PCR检测甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族在不同组织器官中的总体表达及各个成员的特异表达。分别取甘蓝型油菜09L587、白菜09L600、甘蓝09甘4的根、下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花、荚果皮以及不同发育阶段的种子共12个器官的总RNA，采用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反转录为总cDNA，作为PCR扩增的模板。根据拟南芥26SrRNA的序列，设计引物F26S和R26S(表5)以扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝中的看家基因Bn26S基因534bp的保守片段，用于检测和调节反转录的cDNA浓度；PCR扩增采用Easy TaqDNA聚合酶；扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共21个循环，最后72℃延伸10分钟。通过对已克隆得到的甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族成员序列的多重比对分析，根据各成员与其它成员的差异位点，分别设计了6条正向和6条反向特异引物(表5)，用于对各成员进行特异表达的检测：引物组合FRT10S13+RRT10S1用于检测BnTT10-1和BrTT10-1A基因的特异表达，FOT10S13+ROT10S13用于检测BnTT10-2和BoTT10-1基因的特异表达，FTT10S3+RTT10S3用于检测BnTT10-3和BrTT10-2基因的特异表达，FRT10S13+RRT10S3和FOT10S3/ROT10S3分别用于检测BrTT10-1B和BoTT10-1pse基因的特异表达。以甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA为模板，用上述各引物组合进行52-68℃的梯度PCR，得到上述各引物组合的有效扩增的最高退火温度分别为61、61、61、60和60℃。分别以8个成员全长cDNA的单克隆子质粒为模板，同时采用上述各引物组合在上述有效退火温度进行扩增，证明各成员间几乎没有交叉扩增。引物组合FTT10A+RTT10A用于检测TT10基因家族的总体表达。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、55/60/61℃退火1分钟、72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

检测结果如图6所示，BrTT10、BnTT10和BoTT10基因家族成员主要在发育阶段的种子中表达。在芸薹属的根、茎和荚果皮等器官中都没有检测到TT10基因的表达，只有BnTT10-3、BrTT10-2和BrTT10-1B在花中检测到微弱的表达。BoTT10-1pse由于核酸序列中2个碱基的缺失导致移码突变而不能编码功能蛋白，在所有器官中均未检测到其表达。而在4个不同发育阶段的种子中，BnTT10和BrTT10基因家族各成员具有不同的表达特征：BnTT10-1、BnTT10-2和BrTT10-1B在中期种子(花后25～30天)中表达水平最高，在后期(花后40～45天)和转色期(花后50～55天)的种子中也有较强的表达，在早期种子(花后10～15天)中仅有微弱的表达；BrTT10-1A同样在中期种子中表达量最高，在转色期种子中也有一定水平的表达，而在早期和后期的种子中则只检测到微弱的表达；BoTT10-1在后期种子中表达量最高，在中期种子中也有较高水平的表达，在转色期的表达水平较低，而在早期种子中也只检测到较低水平的表达；I型基因成员BnTT10-3和BrTT10-2在中期、转色期和后期种子中的表达水平基本一致，表达量略有随着种子的发育而上升的趋势，它们在早期种子中的表达水平高于其它TT10成员。

表5甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族RT-PCR的内标和特异检测引物

5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族在黑、黄籽近等基因系间的差异表达检测

采用半定量RT-PCR检测甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因家族在黄籽材料主要生殖器官中的总体表达及各个成员的特异表达，并与前述黑籽材料的检测结果进行比较。分别取甘蓝型油菜09L587、白菜09L600、甘蓝09甘1的蕾、花、不同发育阶段的种子共6个主要生殖器官的总RNA，采用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反转录为总cDNA，作为PCR扩增的模板。引物和扩增程序同前述黑籽材料。

检测结果如图7所示，在甘蓝型油菜和白菜黑、黄籽近等基因系各发育阶段的种子中，BnTT10和BrTT10基因家族在黑籽中的总体表达略高于在黄籽中的表达，尤其是种子成熟期的差异最明显。但是BnTT10和BrTT10基因家族各成员表现出不同的表达模式：I型基因成员BnTT10-3和BrTT10-2以及II型基因成员BrTT10-1B在黑籽中的表达高于在黄籽中的表达，而II型基因成员BnTT10-1和BrTT10-1A在黑籽中的表达明显低于其在黄籽中的表达；此外，BnTT10-3在甘蓝型油菜黄籽系的花中有弱的表达，而在黑籽系的花中则没有检测到表达，相反，BrTT10-1B在黑籽系的花中有弱的表达，在黄籽系的花中却没有检测到表达。BoTT10-1在黑、黄籽中的差异表达模式不同于BnTT10和BrTT10：在甘蓝黑籽系中，BoTT10-1在转色期(花后55天)的种子中表达量最高，其次是中期(花后30天)的种子，在后期(花后45天)的种子中表达量较低；而在甘蓝黄籽系中，BoTT10-1在后期种子中的表达量最高，其次是中期和转色期的种子；在发育早期的种子中，BoTT10-1在黄籽系中的表达量也高于在黑籽系中的表达量。无论怎样，这3个物种的一个相同的趋势是，在种子成熟转色期TT10基因在黄籽中的转录表达水平明显低于黑籽，说明TT10基因的表达下调参与了这3个物种黄籽性状的形成。

根据基因结构和进化关系，本发明所克隆的甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT10基因被分为两种类型。对基因编码蛋白和表达模式的研究表明，这两种类型的基因可能存在功能上的分化。首先，从表达模式上来看，I型基因BnTT10-3和BrTT10-2具有与AtTT10基因相近的表达模式，它们在4个发育阶段的种子中都有表达，并且其转录水平随着种子的发育而呈逐渐上升的趋势，在已转色后的后期种子具有最高的转录水平。此外，与AtTT10的编码蛋白相同，对BnTT10-3和BrTT10-2编码蛋白的亚细胞定位预测表明，它们很可能在信号肽被剪掉以后分泌到胞外。根据拟南芥中原花青素的分泌和代谢途径，在细胞衰亡的过程中，随着细胞破裂，表儿茶素和原花青素的低聚物被转运到细胞质外后，可能与TT10反应而被进一步氧化聚合。木质素的积累是发生在次生壁上的，而不是积累在胞内。在I型蛋白的N-末端预测到一个β-糖基水解酶的活性位点，在II型蛋白中没有预测到这个位点。β-糖基水解酶参与多种基础代谢途径，包括木质化过程。因此推测I型基因很可能参与种子发育后期种皮中的原花青素和木质素单体的氧化聚合反应。II型基因表现出与I型基因不同的表达模式。BnTT10-1、BrTT10-1A和BrTT10-1B都在中期的种子具有最高的转录水平，随着种子的逐步发育成熟，它们的转录水平呈逐渐下降的趋势。根据PSORT的预测，II型蛋白序列中预测到的信号肽可能是不可剪切的，它们推测的亚细胞定位是内质网，而无色的原花青素是在由内质网形成的小囊泡中被合成的。因此推断II型基因很可能主要参与种子发育中期至后期的种皮细胞原花青素低聚物的形成。

三、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族的应用

1、BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族反义抑制表达载体的构建

根据所克隆的BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族全长cDNA和基因组序列的比对，选取BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族成员相对保守的第5外显子作为共抑制的反义片段。以BnTT10-2全长cDNA为模板，采用引物组合FTT10A+RTT10A扩增反义片段BTT10A(序列如SEQ ID No.11第653～1604位碱基所示)并在其5’端加上SacI酶切位点、3’端加上BamHI酶切位点；PCR扩增采用Pfu DNA聚合酶，扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物如前法所述进行电泳检测、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序，得重组载体pMD18-T-BTT10A。

用BamHI和SacI从pMD18-T-BTT10A中双酶切出反义片段BnTT10A，再与经同样双酶切后开环的pCAMBIA2301G载体进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取抗卡那霉素(Kan)阳性单斑培养后进行PCR检测，选取阳性克隆子提取质粒，进行PCR检测和BamHI+SacI双酶切验证，获得BnTT10、BrTT10和BoTT10基因家族共抑制的反义抑制表达载体pBTT10A(图8)，反向插入的片段由CaMV35S启动子驱动，由Nos终止子终止转录。pCAMBIA2301G载体由柴友荣构建(植物抗大丽轮枝菌受体类蛋白基因及甘露糖结合型凝集素基因的克隆与表达.西南农业大学，2003)，其含有三个由CaMV 35S启动的植物表达盒，一个为NPTII基因表达盒，另外两个为GUS基因表达盒，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选，其中与NPTII基因表达盒同向的GUS基因表达盒中的GUS基因可被替换为外源目标基因。

2、反义抑制表达载体转化根癌农杆菌

将pBTT10A采用液氮冷激法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于含有75mg/L Kan、40mg/L利福平(Rif)和20mg/L链霉素(Str)的YEB平板上，28℃倒置培养2天，挑取抗性菌落，接种于含有前述相同抗生素的YEB液体培养基中培养，取菌液进行复合PCR检测，检测结果正确的菌液用甘油于-80℃保存，即得农杆菌工程菌株。

3、农杆菌介导的反义抑制表达载体转化甘蓝型油菜黑籽系

本研究选取三种甘蓝型油菜进行转基因研究。甘蓝型油菜黑籽材料Westar具有较短的生育周期，常被用作实验室研究；甘蓝型油菜黑籽商业品种中油821为我国长期种植的典型黑籽生产对照品种，其DH系品系较纯，生长状况稳定；甘蓝型油菜黑籽商业种中双10号为中国农科院油料作物研究所近年来新审定的双低油菜品种，籽粒颜色较黑且品质良好。选用这三个甘蓝型油菜品种同时进行转基因研究，有利于对BnTT10基因家族的功能鉴定和基因工程可能性得出可靠的结论。

将冻存的农杆菌工程菌株解冻活化后培养至对数生长期，5000rpm离心10分钟收集菌体，用MSm液体培养基[MS+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS)]调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.3，供浸染用。选取甘蓝型油菜种子，用清水浸泡1～2小时，95％乙醇清洗1分钟，无菌水冲洗2～3次，再用0.1％的升汞溶液杀菌15分钟，无菌水冲洗4～5次，再接种于MS固体培养基上，25℃光照培养8～10天，切取无菌苗的下胚轴作为转基因的外植体；将下胚轴切成约1cm长的茎段，接入预培培养基(MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA)中25℃光照培养72小时；预培养后的下胚轴浸入前述备好的农杆菌工程菌液中浸染10分钟，用无菌吸水纸吸去多余菌液，再接入共培培养基(MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+50μM AS)中23℃暗培养48小时；共培养后的下胚轴浸入MSk液体培养基[MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef)]中振荡洗涤杀菌30分钟，重复二次，用无菌吸水纸吸干表面水分；再接入诱导愈伤培养基[MS+1.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L Cef+100/75mg/L Kan(Westar和中油821用100mg/L Kan作为筛选压，中双10号用75mg/L Kan作为筛选压)]中光照培养14天以上，至长出肉眼可见的抗性愈伤；再接入分化培养基[MS+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+100/75mg/L Kan]中光照培养14天以上，诱导愈伤组织分化；再接入茎分化培养基(MS+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+100/75mg/L Kan)中光照培养至长出小茎；再接入长茎培养基(MS+0.05mg/L 6-BA+500mg/L Cef+100/75mg/L Kan)中光照培养至长出茎和叶片；再接入生根培养基[MS+2mg/L萘乙酸(NAA)]中光照培养至长出发达根系；生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩-蛭石-草炭土(质量比为1∶1∶1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得14株再生植株。

4、转基因植株的鉴定和栽培

(1)T₁代转基因植株的GUS染色鉴定

取T₁代转基因植株(转基因后再生的当代植株)的叶片，剪成小片浸入GUS染液(50mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液中含有：0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.1mol/L K₄[Fe(CN)6]，10mmol/L Na₂EDTA，0.001％(v/v)Triton X-100，0.5mg/ml X-Gluc)中，37℃染色过夜，再浸入70％乙醇溶液中脱色过夜后，观察染色结果。

(2)T₁代转基因植株的PCR鉴定

取T₁代转基因植株的叶片提取DNA，分别用pCAMBIA2301G载体的35S启动子的正向引物F35S3N与FTT10A配对，终止子的反向引物RNOS5N与RTT10A配对，以及引物组合FGUS+RGUS(检测GUS基因)，扩增转基因植株DNA，对插入片段进行检测，3对引物均扩增出条带且与预期长度一致的确定为转基因阳性植株(图9)。

(3)T₂和T₃代转基因植株的栽培和管理

转基因阳性植株和对照阴性植株的T₂、T₃代种子播种并栽培于人工气候室完成生长、人工春化和发育，T₃代转基因植株和对照也同时种植于天然光照的密闭温室中完成生长、天然春化和发育，均在开花时套袋自交。T₂和T₃代植株全部提取DNA，进行PCR检测，统计其转基因子代分离比例，并挑选生长状况较好的代表性T₂和T₃代植株进行性状鉴定和留种。

本研究共获得抗Kan的再生植株52株，其中Westar有22株，中油821有13株、中双10号有17株。经GUS染色和PCR鉴定、移栽成活且能够正常结荚的双阳性植株只有22株，其中Westar有6株、中油821有9株、中双10号有7株。

5、转基因油菜中BnTT10基因家族的抑制效果检测

(1)转基因植株中TT10基因家族总体及其各成员的表达检测

采用实时定量RT-PCR检测转基因植株中TT10基因家族的总体表达：取转基因阳性植株和对照阴性植株的T₂代种子，提取RNA，各取1μg为模板，用RNA PCR Kit Ver.3.0进行反转录，合成第一链cDNA。以Bn18S基因为内参，用AlleleID 7.0软件设计实时PCR引物FBnT10Q和RBnT10Q(表6)。采用SYBR Premix Ex Taq进行PCR扩增，扩增长度92bp。采用Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪进行PCR产物的实时荧光检测，扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性30秒、60℃退火1分钟、72℃延伸30秒，共40个循环；融解曲线测定为55～95℃。每个样品设3次重复，用MxPro QPCR软件进行数据分析。结果表明，转基因种子中TT10基因家族的整体表达受到0～83％的抑制，不同的株系之间TT10的转录水平不同(图10)。

表6实时定量RT-PCR引物

采用半定量RT-PCR检测转基因植株中TT10基因家族各成员的表达：分别用引物组合FRT10S13+RRT10S1、FOT10S13+ROT10S13和FTT10S3+RTT10S3检测转基因植株种子中BnTT10-1、BnTT10-2和BnTT10-3的成员特异表达；PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，再94℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。结果表明，反义抑制表达载体pBTT10A的转化对BnTT10基因家族的3个成员BnTT10-1、BnTT10-2和BnTT10-3都具有相近的抑制效果，不具有成员特异性(图10)。

(2)转基因种子的重量检测

取转基因阳性植株和对照阴性植株的T₂代种子，每次取20粒称重，每个株系测量3次后数据取平均值，然后计算单个种子粒重。结果显示，转基因种子与对照相比，其单粒种子的重量没有显著的差异。

(3)转基因种子转色过程观察

分别于花后25、30、35、40和45天取转基因阳性植株和对照阴性植株的T₂代荚果，剥开荚果皮，观察种皮颜色变化并用体式显微镜照相。结果如图11所示，转基因植株的种子普遍出现转色延迟现象，表明BnTT10基因影响种皮色泽的形成。在花后25天之前，转基因种子和对照种子的种皮均为绿色；对照植株中花后30～35天的种子已经开始转色，花后40天的种子已经普遍转为红色或黑色；但是在转基因阳性植株中，花后35天的种子才开始极少量着色，花后40天的种子才有部分转色，花后45天的种子才基本完成转色；但是，收获时转基因的成熟种子的种皮色泽从外观上与对照并无明显差异，仍然表现为黑籽。

(4)种皮可溶性原花青素含量测定

剥取甘蓝型油菜Westar的转基因阳性和对照阴性植株的T₃代种子的种皮，采用丁醇-盐酸法测定原花青素的含量[参照Liang等(2006)，Dalzell和Kerven(1998)的报道]，每个株系选取3个单株的种皮作为样品，每个样品重复测量3次取平均值。结果如图12所示，反义抑制BnTT10的转基因种皮中积累了对照种皮中3倍以上的可溶性原花青素，而且抑制程度越强，积累的可溶性原花青素的含量越高。株系V-10和V-13种子中仅保留46％的BnTT10转录本，其种皮中可溶性原花青素含量分别是对照种皮的3.37倍和3.17倍。株系V-12种子中BnTT10基因的表达被抑制了83％，其种皮中可溶性原花青素含量最高，为对照种皮的3.75倍。株系V-22为转基因阳性株系，但荧光定量RT-PCR的结果表明其种子中BnTT10基因的表达未受抑制，其种皮可溶性原花青素的含量没有出现明显的增加。而株系V-10 T₂代分离后的阴性株的T₃种皮中的原花青素的含量也接近于对照种皮。株系V-13的T₂代分离株中出现了目标基因的丢失，在其DNA中只能检测到GUS盒，但是检测不到反义片段，其T₃种皮中可溶性原花青素的含量也没有增加。BnTT10的表达没有受到抑制的阳性株和阴性分离株的种皮中，可溶性原花青素的含量均没有增加，表明可溶性原花青素含量的增加的确是由于BnTT10基因的表达受到抑制而引起的。上述可溶性原花青素含量增加的转基因阳性株系的T₃种皮中，从可溶性原花青素提取后的种皮残渣中测定的不可溶性原花青素含量也是对照种皮的1.2～1.9倍，但是不可溶性原花青素含量的差异小于可溶性原花青素的差异，且未达到显著差异。本研究结果与拟南芥tt10的研究结果类似，在转基因种皮中可测定的可溶性原花青素的总体含量高于对照种皮中原花青素的总体含量，说明原花青素的聚合作用受到一定程度的抑制。

(5)种皮木质素含量测定

剥取甘蓝型油菜Westar的转基因阳性和对照阴性植株的T₃代种子的种皮，采用乙酰溴法测定转基因种子中可提取木质素的含量[参照Morrison(1972)以及Hatfield和Fukushima(2005)的报道]，每个株系选取3个单株的种皮作为样品，每个样品重复测量3次取平均值。结果如图13所示，在转基因Westar阳性株V-10、V-12和V-13的T₃种皮中，木质素含量分别降低了12％、16％和5％。而用同样方法测定转基因阳性和对照植株中茎杆的木质素含量，发现二者并无显著差异，表明TT10基因的表达抑制并未影响植株茎杆中的木质素含量。与原花青素的含量类似，分离阴性株和丢失反义片段的植株的种皮木质素含量均没有显著降低，表明木质素含量的降低的确是由于BnTT10基因的表达受到抑制而引起的。

综合上述实验结果，反义抑制BnTT10基因家族的表达可以有效而特异地降低种皮木质素含量，并抑制种皮原花青素的聚合，使种皮转色推迟。由于油菜黄籽性状的根本特点就是种皮色素的大大减小甚至消失，同时种皮变薄，种皮粗纤维尤其是种皮木质素减少。因此，通过基因工程抑制BnTT10基因家族的表达产生的性状修饰效果与黄籽性状的要求在趋势上是一致的，BnTT10基因家族在通过转基因手段创造油菜黄籽性状的分子育种中是有重要意义和较好应用前景的。本实施例中反义BnTT10转基因油菜成熟种籽的外观仍然呈黑色，由此推断TT10基因本身可能不是油菜黄籽性状的主效位点，而是受该主效基因调控的效应基因之一。发明人前期对已有甘蓝型油菜黄籽材料的分子机理研究结果也表明，黄籽与黑籽相比，在种皮色素和种皮木质素形成途径的多个靶点均发生了表达下调，也说明了该性状的多基因特点。因此，必须对包括TT10在内的多个代谢靶点和调控位点同时进行基因沉默，通过多价基因转化的综合效应有希望创造出具有实用价值的黄籽材料。

需要说明的是，本发明所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT10基因家族，除了上述采用反义抑制技术应用于甘蓝型油菜种子性状的分子育种外，也可以采用RNA干扰等其它技术来介导内源TT10基因或基因家族的表达下调，也可以应用于除甘蓝型油菜以外的其它芸薹属作物种子性状的分子育种。即使是采用反义抑制技术，除优选实施例中所用的pCambia2301G载体以外，也可以采用其它载体来构建反义抑制表达载体；所得反义抑制表达载体除了采用根癌农杆菌LBA4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。而且，除了优选实施例中公开的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜(来自于白菜型油菜亚种)和甘蓝(来自于羽衣甘蓝变种)TT10基因家族的8个成员以外，根据优选实施例所提供的研究方法和研究结果，来自于甘蓝型油菜、白菜和甘蓝的其它TT10等位基因序列，或者来自于这3个物种的其它亚种、生态型或品种的TT10基因序列，或者与上述8个成员的基因序列在连续80bp以上有至少98％一致性的任意核苷酸序列，都可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种中，实现本发明所述用途或效果。

总之，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，而并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (3)

1.白菜TT10基因，其特征在于：所述基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的白菜TT10基因，其特征在于：所述基因的基因组序列如SEQ IDNo.5所示。

3.权利要求1或2所述的白菜TT10基因在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用，所述种子性状为种皮成熟转色和种皮木质素含量。

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