CN102453081B

CN102453081B - 与大豆赤霉素信号转导途径相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102453081B
Application number: CN 201010519801
Authority: CN
Inventors: 李文滨; 高阳; 赵琳
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: CN102453081A

Abstract

本发明公开了一种与大豆赤霉素信号转导途径相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供一种蛋白质，命名为GmGAMYB，来源于大豆(Glycine max东农42)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株高、植物开花时间、植物花药育性和/或植物中赤霉素信号转导途径相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，在大豆中发现了大豆赤霉素信号转导途径中的GmGAMYB的基因，利用该基因进行品种改良，是一种相对于传统方法而言特别有效并且简单可靠的方法。

Description

与大豆赤霉素信号转导途径相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与大豆赤霉素信号转导途径相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

大豆的开花时间、花的数量及花的育性，严格控制着大豆的生育期及其产量，因而大豆生育期性状的改良和花的育性一直都是研究的热点问题。赤霉素(GA)作为重要的植物激素，在大豆的整个生长发育时期有着重要的作用。近几年来，植物中GA信号转导问题成为了研究的热点之一。随着，拟南芥和水稻的全基因组测序工作的完成，拟南芥和水稻作为模式植物，广泛应用于植物生命科学领域的研究。目前为止，应用拟南芥和水稻突变体，已经分离得到了多个GA信号途径中的作用因子：正向作用因子包括DWARF1，PHOR1，GAMYB，SLEEPY1，GID1，RSG。反向作用因子包括RGA/GA1蛋白，SPY，SHI。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与大豆赤霉素信号转导途径相关蛋白及其编码基因。

本发明提供了一种蛋白质，命名为GmGAMYB，来源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)东农42，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株高、植物开花时间、植物花药育性和/或植物中赤霉素信号转导途径相关的由1)衍生的蛋白质。

上述序列2由536个氨基酸残基组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第431-2041位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列1自5’末端的第392-2038位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且与植物株高、植物开花时间、植物花药育性和/或植物中赤霉素信号转导途径相关蛋白编码基因的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90％同源性且与植物株高、植物开花时间、植物花药育性和/或植物中赤霉素信号转导途径相关蛋白编码基因的DNA分子。

上述序列1由2041个核苷酸组成，编码区为序列1自5’末端第431-2041位核苷酸。

含有所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为在载体pCAMBIA1302的Bgl II和Spe I识别位点间插入所述编码基因得到的重组载体；所述重组菌为将所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将所述的编码基因导入目的植物得到的转基因植物，所述转基因植物为如下1)-4)中的至少一种：

1)所述转基因植物的株高高于所述目的植物；

2)所述转基因植物的莲座叶片数少于所述目的植物；

3)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；

4)所述转基因植物的花药育性低于所述目的植物；

所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥。

所述蛋白质在植物育种中的应用，或所述编码基因在植物育种中的应用，或所述重组载体在植物育种中的应用，或所述重组菌在植物育种中的应用均为本发明保护的范围。

本发明的实验证明，在大豆中发现了大豆赤霉素信号转导途径中的GmGAMYB的基因，利用该基因进行品种改良，使得能通过转化方法将其导入任意品种，从而改变这些品种的株高，生育期特性及其育性，并最终改变这些植物品种的开花和成熟期，创造雄性不育系，克服了以往常规育种中，通过杂交选择，或通过辐射和化学试剂进行诱变等常规方法进行品种改良所需时间较长，并且不能预计后代中突变的程度或方向的弱点，用这些基因进行品种改良是一种相对于传统方法而言特别有效并且简单可靠的方法。

附图说明

图1为利用ClustalX(1.83)软件进行多重序列比对将GmGAMYB基因与植物中同源基因序列比较结果

图2为组成型表达载体pCAMBIA1302-GmGAMYB的质粒的酶切验证

图3为重组农杆菌的PCR鉴定

图4为转基因阳性植株的鉴定

图5为亚细胞定位的观察

图6为转基因植株的表征

图7为转基因下游基因表达的检测

图8为GA对植物生长发育的影响

图9为GA处理后下游基因表达的检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大豆赤霉素信号转导途径中转录因子GmGAMYB基因的克隆

1、拼接cDNA全长序列

利用GAMYB基因的保守结构域设计引物，通过5’RACE和3’RACE方法克隆大豆GAMYB基因；将GAMYB保守结构域的中间片段，5’RACE和3’RACE序列片断利用生物学软件DNAMAN进行拼接得到cDNA全长。

通过DNAMAN软件对cDNA全长和麦属，拟南芥，水稻，玉米等植物中的GAMYB-Like基因的比对分析，得到了GAMYB基因BOX1，BOX2，BOX3保守区域。另外，发现了miR159的作用位点。

根据GAMYB编码区的cDNA序列设计引物，克隆得到了GAMYB基因的全长序列，该基因的全长序列为3093bp。通过DNAMAN软件与cDNA的比对发现，GAMYB1基因共有3个外显子和2个内含子。3个外显子分别位于基因上的1-354bp，1517-2511bp，2831-3092bp处。

同源序列比较发现，大豆GAMYB与玉米ZmGAMYB，拟南芥AtMYB33，燕麦AsGAMYB，大麦HvGAMYB，毒麦LtGAMYB，水稻OsGAMYB，马铃薯S1GAMYB和小麦TmGAMYB氨基酸序列进行了比对，结果表明R2R3保守结构域和BOX1，BOX2，BOX3，miR159结合位点的同源率较高，其他部分同源率较低。对植物的GAMYB蛋白进行系统进化树分析(图1)，表明双子叶植物GAMYB蛋白分布在同一分支，单子叶植物GAMYB蛋白则处于同一分支。其中双子叶植物大豆和拟南芥GAMYB亲缘关系较近。

2、植物表达载体pCAMBIA1302-GmGAMYB的构建

Trizol试剂提取大豆(Glycine max，东农42；陈丽君，不同播期对大豆东农42产质量性状动态变化规律研究，[J].大豆科学，2008，(03).公众可从东北农业大学获得。)花总RNA，反转录合成cDNA第一条链，设计引物，正义引物：GTAGATCTGCGTCGCGTCCTATTCAGGCAG(序列3)，反义引物：GCGACTAGTGAGGGGCTGGAATGGATTTTCA(序列4)，分别在该全长基因5’和3’两端引入Bgl II和Spe I酶切位点，进行PCR反应，条件为94℃ 5min；再35个循环：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2.5min；再72℃ 5min，取8μL进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，产物为预期的1661bp片断。将该PCR产物进行测序分析，结果为该PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端第392-2038位核苷酸，该PCR产物的基因命名为GmGAMYB，该基因的编码区为序列表中序列1的自5’末端第431-2041位核苷酸，编码的蛋白命名为GmGAMYB，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

将该PCR产物连接到pMD18-T载体，得到中间载体pMD18-GmGAMYB。将pMD18-GmGAMYB经过Bgl II和Spe I双酶切得到的小片段与经过同样酶切的pCAMBIA1302(Expression analysis of four Pinus radiata male cone promoters inthe heterologous host Arabidopsis.Kai P.Hofig，Richard L.Moyle，JoannaPutterill，Christian Walter.Planta(2003)217：858-867.公众可从东北农业大学获得。)载体片段相连接，得到的连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，将该质粒进行Bgl II和Spe I酶切验证和测序验证，酶切验证结果为得到1661bp左右的目的片段(如图2所示，泳道6为质粒，泳道7为质粒酶切后结果)，测序验证结果为该质粒为将序列表中序列1的自5’末端第392-2038位核苷酸插入到pCAMBIA1302的Bgl II和Spe I酶切位点间得到的，将该质粒命名为pCAMBIA1302-GmGAMYB。

实施例2、转GmGAMYB拟南芥的获得及功能研究

一、转GmGAMYB拟南芥的获得

将上述pCAMBIA1302-GmGAMYB采用冻融法转化到农杆菌LBA4404(陈中健刘兵王宏斌王金发刘良(2003)水稻重复序列RRD3缺失体介导gusA在水稻愈伤组织中的表达式。热带亚热带植物学报，1 I(2)：127-131；公众可从东北农业大学获得。)中，得到的转化子提取质粒后进行PCR鉴定和测序，PCR鉴定的引物为正义引物：GTAGATCTGCGTCGCGTCCTATTCAGGCAG，反义引物：GCGACTAGTGAGGGGCTGGAATGGATTTTCA，结果如图3所示，得到1661bp左右的目的片段的质粒为阳性质粒，再将阳性质粒送去测序，结果为该阳性质粒为pCAMBIA1302-GmGAMYB，将含有该阳性质粒的转化子命名为重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1302-GmGAMYB。

再将重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1302-GmGAMYB通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥Columbia生态型(以下简称野生型拟南芥。郝林，徐昕，曹军.一种拟南芥突变体对高浓度C0₂反应的研究，[J].应用生态学报，2003，14(12)：2359～236.公众可从东北农业大学获得)，得到60株T0代转GmGAMYB拟南芥。

收获T0代转GmGAMYB拟南芥的种子，将种子中加入1ml的10％(质量百分含量)的次氯酸钠水溶液，用涡旋机涡旋8min，充分灭菌；灭菌完后，倒掉EP管中的次氯酸钠水溶液，用灭菌的枪头吸取灭菌的蒸馏水反复吹吸T0代转GmGAMYB拟南芥种子，冲洗4-6次，至次氯酸钠冲洗干净为止；在超净台中，向装有T0代转GmGAMYB拟南芥种子的EP管中加入灭菌水，吹吸使种子在水中重悬，然后吸取种子滴到培养基(培养基由潮霉素(Hyt)和MS培养基组成，Hyt在培养基中的浓度为25mg/L)上，用涂布棒涂匀。用封口膜密封，组培室中培养。经过Hyt抗性筛选得到296株T1代转GmGAMYB拟南芥。将296株T1代转GmGAMYB拟南芥(检测植株)提取DNA作为模板，以正义引物：GTAGATCTGCGTCGCGTCCTATTCAGGCAG，反义引物：GCGACTAGTGAGGGGCTGGAATGGATTTTCA，进行PCR鉴定，结果见图4所示，质粒pCAMBIA1302-GmGAMYB为阳性对照，野生型拟南芥的DNA为阴性对照1，空载体pCAMBIA1302为阴性对照2，得到1661bp左右的目的片段的为阳性T1代转GmGAMYB拟南芥，共获得30株阳性T1代转GmGAMYB拟南芥。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转化到农杆菌LBA4404，得到LBA4404/pCAMBIA1302，再将LBA4404/pCAMBIA1302转入拟南芥中，得到T0代转pCAMBIA1302拟南芥，再将T0代转pCAMBIA1302拟南芥的种子采用上述方法处理后得到T1代转pCAMBIA1302拟南芥，经过PCR鉴定，引物为正义引物：GTAGATCTGCGTCGCGTCCTATTCAGGCAG，反义引物：GCGACTAGTGAGGGGCTGGAATGGATTTTCA，结果为T1代转pCAMBIA1302拟南芥中不含有GmGAMYB。

二、GmGAMYB核质定位和转GmGAMYB拟南芥功能研究

1、利用融合表达载体分析GmGAMYB的核质定位情况

将新鲜洋葱用小刀切成1cm×1cm的小块，再用镊子将表皮撕下放到MS培养基上，培养24小时(14小时光照，10小时黑暗)；将LBA4404/pCAMBIA1302-GmGAMYB接种到YEP(含Kan，Str，Rif三种抗生素)中摇到OD₆₀₀值0.6-0.8时，吸取菌液到不含抗生素的YEP中，摇到OD₆₀₀值为0.6-0.8。用50ml离心管离心，倒掉上清液，用不含抗生素的YEP重悬，加入乙酰丁香酮1ml(100uM/L)；将预培养的洋葱表皮放到重悬液中浸泡40-60min，取出洋葱表皮，吸水纸吸干多余的菌液，然后放到MS培养基上共培养2天(黑暗培养)(c和f)；在荧光显微镜下观察。以未侵染植物材料为阴性对照(a和d)，以LBA4404/pCAMBIA1302为阳性对照(b和e)。结果如图5所示，可以看出，阴性对照未侵染的植物细胞中，没有绿色荧光；阳性对照的植物细胞中，质核都有绿色荧光；转目的基因的植物细胞中，只有核中有绿色荧光。说明该基因为一个核定位基因。

2、T1代转GmGAMYB拟南芥的功能分析

1)T1代转GmGAMYB拟南芥表型观察

收获T0代转GmGAMYB拟南芥和野生型拟南芥的种子，然后灭菌后播种于MS培养基上，得到T1代转GmGAMYB拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗，再16h光/8h暗，25℃条件下生长，待1个月以后移至土中，得到T1代转GmGAMYB拟南芥植株和野生型拟南芥植株，以上述得到的T1代转pCAMBIA1302拟南芥为对照，观察T1代转GmGAMYB拟南芥、T1代转pCAMBIA1302拟南芥和野生型拟南芥的植株的株高，莲座叶片数，开花时间和花药发育的差异。每种植株统计10株，实验重复三次，结果取平均值。

结果统计如下：

T1代转GmGAMYB拟南芥植株的株高为21cm；

野生型拟南芥植株的株高为16cm；

T1代转GmGAMYB拟南芥植株的莲座叶片数为7个；

野生型拟南芥植株的莲座叶片数为11个；

T1代转GmGAMYB拟南芥植株的开花时间为38天；

野生型拟南芥植株的开花时间为42天；

T1代转GmGAMYB拟南芥植株的花药颜色较浅，白色；

野生型拟南芥植株的花药颜色正常，淡黄色；

T1代转GmGAMYB拟南芥植株荚果结实率60％；

野生型拟南芥植株的荚果结实率为98％；

T1代转pCAMBIA1302拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。

结果拍照见图6，图6A为株高和开花时间比较，1为T1代转GmGAMYB拟南芥，2为野生型拟南芥；图6B为育性观察(荚果数)，1为T1代转GmGAMYB拟南芥植株，2为T1代转GmGAMYB拟南芥，3为野生型拟南芥；图6C为花药的比较，1为T1代转GmGAMYB拟南芥，2为野生型拟南芥；从图中看出，T1代转GmGAMYB拟南芥与野生型拟南芥相比，荚果数目增多，植株的高大，提前开花，花药发育及育性下降。T1代转pCAMBIA1302拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。

2)GmGAMYB下游基因的表达检测

提取T1代转GmGAMYB拟南芥与野生型拟南芥植株花的RNA，以拟南芥中Actin为内参，扩增GmGAMYB，LFY(NM_125579)，CYP703A2(NM_100010)目的基因，

LFY的引物如下：

LFY正义：5-TGTGAACATCGCTTGTCGTC-3，LFY反义：5-TAATACCGCCAACTAAAGCC-3；

CYP703A2的引物如下：

CYP703A2正义：5-TCCGTTAGGTGTGACGATGG-3，CYP703A2反义：5-ATGCCATAAACTTCCACCGT-3；

GmGAMYB的引物如下：

正义引物：GTAGATCTGCGTCGCGTCCTATTCAGGCAG，反义引物：GCGACTAGTGAGGGGCTGGAATGGATTTTCA，

Actin的引物如下：正义：CACTGTGCCAATCTACGAGGGT，反义：CACAAACGAGGGCTGGAACAAG

结果如图7所示，1为野生型拟南芥，2为T1代转GmGAMYB拟南芥，从图中可以看出，发现T1代转GmGAMYB拟南芥植株中GmGAMYB基因得到了正常的表达，其与开花相关的下游LFY的表达量有了明显的升高，而与花药发育相关的下游CYP703A2基因的表达量有所减少。LFY表达量的增加，促进了转基因拟南芥的早花。CYP703A2表达量的下降，导致了花药发育的异常。

2)激素对T1代转GmGAMYB拟南芥生长和发育的影响

待上述得到的T1代转GmGAMYB拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗生长到四片叶时期，将培养皿中正常生长的T1代转GmGAMYB拟南芥、野生型拟南芥各取10株转移至含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基(含有GA的1/2MS固体培养基由GA(赤霉素)和1/2MS组成，所述GA在所述含有GA的1/2MS固体培养基中的浓度为1μM。)上，再各取十株转移至不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基上，14天后，观察植株的生长情况。以T1代转pCAMBIA1302拟南芥为对照。实验重复三次，结果取平均值。

测定表型数值：

含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的T1代转GmGAMYB拟南芥的株高为9.7cm，

含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的野生型拟南芥的株高为8.5cm，

不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的T1代转GmGAMYB拟南芥的株高为4cm，

不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的野生型拟南芥的株高为2cm，

含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的T1代转GmGAMYB拟南芥的开花时间为30天，

含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的野生型拟南芥的开花时间为33天，

不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的T1代转GmGAMYB拟南芥的开花时

不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的野生型拟南芥的开花时间为40天，

T1代转pCAMBIA1302拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。

拍照观察见图8所示，1为含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的T1代转GmGAMYB拟南芥；2为含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的野生型拟南芥；3为不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的野生型拟南芥；4为不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的T1代转GmGAMYB拟南芥；从图中可以看出，赤霉素会促进植物开花和茎的伸长，并且转基因植物对赤霉素反应更加的敏感，所以GmGAMYB基因是赤霉素信号转导中的一个促进因子。

待上述各植株准备转入生殖生长的时候，取GA处理的各植株(在含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长的植株)花序，提取RNA做半定量检测。待GA处理的各植株处于花药发育的减数分裂时期之后，再取各自的花，提取RNA进行半定量。

MYB33的引物

正义：AGCGGAAACCTCTCTTGGAT反义：TCATTTCCTATGTCATCGCC

MYB65的引物

正义：TTTACTTGCGTCGAGCTGGC反义：TCCATAAGACCCGACGCCTC

LFY的引物如下：

LFY正义：5-TGTGAACATCGCTTGTCGTC-3，LFY反义：5-TAATACCGCCAACTAAAGCC-3；

CYP703A2的引物如下：

GmGAMYB的引物如下：

结果见图9所示，1为未经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥(不含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长)，2为经GA处理野生型拟南芥(含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长)，3为经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥(含有GA的1/2MS三角瓶固体培养基中生长)；

从图中看出，与未经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥相比，经GA处理野生型拟南芥和经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥的MYB33和MYB65的表达量都得到了相应的提高，而其下游靶基因LFY的表达量也有大幅度的提高，并且可以看出，经GA处理野生型拟南芥的LFY表达量要比经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥的LFY表达量低，而比未经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥的LFY表达量高，这也符合GA处理的野生型拟南未经GA处理T1代转GmGAMYB拟南芥的LFY表达量高，这也符合GA处理的野生型拟南芥植株比GA处理的T1代转GmGAMYB拟南芥植株矮，晚花，而比无GA处理的T1代转GmGAMYB拟南芥植株高，早花的表型。而GA处理后的T1代转GmGAMYB拟南芥和GA处理后的野生型拟南芥的CYP703A2的表达量也明显下降，这也说明GA会影响植株育性。